CN112730547A - 一种用于检测nsclc循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法及应用，其中制备方法包括以制备的NG‑PEI‑COF纳米复合材料作为传感器的基底材料，以Fe‑MOF与Fe²⁺生成普鲁士蓝为信号放大材料，利用核酸杂交构建检测循环肿瘤基因EGFR L858R的夹心型生物传感器。本发明提供的生物传感器不仅具有更强的信号放大作用，而且还具有线性范围宽、特异性强和分析时间短等优点，可为非小细胞肺癌的诊断提供一种新方法。

Description

一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制 备方法及应用

技术领域

本发明涉及电化学DNA传感器技术领域，具体涉及一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因EGFR L858R的电化学生物传感器的制备方法，以及该电化学生物传感器在检测血清EGFRL858R中的应用。

背景技术

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为全球癌症相关死亡的主要原因。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌的85％，而且大约有75％的NSCLC患者在被发现时已经处于晚期，其5年生存率非常低。现有的NSCLC诊断方法在一定程度上具有局限性，比如价格昂贵、过程复杂耗时和患者机体损伤大等。因此对于非小细胞肺癌而言，探索成本较低、简便快捷且机体损伤小的疾病诊断方法具有重要的临床意义。

循环肿瘤DNA(ctDNA)作为一种新兴的肿瘤生物标志物，是来源于肿瘤细胞的一种无细胞状态的胞外DNA，主要存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液。研究表明，循环肿瘤基因EGFR L858R是非小细胞肺癌的常见突变之一，所以检测血液中EGFR L858R的水平对于肺癌的早期诊断具有重要意义。

目前ctDNA的检测方法主要有聚合酶链反应(PCR)、DNA测序、表面增强阿曼光谱(SERS)、局部表面等离子共振(LSPR)和DNA离合探针(DCP)等，虽然灵敏度高但这些方法存在如耗时、成本高、设备昂贵和操作繁琐等不足，因此开发一种简便、灵敏、快速和经济的方法用于临床标本ctDNA的检测是非常有必要的。

电化学生物传感器是使用最广泛的一类生物传感器，因其灵敏度高、操作简单和快速经济等特点，已被广泛的应用于ctDNA检测。但是目前尚未报道用于血液中EGFR L858R的检测的电化学生物传感器。

本发明期望构建一种电化学生物传感器用于检测血清中EGFR L858R，为非小细胞肺癌的检测提供了新的诊断途径。

发明内容

本发明旨在解决上述存在的至少部分技术问题以及实现上述目的，构建了一种以Fe-MOF与Fe²⁺生成普鲁士蓝为信号放大材料，以NG-PEI-COF纳米复合材料为敏感界面的夹心型电化学ctDNA生物传感器，用于检测血清中EGFR L858R，为非小细胞肺癌的检测提供了新的诊断途径。

根据本发明第一方面，提供一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

S1，制备聚乙烯亚胺功能化的氮掺杂石墨烯修饰COF纳米复合材料，记为NG-PEI-COF纳米复合材料；

S2，对电极进行清洁预处理；

S3，将步骤S1制备的NG-PEI-COF纳米复合材料分散液滴加至清洁的电极表面，室温干燥；

S4，将纳米金AuNPs滴加至步骤S3得到的电极表面，室温干燥；

S5，将捕获探针滴加至步骤S4得到的电极表面，室温孵育；

S6，将BSA溶液滴加至步骤S5得到的电极表面，室温孵育，以封闭非特异性结合位点；

S7，将目标探针滴加至步骤S6得到的电极表面，37℃温度下孵育；

S8，将示踪标记物滴加至步骤S7得到的电极表面，得到电化学生物传感器，其中示踪标记物通过将信号探针SP与铁基金属有机框架材料Fe-MOF-AuNPs反应得到，示踪标记物记为Fe-MOF-AuNPs-SP。

