CN110687172A - 一种电化学发光生物传感器、制备方法及其在碱基切除修复酶检测中的应用 - Google Patents

一种电化学发光生物传感器、制备方法及其在碱基切除修复酶检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种电化学发光生物传感器、制备方法及其在碱基切除修复酶检测中的应用。所述电化学发光生物传感器包括β‑CD/GO/GCE电极和FeMOF/AuNPs@luminol‑Hairpin探针；其中，所述电极由氧化石墨烯和环糊精修饰至玻碳电极上制得；所述探针包括：FeMOF，以及修饰在FeMOF上的AuNPs@luminol，AuNPs@luminol上还修饰有发夹结构探针，所述发夹结构探针的茎区设计待测碱基切除修复酶的目标碱基。本发明电化学发光生物传感器可三倍信号放大检测碱基切除修复酶，因此具有极高的灵敏度，可用于碱基切除修复酶抑制剂/激活剂的筛选、生物样品分析等生物医学研究领域。

Description

一种电化学发光生物传感器、制备方法及其在碱基切除修复 酶检测中的应用
技术领域
本发明属于电化学发光检测技术领域，具体涉及一种电化学发光生物传感器、制备方法及其在碱基切除修复酶检测中的应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
金属有机骨架(MOFs)由金属离子或由有机连接基团连接的簇组成，具有优越的物理和化学性质。MOFs具有孔体积大、表面积大、拓扑结构多、孔径可调、表面化学性质好等特点，在吸附分离、传感、催化、药物传递和成像等方面具有广阔的应用前景。普鲁士蓝被认为是一种金属-有机配位网络(MOCN)材料，其中铁离子由CN基团(-(Fe-CN-Fe)-)连接，它可以为传感和生物医学应用的功能界面提供方便的组装和精确的相互作用活性位点。MOF可以作为合成普鲁士蓝的标签。此外，普鲁士蓝因其较高的电化学/电催化性能和较低的氧化还原电位，常被用作电化学传感器的高效介质和纳米酶。
电致化学发光(ECL)是由受激物的能量弛豫引起的电化学激发的光辐射过程。ECL结合了发光和电化学技术的优点，正成为一种越来越受欢迎的生物传感技术，用于检测金属离子和小分子，ECL免疫分析，ECL基因传感器和ECL细胞传感器。ECL不仅继承了化学发光的灵敏度高、动态范围广的特点，而且还具有电化学方法简单、稳定、方便等优点。在ECL研究中被广泛应用发光体主要有三种包括钌(II)配合物、鲁米诺(Luminol)和量子点(QDs)。其中鲁米诺具有良好的化学稳定性和较低的氧化电位。此外，多种策略如使用辣根过氧化物酶(HRP)和DNA酶来增强鲁米诺ECL信号。然而，过氧化物酶的制备、纯化和储存成本高，在苛刻条件下易变性，在某些复杂介质(如废水)中催化活性受到抑制。而普鲁士蓝作为一种模拟过氧化物酶，可以通过溶解氧催化鲁米诺的氧化，产生增强的化学发光信号。
由于识别基序的特异性和生物正交性，主客体分子间的超分子非共价相互作用在催化、电化学发光、电化学传感器等领域有着广泛的应用。环糊精是一种特殊的低聚糖，有6、7、8个葡萄糖单位。独特的笼状结构使CDs及其衍生物对客体分子具有良好的识别和封装能力，可作为生物传感器中的宿主分子。二茂铁(Fc)是一个氧化还原分子可用来与β-CD形成复合物提高溶解度，电稳定性和生物利用度。此外，电化学氧化的Fc(Fc+)可以催化H2O2的沉积生成OH·，从而在luminol-H2O2体系中产生增强的ECL信号，同时Fc(Fc+)在不同的温度和pH值下表现出明显的稳定性优势。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供一种基于主客体识别技术的电化学发光生物传感器，其可用于三倍信号放大检测碱基切除修复酶，因此具有极高的灵敏度，在碱基切除修复酶抑制剂/激活剂的筛选、生物样品分析等生物医学研究领域具有广泛的应用价值。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种检测碱基切除修复酶的电化学发光生物传感器，所述电化学发光生物传感器包括β-CD/GO/GCE电极，所述β-CD/GO/GCE电极由氧化石墨烯(GO)和环糊精(β-CD)修饰至玻碳电极(GCE)上制得。
进一步的，所述电化学发光生物传感器还包括FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针，所述FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针包括：
铁基金属有机骨架(FeMOF)纳米粒子，以及修饰在FeMOF上的AuNPs@luminol，所述AuNPs@luminol上还修饰有发夹结构探针，所述发夹结构探针中的茎区设计有待测碱基切除修复酶的目标碱基，所述目标碱基个数可根据实际情况进行设置，如1个，2个，4个，6个等。
