CN103063597B - 一种检测脂肪酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测脂肪酶活性的方法，其利用了巯基乙酸甲酯修饰纳米金，在脂肪酶存在下，水解成巯基乙酸，从而暴露出羧酸根，而羧酸根之间存在强烈的氢键作用，从而拉近了纳米金之间的距离，使纳米金聚集变蓝。一方面可以从颜色上肉眼直接识别脂肪酶活性的强弱，另一方面，通过紫外可见分光光度计灵敏地检测脂肪酶的活性。本发明从时间、温度、量等方面对脂肪酶的活性做了检测，实验现象明显。本发明操作简单，底物无需乳化，用量少，有利于肉眼观察明显，成本低廉。不仅在学术上有很好的研究价值，在生产应用上也有广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种检测脂肪酶活性的方法。
背景技术
脂肪酶是一大类能催化水解、酯化、酯交换等多种化学反应的生物催化剂，它具有化学、立体和位点选择性，活性高而副反应少，不需要辅助因子等特点，被广泛应用于食品加工、生物医学、生物柴油、精细化工等诸多工业领域，相比于普通的化学催化剂，它具有高效、稳定、温和与清洁的特点，所以是一种具有巨大潜能的“绿色”催化剂，因而建立方便、快捷的检测脂肪酶活性方法显得十分重要。
目前，检测脂肪酶活性的方法有很多，如物化法（检测反应掉的底物量和生成产物量）和免疫学法等，有些需要依赖昂贵仪器，有些操作又比较复杂，需要专业人员的操作，同时，还存在着灵敏度不高的问题，比如像pH计自动滴定仪。荧光法测定脂肪酶活性的方法是选用特定的含有酯键的物质作为底物，该物质水解后生成具有荧光的产物，通过检测荧光的强弱来确定脂肪酶的活性，该方法灵敏度高，但底物较昂贵，同时还得依赖于大型仪器。还有一种方法是将罗丹明B作为显色剂，将罗丹明B水解后会产生橘黄色光圈，这种方法比较直观，但灵敏度欠缺，还有一定的特异性。为了解决灵敏度差的问题，研究人员想了各种方法。众所周知，电化学方法以其灵敏度高而著称，Valincius等人将9-（5’二茂铁戊酸）壬基二硫酯（FPONDS）自组装到金电极上，通过脂肪酶水解酯键，将电信号物质二茂铁释放到溶液中，这样就产生了电信号。现在Ines Ben Rejeb等人用酶联免疫和电极结合的方法来检测脂肪酶的活性，将甘油三酸酯用脂肪酶水解成脂肪酶和甘油，同时，甘油脱氢酶又将甘油中的氢给了NAD+形成NADH，而NADH氧化酶又将氧气氧化为过氧化氢，这样实际就是通过检测过氧化氢的量来间接检测甘油三酸酯的量。目前最经典的方法是用pNPP（对硝基苯酯），其操作简单，还有良好的光学特性，在通过脂肪酶水解后生成黄色的对硝基苯酚，但黄色相对于先前的无色透明的底物，其颜色变化还不是很明显，不利于肉眼直接观察，同时在配制溶液方面还很繁复。以上这些方法在不同的检测条件下各有其优势，但又有其局限性，比如说灵敏度不够或是太过依赖于仪器，不能实现实时检测等等，所以一种简便、灵敏、可视化检测脂肪酶活性的方法急需建立。
现有技术对本发明所述的检测脂肪酶活性的探究在近年来已越来越受到关注，但是利用纳米金可视化检测脂肪酶活性的方法还未有报道。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种方便可视化检测脂肪酶活性的方法。此方法用巯基乙酸甲酯修饰纳米金，当脂肪酶存在时，水解酯键生成巯基乙酸，而羧酸根之间存在强烈氢键作用，从而拉近了纳米金之间的距离，引起纳米金的聚集变蓝。此方法方便简单，颜色的变化明显，可利于肉眼直接识别脂肪酶的活性强弱。
本发明在解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种基于纳米金可视化检测脂肪酶活性的方法，包括以下步骤：
（1）制备纳米金溶液；
（2）用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；
（3）向步骤（2）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度；对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
本发明所述的方法，所述步骤（1）中柠檬酸钠还原法制备的纳米金溶液的浓度为1.8-2.5 nmol/L，纳米金的粒径为13±2 nm。优选纳米金溶液的浓度为2 nmol/L，纳米金的粒径为13 nm。
具体纳米金溶液的制备可以采用现有技术公开的制备方法，如中国申请201110052259.7所公开的，本发明对此不作特别限定。如可采用如下制备方法：
（1）称取HAuCl4.4H2O 溶于蒸馏水中，然后移取一定量的HAuCl4 溶液加入到烧瓶，剧烈搅拌，加热回流。（2）称取一定的二水合柠檬酸钠配成溶液，用容量瓶定容。（3）在沸腾状态下，用移液器移取一定体积的柠檬酸钠溶液，快速的加入到烧瓶中。（4）溶液由无色变为灰色再到酒红色，继续加热30 min，冷却至室温，即得。
其中，所述步骤（2）中，纳米金和巯基乙酸甲酯修饰的量摩尔比为1:40-1:60。优选纳米金和巯基乙酸甲酯的摩尔比为1:50。
其中，步骤（2）中所述功能性纳米金溶液的制备方法为：在纳米金溶液中加入巯基乙酸甲酯，使得最终溶液中纳米金与巯基乙酸甲酯的浓度分别为1.0-2.3 nM与10-110 nM，修饰时间为1-24 h，优选12h。
其中，所述步骤（3）中的缓冲溶液为pH3.4~pH7.0的浓度为0.01-0.1 M的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液。该缓冲液的具体用量为本领域技术人员所理解和掌握，具体以最终将纳米金溶液pH值调至4.0-4.5为准，优选4.4。