上述步骤如没有特别说明，不存在先后顺序，尤其是步骤S1、S2、S4中纳米金AuNPs的制备以及S8中示踪标记物的制备不分先后顺序。

进一步，所述步骤S1中的NG-PEI-COF纳米复合材料通过如下步骤制备：(1)将0.048mmol 1,3,5-三(4-氨基苯基)苯和0.048mmol 1,3,5-(4-甲酰基苯基)苯溶于0.9mL均三甲苯和0.1mL 1，4-二恶烷的混合溶液，超声，再在混合溶液中加入0.1mL 6M的醋酸，然后将以上溶液转移到反应釜中120℃反应3天，冷却，离心，用四氢呋喃洗涤6次所得的沉淀物在60℃真空干燥，最后将黄色粉末分散在超纯水中，即得到浓度为1mg mL^-1的COF分散液；(2)将1mg NG分散在1mL N，N-二甲基甲酰胺中，超声均匀，然后向其中加入500mL 1％PEI，室温搅拌2h后，加入COF分散液1mL混合，超声，室温搅拌8h，离心，超纯水洗涤3次，得到沉淀物即为NG-PEI-COF纳米复合材料；将沉淀物分散在超纯水中，即得到NG-PEI-COF分散液。

进一步，所述步骤S2中的电极为玻碳电极；所述步骤S2中的清洁预处理包括：将电极用食人鱼洗液(98％H₂SO₄/30％H₂O₂＝3:1,v/v)浸泡30min后用超纯水冲洗干净；浸泡后电极分别用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光呈镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥；将干燥后电极在0.5M H₂SO₄中进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥。

进一步，所述步骤S4中AuNPs通过如下步骤制备：将1mL 1％HAuCl₄溶液加入至100mL超纯水中煮沸，然后迅速加入2.5mL 1％柠檬酸三钠溶液继续煮沸15分钟，冷却后用超纯水恢复至原体积得透明的酒红色溶液即为纳米金(AuNPs)溶液。

进一步，所述步骤S5中的捕获探针的序列如SEQ ID NO.2所示；所述步骤S5中室温孵育时间为6h。

进一步，所述步骤S6中BSA溶液浓度为1％，所述步骤S6中室温孵育时间为30min。

进一步，所述步骤S7中的目标探针的序列如SEQ ID NO.1所示；所述步骤S7中孵育时间为2.5h。

进一步，所述步骤S8中信号探针的序列如SEQ ID NO.3所示；所述步骤S8中示踪标记物Fe-MOF-AuNPs-SP分散液通过如下步骤制备：

(1)将0.461mmol 2-氨基对苯二甲酸溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺,然后将0.461mmol FeCl₃·6H₂O加入其中,再将2.3mmol乙酸加入混合物中，120℃油浴4h后冷却至室温，离心，DMF和无水乙醇洗涤3次所得的沉淀物在60℃真空干燥，最后将棕色粉末分散在超纯水中，即得浓度为1mg mL^-1的Fe-MOF分散液；

(2)将1mL 1％HAuCl₄溶液加入至100mL超纯水中煮沸，然后迅速加入2.5mL 1％柠檬酸三钠溶液继续煮沸15分钟，冷却后用超纯水恢复至原体积得透明的酒红色溶液即为纳米金(AuNPs)。

(3)分别取Fe-MOF分散液和AuNPs溶液1mL室温搅拌4h，水洗3次，将沉淀物分散在超纯水中，即得Fe-MOF-AuNPs分散液；

(4)取Fe-MOF-Au分散液1mL，加入100μL 2μM信号探针，4℃搅拌12h，离心，水洗，将沉淀物分散在超纯水中，即得到Fe-MOF-AuNPs-SP分散液。

进一步，所述捕获探针、所述目标探针和所述信号探针使用前，用20mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液室温下处理。

进一步，所述电极尺寸为Φ＝4mm，滴加至该电极(Φ＝4mm)上的NG-PEI-COF纳米复合材料分散液、AuNPs、捕获探针、BSA、目标探针和示踪标记物的滴加量分别为10μL、10μL、10μL、6μL、10μL和6μL。相应地，如果电极大小改变，则上述物质滴加量按比例变化。

根据本发明第二方面，提供一种血清中NSCLC循环肿瘤基因EGFR L858R的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向权利要求上述制备的电化学生物传感器的电极上滴加不同浓度的EGFRL858R；

(2)测量电极的电流变化值；

(3)根据步骤(2)所得电流变化值与EGFR L858R浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线；

