CN112858432B - 一种用于检测肌氨酸的生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测肌氨酸的生物传感器及其制备方法和应用，包括工作电极，工作电极包括玻碳电极表面包覆有MoS2层、信号标志段和与肌氨酸特异性结合的捕获探针ssDNA；捕获探针ssDNA固定在MoS2层上，信号标志段为含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子信号标志段通过修饰ssDNA与捕获探针ssDNA连接。本发明的生物传感器，灵敏度高，对肌氨酸的检测限低，检测方便，特异性好，应用前景好；工艺简单，条件温和，成本较低，极具应用前景。

Description

一种用于检测肌氨酸的生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于新型功能材料及生物传感检测技术领域，涉及一种用于检测肌氨酸的生物传感器及其制备方法和应用，特别涉及一种基于纳米信号放大的超灵敏检测肌氨酸的生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
肌氨酸(N-甲基甘氨酸)是甘氨酸代谢的中间体。近年来，肌氨酸主要被认为是一种前列腺癌生物标志物。它被认为是转移过程中差异性增加的代谢物,肌氨酸在转移性前列腺癌细胞中的作用已被揭示。越来越多的证据表明，肌氨酸可以用来监测前列腺癌的进展。
目前评估前列腺癌风险，通常会通过检测血液中肌氨酸水平来进行。
目前测定肌氨酸的方法较多，如放射免疫分析法、酶免疫分析法、化学发光免疫法、电化学免疫分析方法以及核磁共振波谱检查法。有的方法需要昂贵的仪器，有的方法需要专业训练的操作人员，有的方法灵敏度有待提高。而电化学免疫分析方法所需仪器设备简易、操作方便、成本低廉、特异性强，是目前检测肌氨酸的首选方法。
但目前困扰肌氨酸检测电化学免疫分析方法发展的一个核心难点在于信号标志物的信号强度有限，这导致电化学传感器灵敏度较低，从而极大地限制了电化学传感器的性能的进一步提升。
电极作为电化学传感器的核心，应用纳米材料或者是复合材料等来制备修饰电极，使得电极更为功能化，一定程度上能够提高肌氨酸电化学传感器的灵敏度，但同样也存在一定的不足，如其特异性有待增强。
因此，开发一种灵敏度高且特异性好的肌氨酸电化学传感器极具现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有肌氨酸电化学免疫传感器灵敏度低、特异性较差的缺陷，提供一种灵敏度高且特异性好的肌氨酸电化学传感器。本发明的生物传感器通过硅粒子信号放大以达到增强标志物信号强度，进而提升传感器灵敏度，同时其具有良好的特异性，极具应用前景。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于检测肌氨酸的生物传感器，包括工作电极，所述工作电极包括玻碳电极表面包覆有MoS2(二硫化钼)层、信号标志段和与肌氨酸特异性结合的捕获探针ssDNA(单链DNA)；
所述捕获探针ssDNA固定在MoS2(二硫化钼)层上，所述信号标志段为含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子(SiO2@Fc@修饰ssDNA)，所述信号标志段通过修饰ssDNA与捕获探针ssDNA连接；
所述捕获探针ssDNA含有如下所示的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
5’-CCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTCGGGACGACCACGCAAATACGAATAGTGTGAACGCGGGAGTCCCG-3’。
具体地，捕获探针ssDNA的核苷酸序列为：
5’-CCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTCGGGACGACCACGCAAATACGAATAGTGTGAACGCGGGAGTCCCG-3’。捕获探针ssDNA的序列是肌氨酸的特异性识别基因序列，使用该序列制备的DNA传感器对肌氨酸的检测具有高灵敏度和精确度的优点。
