CN114252485A - 用于结核分枝杆菌mpt64检测的电化学适体传感器及其检测方法 - Google Patents

用于结核分枝杆菌mpt64检测的电化学适体传感器及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器。本发明公开了一种以有序介孔碳CMK‑3与蒽醌‑2‑羧酸(AQ‑2‑COOH)所形成的纳米复合物CMK‑3/AQ‑2‑COOH为信号响应及放大材料，和以海胆状铈基金属有机框架(Ce‑MOF)和金纳米粒子(AuNPs)所形成的Ce‑MOF/AuNPs为传感界面的夹心型电化学适体传感器，用于结核病的病原体结核分枝杆菌特异性抗原MPT64的检测。结果表明，本发明中以Ce‑MOF/AuNPs为传感界面、CMK‑3/AQ‑2‑COOH为氧化还原探针，协同放大传感器的信号实现了对结核分枝杆菌特异性抗原MPT64的超灵敏检测，为结核病的诊断提供了新的检测方法。

Description

用于结核分枝杆菌MPT64检测的电化学适体传感器及其检测 方法
技术领域
本发明属于电化学适体传感器、纳米复合材料技术领域，具体涉及一种用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器及其检测方法。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌所致的严重的传染性疾病，经呼吸道气溶胶传播。世界卫生组织(WHO)2020年全球结核病报告显示，2019年全世界约有1000万例新发结核病(tuberculosis，TB)病例，约有140万人死于TB(包括20.8万艾滋病毒感染者)。结核病的早期诊断对结核病的治疗和传染的控制尤为重要。
目前，结核分枝杆菌的临床检测手段各有其缺陷，难以完全实现对结核分枝杆菌的简便、快速而准确的批量检测。例如：痰培养灵敏度与特异性差；γ干扰素释放实验、T-SPOT.TB和QuantiFERON虽然能够避免BCG接种对结核分枝杆菌检测的影响，但耗时长(16-24h)、价格昂贵；结核分枝杆菌基因检测(如Xpert MTB/RIF检测和线探针LPAs检测)虽然能实现对结核分枝杆菌感染的快速而准确的检测，但价格昂贵，且需要配备专门的技术人员和昂贵的仪器设备。
适体(Aptamer)，是利用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术从核酸分子库中筛选得到的具有强识别及亲和力的单链寡核酸片段。与抗体相比，适体具有同等的甚至更高的与目标物结合的特异性和亲和力，且具有良好的稳定性。将适体用于构建生物传感器，能极大的降低检测成本，提高生物传感器的检测性能。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器。本发明电化学适体传感器以有序介孔碳材料CMK-3与电活性物质蒽醌-2-羧酸(AQ-2-COOH)的复合纳米材料为响应信号，以铈基金属有机框架/金纳米粒子(Ce-MOF/AuNPs)为传感界面的夹心型电化学适体生物传感器。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器，其特征在于：以CMK-3/AQ-2-COOH纳米复合材料为信号响应，以铈基金属有机框架/金纳米粒子(Ce-MOF/AuNPs)为传感界面。
所述CMK-3/AQ-2-COOH纳米复合材料的制备方法为：将AQ-2-COOH溶于DMF，再将CMK-3水溶液滴入AQ-2-COOH DMF溶液中，室温搅拌24小时，离心得沉淀，水洗，制得CMK-3/AQ-2-COOH纳米复合材料。
所述Ce-MOF/AuNPs的制备方法为：将Ce-MOF溶液滴加至洁净的电极表面，晾干；再通过30s电沉积金，将AuNPs修饰于Ce-MOF表面，形成Ce-MOF/AuNPs。
一种用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器，其特征在于：先制备铈基金属有机框架/金纳米粒子(Ce-MOF/AuNPs)传感界面，再制备信号响应纳米复合材料有序介孔碳CMK-3/蒽醌-2-羧酸纳米复合物(CMK-3/AQ-2-COOH)，然后制备示踪标记物(Tracer label)，最后构建用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器。