其中，所述碱基切除修复酶为DNA糖基化酶，包括但不限于烷基腺嘌呤DNA糖化酶(AAG)、甲酰胺嘧啶DNA糖化酶(FPG)、尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)、胸腺嘧啶-DNA糖化酶(TDG)等。
进一步的，所述电化学发光生物传感器还包括K4Fe(CN)6和HCl。
本发明的第二个方面，提供上述检测碱基切除修复酶的电化学发光生物传感器的制备方法，所述制备方法包括：
(1)β-CD/GO/GCE电极的制备：将GO溶液滴加至GCE表面上以获得GO/GCE；干燥后将β-CD溶液溶液滴加至GO/GCE上即获得β-CD/GO/GCE电极；
(2)FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针的制备：将FeMOF与AuNPs@luminol混合获得FeMOF/AuNPs@luminol，然后将FeMOF/AuNPs@luminol与发夹结构探针溶液混合孵育，离心后即得。
本发明的第三个方面，提供上述电化学发光生物传感器在检测碱基切除修复酶中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种基于上述电化学发光生物传感器检测碱基切除修复酶的方法，所述方法包括：将FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针添加至待测样品中得混合溶液，然后将β-CD/GO/GCE电极加入上述混合溶液中进行孵育处理，然后将电极转移至含有K4Fe(CN)6和HCl的溶液中进行二次孵育处理后，进行电化学发光检测。
本发明的第五个方面，提供上述电化学发光生物传感器和/或检测方法在碱基切除修复酶相关药物筛选、生物样品酶分析中的应用。
所述碱基切除修复酶相关药物包括但不限于碱基切除修复酶抑制剂和碱基切除修复酶激活剂；
所述生物样品包括离体的血液、体液、细胞或组织，如HeLa细胞。经试验验证，本发明所提出的生物传感器具有较好的对真实复杂生物样品分析能力，可用于对细胞碱基切除修复酶(如UDG)活性的定量检测，在生物医学基础研究及临床诊断等领域都具有很大的应用潜力。
本发明的有益效果为：
1、金属有机框架(FeMOF)的使用：本发明所使用的金属有机框架(FeMOF)可以吸附鲁米诺金纳米负载大量的鲁米诺分子，同时可以作为合成普鲁士蓝的标签，显著放大电化学发光信号。
2、高灵敏度：本发明采用电化学氧化的Fc(Fc+)可以催化H2O2的沉积生成OH·，从而在luminol-H2O2体系中产生增强的ECL信号，同时使用普鲁士蓝催化鲁米诺，大大简化了操作程序，可灵敏检测UDG，检测限为2.468×10-4U每升。
3、广泛的潜在应用：本发明设计的电化学发光生物传感器可以用于UDG抑制剂的筛选以及对于生物样品的分析，在生物医学研究中具有广泛的潜在应用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明基于主-客体识别和三重信号放大的ECL生物传感器检测UDG的方法原理图；
图2为本发明不同纳米粒子的表征图，A为合成的Fe-MOF的X射线衍射图(XRD)，B为鲁米诺(a)纳米金(b)、AuNPs@luminol(c)的紫外吸收光谱，C为合成的AuNPs@luminol颗粒的透射电子显微镜(TEM)图像，D为合成的Fe-MOF的扫描电子显微镜(SEM)图像，E为FeMOF/AuNPs@luminol的扫描电子显微镜(SEM)图像，F为在FeMOF/AuNPs@luminol表面制备的普鲁士蓝薄膜的扫描电子显微镜(SEM)图像；
图3为本发明实验可行性分析表征图，A为在含有0.1摩尔每升KCl的5毫摩尔每升的Fe(CN)6 3-/4-中的不同修饰电极的电化学阻抗谱(EIS)，a为裸玻碳电极(GCE)，b为GO/GCE，c为β-CD/GO/GCE，d为FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin探针+1U mL-1UDG+β-CD/GO/GCE，B为在含有5毫摩尔每升的0.1摩尔每升PBS中的不同修饰电极的电化学发光(ECL)曲线，a为AuNPs@luminol-hairpin探针，b为AuNPs@luminol-hairpin探针+1U mL-1UDG，c为FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin probe+1U mL-1UDG，d为FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin probe+1UmL-1UDG+普鲁士蓝；
