CN110749635A - 纳米复合材料、电化学microRNA生物传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以铁基金属有机框架(MOF)和端氨基树枝状大分子(PAMAM)功能化富勒烯(C60)新型纳米复合材料C60@PAMAM‑MOF。还公开了一种电化学microRNA生物传感器的制备方法及应用,该生物传感器将纳米金固载在上述材料C60@PAMAM‑MOF中,并与巯基标记的信号探针混合搅拌,通过Au‑S键结合制备生物传感器的示踪标记物,还将捕获探针固载在壳聚糖‑乙炔黑和铂金壳核纳米粒组装的传感界面上,并利用核酸杂交构建检测miR‑3675‑3p的生物传感器。本发明以C60@PAMAM‑MOF为纳米探针制备的传感器不仅具有更强的信号放大作用,而且还具有线性范围宽、特异性强和分析时间短等优点,可为特发性肺纤维化的诊断提供一种新方法。
Description
技术领域
本发明涉及纳米复合材料、电化学microRNA生物传感器技术领域,具体涉及一种C60@PAMAM-MOF新型纳米复合材料,以及一种夹心型电化学microRNA生物传感器制备方法及应用。
背景技术
特发性肺纤维化是一种以肺实质纤维破坏为特征的严重肺部疾病,其准确的诊断一直困扰着人类。迄今,随着特发性肺纤维化发病率逐年上升,甚至高于某些癌症故又被称为“不是癌症的癌症”,但导致该病的原因大多都与肺上皮细胞和成纤维细胞增生、积聚和损伤有关。microRNA是目前用于疾病诊断研究最为广泛的血清学生物标志物,它是一类内源性非编码小分子RNA,在特发性肺纤维化患病初期会出现上皮细胞的损伤和纤维化等,这些均导致microRNA的异常表达。研究表明,血清中miR-3675-3p在特发性肺纤维化中明显升高且未在其他疾病中有相似的表达谱,可能是特发性肺纤维化的特异性microRNA。因此,测定血清中的miR-3675-3p对于特发性肺纤维化的诊断具有重要意义。
目前microRNA的检测方法主要有Northern印迹杂交法(Northern blotting)、定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、微阵列芯片法和原位杂交等,虽然灵敏度高但存在如耗时、成本高、设备昂贵和操作繁琐等不足,因此开发一种简便、灵敏、快速和经济的方法用于临床标本microRNA的检测是非常有必要的。
电化学生物传感器是使用最广泛的一类传感器,因其灵敏度高、操作简单和快速经济等特点,已被广泛的应用于microRNA检测。但由于microRNA序列短、丰度低和电信号较小,常常需要构建“基于纳米材料信号放大技术的生物传感器”检测microRNA。因此,本发明构建了以C60@PAMAM-MOF为纳米信号放大材料的夹心型电化学microRNA生物传感器,用于检测血清中miR-3675-3p。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题,本发明提供一种C60@PAMAM-MOF新型纳米复合材料,以及一种夹心型电化学microRNA生物传感器制备方法及应用。
根据本发明的第一方面,提供一种C60@PAMAM-MOF新型纳米复合材料,通过相转移法由如下步骤制备:(1)制备PAMAM-MOF溶液:将MOF溶于超纯水中,加入PAMAM室温搅拌过夜(搅拌约9-11h),然后对混合溶液离心、洗涤并分散至超纯水中获得PAMAM-MOF溶液;(2)制备C60@PAMAM-MOF溶液:在PAMAM-MOF溶液中加入乙醇混匀,将混匀后溶液加入至C60甲苯溶液中室温搅拌30h,离心获得的沉淀物分别用无水乙醇和超纯水洗涤并分散至超纯水中,即得C60@PAMAM-MOF纳米复合材料。
本发明首次利用相转移法成功合成了铁基金属有机框架(MOF)和端氨基树枝状大分子(PAMAM)功能化富勒烯(C60)的新型纳米复合物C60@PAMAM-MOF,并将其首次作为氧化还原探针用于电化学microRNA生物传感器的信号放大材料。该新型纳米复合材料C60@PAMAM-MOF相比于直接搅拌法合成的NC60@PAMAM-MOF和无MOF的C60@PAMAM具有更强的信号放大作用,一方面主要是因为在MOF和C60之间的协同作用促使其产生更高的响应信号;另一方面C60@PAMAM-MOF表面具有更多丰富的氨基基团,可通过Au-N键吸附更多的纳米金,加速电子的转移速率增强导电性实现信号放大。