(4)用所述电化学生物传感器测量待测的血清样品的电流值，并将得到的电流值通过步骤(3)制得的工作曲线计算得到待测样品的EGFR L858R浓度。

进一步，所述步骤(2)测量电极的电流变化值包括：将电极置于含有1.7mM K₄Fe(CN)₆和0.24M KCl的0.1M PBS溶液中进行表征，测量其电流变化值。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果如下：

本发明提供的一种检测NSCLC循环肿瘤基因EGFR L858R的电化学DNA传感器的制备方法与应用，其突出的特点是：

本发明制备了聚乙烯亚胺(PEI)功能化的氮掺杂石墨烯(NG)修饰COF纳米材料最终形成的NG-PEI-COF纳米复合材料作为传感器的敏感界面；利用NG-PEI和COF具有较大比表面积和良好导电性的特点协同提高AuNPs在单位面积上的负载量；然后氨基标记的捕获探针通过Au-NH₂键固载在电极表面，目标探针与捕获探针通过碱基互补配对，最后通过信号探针与不同浓度目标探针的特异性结合引起电化学信号的不同变化，来实现对ctDNA(EGFR L858R)的定量检测。所制备的电化学传感器成功用于ctDNA(EGFR L858R)的超灵敏检测。与传统的ctDNA检测方法相比，本发明的优点在于灵敏度高，特异性强，检测迅速，操作方便，设备材料价格低廉，无污染，从而为ctDNA的检测提供了新的分析方法。

本发明的具体有益效果总结而言，包括如下方面(不仅限于以下方面，附加有益效果部分可从实施例中得出)：

(1)通过聚乙烯亚胺功能化NG，可以极大地改善了NG的水溶性，有效避免NG的聚集，使其能够均匀地铺展在电极表面，有利于充分发挥其优异的物理化学性能。

(2)其次，NG-PEI具有优异的导电性，有助于电子转移，电化学传感器信号放大，提高检测灵敏度。

(3)NG-PEI-COF具有较大比表面积，可作为固定金属的结合位点，两者协同作用可以提高AuNPs在单位面积上的负载量，进一步提高捕获探针的负载量，从而提高传感器的灵敏度，从而为微量ctDNA的检测提供了新的研究方向和分析方法。

(4)本发明所涉及的材料均可在实验室条件下合成，操作简单，原材料价格低廉，每次使用量极少，降低了实验成本。

(5)整个检测分析方法步骤清晰简便，灵敏度高，信号响应迅速。

(6)本方法制备的电化学生物传感器可为非小细胞肺癌ctDNA(EGFR L858R)的检测提供新方法；该发明所制备的电化学传感器也可应用于疾病的的诊断、分析、检测等方面。

(7)本发明制备的以NG-PEI-COF为基底材料的传感器不仅具有更强的信号放大作用，而且还具有线性范围宽、特异性强和分析时间短等优点，可为非小细胞肺癌的诊断提供一种新方法。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明的电化学生物传感器的构建和检测原理示意图。

图2为本发明传感器对不同浓度EGFR L858R的检测结果。

图3为本发明传感器的重现性、特异性和稳定性检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

本发明实施例中用到的主要化学试剂如下：

氮掺杂石墨烯(NG)从先丰纳米材料科技有限公司(中国南京)订购。1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB，97％)；1,3,5-三甲苯和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)购自上海麦克林生物化学有限公司(中国上海)。1,3,5-三(对甲酰基苯基)苯(TFPB，97％)和牛血清白蛋白(BSA)购自百灵威科技有限公司(中国北京)。氯化金水合物(HAuCl₄)和2-氨基对苯二甲酸购自Sigma(美国)。六水合氯化铁(III)(FeCl₃·6H₂O，99％)购自阿拉丁(美国)。聚乙烯亚胺(PEI)获自Alfa Aesar(美国)。1,4-二恶烷购自成都科隆化工有限公司。乙酸和乙醇购自重庆川东化工集团有限公司。实验中所用的寡核苷酸均由上海生工有限公司提供，具体序列的详细信息见表1。

表1本发明中涉及的核苷酸合成序列表

所用设备及技术参数：

在电化学工作站(Autolab PGSTSAT 302N，Metrohm China Ltd)中采用三电极系统进行循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)测量，其中三电极系统包括铂丝(对电极)、饱和甘汞电极(SCE,参比电极)和修饰后的玻碳电极(GCE,工作电极)。差分脉冲伏安图(DPV)是由三电极系统在含有1.7mM K₄Fe(CN)₆和0.24M KCl的0.1M PBS中以10mV s^-1的扫描速率获得。

