CN102608187B - 空壳纳米金修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种空壳纳米金修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于：空壳纳米金的制备，玻碳电极的清洗活化和表征，滴涂壳聚糖溶液，在空壳纳米金溶液中浸泡12h，在L-半胱氨酸中浸泡3h，滴涂乙酰胆碱酯酶，乙酰胆碱酯酶传感器工作曲线的建立，乙酰胆碱酯酶传感器性能如准确性、稳定性和再生能力的检测，乙酰胆碱酯酶传感器对实际样品的检测。壳聚糖带有大量正电荷的氨基，通过静电作用，将纳米空壳金吸附到壳聚糖膜上。空壳纳米金能够促进电子的传递，并且拥有良好的生物兼容性，L-半胱氨酸具有巯基能稳定的固定在金纳米空壳上，并且L-半胱氨酸中的大量羧基与酶中大量氨基结合，将酶固定在电极上。使乙酰胆碱酯酶更加稳定的固定在电极上，从而使制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器检测时间短，灵敏度高，稳定性好，再生能力好以及可以用于实际样品的检测。

Description

空壳纳米金修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法

技术领域

本发明提供一种空壳纳米金修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，属于生物传感器技术领域。

背景技术

农药是重要的农业生产资料，在农产品生产中对病、虫、草、鼠危害的防治起到非常重要的作用。但是，农药污染及其产生的危害后果是严重的，农药对环境污染造成的损失是多方面的，包括对水环境的污染，对土壤的污染，对大气的污染，对环境生物的影响以及对人体健康的危害等。目前由于使用者普遍缺乏科学使用农药知识，片面追求产量，造成目前市场上流通的农业产品都不同程度地存在农药残留问题，其危害也日益引起公众的关注。我国是一个农业大国，随着我国人民生活水平不断提高，农产品的质量安全问题越来越受到关注，尤其蔬菜中农药残留问题已经成为公众关注的焦点。我国生产和使用的杀虫剂绝大多数品种为有机磷和氨基甲酸酯类农药 (约占70%)，其中高毒性的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂为70% 左右，因此容易引起食物农药残留中毒。可见，加强对农产品中农药残留的检测对保护生态环境，尤其是保障人类健康有着十分深远的意义，而农药残留检测的重点应该放在有机磷和氨基甲酸酯类农药。

目前农药残留分析的主要方法是气相色谱仪、液相色谱仪、气质联用仪、液质联用仪等，这些方法虽然分析精度高，定量准确，但其样品的前处理复杂、检测耗时长、成本高、需要技术熟练的操作人员。我国农药残留的速测方法是酶抑制试纸法和酶抑制分光光度法（农残快速检测仪），可以实现有机磷农药及氨基甲酸酯类农药的现场快速检测，具有较好的实用价值。速测卡是通过肉眼观察卡片的颜色变化，因此一般只能用于严重超标的蔬菜样品进行定性测量。酶抑制分光光度法的应用也比较广泛，国内已有多种农药残留速测仪均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的变化进行检测的，但蔬菜水果中大量的色素会对分光光度法造成很大的影响，导致检测结果的不准确。并且上述方法存在回收率低、错检、漏检比例较高、重复性差、难以满足低残留和定量检测的要求等缺点。

发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及操作简单、价格低廉、灵敏度高的检测农药残留的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法。

其技术方案为：一种空壳纳米金修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于：乙酰胆碱酯酶传感器的组装过程为滴涂壳聚糖溶液，形成一层壳聚糖膜，然后浸泡在空壳纳米金溶液中12 h，再浸入L-半胱氨酸溶液中3 h，最后滴涂乙酰胆碱酯酶。

所述的一种空壳纳米金修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于：玻碳电极（d=3mm）的清洗，乙酰胆碱酯酶传感器敏感界面的构建及过程表征，乙酰胆碱酯酶传感器工作曲线的建立，乙酰胆碱酯酶传感器性能的检测，乙酰胆碱酯酶传感器对实际样品的检测。

所述的一种空壳纳米金修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于：所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的工作曲线为：毒死蜱浓度0.1-30 μg/L时，其线性范围为y=1.0329x+17.429，毒死蜱浓度30-150 μg/L时，其线性范围为y=0.2411x+40.021；克百威浓度0.1-30 μg/L时，其线性范围为y=1.113x+14.047，毒死蜱浓度30-200 μg/L时，其线性范围为y=0.2307x+41.218。检测限为：毒死蜱为0.06 μg/L，克百威为0.08 μg/L。乙酰胆碱酯酶传感器性能检测包括准确性、稳定性，可再生性以及乙酰胆碱酯酶传感器对蔬菜样品回收率的测定。

其制备原理为：由于有机磷农药与乙酰胆碱酯酶具有较高的特异性结合，因此常用乙酰胆碱酯酶作为检测有机磷农药的分子识别元件。乙酰胆碱酯酶生物传感器是将乙酰胆碱酯酶固定在电极表面，酶催化底物乙酰胆碱水解生成胆碱和乙酸。农药在结构上与底物乙酰胆碱有些类似，它可以和乙酰胆碱的活性中心有效结合，抑制乙酰胆碱酯酶的活性。胆碱是一种电活性物质，能在一定电位下发生氧化反应，通过伏安扫描过程中硫代胆碱氧化峰的大小可以测定农药残留的浓度，通过比较有无农药时酶促反应电流信号的变化得到农药对酶的抑制率，该抑制率与农药的浓度成对应关系，便可测得有机磷或氨基甲酸酯类农药的含量。

