CN103063597A - 一种检测脂肪酶活性的方法 - Google Patents
一种检测脂肪酶活性的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103063597A CN103063597A CN2013100073864A CN201310007386A CN103063597A CN 103063597 A CN103063597 A CN 103063597A CN 2013100073864 A CN2013100073864 A CN 2013100073864A CN 201310007386 A CN201310007386 A CN 201310007386A CN 103063597 A CN103063597 A CN 103063597A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- lipase
- nano
- gold
- methyl thioglycolate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 title claims abstract description 11
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims abstract description 66
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims abstract description 66
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims abstract description 66
- MKIJJIMOAABWGF-UHFFFAOYSA-N methyl 2-sulfanylacetate Chemical compound COC(=O)CS MKIJJIMOAABWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 80
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 76
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 43
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 24
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 22
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 11
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 11
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000001164 aluminium sulphate Substances 0.000 claims description 9
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 claims description 9
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 claims description 8
- FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M gold monochloride Chemical compound [Cl-].[Au+] FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 abstract 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 17
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical group OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004237 Crocus Nutrition 0.000 description 1
- 241000596148 Crocus Species 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012988 Dithioester Substances 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001062009 Indigofera Species 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008236 heating water Substances 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000009740 moulding (composite fabrication) Methods 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- -1 p-nitrophenyl ester Chemical class 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 229940005605 valeric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种检测脂肪酶活性的方法，其利用了巯基乙酸甲酯修饰纳米金，在脂肪酶存在下，水解成巯基乙酸，从而暴露出羧酸根，而羧酸根之间存在强烈的氢键作用，从而拉近了纳米金之间的距离，使纳米金聚集变蓝。一方面可以从颜色上肉眼直接识别脂肪酶活性的强弱，另一方面，通过紫外可见分光光度计灵敏地检测脂肪酶的活性。本发明从时间、温度、量等方面对脂肪酶的活性做了检测，实验现象明显。本发明操作简单，底物无需乳化，用量少，有利于肉眼观察明显，成本低廉。不仅在学术上有很好的研究价值，在生产应用上也有广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种检测脂肪酶活性的方法。