其中，所述步骤（3）中，待测脂肪酶溶液的加入量为0.25-2.5 mg/mL。
其中，所述步骤（3）中，反应温度为35-45℃，优选40℃。
更具体地，本发明所述基于纳米金可视化检测脂肪酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)采用柠檬酸钠还原氯金酸制得浓度为1.8-2.5 nmol/L的酒红色纳米金溶液，
(2) 用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；其中，纳米金和巯基乙酸甲酯修饰的量摩尔比为1:40-1:60；修饰时间为1-24h；
(3)向步骤（3）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至4.0-4.5；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至35-45℃，对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
最优选包括如下步骤：
（1）采用柠檬酸钠还原氯金酸制得浓度为1.8-2.5 nmol/L的酒红色纳米金溶液；
（2）用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；所述巯基乙酸甲酯的用量为1*10-6M，与纳米金的摩尔比为50:1，修饰时间为24 h，修饰温度为25 ℃。
（3）向步骤（2）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至4.4；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至40℃，对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
本发明操作简单，相对于传统的pH滴定方法，本发明的方便快速。底物水溶性较好，无需乳化等繁杂的前处理过程，在一定程度上降低了实验误差。在本发明中，底物与酶的用量非常少，对于一些昂贵的酶，这种方法费用较低，更加有利于大规模使用。此外本发明同时还实现了可视化检测，通过观察纳米金溶液由红变蓝的速度和程度，来可视化辨别脂肪酶的活性强弱。
附图说明
图1为纳米金体系加入脂肪酶和灭活脂肪酶的紫外吸收曲线。
图2为在脂肪酶水解下，各个pH环境下的吸光度之比。
图3为脂肪酶在纳米金体系中各个温度下的水解效率。
图4为脂肪酶在纳米金体系中不同时间下的水解效率。
图5为不同脂肪酶的用量对底物的水解效率。
具体实施方式
实施例1
（1）纳米金溶液的制备与表征
首先，准确称取HAuCl4.4H2O 0.0123 g溶于100 mL去离子水中，然后将其加入到250 mL固定好的三口烧瓶中。剧烈搅拌，加热回流。再准确称取柠檬酸钠0.2849 g于25 mL容量瓶中定容。水浴加热到50 ℃后用移液器准确移取一定体积的柠檬酸钠溶液于烧瓶中。溶液由无色变为浅蓝色再到紫色最后成为酒红色，继续加热10分钟后停止加热，继续搅拌10分钟后冷却到室温即制得所需13 ± 2.5 nm金胶。纳米金的直径最后利用投射电子显微镜（JEOL JEM-200CX, Japan）确定。
（2）用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；所述巯基乙酸甲酯的用量为1*10-6M，与纳米金的摩尔比为50:1，修饰时间为24 h，修饰温度为25 ℃。
（3）向步骤（2）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至4.4；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至40℃，对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
实施例2
本实施例所述的基于纳米金可视化检测脂肪酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)采用柠檬酸钠还原氯金酸制得浓度为2.5 nmol/L的酒红色纳米金溶液，
(2) 用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；其中，纳米金和巯基乙酸甲酯修饰的量摩尔比为1：60；修饰时间为24h；
(3)向步骤（3）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至4.5；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至35℃，对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
实施例3
本实施例所述的基于纳米金可视化检测脂肪酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)采用柠檬酸钠还原氯金酸制得浓度为1.8 nmol/L的酒红色纳米金溶液，
(2) 用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；其中，纳米金和巯基乙酸甲酯修饰的量摩尔比为1:40；修饰时间为1h；