图4为本发明实验条件优化图，A为β-CD浓度的优化，B为Fe(CN)6 4-浓度的优化，C为UDG与传感器一步反应的孵育时间，D为普鲁士蓝形成的时间，误差棒代表三次独立实验的标准偏差；
图5为本发明灵敏度实验结果表征图，A为用不同浓度的UDG(从a到j：0，0.0005，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1U每毫升)孵育的生物传感器的电化学发光强度(ECL)曲线，B为ECL强度和UDG浓度的对数在0.0005至1U每毫升的范围内之间的线性关系，检测条件：含有5毫摩尔每升的H2O2的0.1摩尔每升的pH为10的磷酸缓冲溶液，误差棒代表三次独立实验的标准偏差；
图6为本发明不同浓度UGI对UDG相对活性的影响差异。UDG的浓度保持为1U每毫升，误差棒代表三次独立实验的标准偏差；
图7为本发明选择性和稳定性实验结果表征图，A图分别为0.01毫克每毫升的BSA、1U每升的hAAG，0.01毫克每毫升的IgG，误差棒代表三次独立实验的标准偏差；B图为在0～0.5V连续12个周期的循环电位扫描下，所述ECL生物传感器的稳定性；
图8为本发明ECL强度和海拉细胞(HeLa)细胞数的对数之间从5到10000个细胞的线性相关性图，误差棒代表三次独立实验的标准偏差。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
传统的碱基切除修复酶检测方法通常费时费力，且检测灵敏度不高。为了解决如上的技术问题，本发明提出了基于主客体识别技术的电化学发光生物传感器，其可用于三倍信号放大高灵敏检测碱基切除修复酶。
本发明的一种典型实施方式中，提供了一种检测碱基切除修复酶的电化学发光生物传感器，所述电化学发光生物传感器包括β-CD/GO/GCE电极，所述β-CD/GO/GCE电极由氧化石墨烯(GO)和环糊精(β-CD)修饰至玻碳电极(GCE)上制得。
本发明的又一具体实施方式中，所述电化学发光生物传感器还包括FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针，所述FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针包括：铁基金属有机骨架(FeMOF)纳米粒子，以及修饰在FeMOF上的AuNPs@luminol，所述AuNPs@luminol上还修饰有发夹结构探针，所述发夹结构探针的茎区设计有待测碱基切除修复酶的目标碱基，所述目标碱基根据实际情况进行设置，可为1至多个，如1个，2个，4个，6个等。
本发明的又一具体实施方式中，所述铁基金属有机骨架(FeMOF)纳米粒子为Fe-MIL-88NH2(CCDC：647646)；所述Fe-MIL-88NH2自带氨基官能团，具有良好的电催化活性。
本发明的又一具体实施方式中，所述AuNPs@luminol直径为20nm；采用鲁米诺还原氯金酸制备得到。
本发明的又一具体实施方式中，所述发夹结构探针的茎区3'端修饰二茂铁(Fc)，5'端修饰巯基，使得发夹结构探针通过金硫键与AuNPs@luminol进行连接。
本发明的又一具体实施方式中，所述碱基切除修复酶为DNA糖基化酶，包括但不限于烷基腺嘌呤DNA糖化酶(AAG)、甲酰胺嘧啶DNA糖化酶(FPG)、尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)和胸腺嘧啶-DNA糖化酶(TDG)。
本发明的又一具体实施方式中，当待测碱基切除修复酶为尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)时，所述发夹结构探针的核苷酸序列可以为：
5'-HS-UUU GUC UGU GAA GGA GGT AGA TCA CAG ACA AA-(CH2)6-Fc-3'(SEQ IDNO.1)。其中，斜体字母代表在发夹结构探针茎区发生互补配对的碱基。
本发明的又一具体实施方式中，所述电化学发光生物传感器还包括K4Fe(CN)6和HCl。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述检测碱基切除修复酶的电化学发光生物传感器的制备方法，所述制备方法包括：
(1)β-CD/GO/GCE电极的制备：将GO溶液滴加至GCE表面上以获得GO/GCE；干燥后将β-CD溶液溶液滴加至GO/GCE上即获得β-CD/GO/GCE电极；
(2)FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针的制备：将FeMOF与AuNPs@luminol混合获得FeMOF/AuNPs@luminol，然后将FeMOF/AuNPs@luminol与发夹结构探针溶液混合孵育，离心后即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述β-CD溶液的浓度为1～5mM(优选为2mM)；经试验验证，当β-CD溶液的浓度为2mM时，发光强度最高，检测效果最佳。