本发明的一种用于检测肌氨酸的生物传感器，是基于硅纳米粒子信号放大一步法实现对肌氨酸的检测，其具体是利用油包水法制得二氧化硅颗粒吸附二茂铁形成的SiO2@Fc粒子实现对Fc的信号放大，有效提高检测灵敏度，同时通过合成肌氨酸特异性识别基因序列作为捕获探针ssDNA，与互补修饰ssDNA片段形成杂交体系，以二茂铁作为杂交指示剂，构建用于肌氨酸检测的DNA传感器，实现了对前列腺特异性抗原肌氨酸的灵敏检测，此外，选用MoS2(二硫化钼，纳米尺寸的MoS2具有比表面积大、吸附能力强、反应活性高、能带宽度大、易修饰等优点)层作为吸附单链DNA的材料，一方面其解吸附的DNA更多，能够增强传感器的灵敏度，另一方面其稳定性更佳。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种用于检测肌氨酸的生物传感器，所述SiO2(二氧化硅)粒子的粒径为100～150nm。
如上所述的一种用于检测肌氨酸的生物传感器，所述修饰ssDNA含有如下所示的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：
HOOC(羧基)-5’-TTTTTTTTTTCGGGACTCCC-3’。
具体地，修饰ssDNA的核苷酸序列为：
HOOC(羧基)-5’-TTTTTTTTTTCGGGACTCCC-3’。修饰ssDNA是为了将SiO2@Fc连上捕获探针ssDNA，其中修饰ssDNA可与捕获ssDNA形成双螺旋结构。
本发明还提供制备如上所述的一种用于检测肌氨酸的生物传感器的方法，先将MoS2修饰到清洁的玻碳电极表面，而后将捕获探针ssDNA和polyC(多聚胞嘧啶核苷酸)滴加到修饰好的电极上孵育，最后将含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子滴加到电极上孵育，即得所述用于检测肌氨酸的生物传感器。
作为优选的技术方案：
如上所述的方法，所述polyC含有如下所示的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：
5’-CCCCCCCCCCCCCCC-3’。
具体地，polyC的核苷酸序列为：
5’-CCCCCCCCCCCCCCC-3’。捕获探针ssDNA与polyC结合后因polyC与MoS2存在的相互作用即吸附在包覆有MoS2(二硫化钼)层的玻碳电极上，完成捕获探针ssDNA在电极上的固定，同时单独的polyC短链封闭电极上的活性位点。
所述清洁的玻碳电极，具体是指经如下处理的玻碳电极：将玻碳电极(Φ＝2mm)依次用0.3μm、0.05μm的Al2O3(三氧化二铝)抛光粉将电极表面抛成镜面，再用无水乙醇、去离子水超声清洗5min，氮气吹干备用。
如上所述的方法，具体包括如下步骤：
(1)将10～14μL的浓度为20μg/mL的MoS2悬浊液(将20μg MoS2分散在1mL的去离子水中，超声分散5min，得到MoS2悬浊液)滴加到清洁的直径为2mm的玻碳电极表面，孵育30～40min；
(2)将10～14μL捕获探针ssDNA和polyC的混合溶液滴加到修饰好的电极表面，孵育10h；
(3)将10～14μL含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的悬浊液滴加到电极表面，孵育1h，即得用于检测肌氨酸的生物传感器。
步骤(1)～(3)中，所述孵育的温度为25～40℃，具体温度本领域技术人员可根据实际需求进行设定。
如上所述的方法，所述含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的制备方法如下：
取SiO2粒子1mg，分散在1mL浓度为0.01M且pH为7.4的磷酸盐缓冲液(即1mL pH＝7.4的1×PBS溶液)中，再加入2μM修饰ssDNA及2mg二茂铁甲酸，超声15s，随后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)使得此时混合液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺的浓度分别为0.2mM和0.01mM，超声15s，而后在37℃条件下振荡3～4.5h，最后离心并使用磷酸盐(PBS)缓冲液多次洗涤即得含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子(制得的含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子储存在磷酸盐(PBS)缓冲液中)。
如上所述的方法，步骤(1)中，所述孵育的温度为37℃，时间为40min；