示踪标记物(Tracer label)的制备步骤为将CMK-3/AQ-2-COOH水溶液与HAuCl4(1wt％)混合混匀，滴加硼氢化钠水溶液，反应30min，8000rpm 5min离心，沉淀水洗，然后以超纯水重新定容制备CMK-3/AQ-2-COOH/AuNPs溶液；然后，将TES缓冲液溶解的2μM巯基标记适体SP与CMK-3/AQ-2-COOH/AuNPs溶液在冰浴条件下反应12h，离心得沉淀，水洗，得示踪标记物(Tracer label)。
所述构建用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器的方法为：将Ce-MOF溶液滴加至洁净的电极表面，晾干；通过30s电沉积金，将AuNPs修饰于Ce-MOF表面，形成Ce-MOF/AuNPs；然后将链酶亲和素滴加于修饰的电极表面，4℃孵育12h；再用超纯水水洗干净后，滴加MPT64适体(CP)于电极表面，4℃孵育90min，超纯水冲洗干净后再滴加0.5％BSA，室温孵育30min；水洗干净后，滴加用超纯水溶解的MPT64抗原于电极表面，室温孵育90min；最后水洗干净后，滴加tracer label于电极表面，室温孵育1h，即得到用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器。
一种用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：称取Ce(NO3)3粉末，溶于超纯水中，制成0.5M Ce(NO3)3水溶液；再称取将均苯三甲酸粉末加入至现配的体积比1：1的乙醇-水溶液中，在室温静置下滴入0.5M Ce(NO3)3水溶液，静置10min后，8000rpm 5min离心，沉淀用体积比1：1的乙醇-水溶液洗涤，室温下干燥，得Ce-MOF；
步骤2：称取AQ-2-COOH溶于DMF，形成2mg/mL的溶液；再称取CMK-3溶于超纯水，将1mg/mL的CMK-3水溶液滴入2mg/mLAQ-2-COOH DMF溶液中，室温搅拌24小时，10000rpm 5min离心，沉淀水洗，然后用超纯水复溶，制得CMK-3/AQ-2-COOH水溶液；
步骤3：将HAuCl4(1wt％)加入到CMK-3/AQ-2-COOH水溶液中，搅拌20min，加入4mg/mL的硼氢化钠水溶液反应30min，8000rpm 5min离心，沉淀水洗，然后用超纯水复溶，制得CMK-3/AQ-2-COOH/AuNPs水溶液；
步骤4：将CMK-3/AQ-2-COOH/AuNPs水溶液与溶于TES缓冲液的TCEP处理的巯基标记信号探针SP(2μM)混合，4℃搅拌12h，离心得沉淀，用超纯水洗涤，获得示踪标记物(Tracer label)；
步骤5：用超纯水溶解MPT64重组蛋白(即MPT64抗原)分装于无酶管保存至-80℃备用；
步骤6：分别用0.3和0.05μm的氧化铝抛光粉抛光玻碳电极，然后以超纯水、无水乙醇和超纯水的顺序超声清洗电极表面直至获得镜面玻碳电极，在空气中晾干；
步骤7：称取步骤1所制备Ce-MOF溶于超纯水中，形成0.5mg/mL Ce-MOF水溶液；将Ce-MOF(0.5mg mL-1)水溶液滴加至洁净的电极表面，晾干；
步骤8：将步骤7制备的Ce-MOF修饰的玻碳电极通过30s电沉积金(1wt％HAuCl4)，将AuNPs修饰于Ce-MOF表面，形成Ce-MOF/AuNPs；
步骤9：滴加链酶亲和素(100μg mL-1)于步骤8制备的电极表面，4℃孵育12h；
步骤10：将步骤9孵育后的电极用超纯水水洗干净后，滴加MPT64适体(CP)于电极表面，4℃孵育90min；超纯水冲洗干净后再滴加0.5％BSA，室温孵育30min；
步骤11：将步骤10孵育后的电极用超纯水水洗干净后，滴加MPT64抗原于电极表面，室温孵育90min；
步骤12：将步骤11孵育后的电极用超纯水水洗干净后，滴加tracer label于电极表面，室温孵育1h，用超纯水冲洗干净，得到用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器。