本发明的又一具体实施方式中，所述AuNPs@luminol的制备方法与常规柠檬酸钠还原法制备AuNPs基本相同，区别点在于将柠檬酸钠替换为本申请中的鲁米诺。
具体的，所述制备方法为：将氯金酸溶液加热至沸点，然后加入鲁米诺，剧烈搅拌，持续沸腾至溶液颜色从黄色变为酒红色即得。
其中，所述氯金酸溶液质量分数为0.005～0.02％(优选为0.01％，w/w)，鲁米诺浓度为0.005～0.02M(优选为0.01M)；
本发明的又一具体实施方式中，所述发夹结构探针的茎区设计有待测碱基切除修复酶的目标碱基，所述目标碱基个数可为一至多个，根据实际情况进行设置，如1个，2个，4个，6个等。
本发明的又一具体实施方式中，所述发夹结构探针的茎区3'端修饰二茂铁(Fc)，5'端修饰巯基，使得发夹结构探针通过金硫键与AuNPs@luminol进行连接。
本发明的又一具体实施方式中，所述碱基切除修复酶为DNA糖基化酶，包括但不限于烷基腺嘌呤DNA糖化酶(AAG)、甲酰胺嘧啶DNA糖化酶(FPG)、尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)和胸腺嘧啶-DNA糖化酶(TDG)。
本发明的又一具体实施方式中，当待测碱基切除修复酶为尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)时，所述发夹结构探针的核苷酸序列可以为：
5'-HS-UUU GUC UGU GAA GGA GGT AGA TCA CAG ACA AA-(CH2)6-Fc-3'(SEQ IDNO.1)。其中，斜体字母代表在发夹结构探针茎区发生互补配对的碱基。
本发明的又一具体实施方式中，混合孵育处理条件为在低温条件下(4℃)搅拌处理10～16小时(优选12小时)。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述电化学发光生物传感器在检测碱基切除修复酶中的应用。
其中，所述碱基切除修复酶为DNA糖基化酶，包括但不限于烷基腺嘌呤DNA糖化酶(AAG)、甲酰胺嘧啶DNA糖化酶(FPG)、尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)、胸腺嘧啶-DNA糖化酶(TDG)。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种基于上述电化学发光生物传感器检测碱基切除修复酶的方法，所述方法包括：将FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针添加至待测样品中得混合溶液，然后将β-CD/GO/GCE电极加入上述混合溶液中进行孵育处理，然后将电极转移至含有K4Fe(CN)6(0.5mM)和HCl(10mM)的混合溶液中进行二次孵育处理(处理时间为30～60分钟，优选为45分钟)后，进行电化学发光检测。
其中，所述孵育处理条件为：在30～40℃(优选为37℃)处理40～120min(优选为80min)。
进行电化学发光检测条件包括：含有H2O2(5mM)的磷酸缓冲溶液(0.1M，pH10)。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述电化学发光生物传感器和/或检测方法在碱基切除修复酶相关药物筛选、生物样品酶分析中的应用。
所述碱基切除修复酶为DNA糖基化酶，包括但不限于烷基腺嘌呤DNA糖化酶(AAG)、甲酰胺嘧啶DNA糖化酶(FPG)、尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)、胸腺嘧啶-DNA糖化酶(TDG)；进一步优选为尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)。
所述碱基切除修复酶相关药物包括但不限于碱基切除修复酶抑制剂和碱基切除修复酶激活剂；
所述生物样品包括离体的血液、体液、细胞或组织，如HeLa细胞。经试验验证，本发明所提出的生物传感器具有较好的对真实复杂生物样品分析能力，可用于对细胞碱基切除修复酶(如UDG)活性的定量检测，在生物医学基础研究及临床诊断等领域都具有很大的应用潜力。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。下述实施例中，发夹探针由5'到3'的序列为：
5'-HS-UUU GUCUGU GAA GGA GGT AGA TCA CAG ACA AA-(CH2)6-Fc-3'。
实施例