背景技术
脂肪酶是一大类能催化水解、酯化、酯交换等多种化学反应的生物催化剂，它具有化学、立体和位点选择性，活性高而副反应少，不需要辅助因子等特点，被广泛应用于食品加工、生物医学、生物柴油、精细化工等诸多工业领域，相比于普通的化学催化剂，它具有高效、稳定、温和与清洁的特点，所以是一种具有巨大潜能的“绿色”催化剂，因而建立方便、快捷的检测脂肪酶活性方法显得十分重要。
目前，检测脂肪酶活性的方法有很多，如物化法（检测反应掉的底物量和生成产物量）和免疫学法等，有些需要依赖昂贵仪器，有些操作又比较复杂，需要专业人员的操作，同时，还存在着灵敏度不高的问题，比如像pH计自动滴定仪。荧光法测定脂肪酶活性的方法是选用特定的含有酯键的物质作为底物，该物质水解后生成具有荧光的产物，通过检测荧光的强弱来确定脂肪酶的活性，该方法灵敏度高，但底物较昂贵，同时还得依赖于大型仪器。还有一种方法是将罗丹明B作为显色剂，将罗丹明B水解后会产生橘黄色光圈，这种方法比较直观，但灵敏度欠缺，还有一定的特异性。为了解决灵敏度差的问题，研究人员想了各种方法。众所周知，电化学方法以其灵敏度高而著称，Valincius等人将9-（5’二茂铁戊酸）壬基二硫酯（FPONDS）自组装到金电极上，通过脂肪酶水解酯键，将电信号物质二茂铁释放到溶液中，这样就产生了电信号。现在Ines Ben Rejeb等人用酶联免疫和电极结合的方法来检测脂肪酶的活性，将甘油三酸酯用脂肪酶水解成脂肪酶和甘油，同时，甘油脱氢酶又将甘油中的氢给了NAD+形成NADH，而NADH氧化酶又将氧气氧化为过氧化氢，这样实际就是通过检测过氧化氢的量来间接检测甘油三酸酯的量。目前最经典的方法是用pNPP（对硝基苯酯），其操作简单，还有良好的光学特性，在通过脂肪酶水解后生成黄色的对硝基苯酚，但黄色相对于先前的无色透明的底物，其颜色变化还不是很明显，不利于肉眼直接观察，同时在配制溶液方面还很繁复。以上这些方法在不同的检测条件下各有其优势，但又有其局限性，比如说灵敏度不够或是太过依赖于仪器，不能实现实时检测等等，所以一种简便、灵敏、可视化检测脂肪酶活性的方法急需建立。
现有技术对本发明所述的检测脂肪酶活性的探究在近年来已越来越受到关注，但是利用纳米金可视化检测脂肪酶活性的方法还未有报道。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种方便可视化检测脂肪酶活性的方法。此方法用巯基乙酸甲酯修饰纳米金，当脂肪酶存在时，水解酯键生成巯基乙酸，而羧酸根之间存在强烈氢键作用，从而拉近了纳米金之间的距离，引起纳米金的聚集变蓝。此方法方便简单，颜色的变化明显，可利于肉眼直接识别脂肪酶的活性强弱。
本发明在解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种基于纳米金可视化检测脂肪酶活性的方法，包括以下步骤：
（1）制备纳米金溶液；
（2）用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；
（3）向步骤（2）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度；对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
本发明所述的方法，所述步骤（1）中柠檬酸钠还原法制备的纳米金溶液的浓度为1.8-2.5 nmol/L，纳米金的粒径为13±2 nm。优选纳米金溶液的浓度为2 nmol/L，纳米金的粒径为13 nm。
具体纳米金溶液的制备可以采用现有技术公开的制备方法，如中国申请201110052259.7所公开的，本发明对此不作特别限定。如可采用如下制备方法：
（1）称取HAuCl4.4H2O 溶于蒸馏水中，然后移取一定量的HAuCl4 溶液加入到烧瓶，剧烈搅拌，加热回流。（2）称取一定的二水合柠檬酸钠配成溶液，用容量瓶定容。（3）在沸腾状态下，用移液器移取一定体积的柠檬酸钠溶液，快速的加入到烧瓶中。（4）溶液由无色变为灰色再到酒红色，继续加热30 min，冷却至室温，即得。
其中，所述步骤（2）中，纳米金和巯基乙酸甲酯修饰的量摩尔比为1:40-1:60。优选纳米金和巯基乙酸甲酯的摩尔比为1:50。
其中，步骤（2）中所述功能性纳米金溶液的制备方法为：在纳米金溶液中加入巯基乙酸甲酯，使得最终溶液中纳米金与巯基乙酸甲酯的浓度分别为1.0-2.3 nM与10-110 nM，修饰时间为1-24 h，优选12h。
其中，所述步骤（3）中的缓冲溶液为pH3.4~pH7.0的浓度为0.01-0.1 M的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液。该缓冲液的具体用量为本领域技术人员所理解和掌握，具体以最终将纳米金溶液pH值调至4.0-4.5为准，优选4.4。
其中，所述步骤（3）中，待测脂肪酶溶液的加入量为0.25-2.5 mg/mL。
其中，所述步骤（3）中，反应温度为35-45℃，优选40℃。
更具体地，本发明所述基于纳米金可视化检测脂肪酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)采用柠檬酸钠还原氯金酸制得浓度为1.8-2.5 nmol/L的酒红色纳米金溶液，
(2) 用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；其中，纳米金和巯基乙酸甲酯修饰的量摩尔比为1:40-1:60；修饰时间为1-24h；
(3)向步骤（3）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至4.0-4.5；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至35-45℃，对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
最优选包括如下步骤：
（1）采用柠檬酸钠还原氯金酸制得浓度为1.8-2.5 nmol/L的酒红色纳米金溶液；
（2）用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；所述巯基乙酸甲酯的用量为1*10-6M，与纳米金的摩尔比为50:1，修饰时间为24 h，修饰温度为25 ℃。
