CN104483362A - 捕获探针与信号探针修饰的电极及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了捕获探针与信号探针修饰的电极及其制备方法和应用，捕获探针与信号探针修饰的电极由聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针与捕获探针修饰电极构成，通过将信号探针标记在聚苯胺-纳米金复合物上，利用纳米材料可产生电化学信号的特性，直接进行化学检测，同时检测信号，聚苯胺具有导电率高、环境稳定性好，再用双探针以提高电极的特异性，灵敏性，获得特异性好、灵敏度高的检测电极；并且该电极的制备方法简单，便于工业化应用。
Description
技术领域
本发明属于电化学检测领域，具体涉及捕获探针与信号探针修饰的电极，还涉及该电极的制备方法和应用。
背景技术
电化学DNA生物传感器的工作原理是在电极表面固定某一特定序列的ssDNA，与溶液中的互补序列DNA进行特异杂交形成dsDNA，借助能识别单双链DNA的杂交指示剂的电化学响应信号的变化对目标基因进行定性定量检测。目前，电化学DNA生物传感器主要采用杂交指示剂标识特定序列的ssDNA形成信号探针，然后利用信号探针选择性地与dsDNA结合产生电化学响应信号，达到定量检测目标DNA的目的。但杂交指示剂标识的信号探针的灵敏度及特异性有限，难以满足应用的需求。因此，有必要进一步提高电化学DNA生物传感器的灵敏度和特异性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供捕获探针与信号探针修饰的电极；本发明的目的之二在于提供捕获探针与信号探针修饰的电极的制备方法；本发明的目的之三在于提供捕获探针与信号探针修饰的电极的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、捕获探针与信号探针修饰的电极，所述电极由聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针与捕获探针修饰电极构成，所述信号探针为5’-SH-ccccccaaaaatcgacacata-3’；所述捕获探针为5’-ggtgaggtct(SH)-3’。
优选的，所述电极为玻碳电极。
2、所述捕获探针与信号探针修饰的电极的制备方法，包括聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针和捕获探针修饰电极的制备：
所述聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针的制备方法为：将H2SO4溶液滴加到苯胺中，持续搅拌，得苯胺硫酸溶液，然后将固体金胶加入苯胺硫酸溶液中，再逐滴加入过硫酸钾溶液中，剧烈搅拌后，离心，清洗，得聚苯胺-纳米金复合物；接着将信号探针溶液加入所得聚苯胺-纳米金复合物的溶液中，反应后将反应物离心去上清，沉淀经清洗后用水溶解，得聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针；
所述捕获探针修饰电极的制备方法为：将含捕获探针的溶液滴加到打磨的玻碳电极表面，反应后用水清洗，然后向电极表面滴加已硫醇溶液封闭非特异性的位点，封闭后用水清洗，得捕获探针修饰电极。
优选的，所述聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针的制备方法为，将浓度为0.5M的H2SO4溶液滴加到苯胺中至H2SO4浓度为0.42M，持续搅拌，得苯胺硫酸溶液，然后将固体金胶按体积比为5:3加入苯胺硫酸溶液中，再将浓度为0.15M的过硫酸钾溶液逐滴加入含固体金胶的苯胺硫酸溶液中，加入后过硫酸钾的终浓度为0.04M，剧烈搅拌2小时，反应后将产物离心，用水清洗得到聚苯胺-纳米金复合物，接着将浓度为2μm的信号探针按体积比为1:20加入浓度为0.5M的聚苯胺-纳米金复合物中，4℃反应2小时，然后离心去上清，用水清洗数后再用水溶解，制得聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针。更优选的，所述捕获探针修饰电极的制备为：将浓度为2.5μM的捕获探针溶液滴加到已打磨的玻碳电极表面，在18～25℃下静置16小时后用水清洗，再向电极表面滴加浓度为1mM的已硫醇溶液封闭非特异性的位点，在18～25℃条件在静置2小时后用水清洗，得捕获探针修饰电极。
3、含有所述捕获探针与信号探针修饰的电极的电化学生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极和实验电解液；所述工作电极为权利要求1或2所述捕获探针与信号探针修饰的电极，所述对电极为铂电极，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述实验电解液为pH 7.4的含5mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和0.1mol/L KCl的磷酸盐缓冲液。