本实施例的原理，如图1所示：
设计一个发夹式探针，其茎部有6个尿嘧啶碱基，5'端有一个巯基，用于固定在FeMOF/AuNPs@luminol表面，3'端有一个Fc。在没有UDG的情况下，发夹探针的六个尿嘧啶碱基不能被删除，FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin探针不能被β-CD捕获到电极表面，导致没有普鲁士蓝的生产。由于Fc和普鲁士蓝在电极上的缺失，ECL发光强度较低。当UDG存在时，去除发夹DNA中6个尿嘧啶碱基，产生了6个AP位点，形成了Fc位于3'端的直单链DNA(ssDNA)。Fc通过与β-CD的主客体作用被固定在电极上进一步催化鲁米诺自由基(L-·)与H2O2生成的OH·反应生成3-氨基甲酸酯(AP2-*)。当AP2-*返回基态时，将产生增强的ECL信号。此外，当K4Fe(CN)6和酸(H+)加入电极表面时，它们与Fe3+在FeMOF中反应生成普鲁士蓝(亚铁氰化物，[FeIIIFeII(CN)6]-)。普鲁士蓝可以在碱性溶液中以及H2O2存在的情况下催化3-氨基酞酸盐(AP2-*)的形成，进一步增强ECL信号。
具体过程：
FeMOF的合成：将0.126克(0.692毫摩尔)2-氨基对苯二甲酸和0.187克(0.692毫摩尔)六水合三氯化铁溶解在15毫升DMF中，混合溶液中加入3.45毫摩尔的醋酸，在120℃油浴4h结晶。冷却至室温后，以4000rpm的转速离心，然后用N-N二甲基甲酰胺(DMF)和乙醇洗涤去除多余的反应物，然后在真空炉中干燥。
AuNPs@luminol的合成：本实验使用的所有玻璃器皿均在新鲜配制的HNO3/HCl(1:3，v/v)浴中清洗干净，再用二次水中彻底冲洗干净，烘干备用。用鲁米诺还原氯金酸制备金胶体，将100毫升氯金酸溶液(0.01％，w/w)加热至沸点，然后快速加入1.6毫升0.01摩尔每升的鲁米诺，剧烈搅拌。将溶液保持沸腾30分钟后，颜色从黄色变为酒红色。然后取下加热源，将胶体在室温下冷却20分钟，4℃保存。
FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针的合成：将4毫升AuNPs@luminol(20nm直径)和2毫升FeMOF(1毫克每毫升)混合剧烈摇晃2小时。获得的FeMOF/AuNPs@luminol使用5000rpm离心收集，并用超纯水清洗三次，分散在1毫升的Tris-HCl(10毫摩尔每升，pH值7.4)中。发夹探针被稀释到10微摩尔每升在包含10毫摩尔每升Tris-HCl(pH值8.0)和1.5毫摩尔每升MgCl2的反应体系中，然后在95℃孵育5分钟，冷却到室温形成发夹结构。然后将200μL发夹结构探针(10μM)加入FeMOF/AuNPs@luminol的溶液，在4℃搅拌12小时，FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin探针通过5000rpm离心获得。
电化学发光生物传感器的制备：电化学传感器是构建在GCE电极上。电极在修饰之前，分别用1.0，0.3和0.05微米α-Al2O3粉抛光GCE电极，然后分别依次用纯水和乙醇超声处理3分钟。将20微升氧化石墨烯溶液(0.25毫克每毫升，溶剂为超纯水)滴加到GCE表面上以获得GO/GCE。在室温下干燥后，将20微升的环糊精(β-CD)滴在GO/GCE上以获得β-CD/GO/GCE。
UDG和抑制剂分析的电化学发光检测：将10微升FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin探针添加到包含不同浓度UDG和2微升10×UDG反应缓冲的20微升的反应体系中。将β-CD/GO/GCE与20微升含有不同浓度的目标UDG的FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin探针溶液中于37℃孵育80分钟，然后将得到的电极转移到含有0.5毫摩尔每升K4Fe(CN)6和10毫摩尔每升的HCl的溶液中孵育45分钟，在电极表面形成普鲁士蓝。检测条件是含有5毫摩尔每升的H2O2的0.1摩尔每升的pH为10的磷酸缓冲溶液。此外，以UGI为模型抑制剂，研究了UDG抑制实验。除了不同浓度的抑制剂UGI与含有1U mL-1UDG的反应缓冲液预混合外，UDG抑制试验也采用类似方法。
细胞提取物的制备：HeLa细胞在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，放在37℃、含有5％二氧化碳的培养箱中进行培养。当海拉细胞生长到指数增长阶段，用胰蛋白酶消化收集，用冷的PBS(pH值7.4，Gibco，美国)洗涤两次，所得溶液以1000转离心5分钟。这些细胞被悬浮在100微升裂解缓冲液中，在冰上孵育30分钟，在4℃以12000g离心20分钟。将上清液转移到一个新鲜的试管中，并储存在-80℃。