本发明采用壳聚糖，空壳纳米金，L-半胱氨酸对玻碳电极进行修饰，壳聚糖有着类似网状结构的笼形分子，对金属离子有极好的配合能力，它带有大量正电荷的氨基，通过静电作用，将纳米空壳金吸附到壳聚糖薄膜上。空壳纳米金内外壳之间存在着电势差，因此可以作为微小的导电中心，在电化学反应中促进电子的传递，此外，由于金纳米空球拥有良好的生物兼容性，因此可以作为蛋白质的固定载体。 L-半胱氨酸是20 种天然氨基酸中唯一具有巯基的化合物，因而它能稳定的固定在金纳米空壳上，并且L-半胱氨酸中的大量羧基与酶中大量氨基结合，将酶固定在电极上。将经过上述步骤修饰过的玻碳电极，制成的酶传感器，具有检测限低，范围广，精度高、适用于现场检测等优点。采用本发明制成的电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器可以在蔬果采收、上市前，进行农药残留的快速测定，直接对农药残留是否超标量进行检测，避免因食含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种空壳纳米金的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于：(1)乙酰胆碱酯酶传感器制备前玻碳电极的清洗，活化和性能测试，如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在80 mV以下，并尽可能接近64 mV，所述玻碳电极可使用，否则要重新返回清洗步骤中，直到符合要求。(2) 清洗干净的玻碳电极上滴涂壳聚糖溶液，室温下自然晾干后，形成一层壳聚糖薄膜，然后将电极浸入不断搅拌着的空壳纳米金乙醇溶液中12 h，期间一直充氮气，取出后用超纯水彻底冲洗干净，以除去较弱吸附的空壳纳米金。然后将电极浸入L-半胱氨酸 中3 h，用磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，滴涂乙酰胆碱酯酶，2 h后冲洗干净，电流型乙酰胆碱酯酶传感器制备结束，放入冰箱里4℃保存备用。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种空壳纳米金的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于：(1) 配置一系列的毒死蜱和克百威标准液，进行循环伏安扫描，得到抑制率，进一步得到上述制备的电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器的工作曲线、检测范围和检测限；(2) 将农药抑制后的电极浸入解磷定10 min，测得其乙酰胆碱酯酶生物传感器的再生性能；(3) 对乙酰胆碱酯酶生物传感器的精确度和稳定性进行评价；(4) 对实际果蔬样品进行分析得出该传感器的回收率和重现性。

本发明首先制备空壳纳米金，纳米空壳金颗粒能促进电化学反应中电子的传递，提高电极上的响应电流，因而可以作为载体材料，用来制备较大响应信号和较高灵敏度的电化学生物传感器；纳米空壳金颗粒由于其良好的生物兼容性，可以提高生物活性物质在电极上的固定量。壳聚糖无毒，并且价格低廉，具有类似网状结构的笼形分子，对金属离子有极好的配合能力，它带有大量正电荷的氨基，通过静电作用，将纳米空壳金吸附到壳聚糖膜上。L-半胱氨酸是20 种天然氨基酸中唯一具有巯基的化合物，因而它能稳定的固定在空壳纳米金上，并且L-半胱氨酸中的大量羧基与酶中大量氨基结合，能够将酶稳定的固定在电极上。

所述空壳纳米金乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备工艺如下：(1) 将5 μL 0.5 wt%壳聚糖溶液滴涂在预处理好的玻碳电极上，室温下干燥后，形成一层壳聚糖膜。 (2) 然后将电极浸入不断搅拌着的空壳纳米金溶液中12 h，期间一直充氮气，取出后用超纯水彻底冲洗干净，以除去较弱吸附的空壳纳米金。(3) 然后将电极浸入L-半胱氨酸 中3 h，用磷酸盐缓冲溶液冲洗干净。(4)取5 μL 乙酰胆碱酯酶溶液滴涂在电极上，常温下2 h，然后用PH=7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗表面，后用氮气吹干，乙酰胆碱酯酶生物传感器制作完成，保存在4℃条件下备用。