4、所述捕获探针与信号探针修饰的电极或电化学生物传感器在检测结核分支杆菌中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了捕获探针与信号探针修饰的电极，该电极利由聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针与捕获探针修饰电极构成，利用聚苯胺-纳米金复合材料具有导率高、环境稳定性好、合成简便、单体合成成本低的特性，将聚苯胺作为直接的电子媒介体进行探针标记，使电化学响应信号放大，简化了标记过程；同时为克服聚苯胺生物相容性较差，难以固化生物分子的缺点，聚苯胺聚合过程中杂合具有良好生物相容性及电子传递性能的纳米金，能有效提高生物分子的固载，在结合合双探针技术提高检测的特异性，获得特异性和灵敏度均高的电极。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为聚苯胺-纳米金复合物扫描电镜表征图。
图2为捕获探针修饰电极的循环伏安法(CV)表征曲线。
图3为双探针修饰电极的差分脉冲伏安法(DPV)响应曲线。
图4为灵敏度试验结果图。
图5为特异性试验结果图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中使用的主要仪器及试剂来源如下：CHI760D型电化学工作站购于上海辰华仪器有限公司；玻碳电极、饱和甘汞电极、铂电极和0.3μm、0.05μm Al2O3粉末购于天津艾达恒昊科技发展有限公司；过硫酸钾(K2S2O8)、己烷巯醇(96％，HT)购于美国Sigma公司。捕获探针、信号探针等核酸单链由上海生物生工有限公司合成。
实施例1、捕获探针与信号探针修饰电极的制备
捕获探针与信号探针修饰的电极的制备方法，包括如下步骤：
(1)聚苯胺-纳米金复合材料的制备
将5mL浓度为0.5M的H2SO4溶液滴加到蒸馏纯化的100μL苯胺中，持续搅拌，得苯胺硫酸溶液，然后将10mL固体金胶加入6mL苯胺硫酸溶液中，再将5mL浓度为0.15M的过硫酸钾(K2S2O8)溶液逐滴加入上述溶液中剧烈搅拌2小时，反应后将产物在8000rpm条件下离心15min，用双蒸水清洗数次得到聚苯胺-纳米金复合物。
(2)信号探针标记聚苯胺-纳米金复合物
将250μL浓度为2μm的信号探针5’-SH-ccccccaaaaatcgacacata-3’(SEQ ID NO.1)溶液加入到5mL步骤(1)所得的浓度为0.5M的聚苯胺-纳米金复合物的溶液中，4℃反应2小时，然后将反应物在5000rpm条件下离心10min，去上清，用重蒸水清洗数次，再用2mL双蒸水溶解，制得聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针。
(3)捕获探针修饰电极
将20μL浓度为2.5μM的捕获探针5’-ggtgaggtct(SH)-3’(SEQ ID NO.2)溶液滴加到已打磨的玻碳电极表面，室温(18～25℃)静置16小时后双蒸水清洗，得修饰有捕获探针的电极，再向修饰有捕获探针的电极表面滴加20μL浓度为1mM的已硫醇溶液封闭电极表面非特异性的位点，室温(18～25℃)静置2小时后用双蒸水清洗，得捕获探针修饰电极。
利用步骤(2)制得的聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针与捕获探针修饰电极构成捕获探针与信号探针修饰的电极。该电极的杂交反应方法为：在捕获探针修饰电极表面滴加20μL含靶基因5’-agacctcacctatgtgtcga-3’(SEQ ID NO.3)的溶液，室温(18～25℃)反应2小时后用双蒸水清洗，最后在电极表面滴加5μL聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针溶液。
为了对捕获探针与信号探针修饰的电极进行表征，对步骤(1)制得的聚苯胺-纳米金复合物进行扫描电镜表征，如图1所示。由图1可知，苯胺聚合成为丝管状的聚苯胺，其表面覆盖了大量的亮光点为纳米金粒。聚苯胺的多孔网状结构及表面的球状纳米金粒提高了复合物的有效面积及电子传递能力，放大了电化学响应信号。
实施例2、构建电化学生物传感器检测系统
以捕获探针与信号探针修饰的电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极作为对电极形成电化学生物传感器检测系统。然后用电缆将制备好的电化学传感器联入电化学工作站，于pH 7.4的铁氰化钾缓冲溶液(5mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和0.1mol/LKCl为实验电解液)中进行循环伏安扫描，工作电位为-0.3V～0.7V，扫描速度为50mV/s。然后利用构建的电化学生物传感器检测系统用循环伏安法(CV)表征捕获探针与信号标记探针修饰电极及玻碳裸电极的曲线，结果如图2所示。图2中a为玻碳裸电极的CV曲线；b为捕获探针修饰后的CV曲线。可以看出曲线a的峰电流值较曲线b减小，表明表面捕获探针后阻碍了电极表面的电子传递。