实验结果
1、材料的表征
本实施例使用X射线衍射图(XRD)研究了FeMOF的晶体结构(图2A)。FeMOF的主衍射峰分别出现在9.06°、9.98°、16.46°和18.88°，分别对应于(002)、(101)、(200)和(201)低角度，这与之前的报道一致，表示与MIL-88(Cr)结构相同的FeMOF的高结晶性。紫外-可见光谱用于表征AuNPs@luminol的形成(图2B)。鲁米诺的光谱特征峰在300和360纳米(图2B，曲线a)。用柠檬酸钠作为稳定剂合成的13纳米的AuNPs吸收光谱显示了一个在525纳米的吸收峰(图2B，曲线b)。相比之下，AuNPs@luminol胶体的紫外光谱、鲁米诺的双重吸收峰消失，两个吸收峰分别出现在368和530纳米(图2B，曲线c)，表明形成鲁米诺功能化的AuNPs。合成的纳米材料(AuNPs@luminol，FeMOF，FeMOF/AuNPs@luminol，以及由FeMOF/AuNPs@luminol制备的普鲁士蓝膜)的形貌通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)进行了表征。AuNPs@luminol的TEM图像(图2C)显示了直径为20nm的均匀分布。在SEM图像中，FeMOF中的大部分颗粒呈现出平均直径为200nm的八面体形貌(图2D)。此外，得到的FeMOF在硅片中没有任何背景，非常纯净(图2D)。当AuNPs@luminol在FeMOF上修饰时，AuNPs@luminol很好地分散在FeMOF基体的表面(图2E)，说明AuNPs@luminol与FeMOF的NH2基团之间通过静电吸附成功吸附到FeMOF上。以FeMOF为模板，由FeMOF/AuNPs@luminol制备的普鲁士蓝(KFeIIIFeII(CN)6)膜呈现多孔结构(图2F)。普鲁士蓝的多孔结构可以增加有效表面积和传质效率，促进鲁米诺自由基催化形成3-氨基邻苯二甲酸酯(AP2-*)，产生增强的ECL信号。
2、原理的实验验证
为了证明本技术方案的可行性，本实施例通过电化学阻抗谱(EIS)来表征了修饰电极在5毫摩尔每升[Fe(CN)6]3-/4-溶液中不同阶段的电化学行为。如图3A所示，裸GCE显示一个小半圆直径长尾，Ret为502Ω，表明Fe(CN)6 3-/4-在电极表面的扩散(图3A，曲线a)。GO/GCE的阻抗谱(图3A，曲线b)Ret与裸电极相比增加到1600Ω。这可以解释为，氧化石墨烯导电能力差且带负电荷，可以排斥带负电荷的氧化还原探针Fe(CN)6 3-/4-。由于β-CD的不导电，当将β-CD修饰到GO/GCE上，Ret显著增加到2734Ω(图3A，曲线c)当FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin与1U每毫升UDG在β-CD/GO/GCE上孵育80分钟，由于FeMOF的空间位阻以及DNA与Fe(CN)6 3-/4-之间的静电排斥作用，Ret增加到5917Ω(图3A，曲线d)。
利用电化学发光方法(ECL)探讨了不同修饰电极的生物传感器的可行性。相比与不存在目标物UDG的情况下(图3B，曲线a)，当FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin探针和UDG在β-CD/GO/GCE上孵育，可以观察到一个较高的ECL发强度(图3B，曲线c)。在UDG存在时，生成普鲁士蓝薄膜后，ECL强度(图3B，曲线d)增加为AuNPs@luminol-hairpin探针发光强度(图3B，曲线b)的8倍和只存在FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin探针时的3倍(图3B，曲线c)，表明普鲁士蓝和Fc的引入可以催化H2O2的沉积，在luminol-H2O2体系中产生增强的ECL信号。
3、实验条件优化
为了确保ECL生物传感器的高性能，优化实验条件，包括β-CD和Fe(CN)6 4-的浓度，FeMOF与Fe(CN)6 4-反应普鲁士蓝的形成的时间，FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin探针与UDG反应的时间(图4)。研究β-CD浓度对分析性能的影响(图4A)。随着β-CD的浓度从1增加到5毫摩尔每升，发光强度大大提高，在2毫摩尔每升时达到最大值。β-CD浓度越高，越多的FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin探针被β-CD/GO/GCE捕获。因此，2毫摩尔每升的β-CD用于后续研究。Fe(CN)6 4-的浓度对普鲁士蓝的形成起着重要的作用。