具体实施方式

实施例：(1) 空壳纳米金的制备：首先制备钴纳米粒子，50 μL of 0.4 M CoCl₂ 溶液加入 50 mL 含有 8 mM 硼氢化钠 和 0.8 mM 柠檬酸的去氧纯水中，得到钴纳米粒子。在此期间一直充氮气，30 mL 钴纳米粒子缓慢加入到 18 mL 搅拌着的1 mM HAuCl₄ 溶液中，所得到的悬浮液进行离心，转速为10000 rps，吸走上清液，5 mL pH 7.5 磷酸盐缓冲溶液加入到离心后得到的沉淀物中，得到空壳纳米金溶液；(2) 玻碳电极的清洗：玻碳电极修饰前，首先浸入热的“piranha”溶液 (H₂SO₄:30% H₂O₂ = 3:1)中浸泡 15 min，用水清洗干净，接下来用0.3 μm、30 nm的Al₂O₃浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水洗去表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5 min，重复二次，然后依次用 6 mol/L 的HNO₃、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥；(3)玻碳电极的活化：彻底洗涤后，电极在 0.5 mol/L H₂SO₄溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0V～-1.0V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。(4)预处理好的玻碳电极的测试：最后在 0.20 mol/L KNO₃中记录1×10^-3 mol/L K₃Fe(CN)₆溶液的循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极的性能，扫描速度50 mV/s，扫描范围为-0.1V～0.6V；当所述循环伏安曲线中的峰电位差在 80 mV 以下，并尽可能接近 64 mV，所述玻碳电极可使用，否则要重新返回步骤(1)中，处理所述玻碳电极，直到符合要求；(5) 在前处理完的干净电极表面滴上5 μL 0.5 wt%的壳聚糖溶液，让其在空气中蒸发，从而形成一层壳聚糖薄膜；(6) 然后将电极浸入不断搅拌着的空壳纳米金乙醇溶液中 12 h，取出后用超纯水彻底冲洗干净，以除去较弱吸附的空壳纳米金；(7) 将修饰好的浸入 20  mmol/L 的 L-半胱氨酸 中 3 h，通过 Au-S 键将L-半胱氨酸组装到电极表面，用水清洗后，用氮气吹干；(8) 取 5 μL 乙酰胆碱酯酶溶液滴涂在电极上，常温下 2 h，然后用 PH 7.5 的磷酸盐缓冲液冲洗表面，氮气吹干，乙酰胆碱酯酶生物传感器制作完成，保存在4℃条件下备用。(9) 将上述制备好的乙酰胆碱酯酶传感器在含有1 mM的氯化硫代乙酰胆碱的 pH 7.5 的磷酸盐缓冲溶液中以50 mV/s扫描速度进行循环伏安测试，电位窗口为0.0V~1.2V；(10) 配置0.05 μg/L-200 μg/L的毒死蜱和克百威标准溶液，农药测量时，将上述乙酰胆碱酯酶传感器浸入到不同浓度的农药标准溶液中10 min，然后在，含有1 mM氯化硫代乙酰胆碱(ATCl)的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描，抑制率I可由下式求得：

I(%)=(i_P, control?i_P, exp)/i_P, control×100%

其中i_P, control，和i_P, exp分别为修饰电极未经过农药抑制和经过农药抑制后，在ATCl溶液中的峰电流，农药浓度与抑制率呈一定的线性关系，做出工作曲线图，得到农药浓度与抑制率之间的线性关系，以及检测限。(11) 乙酰胆碱酯酶生物传感器的精确性是通过组内偏差实验进行研究的。同一支电极进行六次重复测定获得组内变异系数；重复六次制备不同的电极对标准浓度农药测定获得组间变异系数。当电极不用时保存在4℃冰箱中，7天和30天后电流响应的变化得到此传感器的稳定性。(12) 将农药抑制后的的传感器浸在 4.0 mM的碘解磷定溶液中 10 min，用磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，在1 mM ATCl的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描，以检测其再生能力；(13) 把蔬菜彻底清洗干净并用去离子水清洗3次，喷洒上一定浓度的农药，放置 24 h 后，用磷酸盐缓冲溶液 (pH 7.5) 做溶剂超声处理 30 min(换溶剂三次)，以检测实际样品的回收率。

此种乙酰胆碱酯酶生物传感器农药残留的检测方法操作工艺简单，检测时间较短，检测农药范围广，检测限低，灵敏度高，稳定性好，再生能力高以及对实际样品分析有较好的回收率和重现性，符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。

Claims (3)

1.一种空壳纳米金修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于：电流型乙酰胆碱酯酶传感器的组状过程为滴涂壳聚糖溶液，在空壳纳米金溶液中浸泡12 h，在L-半胱氨酸中浸泡3 h，滴涂乙酰胆碱酯酶。

2.如权利要求1所述的一种空壳纳米金修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于：乙酰胆碱酯酶传感器敏感界面的构建及过程表征，乙酰胆碱酯酶传感器工作曲线的建立，乙酰胆碱酯酶传感器性能的检测，乙酰胆碱酯酶传感器对实际样品的检测。

3.如权利要求1所述的一种空壳纳米金修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于：所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的工作曲线为：毒死蜱浓度0.1-30μg/L时，其线性范围为y=1.0329x+17.429，毒死蜱浓度30-150μg/L时，其线性范围为y=0.2411x+40.021；克百威浓度0.1-30μg/L时，其线性范围为y=1.113x+14.047，克百威浓度30-200μg/L时，其线性范围为y=0.2307x+41.218 ；所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的检测限为：毒死蜱为0.06 μg/L，克百威为0.08 μg/L ；乙酰胆碱酯酶传感器性能检测包括准确性、稳定性和再生能力，以及乙酰胆碱酯酶传感器对蔬菜样品回收率的测定。