本发明公开了一种以有序介孔碳CMK-3与蒽醌-2-羧酸(AQ-2-COOH)所形成的纳米复合物CMK-3/AQ-2-COOH为信号响应及放大材料，和以海胆状铈基金属有机框架(Ce-MOF)和金纳米粒子(AuNPs)所形成的Ce-MOF/AuNPs为传感界面的夹心型电化学适体传感器，用于结核病的病原体结核分枝杆菌特异性抗原MPT64的检测。其特征在于：首先通过搅拌的方式制备CMK-3/AQ-2-COOH纳米复合物，然后将纳米金固载在上述材料中，并与巯基标记的信号探针(SP)混合搅拌，通过Au-S键结合制备示踪标记物(Tracer label)。将生物素标记捕获探针(CP)通过亲和素-生物素系统固载在Ce-MOF/AuNPs的传感界面上，利用核酸适体对MPT64抗原的特异性识别构建检测MPT64的夹心型生物传感器。
本发明还提供利用上述传感器检测结核分枝杆菌特异性抗原MPT64的方法。
一种利用上述传感器检测结核分枝杆菌特异性抗原MPT64的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)向所述的传感器的电极上滴加不同浓度的目标物MPT64；
2)将电极置于含有10mM KCl和2mM MgCl2的0.1M PBS溶液中进行表征，测量不同浓度MPT64的电流值；
3)根据步骤2)不同浓度MPT64对数值和DPV响应信号绘制标准曲线；
4)将待测样品用所述的传感器检测，将得到的电流值通过步骤3)制得的工作曲线计算得到待测样品的MPT64浓度。
有益效果：
本发明提供一种用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器。首先，利用海胆状Ce-MOF的多孔结构和大的比表面积极大的增加传感界面金纳米粒子(电沉积金法)的载量，从而为亲和素-生物素标记适体信号放大系统的进一步修饰提供丰富的活性位点。再利用有序介孔碳CMK-3的大的比表面积、良好的导电性对蒽醌-2-羧酸的信号进行放大，通过CMK-3多孔结构对蒽醌类物质的强大的吸附能力，将蒽醌-2-羧酸固定于CMK-3的孔道内，形成CMK-3/AQ-2-COOH纳米复合物。之后，通过硼氢化钠还原氯金酸(HAuCl4)将AuNPs负载于CMK-3/AQ-2-COOH之上，最后通过Au-S键与巯基标记适体结合，形成示踪标记物:CMK-3/AQ-2-COOH/AuNPs/SP(Tracer label)。与单独的蒽醌-2-羧酸相比，极大的放大了生物传感器对MPT64抗原的检测信号。因此，本发明中以Ce-MOF/AuNPs为传感界面、CMK-3/AQ-2-COOH为氧化还原探针，协同放大传感器的信号实现了对结核分枝杆菌特异性抗原MPT64的超灵敏检测，为结核病的诊断提供了新的检测方法。
与现有技术相比，本发明的一种检测MPT64抗原的电化学适体生物传感器的制备方法与应用，其突出的特点是：
(1)本发明利用有序介孔碳CMK-3对蒽醌-2-羧酸的强大的吸附作用与信号放大效应，成功制备CMK-3/AQ-2-COOH纳米复合物，首次将其作为氧化还原探针检测MPT64抗原，并表现出优越的信号响应；
(2)本发明中以Ce-MOF/AuNPs为传感界面，一方面增加了电极的导电性，另一方面其大的比表面积使其能固载更多的捕获探针，与示踪标记物杂交协同放大传感器的信号，进而提高电化学适体传感器对MPT64抗原检测的灵敏度和检测范围；
(3)本发明中涉及的实验材料易获取、可在实验室条件下完成，且整个检测分析步骤较清晰，检测限可达fg级别，本发明中制备的用于MPT64抗原检测的电化学适体生物传感器有望为结核病的诊断提供一种新途径。
附图说明
图1：本发明的MPT64抗原检测的电化学适体生物传感器的构建和检测原理示意图。
图2：本发明传感器对不同浓度MPT64抗原的检测结果：图A为在0.1M PBS(pH＝7.0)中传感器对不同浓度MPT64扫描的差分脉冲伏安图(DPV)，a→h:0、100fg/mL、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、3ng/mL和10ng/mL；图B为不同浓度MPT64抗原对数值与传感器DPV响应值的校准曲线。