如图4B所示，ECL强度随着Fe(CN)6 4-浓度从0.1增加到0.5毫摩尔每升而增强，当Fe(CN)6 4-浓度大于0.5毫摩尔每升时，ECL强度急剧下降。S/N比值(指有UDG时ECL强度与无UDG时ECL强度之比)在浓度为0.5毫摩尔每升时也达到最大值。因此，后续研究采用0.5毫摩尔每升Fe(CN)6 4-。此外，ECL强度随着FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin探针和UDG反应时间从40分钟到120分钟的增加而增加，并在80分钟时达到最大值(图4C)。进一步优化了Fe(CN)6 4-与FeMOF反应生成普鲁士蓝的时间。如图4D，ECL强度随着Fe(CN)6 4–与FeMOF/AuNPs@luminol-hairpin探针反应时间从20分钟增加到50分钟迅速提高，信噪比在50分钟时达到最大。因此，在后续的研究中选择50分钟用于普鲁士蓝的形成的最佳反应时间。
4、灵敏度实验
为了评估本技术方案检测UDG的灵敏度，在含5毫摩尔每升H2O2的0.1摩尔每升PBS(pH为10)中测量了不同浓度UDG对ECL信号的影响(图5A)。电化学发光(ECL)信号随着UDG浓度从0.0005到1U每毫升的增加而增强，在ECL信号的变化与UDG浓度(0.0005U每毫升到1U每毫升)的对数之间获得了良好的线性关系。相应的方程为IECL＝7422+2043log10C，相关系数为0.9978(图5B)，其中I为ECL发光强度，C为UDG浓度(U每毫升)。基于空白响应的3倍标准偏差，该生物传感器的检测限被计算为2.468×10-4U每毫升，优于所报道的UDG测定方法，比荧光法高3.2倍，比电化学发光法高24倍，比比色法高81倍，比电化学法高32倍。本技术方案的高灵敏度可归因为三个因素:(1)超分子主体-客体(β-CD-Fc)识别提供了一种简单而有效的方法来捕获氧化还原分子Fc，同时Fc可催化过氧化氢分解对鲁米诺发光信号放大；(2)每个FeMOF携带大量的AuNPs@luminol连接的发卡DNA和丰富的luminol分子，大大增强了ECL信号；(3)在电极表面加入K4Fe(CN)6和酸(H+)，与FeMOF中Fe3+反应生成普鲁士蓝，催化鲁米诺自由基形成AP2-*，产生增强的ECL信号。
5、UDG抑制剂实验
为了验证所提出的用于UDG抑制实验的电化学发光生物传感器的可行性，使用尿嘧啶糖基酶抑制剂(UGI)作为模型抑制剂。UGI可以以1:1摩尔的化学计量比与UDG结合形成紧密的、生理上不可逆的复合物。UDG的相对活性(RA)根据RA
Figure BDA0002237995110000171
计算，No代表没有UDG时的峰值电流，Nt代表在1U每毫升UDG存在时的峰值电流，Ni代表在1U每毫升UDG和UGI同时存在时的电流值。如图6所示，UDG的相对活性随着UGI浓度的增加呈单调下降。实验结果表明，该ECL生物传感器可用于UDG抑制剂的筛选。根据ECL强度与UGI浓度之间的剂量依赖关系，得到的IC50值(UGI浓度对UDG活性抑制50％)为0.6464U mL-1，与文献报道一致。
6、电化学生物传感器的选择性、重现性和稳定性实验
为了评估本技术方案检测UDG的特异性，本实施例使用人烷基腺嘌呤DNA糖化酶(hAAG)、牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白G(IgG)作为干扰物。BSA和IgG不是DNA糖化酶，它们不能识别并从DNA底物中去除尿嘧啶。hAAG可以切除烷基化腺嘌呤生成无嘌呤位点，但不能切割本研究使用的DNA底物。如图7A所示，在存在UDG的情况下，ECL显著增强。而BSA、hAAG和IgG对ECL信号没有明显的影响，说明所提出的ECL生物传感器对UDG具有较高的选择性。此外，还研究了在1U每毫升UDG存在的情况下，0～0.5V下连续循环电位扫描12个周期的ECL生物传感器的稳定性(图7B)。所提出的ECL生物传感器具有良好的稳定性，相对标准偏差(RSD)为0.65％。进一步研究了所提出的ECL生物传感器的再现性，通过测量相同的UDG浓度(1U每毫升)，在相同的条件下制备五个电极。RSD值为2.6％，表明该ECL生物传感器具有良好的重复性。
7、生物样品实验
为了评估本技术方案所提出的生物传感器对真实复杂生物样品分析的能力，本实施例使用HeLa细胞作为检测细胞UDG活性的模型。如图8所示，ECL信号与HeLa细胞数的对数呈线性相关，范围为5～10000个细胞，线性方程为IECL＝930.9log10N-152.7，相关系数为0.9889，其中I为ECL强度，N为HeLa细胞数。基于空白响应的3倍标准偏差，确定检测限为2个细胞。这些结果清楚地表明该ECL生物传感器可用于细胞UDG活性的定量检测，在临床诊断中具有很大的应用潜力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120>一种电化学发光生物传感器、制备方法及其在碱基切除修复酶检测中的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