在本发明的一种优选方案中,所述步骤(1)中MOF的浓度为0.25-4mg/mL,PAMAM的使用量为100-200μL;所述步骤(2)中乙醇的使用量为20mL,所述C60甲苯溶液的浓度为1mg/mL。
在本发明的一种优选方案中,所述步骤(2)中洗涤沉淀物的步骤为依次用无水乙醇、无水乙醇和超纯水洗涤。
根据本发明的第二方面,提供一种用于检测miR-3675-3p的电化学microRNA生物传感器的制备方法,包括如下步骤:(1)将电极表面进行预处理,得到洁净的电极;(2)将壳聚糖-乙炔黑(CS-AB)分散液滴加至洁净的电极表面,并于空气中晾干;(3)将铂金壳核纳米粒(Pt@AuNPs)滴加至干燥的电极表面,并于空气中晾干;(4)将捕获探针滴加至干燥的电极表面,并将电极室温孵育12h,然后用超纯水冲洗干净后滴加牛血清白蛋白(BSA)再次室温孵育45min;(5)将步骤(4)获得的电极用DEPC水冲洗干净后,滴加不同浓度miR-3675-3p于电极表面,于37℃孵育2h;(6)将步骤(5)获得的电极用DEPC水冲洗干净后,将示踪标记物(Tracer label)滴加至电极表面,再于37℃孵育2h,即获得用于检测miR-3675-3p的电化学microRNA生物传感器,其中,所述步骤(6)中的所述Tracer label采用上述的C60@PAMAM-MOF纳米复合材料制备。
本发明以壳聚糖-乙炔黑(CS-AB)和铂金壳核纳米粒(Pt@AuNPs)层层自组装作为传感界面,进一步增强了导电性和提供更多的活性结合位点,能将捕获探针更多的固定在电极表面进一步与信号探针杂交实现信号放大。此外,本发明的生物传感器以CS-AB和Pt@AuNPs为传感界面、以新型纳米复合材料C60@PAMAM-MOF为氧化还原探针,三者协同放大传感器的信号能够实现对miR-3675-3p的超灵敏检测,为特发性肺纤维化患者早期诊断提供新的诊断途径。
在本发明的一种优选方案中,所述步骤(1)对电极表面的预处理为:分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉在麂皮上抛光电极,再以超纯水、无水乙醇和超纯水的顺序超声清洗电极直至呈镜面,然后在空气中晾干得到洁净的电极。
在本发明的一种优选方案中,所述步骤(2)的CS-AB分散液的制备方法为:将乙炔黑粉末加入至现配的壳聚糖乙酸溶液中,超声处理得到CS-AB分散液;所述步骤(3)的Pt@AuNPs纳米粒的制备方法为:将纳米金(AuNPs)加入超纯水中并加热至80℃,然后迅速加入1%H2PtCl6溶液剧烈搅拌,再逐滴加入1%AA,溶液迅速变成黑色继续加热回流至颜色不再变化,停止加热,冷却至室温即得到Pt@AuNPs纳米粒。
在本发明的一种优选方案中,所述步骤(6)的所述示踪标记物的制备方法为:将1%HAuCl4加入至所述C60@PAMAM-MOF中,搅拌15分钟,随后缓慢滴加4mg/mL NaBH4溶液继续反应40分钟,反应后的混合液离心、洗涤,并分散至5mL超纯水中;最后将三(2-羧乙基)膦盐酸盐处理过的2μM巯基标记的信号探针加入至上述溶液中,于4℃下反应12h,然后用超纯水离心洗涤,即获得所述示踪标记物;其中,所述信号探针的序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种优选方案中,所述步骤(2)的CS-AB分散液的滴加量为6μL;所述步骤(3)的Pt@AuNPs纳米粒的滴加量为6μL;所述步骤(4)的捕获探针的浓度为2μM滴加量为20μL,所述捕获探针的序列如SEQ ID NO.3所示;所述BSA浓度为0.25%滴加量为20μL;所述步骤(6)的示踪标记物的滴加量为20μL。
根据本发明的第三方面,提供一种利用上述的电化学microRNA生物传感器检测miR-3675-3p的方法,包括以下步骤:
(1)将所述电化学microRNA生物传感器用DEPC水冲洗干净后,滴加4μL10mM TOAB于电极表面晾干,并将电极置于0.1M PBS溶液中表征,测量不同浓度miR-3675-3p的电流变化值;
(2)根据不同浓度对数值与电流变化值呈线性关系,绘制标准曲线;
(3)将待测样品用所述电化学microRNA生物传感器检测,将得到的电流值通过所述标准曲线计算得到待测样品中的miR-3675-3p的浓度。
综上所述,由于采用了上述技术方案,本发明的有益效果为:
1、本发明首次利用相转移法成功合成了铁基金属有机框架(MOF)和端氨基树枝状大分子(PAMAM)功能化富勒烯(C60)新型纳米复合物C60@PAMAM-MOF,并首次将其作为生物传感器的氧化还原探针来检测miR-3675-3p,显示出较强的信号放大作用。
2、本发明通过将纳米金固载在C60@PAMAM-MOF材料中,并与巯基标记的信号探针混合搅拌,通过Au-S键结合制得示踪标记物,方法简单,且本发明采用新型纳米复合物C60@PAMAM-MOF制备的示踪标记物可应用于各种不同生物传感器。
3、本发明生物传感器以CS-AB和Pt@AuNPs为传感界面,一方面增加了电极的导电性,另一方面能固载更多的捕获探针,与示踪标记物杂交协同放大传感器的信号,进而提高电化学microRNA传感器的灵敏度和检测范围。并且,本发明制得的生物传感器还具有线性范围宽、特异性强、分析时间短,稳定性和重现性好等优点。
4、本发明中涉及的实验材料易获取、可在实验室条件下完成,且整个检测分析步骤较清晰,检测限可达fM级别。
本发明制备的电化学microRNA生物传感器有望为特发性肺纤维化的诊断提供一种新途径。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明纳米复合材料C60@PAMAM-MOF的制备及采用该材料制备Tracer label的示意图。
图2为本发明纳米复合材料NC60@PAMAM-MOF的制备及采用该材料制备Tracerlabel的示意图。
图3为对比例1的纳米复合材料C60@PAMAM的制备及采用该材料制备Tracer label的示意图。
图4为构建本发明电化学microRNA生物传感器的示意图。
图5为采用本发明实施例1和2以及对比例1的材料制备的生物传感器在0.1M PBS中扫描的差分脉冲伏安(DPV)图。
图6A本发明传感器对不同浓度miR-3675-3p扫描的差分脉冲伏安(DPV)图;图6B为不同浓度miR-3675-3p对数值与传感器DPV响应值的校准曲线。
图7为本发明传感器的特异性检测结果。
图8为本发明传感器的在0.1M PBS(pH=7.0)中扫描30圈后的循环伏安图。
图9A和图9B为本发明传感器的重现性检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明,但并不因此而限制本发明。下述实施例中的实验方法,如无特别说明,均为常规方法。
本发明实施例中用到的主要化学试剂如下:
C60粉末购自先丰纳米材料科技有限公司(南京,中国)。乙炔黑(AB)购自艾维信化工科技有限公司(天津,中国)。端氨基树枝状大分子(PAMAM,G5.0),氯金酸(HAuCl4),氯铂酸(H2PtCl6)和2-氨基对苯二甲酸购自Sigma(美国)。壳聚糖(CS),抗坏血酸(AA),硼氢化钠(NaBH4)和柠檬酸三钠二水合物购自成都市科龙化工试剂厂(成都,中国)。三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和三氯化铁六水合物(FeCl3·6H2O)购自Aladdin。四辛基溴化铵(TOAB)购自源叶生物科技有限公司(上海,中国)。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自麦克林生化科技有限公司(上海,中国)。牛血清白蛋白(BSA)购自百灵威科技有限公司(北京,中国)。实验中所有的microRNA和DNA序列均由上海生工有限公司合成纯化,具体序列见表1。
表1本发明中涉及的核苷酸合成序列表