实施例1电化学DNA传感器的构建

按如下步骤操作(构建原理图如图1所示)：

步骤1：将1mL 1％HAuCl₄溶液加入至100mL超纯水中煮沸，然后迅速加入2.5mL1％柠檬酸三钠溶液继续煮沸15分钟，冷却后用超纯水恢复至原体积得透明的酒红色溶液即为纳米金(AuNPs)。步骤1的构建原理参见图1中(A)图。

步骤2：将0.461mmol 2-氨基对苯二甲酸溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺,然后将0.461mmol FeCl₃·6H₂O加入其中，再将2.3mmol乙酸加入混合物中，120℃油浴4h后冷却至室温，离心，DMF和无水乙醇洗涤3次所得的沉淀物在60℃真空干燥，最后将棕色粉末分散在超纯水中，即得浓度为1mg mL^-1的Fe-MOF分散液，备用。步骤2的构建原理参见图1中(B)图。

步骤3：分别取Fe-MOF分散液和AuNPs溶液1mL室温搅拌4h，水洗3次，将沉淀物分散在超纯水中，即得Fe-MOF-AuNPs分散液，备用。

步骤4：取Fe-MOF-Au分散液1mL，加入100μL 2μM信号探针(SP)，4℃搅拌12h，离心，水洗，将沉淀物分散在超纯水中，即得到示踪标志物Fe-MOF-AuNPs-SP分散液。步骤3和步骤4的构建原理参见图1中(C)图。

步骤5：先将0.048mmol 1,3,5-三(4-氨基苯基)苯和0.048mmol 1,3,5-(4-甲酰基苯基)苯溶于0.9mL均三甲苯和0.1mL 1,4-二恶烷的混合溶液，超声，再在混合溶液中加入0.1mL 6M的醋酸，然后将以上溶液转移到反应釜中120℃反应3天，冷却，离心，用四氢呋喃洗涤6次所得的沉淀物在60℃真空干燥，最后将黄色粉末分散在超纯水中，即得到浓度为1mg mL^-1的COF分散液。步骤5的构建原理参见图1中(D)图。

步骤6：将1mg NG分散在1mL N，N-二甲基甲酰胺中，超声均匀，然后向其中加入500mL 1％PEI，室温搅拌2h后，加入COF分散液1mL混合，超声，室温搅拌8h，离心，超纯水洗涤3次，再将沉淀物分散在超纯水中，即得到NG-PEI-COF分散液。

步骤7：用20mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液室温下处理捕获探针(CP)、目标探针(TP)、信号探针(SP)，储存备用。

步骤8：将玻碳电极用食人鱼洗液(98％H₂SO₄/30％H₂O₂＝3:1,v/v)浸泡30min后用超纯水冲洗干净备用。

步骤9：将步骤7得到的电极分别用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光呈镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥备用。

步骤10：将步骤8得到的电极在0.5M H₂SO₄中进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥。

步骤11：将10μL步骤1所制的新型纳米基底材料滴加到步骤10清洁的玻碳电极表面上，室温干燥。

步骤12：将10μL AuNPs滴加到步骤11玻碳电极表面上，室温干燥。

步骤13：将10μL步骤7制得的捕获探针，滴加在步骤12制备得到的电极上室温孵育6h。

步骤14：将6μL 1％BSA溶液滴加到步骤13得到的电极上室温孵育30min。

步骤15：将10μL步骤7所得的目标探针，滴在步骤14得到的电极37℃孵育2.5h。

步骤16：向步骤15构建的DNA传感器中滴加6μL步骤4所制的示踪标志物于电极表面，即得到用于ctDNA检测的电化学DNA传感器。步骤11至16的构建原理参见图1中(E)图。

实施例2利用电化学DNA传感器检测NSCLC循环肿瘤基因(EGFR L858R)