图3：本发明传感器的特异性、稳定性和重复性检测结果。图A为孵育不同干扰物质的特异性，图a:目标MPT64(100pg/mL)；b:空白对照；c:生理盐水；d:DNA(10pM)；e:白蛋白(100pg/mL)；f:干扰素-α(100pg/mL)；g:葡萄糖(5mM)。图B为该传感器在0.1M PBS(pH＝7.0)中扫描49圈后的循环伏安图。图C为该传感器在4℃储存20天，每间隔5天测得的DPV响应值。图D是本发明传感器的重现性检测结果：同一批次5支不同电极在0.1M PBS中扫描的差分脉冲伏安图(DPV)对应柱状图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所用原料及试剂均为市售产品。除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。
实施例1
本发明实施例中用到的主要化学试剂如下：
重组MPT64蛋白购自德泰生物科技有限公司(南京，中国)。AQ-2-COOH和牛血清蛋白(BSA)购自百灵威科技有限公司(北京,中国)。链酶亲和素、氯金酸(HAuCl4)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)购自阿拉丁生化科技有限公司(上海，中国)。CMK-3购自先丰纳米材料科技有限公司(南京,中国)。硼氢化钠(NaBH4)购自成都市科龙化工试剂厂(成都,中国)。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自麦克林生化科技有限公司(上海,中国)。实验中所有的DNA序列均由上海生工有限公司合成纯化，具体序列见表1。
表1.本发明中涉及的核苷酸合成序列表
Figure BDA0003424931800000061
所用设备及技术参数：
在CHI 660E电化学工作站(上海辰华)中采用三电极系统进行循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)测量，其中三电极系统包括铂丝(对电极)、饱和甘汞电极(SCE,参比电极)和修饰后的玻碳电极(GCE,工作电极)。差分脉冲伏安图(DPV)是由三电极系统在0.1MPBS(pH＝7.0)中以100mV/s的扫描速率获得。
实施例1结核分枝杆菌MPT64抗原检测的电化学适体传感器的构建
按如下步骤操作(构建原理图如图1所示)：
步骤1：称取217.11mg Ce(NO3)3粉末，溶于1mL超纯水中，制成0.5M Ce(NO3)3水溶液。再称取将105.07mg均苯三甲酸粉末加入至现配的40mL体积比1比1的乙醇-水溶液中，在室温静置下滴入1mL 0.5M Ce(NO3)3水溶液，静置10min后，8000rpm 5min离心，沉淀用体积比1比1的乙醇-水溶液洗，室温下干燥，得海胆状Ce-MOF。
步骤2：称取8mgAQ-2-COOH溶于4mLDMF，形成2mg/mL的溶液。再称取4mg CMK-3溶于4mL超纯水，将4mL 1mg/mL的CMK-3水溶液滴入4mL 2mg/mL AQ-2-COOH DMF溶液中，室温搅拌24小时，10000rpm 5min离心，沉淀水洗数次，制得CMK-3/AQ-2-COOH纳米复合物，以超纯水重悬，定容为4mL。
步骤3：将1mL CMK-3/AQ-2-COOH水溶液与100μL HAuCl4(1wt％)共同搅拌20min，使其充分混匀。之后，逐滴加入200μL4 mg/mL的硼氢化钠水溶液，反应30min，8000rpm 5min离心，沉淀水洗数次，制得CMK-3/AQ-2-COOH/AuNPs复合物，以超纯水重新定容为1mL。
步骤4：将1mL CMK-3/AQ-2-COOH/AuNPs水溶液与溶于TES缓冲液的TCEP处理的150μL巯基标记信号探针SP(2μM)4℃搅拌12h，，离心得沉淀，以超纯水洗涤3次，获得示踪标记物(Tracer label)，用超纯水重新定容为1mL。
步骤5：用超纯水溶解MPT64重组蛋白分装于无酶管保存至-80℃备用。
步骤6：分别用0.3和0.05μm的氧化铝抛光粉抛光玻碳电极，然后以超纯水、无水乙醇和超纯水的顺序超声清洗电极表面直至获得镜面玻碳电极，在空气中晾干。
步骤7：称取步骤1所制备Ce-MOF 1mg，溶于2mL超纯水中，形成0.5mg/mL Ce-MOF水溶液。将10μL Ce-MOF(0.5mg mL-1)水溶液滴加至洁净的电极表面，在空气中晾干。
步骤8：将Ce-MOF修饰的玻碳电极通过30s电沉积金(1wt％HAuCl4)，将AuNPs修饰于Ce-MOF表面，形成Ce-MOF/AuNPs。