本发明的捕获探针和信号探针均经巯基修饰。
本发明所用设备及技术参数:
在CHI 660E电化学工作站(上海辰华)中采用三电极系统进行循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)测量,其中三电极系统包括铂丝(对电极)、饱和甘汞电极(SCE,参比电极)和修饰后的玻碳电极(GCE,工作电极)。差分脉冲伏安图(DPV)是由三电极系统在0.1MPBS(pH=7.0)中以100mV/s的扫描速率获得。
实施例1本发明纳米复合材料C60@PAMAM-MOF和Tracer label 1的制备
称取0.187g FeCl3·6H2O和0.126g二氨基对苯二甲酸溶于15mL DMF溶液中,随后加入207μL乙酸超声处理使其混合均匀;将上述的混合溶液转移至反应瓶并在120℃硅油中持续搅拌反应4h,反应冷却至室温后依次用DMF和乙醇离心洗涤3次除去多余的溶剂即得MOF。
称取上述制备的5mg MOF溶于5mL超纯水获得棕红色溶液,加入200μL PAMAM溶液颜色立马由棕红色变为亮黄色,室温搅拌过夜后,用超纯水以10000rpm离心8min洗涤3次除去未结合的PAMAM,分散至超纯水中即得PAMAM-MOF溶液。
在上述PAMAM-MOF溶液中加入20mL乙醇超声混匀后,加入至C60甲苯溶液(C60的浓度1mg mL-1)中,室温搅拌30h,以无水乙醇、无水乙醇和超纯水的顺序洗涤除去未结合的反应物,最后分散至5mL超纯水中即得C60@PAMAM-MOF。
采用C60@PAMAM-MOF材料制备示踪标记物(Tracer label):将1mL 1%HAuCl4加入至上述制备好的C60@PAMAM-MOF纳米复合材料中室温搅拌15min,随后逐滴加入2mL NaBH4(4mg mL-1)搅拌40min,然后以8000rpm离心8min去除未结合的AuNPs,再将沉淀物分散至5mL超纯水中;最后加入1mL TCEP处理的信号探针(2μM)搅拌过夜,超纯水离心洗涤3次获得示踪标记物(Tracer label),记为Tracer label 1。
图1具体示出了本发明的C60@PAMAM-MOF制备过程及对应Tracer label的制备过程。
对比例1
利用类似方法制备无MOF的PAMAM功能化C60(C60@PAMAM)。即,在5mL超纯水中加入200μL PAMAM再加入20mL乙醇混匀后,加入至C60甲苯溶液(C60的浓度为1mg mL-1)中,室温搅拌30h,以无水乙醇、无水乙醇和超纯水的顺序洗涤除去未结合的反应物,最后分散至5mL超纯水中获得C60@PAMAM。
采用C60@PAMAM材料制备示踪标记物(Tracer label):方法与实施例1中制备Tracer label相同,制得的示踪标记物(Tracer label)记为Tracer label 3。
图3具体示出了对比例1的C60@PAMAM制备过程及对应Tracer label的制备过程。
实施例2本发明纳米复合材料NC60@PAMAM-MOF和Tracer label 2的制备
将对比例1中制备的5mL C60@PAMAM溶液加入至MOF溶液(1mg mL-1)中室温搅拌30h,超纯水洗涤3次后分散至超纯水中即得NC60@PAMAM-MOF。
采用NC60@PAMAM-MOF材料制备示踪标记物(Tracer label):方法与实施例1中制备Tracer label相同,制得的示踪标记物(Tracer label)记为Tracer label2。
图2具体示出了本发明的NC60@PAMAM-MOF制备过程及对应Tracer label的制备过程。如图2所示,在直接搅拌法制备NC60@PAMAM-MOF过程中,C60变成了针状结构。
实施例3本发明电化学microRNA生物传感器的构建
制备CS-AB分散液:称取1mg乙炔黑粉末加入至现配的壳聚糖乙酸溶液中,超声处理得到壳聚糖-乙炔黑分散液(CS-AB),备用。