步骤(2)中，所述孵育的温度为室温，所述捕获探针ssDNA和polyC的混合溶液中捕获探针ssDNA及polyC的浓度分别为1μM及1μM；
步骤(3)中，所述孵育的温度为室温，所述悬浊液中含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的浓度为250μg/mL。
如上所述的一种用于检测肌氨酸的生物传感器在肌氨酸检测方面的应用。
本发明还提供如上所述的一种用于检测肌氨酸的生物传感器的应用方法，将待检测的试样滴加到用于检测肌氨酸的生物传感器上在室温下孵育2h后清洗，以浓度为10mM的磷酸盐缓冲液作为电解液测定电流变化，根据以下公式即可得到待检测的试样中肌氨酸的浓度；
△I＝0.99664×{Lg[C肌氨酸]}-0.05527；
其中△I为电流变化值，单位为μA，C肌氨酸为待检测的试样中肌氨酸的浓度，单位为fg·mL-1。
以上公式是通过测定肌氨酸与电流值变化大小的标准曲线获得的，其具体操作如下：
滴加不同浓度的肌氨酸到制备好的DNA生物传感器上，孵育后清洗，用PBS溶液作为电解液，再采用方波伏安法测定电流变化，得到肌氨酸与电流值变化大小的标准曲线；
具体地，取出制备好的DNA传感器，依次滴加12μL不同浓度的肌氨酸，室温下孵育2h，随后用PBS溶液洗涤，氮气吹干，在PBS溶液中采用方波伏安法考察电流的变化，以此作为检测结果，可用于肌氨酸检测的标准曲线制作，其中，SWV(方波伏安法)扫描中，扫描的PBS溶液的pH＝7.4，浓度为10mM，扫描电压范围0～0.6V。
发现，肌氨酸浓度为1×10-1～1×109fg/mL时，拟合效果较好，其最低检测限为1.79fg/mL。
当然，本领域技术人员可根据实际需求改变测试条件，当然其标准曲线也需重新测定。
有益效果：
(1)本发明的用于检测肌氨酸的生物传感器，在玻碳电极上覆盖MoS2并通过polyC来固定捕获ssDNA，有效增加传感器灵敏度；
(2)本发明的用于检测肌氨酸的生物传感器，SiO2@Fc粒子有效的放大了Fc的电化学信号，从而有效提高了传感器的灵敏度，极大的降低检测限(对肌氨酸浓度检测限为1.79fg/mL)；
(3)本发明的用于检测肌氨酸的生物传感器，检测方便，灵敏度高，特异性好，应用前景好；
(4)本发明的用于检测肌氨酸的生物传感器的制备方法，工艺简单，条件温和，成本较低。
附图说明
图1为本发明的用于检测肌氨酸的生物传感器的制备及进行肌氨酸检测的流程示意图；
图2为本发明的用于检测肌氨酸的生物传感器在存在目标物肌氨酸及不存在目标物肌氨酸条件下的CV信号变化示意图；
图3为测试序列组的SWV信号变化图；
图4为SiO2@Fc@修饰ssDNA的浓度优化示意图；
图5为SiO2@Fc@修饰ssDNA的孵育时间优化示意图；
图6为用于检测肌氨酸的生物传感器用于检测不同浓度肌氨酸的SWV图；
图7为肌氨酸浓度与电流大小关系曲线图(肌氨酸的浓度为1×10-1～1×109fg/mL)；
图8为用于检测肌氨酸的生物传感器进行特异性研究的电流抑制比比较图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式做进一步阐述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
以下实施例中，捕获探针ssDNA的核苷酸序列为：
5’-CCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTCGGGACGACCACGCAAATACGAATAGTGTGAACGCGGGAGTCCCG-3’；
修饰ssDNA的核苷酸序列为：
HOOC-5’-TTTTTTTTTTCGGGACTCCC-3’；
polyC的核苷酸序列为：
5’-CCCCCCCCCCCCCCC-3’。
实施例1
一种用于检测肌氨酸的生物传感器的制备方法，其步骤如下，流程示意图如图1所示：
(1)清洁玻碳电极：
将玻碳电极(Φ＝2mm)依次用0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉将电极表面抛成镜面，再用无水乙醇、去离子水超声清洗5min，氮气吹干备用；
(2)将12μL的浓度为20μg/mL的MoS2悬浊液滴加到清洁后的玻碳电极表面，在37℃下孵育40min；
(3)将12μL的捕获探针ssDNA和polyC的混合溶液滴加到修饰好的电极表面，在室温下孵育10h，捕获探针ssDNA和polyC的混合溶液中捕获探针ssDNA及polyC的浓度分别为1μM及1μM：