（3）向步骤（2）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至4.4；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至40℃，对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
本发明操作简单，相对于传统的pH滴定方法，本发明的方便快速。底物水溶性较好，无需乳化等繁杂的前处理过程，在一定程度上降低了实验误差。在本发明中，底物与酶的用量非常少，对于一些昂贵的酶，这种方法费用较低，更加有利于大规模使用。此外本发明同时还实现了可视化检测，通过观察纳米金溶液由红变蓝的速度和程度，来可视化辨别脂肪酶的活性强弱。
附图说明
图1为纳米金体系加入脂肪酶和灭活脂肪酶的紫外吸收曲线。
图2为在脂肪酶水解下，各个pH环境下的吸光度之比。
图3为脂肪酶在纳米金体系中各个温度下的水解效率。
图4为脂肪酶在纳米金体系中不同时间下的水解效率。
图5为不同脂肪酶的用量对底物的水解效率。
具体实施方式
实施例1
（1）纳米金溶液的制备与表征
首先，准确称取HAuCl4.4H2O 0.0123 g溶于100 mL去离子水中，然后将其加入到250 mL固定好的三口烧瓶中。剧烈搅拌，加热回流。再准确称取柠檬酸钠0.2849 g于25 mL容量瓶中定容。水浴加热到50 ℃后用移液器准确移取一定体积的柠檬酸钠溶液于烧瓶中。溶液由无色变为浅蓝色再到紫色最后成为酒红色，继续加热10分钟后停止加热，继续搅拌10分钟后冷却到室温即制得所需13 ± 2.5 nm金胶。纳米金的直径最后利用投射电子显微镜（JEOL JEM-200CX, Japan）确定。
（2）用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；所述巯基乙酸甲酯的用量为1*10-6M，与纳米金的摩尔比为50:1，修饰时间为24 h，修饰温度为25 ℃。
（3）向步骤（2）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至4.4；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至40℃，对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
实施例2
本实施例所述的基于纳米金可视化检测脂肪酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)采用柠檬酸钠还原氯金酸制得浓度为2.5 nmol/L的酒红色纳米金溶液，
(2) 用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；其中，纳米金和巯基乙酸甲酯修饰的量摩尔比为1：60；修饰时间为24h；
(3)向步骤（3）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至4.5；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至35℃，对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
实施例3
本实施例所述的基于纳米金可视化检测脂肪酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)采用柠檬酸钠还原氯金酸制得浓度为1.8 nmol/L的酒红色纳米金溶液，
(2) 用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；其中，纳米金和巯基乙酸甲酯修饰的量摩尔比为1:40；修饰时间为1h；
(3)向步骤（3）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至4.0；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至45℃，对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
为了进一步找出最佳的实施方式，同时验证本发明所述技术方案的科学可行性，发明人进一步展开了如下专项试验。
试验例1 发明方案的可行性验证
将灭活的脂肪酶和活性脂肪酶放入修饰后的纳米金溶液，调节pH4.4，放置10 min，用紫外可见分光光度计扫描。试验结果见图1所示，图示结果表明活性脂肪酶能高效的催化底物的水解，生成巯基乙酸，产生氢键，拉近纳米金表面距离，从而使纳米金聚集变蓝。
pH的影响
将pH为3.4~7.0的一系列缓冲液加入到修饰后的纳米金溶液，再加入2 mg/mL的脂肪酶，放置10 min，用紫外可见分光光度计扫描，试验结果见图2，图示结果表明在pH 明显大于4.4时，羧酸根之间不能产生强烈的氢键作用，纳米金体系变色不明显，所以，本发明用pH4.0-4.5，优选 4.4。
温度的影响
将修饰后的纳米金溶液调节pH为4.4后放入水浴锅，调节温度，加入2 mg/mL脂肪酶，放置10 min后，用紫外可见分光光度计扫描，试验结果见图3，图示结果表明脂肪酶在低温和高温的活性没有完全表达，在40℃ 时，E650/E520达到最大值，表明在40℃时，脂肪酶活性最大。此外，在35-45℃的温度范围内，均能够实现本发明的技术方案。
时间的影响
在修饰后的纳米金溶液中调节pH 4.4，加入0.5 mg/mL脂肪酶，在不同的时间段分别检测其吸光度，试验结果见图4，结果为脂肪酶水解活性与时间的关系。试验结果表明：随着时间的增加，纳米金聚集程度增大，脂肪酶水解底物的程度也越高。
量的影响
修饰后的纳米金溶液调节温度为40℃、pH为4.4后，加入不同量的脂肪酶，放置10 min后，分别检测其吸光度，试验结果见图5，图示结果表明脂肪酶的量增加，水解效率也增大，最后底物水解完全，达到平衡。
采用上述技术方案，本发明实现了一种新的、简便的可视化检测脂肪酶活性的方法。通过对其最适条件等的研究，发现该发明快速、灵敏地的检测脂肪酶水解活性。本发明所涉及到的物质价格便宜，操作简单，这为大规模的工业化生产及应用检测奠定了十分重要的基础。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种检测脂肪酶活性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）制备纳米金溶液；