步骤9：滴加10μL链酶亲和素(100μg mL-1)于上述修饰的电极表面，4℃孵育12h；
步骤10：将孵育后的电极用超纯水水洗干净后，滴加20μL 2μM MPT64适体CP于电极表面，4℃孵育90min；超纯水冲洗干净后再滴加10μL 0.5％BSA，室温孵育30min；
步骤11：将孵育后的电极用超纯水水洗干净后，滴加20μL不同浓度的MPT64抗原于电极表面，室温孵育90min；
步骤12：将孵育后的电极水洗干净后，滴加15μLtracer label于电极表面，室温孵育1h，用超纯水冲洗干净。
实施例2利用电化学适体传感器检测MPT64抗原。
利用实施例1构建的电化学适体传感器检测MPT64抗原，按照如下步骤操作：
(1)标准曲线的绘制：
将实施例1构建的生物传感器的电极置于0.1M PBS溶液(含10mM KCl和2mMMgCl2)中表征，测量不同浓度MPT64的电流值。根据不同浓度MPT64对数值和DPV响应信号绘制标准曲线，检测结果表明两者在100fg/mL-10ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系，线性相关系数为0.9885，检测限为67.6fg/mL，结果详见图2。
(2)传感器特异性检测：
为了检测本发明传感器的特异性，对如下物质进行检测：目标MPT64(100pg/mL)、空白对照、生理盐水、DNA(10pM)、白蛋白(100pg/mL)、干扰素-α(100pg/mL)、葡萄糖(5mM)。在相同浓度及条件下测定的不同物质在0.1M PBS中电流响应值见图3(A)，图中结果表明本发明的生物传感器具有令人满意的特异性。
(3)传感器稳定性检测：
将传感器在最佳条件下连续扫描49圈CV后，其响应电流仍为初始电流的95.9％，结果详见图3(B)；将制备好的传感器置于4℃储存20天，结果发现储存10天后电流为初始电流的96.2％，储存20天之后电流值仍为初始电流的88.0％，结果详见图3(C)，以上数据表明该传感器具有可接受的稳定性。
(4)传感器重现性检测：
在相同条件下，使用本发明制备的同一批次的5支不同电极，对MPT64(1ng/mL)进行测定，结果详见图3(D)，其电流响应值的相对标准偏差(RSDs)为2％，说明传感器批内差异较小和重现性较好。

Claims (6)

1.一种用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器，其特征在于：以CMK-3/AQ-2-COOH纳米复合材料为信号响应，以铈基金属有机框架/金纳米粒子(Ce-MOF/AuNPs)为传感界面；所述CMK-3/AQ-2-COOH纳米复合材料的制备方法为：将AQ-2-COOH溶于DMF，再将CMK-3水溶液滴入AQ-2-COOH DMF溶液中，室温搅拌24小时，离心得沉淀，水洗，制得CMK-3/AQ-2-COOH纳米复合材料；所述Ce-MOF/AuNPs的制备方法为：将Ce-MOF滴加至洁净的电极表面，在空气中晾干；再通过30s电沉积金，将AuNPs修饰于Ce-MOF表面，形成Ce-MOF/AuNPs。
2.如权利要求1所述的电化学适体传感器，其特征在于：先制备铈基金属有机框架/金纳米粒子(Ce-MOF/AuNPs)传感界面，再制备信号响应纳米复合材料有序介孔碳CMK-3/蒽醌-2-羧酸纳米复合物(CMK-3/AQ-2-COOH)，然后制备示踪标记物(Tracer label)，最后构建用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器。
3.如权利要求2所述的电化学适体传感器，其特征在于：所述示踪标记物(Tracerlabel)的制备步骤为将CMK-3/AQ-2-COOH水溶液与HAuCl4(1wt％)混合混匀，滴加硼氢化钠水溶液，反应30min，8000rpm 5min离心，沉淀水洗，以超纯水重新定容制备CMK-3/AQ-2-COOH/AuNPs溶液；然后，将TES缓冲液溶解的2μM巯基标记适体SP与CMK-3/AQ-2-COOH/AuNPs溶液在冰浴条件下反应12h，离心后沉淀水洗，以超纯水定容制得示踪标记物(Tracerlabel)。