(4)将12μL含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的悬浊液滴加到电极表面，在室温下孵育1h，即得用于检测肌氨酸的生物传感器，悬浊液中含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的浓度为250μg/mL；
其中含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的制备方法如下：
取粒径为100～150nm的SiO2粒子1mg，分散在1mL浓度为0.01M且pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，再加入2μM修饰ssDNA及2mg二茂铁甲酸，超声15s，随后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺使得此时混合液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺的浓度分别为0.2mM和0.01mM，超声15s，而后在37℃条件下振荡3～4.5h，最后离心并使用磷酸盐缓冲液多次洗涤即得含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子。
实施例2～5
一种用于检测肌氨酸的生物传感器的制备方法，与实施例1基本相同，不同在于，步骤(2)～(4)中分散液(即对应MoS2悬浊液、捕获探针ssDNA和polyC的混合溶液及含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的悬浊液)的添加量、孵育的温度及时间，不同具体如下表所示，表中，A为MoS2悬浊液的添加量，单位为μL，B、C为步骤(2)中孵育的温度及时间，单位分别为℃、min，D为捕获探针ssDNA和polyC的混合溶液的添加量，单位为μL，E为步骤(3)中孵育的温度，单位为℃，F为含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的悬浊液的添加量，单位为μL，G为步骤(4)中孵育的温度，单位为℃；
A B C D E F G
实施例2 10 40 30 11 30 12 25
实施例3 14 25 40 10 28 11 29
实施例4 12 30 35 14 40 10 32
实施例5 13 36 30 13 36 14 40
实施例6
用于检测肌氨酸的生物传感器的应用，其步骤如下：
建立肌氨酸检测的标准曲线：
取出实施例1制得的用于检测肌氨酸的生物传感器，依次滴加12μL不同浓度的肌氨酸，在室温下孵育2h，随后用PBS溶液洗涤，氮气吹干，在PBS溶液中采用方波伏安法考察电流的变化，以此作为检测结果，可用于肌氨酸检测的标准曲线制作，其中，SWV扫描中，扫描的PBS溶液的pH＝7.4，浓度为10mM，扫描电压范围0～0.6V。
其传感器检测目标物肌氨酸的CV图信号变化如图2所示，用于检测不同浓度梯度的肌氨酸得到的SWV信号图如图6所示，肌氨酸浓度从a～l分别为0fg/mL、1fg/mL、10fg/mL、100fg/mL、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1μg/mL；
依次滴加的不同浓度的肌氨酸浓度范围为1×10-1～1×109fg/mL。通过方波伏安法得到电流值，以肌氨酸浓度的对数为横坐标，电流值大小为纵坐标作图，得到传感器检测肌氨酸的标准曲线，结果如图7所示，由图7可以看出，肌氨酸浓度为1×10-1～1×109fg/mL时，拟合效果较好，其拟合公式具体为：
△I＝1.55292-0.22823Lg[C肌氨酸]；
其中△I为电流变化值，单位为μA，C肌氨酸为待检测的试样中肌氨酸的浓度，单位为fg·mL-1，上述方法的最低检测限为1.79fg/mL。
使用本发明的用于检测肌氨酸的生物传感器检测肌氨酸的浓度的具体操作为：
将待检测的试样滴加到用于检测肌氨酸的生物传感器上在室温下孵育2h后清洗，以浓度为10mM的磷酸盐缓冲液作为电解液测定电流变化，根据以下公式即可得到待检测的试样中肌氨酸的浓度；
△I＝0.99664×{Lg[C肌氨酸]}-0.05527；
其中△I为电流变化值，单位为μA，C肌氨酸为待检测的试样中肌氨酸的浓度，单位为fg·mL-1。
实施例7
用于检测肌氨酸的生物传感器的特异性测试：