（2）用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；
（3）向步骤（2）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度；对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
2.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，所述步骤（1）中柠檬酸钠还原法制备的纳米金溶液的浓度为1.0-2.3 nmol/L，纳米金的粒径为13±2 nm。
3.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，纳米金和巯基乙酸甲酯修饰的量摩尔比为1:40-1：60。
4.根据权利要求3所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，所述的：所述步骤（2）中，纳米金和巯基乙酸甲酯的摩尔比为1:50。
5.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，步骤（2）中所述功能性纳米金溶液的制备方法为：在纳米金溶液中加入巯基乙酸甲酯，使得最终溶液中纳米金与巯基乙酸甲酯的浓度分别为1.0-2.3 nM与10-110 nM，修饰时间为1-24 h，优选12h。
6.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的缓冲溶液为pH3.4~pH7.0的浓度为0.01-0.1 M的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液。
7.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，步骤（3）中，将pH调至4.0-4.5，优选4.4。
8.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，待测脂肪酶溶液的加入量为0.25-2.5 mg/mL。
9.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，反应温度为35-45℃。
10.根据权利要求1所述的检测脂肪酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）采用柠檬酸钠还原氯金酸制得浓度为1.8-2.5 nmol/L的酒红色纳米金溶液；
（2）用巯基乙酸甲酯修饰步骤（1）所得的纳米金溶液，得到功能性纳米金溶液；所述巯基乙酸甲酯的用量为1*10-6M，与纳米金的摩尔比为50:1，修饰时间为24 h，修饰温度为25 ℃；
（3）向步骤（2）中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至4.4；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至40℃，对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E650/E520作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310007386.4A CN103063597B (zh) | 2013-01-09 | 2013-01-09 | 一种检测脂肪酶活性的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310007386.4A CN103063597B (zh) | 2013-01-09 | 2013-01-09 | 一种检测脂肪酶活性的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103063597A true CN103063597A (zh) | 2013-04-24 |
| CN103063597B CN103063597B (zh) | 2014-12-31 |
Family
ID=48106310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310007386.4A Active CN103063597B (zh) | 2013-01-09 | 2013-01-09 | 一种检测脂肪酶活性的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103063597B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104597044A (zh) * | 2014-07-24 | 2015-05-06 | 南京工业大学 | 一种原位合成的纳米金比色法检测脂肪酶酶活 |
| CN109374605A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-02-22 | 东北农业大学 | 一种纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法 |
| CN109724953A (zh) * | 2018-11-22 | 2019-05-07 | 佛山科学技术学院 | 一种荧光检测脂肪酶活性的方法 |
| CN113008853A (zh) * | 2021-02-25 | 2021-06-22 | 中国工程物理研究院化工材料研究所 | 基于荧光含能分子对炸药的原位标记与视觉示踪的方法 |
| CN113324933A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-08-31 | 浙江大学 | 一种检测血管紧张素转换酶的方法及其应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1967212A (zh) * | 2006-11-03 | 2007-05-23 | 中国科学院等离子体物理研究所 | 作物种子的脂肪酶活性精确定量检测方法 |
| WO2010115825A2 (en) * | 2009-03-31 | 2010-10-14 | Robert Zimmermann | Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor |
| CN102279166A (zh) * | 2011-07-06 | 2011-12-14 | 长沙理工大学 | 一种利用近红外快速测定米糠脂肪酶活性的方法 |
| CN102608187A (zh) * | 2012-03-30 | 2012-07-25 | 山东理工大学 | 空壳纳米金修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法 |
| CN102661927A (zh) * | 2012-04-19 | 2012-09-12 | 湖南大学 | 基于表面活性剂修饰连接鞘糖脂的复合纳米材料定量检测病毒及酶的生物传感方法 |
| CN102788776A (zh) * | 2012-08-09 | 2012-11-21 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种羧酸酯酶的活性和羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法 |
| CN102798628A (zh) * | 2012-08-03 | 2012-11-28 | 湖南大学 | 检测纤维二糖酶活性的纳米金探针及其制备方法 |
-
2013
- 2013-01-09 CN CN201310007386.4A patent/CN103063597B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1967212A (zh) * | 2006-11-03 | 2007-05-23 | 中国科学院等离子体物理研究所 | 作物种子的脂肪酶活性精确定量检测方法 |
| WO2010115825A2 (en) * | 2009-03-31 | 2010-10-14 | Robert Zimmermann | Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor |
| CN102279166A (zh) * | 2011-07-06 | 2011-12-14 | 长沙理工大学 | 一种利用近红外快速测定米糠脂肪酶活性的方法 |
| CN102608187A (zh) * | 2012-03-30 | 2012-07-25 | 山东理工大学 | 空壳纳米金修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法 |
| CN102661927A (zh) * | 2012-04-19 | 2012-09-12 | 湖南大学 | 基于表面活性剂修饰连接鞘糖脂的复合纳米材料定量检测病毒及酶的生物传感方法 |
| CN102798628A (zh) * | 2012-08-03 | 2012-11-28 | 湖南大学 | 检测纤维二糖酶活性的纳米金探针及其制备方法 |
| CN102788776A (zh) * | 2012-08-09 | 2012-11-21 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种羧酸酯酶的活性和羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| FARIHA HASAN ET AL.: "Methods for detection and characterization of lipases: A comprehensive review", 《BIOTECHNOLOGY ADVANCE》, vol. 27, 17 June 2009 (2009-06-17) * |
| XIAHONG XU ET AL.: "Label-Free Fluorescent Detection of Protein Kinase Activity Based on the Aggregation Behavior of Unmodified Quantum Dots", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》, vol. 83, no. 1, 1 January 2011 (2011-01-01) * |
| 司刚 等: "巯基乙酸酯官能团修饰的铁氢化酶模拟化合物的合成及表征", 《影像科学与光化学》, vol. 26, no. 5, 30 September 2008 (2008-09-30), pages 314 - 2 * |
| 平功享: "《高中化学教材基础知识全解》", 31 May 2008, article "第1版", pages: 401 * |
| 张海燕 等: "脂肪酶酶活性的最新研究", 《生物学通报》, vol. 42, no. 3, 31 March 2007 (2007-03-31) * |
| 张瑛 等: "一种新的水稻种子碱性脂肪酶活性快速检测方法及应用", 《中国农业科技导报》, vol. 11, no. 2, 31 December 2009 (2009-12-31) * |
| 牛真真 等: "基于对氨基苯甲酸/硫堇/纳米金共价修饰玻碳电极的葡萄糖生物传感器", 《化学学报》, vol. 69, no. 12, 31 December 2011 (2011-12-31), pages 1458 - 2 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104597044A (zh) * | 2014-07-24 | 2015-05-06 | 南京工业大学 | 一种原位合成的纳米金比色法检测脂肪酶酶活 |
| CN104597044B (zh) * | 2014-07-24 | 2019-02-12 | 南京工业大学 | 一种原位合成的纳米金比色法检测脂肪酶酶活 |
| CN109374605A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-02-22 | 东北农业大学 | 一种纳米金比色法检测米糠中脂肪酶活性的方法 |
| CN109724953A (zh) * | 2018-11-22 | 2019-05-07 | 佛山科学技术学院 | 一种荧光检测脂肪酶活性的方法 |