利用实施例1构建的电化学DNA传感器检测NSCLC循环肿瘤基因EGFR L858R，按照如下步骤操作：

(1)标准曲线的绘制：

将实施例1构建的DNA传感器置于含有1.7mM K₄Fe(CN)₆和0.24M KCl的0.1M PBS溶液中表征，测量不同浓度ctDNA的电流值。根据不同浓度ctDNA对数值和DPV响应信号绘制标准曲线，检测结果表明两者在100fM-100nM浓度范围内呈良好的线性关系，线性相关系数为0.9972，检测限为25.7fM，结果详见图2。图2中(A)为在含有1.7mM K₄Fe(CN)₆和0.24mM KCl的0.1M PBS缓冲液中，传感器对不同浓度EGFR L858R扫描的差分脉冲伏安图(DPV)；图2中(B)为不同浓度EGFR L858R对数值与传感器DPV响应值的校准曲线。

(2)传感器重现性检测：

在相同条件下，使用本发明制备的同一批次的5支不同电极，对ctDNA(100pM)进行测定，结果详见图3(A)-3(B)，图3中(A)为本发明传感器重现性的检测结果：为同一批次5支不同电极在含有1.7mM K₄Fe(CN)₆和0.24M KCl的0.1M PBS中扫描的差分脉冲伏安图(DPV)。图3中(B)显示的为本发明传感器重现性的检测结果：为同一批次5支不同电极DPV电流值柱状图。结果显示，电流响应值的相对标准偏差(RSD)为1.28％，说明传感器重现性较好。

(3)传感器特异性检测：

为了检测本发明传感器的特异性，对如下ctDNA进行检测：a:目标ctDNA(EGFRL858R)；b:空白对照；c:非互补ctDNA(N-DNA)；d:双碱基错配ctDNA(D-DNA)；e:单碱基错配ctDNA(S-DNA)；f:EGFR。在相同浓度(100nM)及条件下测定的不同干扰ctDNA在含有1.7mMK₄Fe(CN)₆和0.24M KCl的0.1M PBS中电流响应值见图3(C)，图3中(C)为孵育不同干扰物的特异性a:目标ctDNA(EGFR L858R)；b:空白对照；c:非互补ctDNA(N-DNA)；d:双碱基错配ctDNA(D-DNA)；e:单碱基错配ctDNA(S-DNA)；f:EGFR；在相同浓度和条件下检测的DPV电流值的柱状图。结果表明本发明的生物传感器具有令人满意的特异性。

(4)传感器稳定性检测：

将制备好的传感器置于4℃储存14天，结果发现储存14天后电流为初始电流的83.1％，结果详见图3(D)，图3中(D)为本发明传感器稳定性的检测结果：将构建的传感器在4℃储存不同时间扫描的差分脉冲伏安图(DPV)。上述结果表明该传感器具有可接受的稳定性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 重庆医科大学

<120> 一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法及应用

<130> 无

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gattttgggc tggccaaact g 21

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcccaaaat cgcgcgc 17

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgcgccagt ttggc 15

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcgcgataa tataagcgac a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gattttgggc gggccagact g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatttttggc gggccagact g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gattttgggc gggccaaact g 21

Claims (10)

1.一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，制备聚乙烯亚胺功能化的氮掺杂石墨烯修饰COF纳米复合材料，记为NG-PEI-COF纳米复合材料；

S2，对电极进行清洁预处理；

S3，将步骤S1制备的NG-PEI-COF纳米复合材料分散液滴加至清洁的电极表面，室温干燥；

S4，将纳米金AuNPs滴加至步骤S3得到的电极表面，室温干燥；

S5，将捕获探针滴加至步骤S4得到的电极表面，室温孵育；

S6，将BSA溶液滴加至步骤S5得到的电极表面，室温孵育；

S7，将目标探针滴加至步骤S6得到的电极表面，37℃温度下孵育；

S8，将示踪标记物滴加至步骤S7得到的电极表面，得到电化学生物传感器，其中示踪标记物通过将信号探针SP与铁基金属有机框架材料Fe-MOF-AuNPs反应得到，示踪标记物记为Fe-MOF-AuNPs-SP。