制备Pt@AuNPs:将1mL 1%HAuCl4溶液加入至100mL超纯水中煮沸,然后迅速加入2.5mL 1%柠檬酸三钠溶液继续煮沸15分钟,冷却后用超纯水恢复至原体积得透明的酒红色溶液即为纳米金(AuNPs)。将20mL AuNPs加入至30mL超纯水加热至80℃后,迅速加入2.5mL 1%H2PtCl6溶液剧烈搅拌,再逐滴加入1.75mL 1%AA,溶液迅速变成黑色继续加热回流至颜色不再变化,停止加热冷却至室温即得到Pt@Au壳-核纳米粒(Pt@AuNPs),备用。
其他样品和材料准备:用DEPC水溶解miR-3675-3p分装于无酶管保存至-80℃;用含10mM TCEP的TES缓冲液溶解巯基修饰的捕获探针并保存于-20℃中,备用。
本发明电化学microRNA生物传感器的具体构建步骤如下:
步骤1:分别用0.3和0.05μm的氧化铝抛光粉抛光玻碳电极,然后以超纯水、无水乙醇和超纯水的顺序超声清洗电极表面直至获得镜面玻碳电极,在空气中晾干。
步骤2:滴加6μL CS-AB分散液于洁净的电极表面,在空气中晾干。
步骤3:滴加6μL Pt@AuNPs于步骤2获得的干燥的电极表面,在空气中晾干。
步骤4:滴加20μL捕获探针于步骤3获得的干燥的电极表面,室温孵育12h;将孵育后的电极用超纯水冲洗干净后,滴加20μL 0.25%BSA于电极表面室温孵育45min。
步骤5:将步骤4孵育后的电极用DEPC水冲洗干净,滴加20μL不同浓度miR-3675-3p于孵育后的电极表面,37℃孵育2h。
步骤6:将步骤5孵育后的电极用DEPC水冲洗干净,滴加20μL Tracer label于孵育后的电极表面,37℃孵育2h,用DEPC水冲洗干净,即得用于检测miR-3675-3p的电化学microRNA生物传感器。
图4示出了本发明电化学microRNA生物传感器具体构建过程。图5示出了利用实施例1-2和对比例1三种材料制备的Tracer label制备成生物传感器后,在0.1M PBS中扫描的差分脉冲伏安(DPV)图。结果表明,相比于无MOF的纳米材料C60@PAMAM,采用本发明相转移法合成的纳米复合材料C60@PAMAM-MOF和直接搅拌法合成的纳米复合材料NC60@PAMAM-MOF制作的生物传感器对miR-3675-3p电流响应值均较高。其中,以本发明C60@PAMAM-MOF为氧化还原探针的生物传感器,显示最强的信号放大作用。
实施例4本发明电化学microRNA生物传感器的应用
采用实施例3构建的电化学microRNA传感器检测miR-3675-3p,按照如下步骤操作:
(1)标准曲线的绘制:
在实施例3构建的microRNA生物传感器上滴加4μL 10mM TOAB于电极表面,并将电极置于0.1M PBS溶液(含10mM KCl和2mM MgCl2)中表征,测量不同浓度miR-3675-3p的电流值。根据不同浓度miR-3675-3p对数值和DPV响应信号绘制标准曲线。
本发明传感器对不同浓度miR-3675-3p的检测结果如图6A和图6B所示。图6A为在0.1M PBS(pH=7.0)中传感器对不同浓度miR-3675-3p扫描的差分脉冲伏安图(DPV)图中,a至h分别对应0、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM和10nM不同浓度的miR-3675-3p检测结果。图6B为不同浓度miR-3675-3p的对数值与传感器DPV响应值的校准曲线,检测结果表明miR-3675-3p对数值与传感器DPV响应值两者在miR-3675-3p的10fM-10nM浓度范围内呈良好的线性关系,线性相关系数为0.9976,检测限为2.99fM。
(2)将待测样品用所述电化学microRNA生物传感器检测,将得到的电流值通过所述标准曲线计算得到待测样品中的miR-3675-3p的浓度。
实施例5本发明电化学microRNA生物传感器的性能检测
对采用实施例1的纳米复合材料制备电化学microRNA生物传感器进行特异性、稳定性和重现性检测。
(1)传感器特异性检测:
为了检测本发明传感器的特异性,对如下microRNA进行检测:目标microRNA(miR-3675-3p,100pM)、混合microRNA(miR-3675-3p+Let-7d-5p,100pM)、单碱基错配microRNA(SBM,100pM)、其他microRNA(Let-7d-5p,100pM)和空白对照。在相同浓度及条件下测定的不同干扰microRNA在0.1M PBS中电流响应值见图7,图7中样品a至e分别对应于上述目标microRNA(miR-3675-3p,100pM)、混合microRNA(miR-3675-3p+Let-7d-5p,100pM)、单碱基错配microRNA(SBM,100pM)、其他microRNA(Let-7d-5p,100pM)和空白对照。如图7所示,目标microRNA(miR-3675-3p)电流响应值最高,表明本发明的生物传感器具有令人满意的特异性。
(2)传感器稳定性检测:
将制备好的传感器置于4℃储存14天,结果发现储存7天后电流为初始电流的97.92%,储存14天之后电流值仍为初始电流的82.11%;将传感器在最佳条件下连续扫描30圈CV后,其响应电流仍为初始电流的93.73%。本发明传感器在0.1M PBS(pH=7.0)中扫描30圈后的循环伏安图结果详见图8。以上数据表明该传感器具有可接受的稳定性。
(3)传感器重现性检测:
在相同条件下,使用本发明制备的同一批次的5支不同电极,对miR-3675-3p(10pM)进行测定,结果详见图9A和图9B。图9A为同一批次5支不同电极在0.1M PBS中扫描的差分脉冲伏安(DPV)图;图9B为对应图9A重现性结果的柱状图。检测结果显示,同一批次的5支不同电极对miR-3675-3p电流响应值相近,其相对标准偏差(RSD)为2.35%,说明本发明生物传感器批内差异较小,重现性较好。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 重庆医科大学
<120> 一种纳米复合材料、电化学microRNA生物传感器的制备方法及应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
caucucuaag gaacuccccc aa 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagguagua gguugcauag uu 22
<210> 3
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>捕获探针
<400> 3
ccttagagat g 11
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>与纳米材料结合的信号探针序列
<400> 4
ttgggggagt t 11
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>与靶基因相对应的单碱基错配序列
<400> 5
caucucuaag gaacucaccc aa 22
Claims (9)
1.一种C60@PAMAM-MOF纳米复合材料,其特征在于,通过相转移法以如下步骤制备:
(1)制备PAMAM-MOF溶液:将MOF溶于超纯水中,加入PAMAM室温搅拌9-11h,然后对混合溶液离心、洗涤并分散至超纯水中,获得PAMAM-MOF溶液;
(2)制备C60@PAMAM-MOF溶液:在PAMAM-MOF溶液中加入乙醇混匀,将混匀后溶液加入至C60甲苯溶液中室温搅拌30-36h,离心获得的沉淀物分别用无水乙醇和超纯水洗涤并分散至超纯水中,即得C60@PAMAM-MOF纳米复合材料。
2.根据权利要求1所述的C60@PAMAM-MOF纳米复合材料,其特征在于,所述步骤(1)中MOF的浓度为0.25-4mg/mL,PAMAM的使用量为100-200μL;所述步骤(2)中乙醇的使用量为20mL,所述C60甲苯溶液的浓度为1mg/mL。
3.根据权利要求1所述的C60@PAMAM-MOF纳米复合材料,其特征在于,所述步骤(2)中洗涤沉淀物的步骤为:依次用无水乙醇、无水乙醇和超纯水洗涤。
4.一种用于检测miR-3675-3p的电化学microRNA生物传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将电极表面进行预处理,得到洁净的电极;
(2)将CS-AB分散液滴加至洁净的电极表面,并于空气中晾干;
(3)将Pt@AuNPs纳米粒溶液滴加至步骤(2)获得的干燥的电极表面,并于空气中晾干;
(4)将巯基修饰的捕获探针滴加至步骤(3)获得的干燥的电极表面,并将电极室温孵育10-12h,然后用超纯水冲洗干净后滴加BSA溶液,再次室温孵育30-60min;
(5)将步骤(4)获得的电极用DEPC水冲洗干净后,滴加不同浓度miR-3675-3p于电极表面,于25-45℃下孵育0.5-3h;
(6)将步骤(5)获得的电极用DEPC水冲洗干净后,将示踪标记物滴加至电极表面,再于37℃下孵育2h,即获得用于检测miR-3675-3p的电化学microRNA生物传感器,
其中,所述步骤(6)中的所述示踪标记物采用如权利要求1-3任一项所述的C60@PAMAM-MOF纳米复合材料制备。
5.根据权利要求4所述的电化学microRNA生物传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)对电极表面的预处理为:分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉在麂皮上抛光电极,再以超纯水、无水乙醇和超纯水的顺序超声清洗电极直至电极表面呈镜面,然后在空气中晾干得到洁净的电极。
6.根据权利要求4所述的电化学microRNA生物传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)的CS-AB分散液的制备方法为:将乙炔黑粉末加入至现配的壳聚糖乙酸溶液中,超声处理得到CS-AB分散液;
所述步骤(3)的Pt@AuNPs纳米粒溶液的制备方法为:将纳米金(AuNPs)加入超纯水中并加热至80℃,然后迅速加入1%H2PtCl6溶液剧烈搅拌,再逐滴加入1%AA,溶液迅速变成黑色继续加热回流至颜色不再变化,停止加热,冷却至室温即得到Pt@AuNPs纳米粒溶液。
7.根据权利要求4所述的电化学microRNA生物传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(6)的所述示踪标记物的制备方法为:将1%HAuCl4加入至所述C60@PAMAM-MOF纳米复合材料中,室温搅拌15-20min;随后缓慢滴加4mg/mL NaBH4溶液继续反应40-60min,反应后的混合液离心洗涤并分散至超纯水中;再将三(2-羧乙基)膦盐酸盐处理过的2μM巯基标记的信号探针加入至上述溶液中,于4℃下反应10-12h,然后用超纯水离心洗涤,即获得所述示踪标记物;其中,所述信号探针的序列如SEQ ID NO.4所示。
8.根据权利要求4所述的电化学microRNA生物传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)的CS-AB分散液的滴加量为6μL;所述步骤(3)的Pt@AuNPs纳米粒的滴加量为6μL;所述步骤(4)的捕获探针的浓度为2μM,滴加量为20μL,所述捕获探针的序列如SEQ ID NO.3所示;所述BSA浓度为0.25-1%,滴加量为20μL;所述步骤(6)的示踪标记物的滴加量为20μL。
9.一种利用权利要求4-8任一项所述的电化学microRNA生物传感器检测miR-3675-3p的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将所述电化学microRNA生物传感器用DEPC水冲洗干净后,滴加4μL10mM TOAB于电极表面晾干,并将电极置于0.1M PBS溶液中表征,测量不同浓度miR-3675-3p的电流变化值;
(2)根据不同浓度对数值与电流变化值呈线性关系,绘制标准曲线;
(3)将待测样品用所述电化学microRNA生物传感器检测,将得到的电流值通过所述标准曲线计算得到待测样品中的miR-3675-3p的浓度。
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