(3)向步骤（3）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至4.0；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至45℃，对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
为了进一步找出最佳的实施方式，同时验证本发明所述技术方案的科学可行性，发明人进一步展开了如下专项试验。
试验例1 发明方案的可行性验证
将灭活的脂肪酶和活性脂肪酶放入修饰后的纳米金溶液，调节pH4.4，放置10 min，用紫外可见分光光度计扫描。试验结果见图1所示，图示结果表明活性脂肪酶能高效的催化底物的水解，生成巯基乙酸，产生氢键，拉近纳米金表面距离，从而使纳米金聚集变蓝。
pH的影响
将pH为3.4~7.0的一系列缓冲液加入到修饰后的纳米金溶液，再加入2 mg/mL的脂肪酶，放置10 min，用紫外可见分光光度计扫描，试验结果见图2，图示结果表明在pH 明显大于4.4时，羧酸根之间不能产生强烈的氢键作用，纳米金体系变色不明显，所以，本发明用pH4.0-4.5，优选 4.4。
温度的影响
将修饰后的纳米金溶液调节pH为4.4后放入水浴锅，调节温度，加入2 mg/mL脂肪酶，放置10 min后，用紫外可见分光光度计扫描，试验结果见图3，图示结果表明脂肪酶在低温和高温的活性没有完全表达，在40℃ 时，E650/E520达到最大值，表明在40℃时，脂肪酶活性最大。此外，在35-45℃的温度范围内，均能够实现本发明的技术方案。
时间的影响
在修饰后的纳米金溶液中调节pH 4.4，加入0.5 mg/mL脂肪酶，在不同的时间段分别检测其吸光度，试验结果见图4，结果为脂肪酶水解活性与时间的关系。试验结果表明：随着时间的增加，纳米金聚集程度增大，脂肪酶水解底物的程度也越高。
量的影响
修饰后的纳米金溶液调节温度为40℃、pH为4.4后，加入不同量的脂肪酶，放置10 min后，分别检测其吸光度，试验结果见图5，图示结果表明脂肪酶的量增加，水解效率也增大，最后底物水解完全，达到平衡。
采用上述技术方案，本发明实现了一种新的、简便的可视化检测脂肪酶活性的方法。通过对其最适条件等的研究，发现该发明快速、灵敏地的检测脂肪酶水解活性。本发明所涉及到的物质价格便宜，操作简单，这为大规模的工业化生产及应用检测奠定了十分重要的基础。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种检测脂肪酶活性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）柠檬酸钠还原法制备纳米金溶液，制备的纳米金溶液的浓度为1.8-2.5 nmol/L，纳米金的粒径为13±2 nm；
（2）用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液，纳米金和巯基乙酸甲酯修饰的量摩尔比为1:40-1：60；
（3）向步骤（2）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH调至4.0-4.5；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度；对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
2.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，纳米金和巯基乙酸甲酯的摩尔比为1:50。
3.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，步骤（2）中所述功能性纳米金溶液的制备方法为：在纳米金溶液中加入巯基乙酸甲酯，使得最终溶液中纳米金与巯基乙酸甲酯的浓度分别为1.0-2.3 nmol/L与10-110 nmol/L，修饰时间为1-24 h。
4.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的缓冲溶液为pH3.4~pH7.0的浓度为0.01-0.1 mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，待测脂肪酶溶液的加入量为0.25-2.5 mg/mL。
6.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，反应温度为35-45℃。
7.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）采用柠檬酸钠还原氯金酸制得浓度为1.8-2.5 nmol/L的酒红色纳米金溶液；
（2）用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；所述巯基乙酸甲酯的用量为1*10-6 mol/L，与纳米金的摩尔比为50:1，修饰时间为24 h，修饰温度为25 ℃；
（3）向步骤（2）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至4.4；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至40℃，对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
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