2.如权利要求1所述的一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的NG-PEI-COF纳米复合材料通过如下步骤制备：(1)将0.048mmol 1,3,5-三(4-氨基苯基)苯和0.048mmol 1,3,5-(4-甲酰基苯基)苯溶于0.9mL均三甲苯和0.1mL 1,4-二恶烷的混合溶液，超声，再在混合溶液中加入0.1mL 6M的醋酸，然后将以上溶液转移到反应釜中120℃反应3天，冷却，离心，用四氢呋喃洗涤6次所得的沉淀物在60℃真空干燥，最后将黄色粉末分散在超纯水中，即得到浓度为1mg mL^-1的COF分散液；

(2)将1mg NG分散在1mL N，N-二甲基甲酰胺中，超声均匀，然后向其中加入500mL 1％PEI，室温搅拌2h后，加入COF分散液1mL混合，超声，室温搅拌8h，离心，超纯水洗涤3次，得到沉淀物即为NG-PEI-COF纳米复合材料；将沉淀物分散在超纯水中，即得到NG-PEI-COF分散液。

3.如权利要求1所述的一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的电极为玻碳电极；所述步骤S2中的清洁预处理包括：将电极用食人鱼洗液(98％H₂SO₄/30％H₂O₂＝3:1,v/v)浸泡30min后用超纯水冲洗干净；浸泡后电极分别用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光呈镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥；将干燥后电极在0.5M H₂SO₄中进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥。

4.如权利要求1所述的一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S4的AuNPs通过如下步骤制备：将1mL 1％HAuCl₄溶液加入至100mL超纯水中煮沸，然后迅速加入2.5mL 1％柠檬酸三钠溶液继续煮沸15分钟，冷却后用超纯水恢复至原体积的透明的酒红色溶液即为AuNPs溶液。

5.如权利要求1所述的一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中的捕获探针的序列如SEQ ID NO.2所示，所述步骤S5中室温孵育时间为6h；所述步骤S6的BSA溶液浓度为1％，所述步骤S6中室温孵育时间为30min；所述步骤S7中的目标探针的序列如SEQ ID NO.1所示；所述步骤S7中孵育时间为2.5h。

6.如权利要求5所述的一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S8中信号探针的序列如SEQ ID NO.3所示；所述步骤S8中示踪标记物Fe-MOF-AuNPs-SP分散液通过如下步骤制备：

(1)将0.461mmol 2-氨基对苯二甲酸溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺,然后将0.461mmolFeCl₃·6H₂O加入其中,再将2.3mmol乙酸加入混合物中，120℃油浴4h后冷却至室温，离心，DMF和无水乙醇洗涤3次所得的沉淀物在60℃真空干燥，最后将棕色粉末分散在超纯水中，即得浓度为1mg mL^-1的Fe-MOF分散液；

(2)分别取Fe-MOF分散液和AuNPs溶液1mL室温搅拌4h，水洗3次，将沉淀物分散在超纯水中，即得Fe-MOF-AuNPs分散液；

(3)取Fe-MOF-Au分散液1mL，加入100μL 2μM信号探针，4℃搅拌12h，离心，水洗，将沉淀物分散在超纯水中，即得到Fe-MOF-AuNPs-SP分散液。

7.如权利要求1所述的一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述捕获探针、所述目标探针和所述信号探针使用前，用20mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液室温下处理。

8.如权利要求1所述的一种用于检测NSCLC循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述电极尺寸为Φ＝4mm；滴加至该电极上的NG-PEI-COF纳米复合材料分散液、AuNPs、捕获探针、BSA、目标探针和示踪标记物的滴加量分别为10μL、10μL、10μL、6μL、10μL和6μL。

9.一种血清中NSCLC循环肿瘤基因EGFR L858R的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向权利要求1-8任一项所述的方法制备的电化学生物传感器的电极上滴加不同浓度的EGFR L858R；

(2)测量电极的电流变化值；

(3)根据步骤(2)所得电流变化值与EGFR L858R浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线；

(4)用所述电化学生物传感器测量待测的血清样品的电流值，并将得到的电流值通过步骤(3)制得的工作曲线计算得到待测样品的EGFR L858R浓度。

10.如权利要求9所述的一种血清中NSCLC循环肿瘤基因EGFR L858R的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)测量电极的电流变化值包括：将电极置于含有1.7mM K₄Fe(CN)₆和0.24M KCl的0.1M PBS溶液中进行表征，测量其电流变化值。

Images