| CN113008853A (zh) * | 2021-02-25 | 2021-06-22 | 中国工程物理研究院化工材料研究所 | 基于荧光含能分子对炸药的原位标记与视觉示踪的方法 |
| CN113324933A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-08-31 | 浙江大学 | 一种检测血管紧张素转换酶的方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103063597B (zh) | 2014-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103063597B (zh) | 一种检测脂肪酶活性的方法 | |
| Wang et al. | Quenching effect of exciton energy transfer from CdS: Mn to Au nanoparticles: a highly efficient photoelectrochemical strategy for microRNA-21 detection | |
| Ma et al. | Protein binding bends the gold nanoparticle capped DNA sequence: toward novel energy-transfer-based photoelectrochemical protein detection | |
| CN104308182B (zh) | 一种具有fret效应的金纳米粒子二聚体的组装方法 | |
| Han et al. | MicroRNA detection based on duplex-specific nuclease-assisted target recycling and gold nanoparticle/graphene oxide nanocomposite-mediated electrocatalytic amplification | |
| CN109959691A (zh) | 一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法 | |
| CN107034205B (zh) | 一种利用表面活性剂制备高酯化活性脂肪酶的方法 | |
| Zhou et al. | An electrochemical biosensor integrating immunoassay and enzyme activity analysis for accurate detection of active human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 | |
| CN107045010A (zh) | 基于二硫化锡‑介孔氮化碳的光电化学传感器的制备方法 | |
| CN102507921A (zh) | 一种检测微囊藻毒素的方法 | |
| CN105352919A (zh) | 双色荧光含金碳点的制备及该碳点在可视化检测的应用 | |
| Du et al. | ZnIn2S4 QDs@ TiO2 nanosphere-BiOI double heterojunction combined with unique tripod DNA walker amplification for photoelectrochemical biosensing of microRNA-21 | |
| Pang et al. | CdSe quantum dot-functionalized TiO2 nanohybrids as a visible light induced photoelectrochemical platform for the detection of proprotein convertase subtilisin/kexin type 6 | |
| CN104897846A (zh) | 一种基于原位形成光活性纳米材料模拟酶的碱性磷酸酯酶活性检测方法 | |
| CN107202828A (zh) | 一种基于硼掺杂铁钴氧化物二维纳米复合材料的雌二醇光电化学传感器及其制备与应用 | |
| CN107383384A (zh) | 锌卟啉金属‑有机骨架纳米圆盘的制备方法及应用 | |
| CN108410455A (zh) | 一种同时合成亲、疏水碳点的方法及其在检测Au3+和制备白光发光二极管中的应用 | |
| Li et al. | A boronic acid carbon nanodots/poly (thionine) sensing platform for the accurate and reliable detection of NADH | |
| CN110687172A (zh) | 一种电化学发光生物传感器、制备方法及其在碱基切除修复酶检测中的应用 | |
| Wen et al. | A novel nonenzymatic cascade amplification for ultrasensitive photoelectrochemical DNA sensing based on target driven to initiate cyclic assembly of hairpins | |
| CN106434852A (zh) | 一种基于手性自组装纳米传感器实现胞内端粒酶活性检测的方法 | |
| CN108918620B (zh) | 基于磷化钴纳米线对单双链dna吸附差异性的光电化学dna检测方法 | |
| CN105259231A (zh) | 用于土霉素检测的电化学适体电极及其制备方法 | |
| CN104076072A (zh) | 氧化铱-铁卟啉-氧化钛的高灵敏度光电化学传感器及其制备方法 | |
| Liu et al. | An amplified fluorescence biosensor for intracellular telomerase determination and in situ imaging based on thioflavin T and conjugated polymer nanoparticles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |