CN109374605A - 一种纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法。其利用了吐温60修饰纳米金，在米糠中的脂肪酶存在时，水解吐温60的羧酸酯键，从而削弱了吐温60的空间静电排斥力，从而拉近了纳米金之间的距离，使其聚集变蓝。它解决了目前传统的米糠中的脂肪酶活检测方法过程复杂、成本昂贵、检测速度慢、灵敏度低等问题。其发明步骤如下：使用吐温60修饰纳米金，构建了纳米金比色传感器，与不同活性的脂肪酶建立标准曲线，并应用于检测米糠中的脂肪酶活性。在650和520nm处的吸光度比值与米糠中的脂肪酶活性在0.02～1.8mg/mL范围内呈现良好的线性关系，检出限为2.56×10‑4mg/mL(S/N＝3)。此过程无需样品预处理、特异性强、灵敏度高，可实时检测米糠生产过程中脂肪酶活性。

Description

一种纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法
技术领域
本发明涉及一种纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法。
背景技术
我国米糠资源十分丰富，年产量约1000多万吨，是一种量大面广的可再生资源，是潜在的大宗油源和新型植物蛋白源，如何合理开发和利用米糠资源，变资源优势为经济优势，是我们亟待解决的课题。米糠富含多种内源酶，其中与米糠酸败变质有关的酶包括脂肪酶、脂肪氧化酶和过氧化物酶等，尤其脂肪酶对米糠货架期及品质的影响最为显著，在我国，虽然米糠已经受到一定的重视，但是由于其是副产物，加上其易酸败，稳定性差且难以收集，深度开发利用仍然处于理论阶段或者初级水平，大部分还被用作饲料，只有10％的米糠被用作制油或进一步提取植酸钙、肌醇、谷维素等价值较高的产品。米糠要进行深加工增值，首先要防止酸败的发生，而米糠稳定化是解决米糠酸败变质的关键。米糠的变质主要是米糠中含有在常温下易使米糠中脂肪水解为游离脂肪酸的脂肪酶。
目前，米糠中的脂肪酶活性检测普遍采用酸碱滴定法、浊度法及光度法，但这些方法多存在灵敏度不高、误差大、且费时费力、不适用于高通量检测等不足。荧光法虽然灵敏度较高，但大部分可被脂肪酶水解的荧光底物均受限于反应介质的酸度，另外荧光猝灭等因素还可能影响实验结果的精确性。对于动辄数以千计的定向进化库而言，要进行高通量酶检测，这些方法存在较大局限性。因此迫切需要建立高灵敏度、高选择性，更加简单、快速、准确的米糠中的脂肪酶检测方法。
鉴于上述原因，进一步研究开发灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简单、成本低的检测方法具有重要的理论意义和实际应用价值，纳米金因其独特的表面等离子体共振(SPR)效应成为构建生物传感器的优良材料，已被用于多种酶分析研究中，尤其是基于纳米金的比色检测方法由于其样品无需预处理、简单快速、灵敏度高、操作简便等优点而倍受关注，并在食品检测中广泛应用。将制备的纳米金比色传感器用于实时检测米糠中的脂肪酶活性的大小，对米糠生产具有重要的理论意义和实际应用价值。
发明内容
本发明是针对实际生产中，传统检测米糠中的脂肪酶活性的方法过程复杂，样品检测前需要预处理、耗时长且价格昂贵等问题，而提出的一种纳米金比色法检测米糠中的脂肪酶活性大小的方法，此方法用吐温60修饰纳米金，当米糠中的脂肪酶存在时，水解吐温60的羧酸酯键，削弱了吐温60的空间静电排斥力，从而拉近了纳米金之间的距离，使其聚集变蓝。通过以下步骤实现：步骤一：纳米金溶液的制备；步骤二：吐温60-纳米金比色传感器的合成；步骤三：纳米金比色传感器测定条件的优化；步骤四：建立不同活性米糠中的脂肪酶的标准曲线；步骤五:米糠中的脂肪酶活性的实时检测。
本发明的有益点是：本发明利用纳米金比色法检测米糠中的脂肪酶活性，解决了目前传统的检测方法检测费用高、速度慢等不足，同时可以有效地改善我国目前米糠中的脂肪酶活性检测速度慢、灵敏度不高、费用昂贵等问题。此过程使用方便、加工简易、成本低廉、响应速度快、自动化操作、灵敏度高、特异性强，可以为生产过程中米糠中的脂肪酶活性的实时监测提供技术支持。
具体实施方式
具体实施方式一：一种纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法，通过以下步骤实现：
步骤一：纳米金溶液的制备：将300μL HAu Cl4(0.1mol/L)溶液加入含有 100m L超纯水的三口烧瓶中，剧烈搅拌且加热至沸腾，2min后加入4m L一定浓度现配的柠檬酸钠溶液，继续反应一定时间后停止加热，溶液颜色由黄色逐渐变为透明酒红色自然冷却到室温，制得的纳米金溶液在4℃保存备用；
步骤二：吐温60-纳米金比色传感器的合成：移取适量一定浓度的纳米金溶液和一定浓度的吐温60溶液按照一定的摩尔比进行混合，在室温下，轻微振荡 2h，使吐温60在溶液中分散均匀，再静置10h，即得吐温60修饰的纳米金复合物；
步骤三：纳米金比色传感器测定条件的优化：在0.2mol/LpH 7.5的PBS缓冲液，将标准活性的诺维信435脂肪酶加入到制备的吐温60-纳米金复合溶液中，在一定温度条件下，反应一段时间，根据吸光度比值A650/A520实时检测脂肪酶活性大小，得到检测的最优条件；
步骤四：建立不同活性脂肪酶的标准曲线：在得到检测的最优条件下，将不同活性的脂肪酶溶液加入到制备的吐温60-纳米金复合溶液中，在一定的反应条件下反应后，以吸光度比值A650/A520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶活的标准曲线；
步骤五：米糠中的脂肪酶活性的实时检测：将100g新鲜米糠，经过碾米机碾磨30min后，得到分散均匀的米糠粉末，将得到的米糠粉末放置在空气中自然干燥，将放置在空气中的米糠粉末，每次间隔一定时间，称取适量的米糠样品，加入到含有吐温60修饰的纳米金复合物中反应一定时间，根据A650/A520 比值实时检测米糠中的脂肪酶活性，得到检测的最优条件。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤一将38 mmol/L现配的柠檬酸钠溶液，继续反应10min后停止加热，溶液颜色由黄色逐渐变为透明酒红色自然冷却到室温，其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤二将2.3nmol/L的纳米金溶液和1.0μmol/L的吐温60溶液按照1:50的摩尔比进行混合，其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三将标准活性的诺维信435脂肪酶加入到制备的吐温60-纳米金复合溶液中，在反应温度50℃，反应10min，根据吸光度比值A650/A520实时检测脂肪酶活性，其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四将不同活性的脂肪酶溶液加入到制备的吐温60-纳米金复合溶液中，在温度为50℃的条件下反应10min后，再测定其吸光度比值，其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤五将放置在空气中的米糠粉末，每次间隔2h，称取5mg米糠样品，加入到含有吐温 60修饰的纳米金复合物中反应10min，其它步骤与具体实施方式一相同。

Claims (6)

1.一种纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法，其特征在于用吐温60-纳米金比色传感器检测米糠中脂肪酶活性的方法通过以下步骤实现：
步骤一：纳米金溶液的制备：将300μL HAuCl4(0.1mol/L)溶液加入含有100mL超纯水的三口烧瓶中，剧烈搅拌且加热至沸腾，2min后加入4mL一定浓度现配的柠檬酸钠溶液，继续反应一定时间后停止加热，溶液颜色由黄色逐渐变为透明酒红色自然冷却到室温，制得的纳米金溶液在4℃保存备用；
步骤二：吐温60-纳米金比色传感器的合成：移取适量一定浓度的纳米金溶液和一定浓度的吐温60溶液按照一定的摩尔比进行混合，在室温下，轻微振荡2h，使吐温60在溶液中分散均匀，再静置10h，即得吐温60修饰的纳米金复合物；
步骤三：纳米金比色传感器测定条件的优化：在0.2mol/LpH 7.5的PBS缓冲液，将标准活性的诺维信435脂肪酶加入到制备的吐温60-纳米金复合溶液中，在一定温度条件下，反应一段时间，根据A650/A520比值实时检测脂肪酶活性大小，得到检测的最优条件；
步骤四：建立不同活性脂肪酶的标准曲线：在得到检测的最优条件下，将不同活性的脂肪酶溶液加入到制备的吐温60-纳米金复合溶液中，在一定的反应条件下反应后，以吸光度比值A650/A520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶活的标准曲线；
步骤五：米糠样品的实时检测：将100g新鲜米糠，经过碾米机碾磨30min后，得到分散均匀的米糠粉末，将得到的米糠粉末放置在空气中自然干燥，将放置在空气中的米糠粉末，每次间隔一定时间，称取适量的米糠样品，加入到含有吐温60修饰的纳米金复合物中反应一定时间，根据A650/A520比值实时检测米糠中脂肪酶活性，得到检测的最优条件。
2.根据权利要求1所述的纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法，其特征在于步骤一将38mmol/L现配的柠檬酸钠溶液，继续反应10min后停止加热，溶液颜色由黄色逐渐变为透明酒红色自然冷却到室温。
3.根据权利要求1所述的纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法，其特征在于步骤二将2.3nmol/L的纳米金溶液和1.0μmol/L的吐温60溶液按照1:50的摩尔比进行混合。
4.根据权利要求1所述的纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法，其特征在于步骤三将米糠中的脂肪酶加入到制备的吐温60-纳米金复合溶液中，在反应温度50℃，反应10min，根据A650/A520比值实时检测米糠中的脂肪酶活性。
5.根据权利要求1所述的纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法，其特征在于步骤四将不同活性的脂肪酶溶液加入到制备的吐温60-纳米金复合溶液中，在温度为50℃的条件下反应10min后，再测定其吸光度比值。
6.根据权利要求1所述的纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法，其特征在于步骤五将放置在空气中的米糠粉末，每次间隔2h，称取5mg米糠样品，加入到含有吐温60修饰的纳米金复合物中反应10min。
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