在实施例1制得的用于检测肌氨酸的生物传感器上分别滴加500ng/mL的尿酸(UA)，肌氨酸(SAR)、麦芽糖(MAL)、柠檬酸(CA)以及葡萄糖(GLU)，并检测传感器的电流，得到的电流抑制比如图8所示，由图8可以看出，当传感器的检测目标物为UA、SAR、MAL、CA和GLU时，得到的电流信号抑制比分别为5.22％、76.3％、5.35％、8.47％和7.76％，说明本发明的传感器对SAR有很强的检测特异性。
实施例8
确定传感器搭建所选用DNA序列，设置对照试验，选择抑制比与信号都更佳的序列，测试的SWV信号变化图如图3所示：
图3A对应序列1，其具体对应如下：
修饰ssDNA：5’-HOOC-TTTTTTTTTTGTCCCGAACTGAG-3’；
图3A左侧对应的头朝上Capture DNA：
5’-CCCCCCCCCCCCCCCTTTTTT-CTCAGTTCGGGACGACCACGCAAATACGAATAGTGTGAACGCGGGAGTCCCGAA-3’；
图3A右侧对应的头朝下Capture DNA：
5’-CTCAGTTCGGGACGACCACGCAAATACGAATAGTGTGAACGCGGGAGTCCCGAATTTTTTCCCCCCCCCCCCCCC-3’；
图3B对应序列2，其具体对应如下：
修饰ssDNA：5’-HOOC-TTTTTTTTTTCGGGACTCCC-3’；
图3B左侧对应的头朝上Capture DNA：
5’-CCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTCGGGACGACCACGCAAATACGAATAGTGTGAACGCGGGAGTCCCG-3’；
图3B右侧对应的头朝下Capture DNA：
5’-CGGGACGACCACGCAAATACGAATAGTGTGAACGCGGGAGTCCCGTTTTTTCCCCCCCCCCCCCCC-3’；
由图3中可以看出，序列1对应的头朝上序列的抑制比为77.97％，头朝下序列的抑制比为72.27％；序列2对应的头朝上序列的抑制比为89.58％，头朝下序列的抑制比为68.98％，选用序列2对应的头朝上序列即本发明优选得到的捕获探针ssDNA的核苷酸序列。
实施例9
测试条件的优化：
一、标志物浓度的优化：
将12μL含不同浓度修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的悬浊液滴加到电极表面，在室温下孵育2h，即得用于检测PSA的生物传感器，悬浊液中含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的浓度分别为1μg/mL、12μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL，其结果如图4所示，由图4可以看出修饰ssDNA@SiO2@Fc浓度达到250μg/mL时，电流值不再显著增加；
二、孵育时间优化：
将12μL含250μg/mL的修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的悬浊液滴加到电极表面，在室温下孵育，即得用于检测PSA的生物传感器，孵育时间分别为0min，10min，30min，60min，90min，120min，150min，其结果如图5所示，由图5可以看出当孵育时间达到1h后，电流值不再显著增加；
故而，测试条件优选为修饰ssDNA@SiO2@Fc浓度为250μg/mL，孵育时间为1h。
经验证，本发明的用于检测肌氨酸的生物传感器，在玻碳电极上覆盖MoS2并通过polyC来固定捕获ssDNA，有效增加传感器灵敏度；SiO2@Fc粒子有效的放大了Fc的电化学信号，从而有效提高了传感器的灵敏度，极大的降低检测限(对肌氨酸浓度检测限为1.79fg/mL)；检测方便，灵敏度高，特异性好，应用前景好；制备方法，工艺简单，条件温和，成本较低，极具应用前景。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应该理解，这些仅是举例说明，在不违背本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。
序列表
<110> 上海工程技术大学
<120> 一种用于检测肌氨酸的生物传感器及其制备方法和应用
<141> 2021-01-08
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cccccccccc cccccttttt tcgggacgac cacgcaaata cgaatagtgt gaacgcggga 60