uuugucugug aaggaggtag atcacagaca aa 32

Claims (10)

1.一种检测碱基切除修复酶的电化学发光生物传感器，其特征在于，所述电化学发光生物传感器包括β-CD/GO/GCE电极和FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针；
其中，所述β-CD/GO/GCE电极由氧化石墨烯和环糊精修饰至玻碳电极上制得；
所述FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针包括：FeMOF，以及修饰在FeMOF上的AuNPs@luminol，所述AuNPs@luminol上还修饰有发夹结构探针，所述发夹结构探针的茎区设计有一至多个待测碱基切除修复酶的目标碱基。
2.如权利要求1所述的电化学发光生物传感器，其特征在于，
所述FeMOF为Fe-MIL-88NH2；或，
所述AuNPs@luminol直径为20nm；采用鲁米诺还原氯金酸制备得到；或，
发夹结构探针的茎区3'端修饰二茂铁，5'端修饰巯基。
3.如权利要求1所述的电化学发光生物传感器，其特征在于，所述碱基切除修复酶为DNA糖基化酶，包括烷基腺嘌呤DNA糖化酶、甲酰胺嘧啶DNA糖化酶、尿嘧啶-DNA糖化酶和胸腺嘧啶-DNA糖化酶；
优选的，当待测碱基切除修复酶为尿嘧啶-DNA糖化酶时，发夹结构探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1所述的电化学发光生物传感器，其特征在于，所述电化学发光生物传感器还包括K4Fe(CN)6和HCl。
5.权利要求1-4任一项所述电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
β-CD/GO/GCE电极的制备：将GO溶液滴加至GCE表面上以获得GO/GCE；干燥后将β-CD溶液溶液滴加至GO/GCE上即获得β-CD/GO/GCE电极；
FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针的制备：将FeMOF与AuNPs@luminol混合获得FeMOF/AuNPs@luminol，然后将FeMOF/AuNPs@luminol与发夹结构探针溶液混合孵育，离心后即得。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述β-CD溶液的浓度为1～5mM(优选为2mM)。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述AuNPs@luminol的制备方法包括：将氯金酸溶液加热至沸点，然后加入鲁米诺，剧烈搅拌，持续沸腾至溶液颜色从黄色变为酒红色即得；
优选的，所述氯金酸溶液质量分数为0.005～0.02％(优选为0.01％，w/w)，鲁米诺浓度为0.005～0.02M(优选为0.01M)；
优选的，混合孵育处理条件为在低温条件下搅拌处理10～16小时(优选12小时)。
8.权利要求1-4任一项所述电化学发光生物传感器在检测碱基切除修复酶中的应用。
9.一种基于权利要求1-4任一项所述电化学发光生物传感器检测碱基切除修复酶的方法，其特征在于，所述方法包括：将FeMOF/AuNPs@luminol-Hairpin探针添加至待测样品中得混合溶液，然后将β-CD/GO/GCE电极加入混合溶液中进行孵育处理，然后将电极转移至含有K4Fe(CN)6和HCl的混合溶液中进行二次孵育处理(处理时间为30～60分钟，优选为45分钟)后，进行电化学发光检测；
优选的，所述孵育处理条件为：在30～40℃(优选为37℃)处理40～120min(优选为80min)；
优选的，进行电化学发光检测条件包括：在含有H2O2(5mM)的磷酸缓冲溶液(0.1M，pH10)中进行。
10.权利要求1-4任一项所述电化学发光生物传感器和/或权利要求9所述检测方法在碱基切除修复酶相关药物筛选、生物样品酶分析中的应用；
优选的，所述碱基切除修复酶为DNA糖基化酶，包括烷基腺嘌呤DNA糖化酶、甲酰胺嘧啶DNA糖化酶、尿嘧啶-DNA糖化酶和胸腺嘧啶-DNA糖化酶；
所述碱基切除修复酶相关药物包括碱基切除修复酶抑制剂和碱基切除修复酶激活剂；
所述生物样品包括离体的血液、体液、细胞(HeLa细胞)或组织。
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