4.如权利要求3所述的电化学适体传感器，其特征在于：所述构建用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器的方法为：将Ce-MOF溶液滴加至洁净的电极表面，晾干；通过30s电沉积金，将AuNPs修饰于Ce-MOF表面，形成Ce-MOF/AuNPs；然后将链酶亲和素滴加于修饰的电极表面，4℃孵育12h；再用超纯水洗干净后，滴加MPT64适体CP于电极表面，4℃孵育90min，超纯水冲洗干净后再滴加0.5％BSA，室温孵育30min；接下来水洗干净后，滴加用超纯水溶解的MPT64抗原于电极表面，室温孵育90min；最后水洗干净后，滴加tracer label于电极表面，室温孵育1h，得到用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器。
5.一种用于结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测的电化学适体传感器，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：称取Ce(NO3)3粉末，溶于超纯水中，制成0.5M Ce(NO3)3水溶液；再称取将均苯三甲酸粉末加入至现配的体积比1：1的乙醇-水溶液中，在室温静置下滴入0.5M Ce(NO3)3水溶液，静置10min后，8000rpm 5min离心，沉淀用体积比1：1的乙醇-水溶液洗涤，室温下干燥，得Ce-MOF；
步骤2：称取AQ-2-COOH溶于DMF，形成2mg/mL的溶液；再称取CMK-3溶于超纯水，将1mg/mL的CMK-3水溶液滴入2mg/mLAQ-2-COOH DMF溶液中，室温搅拌24小时，10000rpm 5min离心得沉淀，水洗，然后用超纯水复溶制得CMK-3/AQ-2-COOH水溶液；
步骤3：将HAuCl4(1wt％)加入到CMK-3/AQ-2-COOH水溶液中搅拌20min，再加入4mg/mL的硼氢化钠水溶液反应30min，8000rpm 5min离心得沉淀，水洗，然后用超纯水复溶制得CMK-3/AQ-2-COOH/AuNPs水溶液；
步骤4：将CMK-3/AQ-2-COOH/AuNPs水溶液与溶于TES缓冲液的TCEP处理的巯基标记信号探针SP(2μM)混合，4℃搅拌12h，离心得沉淀，以超纯水洗涤3次，获得示踪标记物(Tracerlabel)；
步骤5：用超纯水溶解MPT64重组蛋白分装于无酶管保存至-80℃备用；
步骤6：分别用0.3和0.05μm的氧化铝抛光粉抛光玻碳电极，然后以超纯水、无水乙醇和超纯水的顺序超声清洗电极表面直至获得镜面玻碳电极，在空气中晾干；
步骤7：称取步骤1所制备Ce-MOF溶于超纯水中，形成0.5mg/mL Ce-MOF水溶液；将Ce-MOF(0.5mg mL-1)水溶液滴加至洁净的电极表面，在空气中晾干；
步骤8：将步骤7制备的Ce-MOF修饰的玻碳电极通过30s电沉积金(1wt％HAuCl4)，将AuNPs修饰于Ce-MOF表面，形成Ce-MOF/AuNPs；
步骤9：滴加链酶亲和素(100μg mL-1)于步骤8制备的电极表面，4℃孵育12h；
步骤10：将步骤9孵育后的电极用超纯水洗干净后，滴加MPT64适体CP于电极表面，4℃孵育90min；超纯水冲洗干净后再滴加0.5％BSA，室温孵育30min；
步骤11：将步骤10孵育后的电极用超纯水冲洗干净后，滴加MPT64抗原于电极表面，室温孵育90min；
步骤12：将步骤11孵育后的电极用超纯水冲洗干净后，滴加tracer label于电极表面，室温孵育1h，超纯水冲洗干净。
6.一种利用权利要求1-5任一项所述传感器检测结核分枝杆菌特异性抗原MPT64的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)向所述的传感器的电极上滴加不同浓度的目标物MPT64；
2)将电极置于含有10mM KCl和2mM MgCl2的0.1M PBS溶液中进行表征，测量不同浓度MPT64的电流值；
3)根据步骤2)不同浓度MPT64对数值和DPV响应信号绘制标准曲线；
4)将待测样品用所述的传感器检测，将得到的电流值通过步骤3)制得的工作曲线计算得到待测样品的MPT64浓度。
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