gtcccg 66
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tttttttttt cgggactccc 20
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cccccccccc ccccc 15

Claims (5)

1.一种用于检测肌氨酸的生物传感器，包括工作电极，所述工作电极包括玻碳电极表面包覆有MoS2层、信号标志段和与肌氨酸特异性结合的捕获探针ssDNA；
所述捕获探针ssDNA固定在MoS2层上，所述信号标志段为含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子，所述信号标志段通过修饰ssDNA与捕获探针ssDNA连接；所述SiO2粒子的粒径为100～150nm；
所述捕获探针ssDNA为如下所示的核苷酸序列：
5’-CCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTCGGGACGACCACGCAAATACGAAT AGTGTGAACGCGGGAGTCCCG-3’；
所述修饰ssDNA为如下所示的核苷酸序列：
HOOC-5’-TTTTTTTTTTCGGGACTCCC-3’；
所述用于检测肌氨酸的生物传感器的制备方法为，先将MoS2修饰到清洁的玻碳电极表面，而后将捕获探针ssDNA和polyC滴加到修饰好的电极上孵育，最后将含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子滴加到电极上孵育，即得所述用于检测肌氨酸的生物传感器；所述polyC为如下所示的核苷酸序列：
5’-CCCCCCCCCCCCCCC-3’。
2.根据权利要求1所述的用于检测肌氨酸的生物传感器，其特征在于，用于检测肌氨酸的生物传感器的制备方法具体包括如下步骤：
(1)将10～14μL的浓度为20μg/mL的MoS2悬浊液滴加到清洁的直径为2mm的玻碳电极表面，孵育30～40min；
(2)将10～14μL捕获探针ssDNA和polyC的混合溶液滴加到修饰好的电极表面，孵育10h；
(3)将10～14μL含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的悬浊液滴加到电极表面，孵育1h，即得用于检测肌氨酸的生物传感器。
3.根据权利要求1所述的用于检测肌氨酸的生物传感器，其特征在于，所述含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的制备方法如下：
取SiO2粒子1mg，分散在1mL浓度为0.01M且pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，再加入2μM修饰ssDNA及2mg二茂铁甲酸，超声15s，随后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺使得此时混合液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺的浓度分别为0.2mM和0.01mM，超声15s，而后在37℃条件下振荡3～4.5h，最后离心并使用磷酸盐缓冲液多次洗涤即得含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子。
4.根据权利要求2所述的用于检测肌氨酸的生物传感器，其特征在于，步骤(1)中，所述孵育的温度为37℃，时间为40min；
步骤(2)中，所述孵育的温度为室温，所述捕获探针ssDNA和polyC的混合溶液中捕获探针ssDNA及polyC的浓度分别为1μM及1μM；
步骤(3)中，所述孵育的温度为室温，所述悬浊液中含修饰ssDNA且标记有二茂铁的SiO2粒子的浓度为250μg/mL。
5.一种检测肌氨酸的生物传感器的方法，其特征在于，将待检测的试样滴加到权利要求1-4任一项所述用于检测肌氨酸的生物传感器上，在室温下孵育2h后清洗，以浓度为10mM的磷酸盐缓冲液作为电解液测定电流变化，根据以下公式即可得到待检测的试样中肌氨酸的浓度；
△I＝0.99664×{Lg[C肌氨酸]}-0.05527；
其中△I为电流变化值，单位为μA，C肌氨酸为待检测的试样中肌氨酸的浓度，单位为fg·mL-1。
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