实施例3、利用捕获探针与信号探针修饰的电极检测结核分枝杆菌
将20μl浓度为2.5μM的捕获探针5’-ggtgaggtct(SH)-3’(SEQ ID NO.2)溶液滴加到电极表面，室温(18～25℃)静置16小时后双蒸水清洗，然后用20μL浓度为1mM的已硫醇溶液封闭电极2小时，双蒸水清洗，再在电极表面滴加20μL结核分枝杆菌DNA溶液(1nM)，室温反应2小时，双蒸水清洗后，在电极表面滴加5μL聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针溶液，室温反应2小时，用双蒸水清洗后在0.1M的PBS缓冲液(pH 7.4)中进行差分脉冲伏安法(DPV)扫描，检测电流峰值，电位扫描范围为-0.3V～0.4V，结果如图3所示。图3中a为经双探针修饰后，待测溶液中没有目标物的DPV响应曲线；b为经双探针修饰后，待测溶液中有目标物的DPV响应曲线，由于溶液中含有目标物的靶基因，使聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针结合到电极表面，产生了DPV的电化学响应信号。
灵敏度实验：将20μl浓度为2.5μM的捕获探针5’-ggtgaggtct(SH)-3’(SEQ ID NO.2)溶液滴加到电极表面，室温(18～25℃)静置16小时后双蒸水清洗，然后用20μL浓度为1mM的已硫醇溶液封闭电极2小时，双蒸水清洗，再在电极表面滴加20μL不同梯度浓度(0M、1×10-15M、1×10-14M、1×10-13M、1×10-12M、1×10-11M、1×10-10M、1×10-9M)的结核分枝杆菌DNA溶液，室温反应2小时，双蒸水清洗后，在电极表面滴加5μL聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针溶液，室温反应2小时，用双蒸水清洗后在0.1M的PBS缓冲液(pH 7.4)中进行差分脉冲伏安法(DPV)扫描，检测电流峰值，电位扫描范围为-0.3V～0.4V，结果如图4所示。图4中a到h为目标物梯度浓度的DPV响应曲线。可以看出峰电流值随着目标物浓度的增加而增大。检测线性范围为1×10-15M～1×10-9M。
特异性实验：将20μl浓度为2.5μM的捕获探针5’-ggtgaggtct(SH)-3’(SEQ ID NO.2)溶液滴加到电极表面，室温(18～25℃)静置16小时后双蒸水清洗，然后用20μL浓度为1mM的已硫醇溶液封闭电极2小时，双蒸水清洗，再在每只电极表面分别滴加20μL浓度均为100pm的结核分枝杆菌DNA溶液、金黄色葡萄球菌DNA溶液、肺炎支原体DNA溶液及混合物DNA溶液(包括结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌与肺炎支原体)，室温反应2小时，双蒸水清洗后，在电极表面滴加5μL聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针溶液，室温反应2小时，用双蒸水清洗后在0.1M的PBS缓冲液(pH 7.4)中进行差分脉冲伏安法(DPV)扫描，检测电流峰值，电位扫描范围为-0.3V～0.4V，结果如图5。图5中a为空白对照的DPV响应曲线，b为金黄色葡萄球菌的DPV响应曲线，c为肺炎支原体的DPV响应曲线，d为混合菌的DPV响应曲线，e为结核分枝杆菌的DPV响应曲线。可以看出金黄色葡萄球菌与肺炎支原体两种干扰菌电信号大小与空白相当同时也没有对结核分枝杆菌的检测产生干扰。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.捕获探针与信号探针修饰的电极，其特征在于：所述电极由聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针和捕获探针修饰电极构成，所述信号探针为5’-SH-ccccccaaaaatcgacacata-3’；所述捕获探针为5’-ggtgaggtct(SH)-3’。
2.根据权利要求1所述捕获探针与信号探针修饰的电极，其特征在于：所述电极为玻碳电极。
3.权利要求1或2所述捕获探针与信号探针修饰的电极的制备方法，其特征在于：包括聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针和捕获探针修饰电极的制备：
所述聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针的制备方法为：将H2SO4溶液滴加到苯胺中，持续搅拌，得苯胺硫酸溶液，然后将固体金胶加入苯胺硫酸溶液中，再逐滴加入过硫酸钾溶液中，剧烈搅拌后，离心，清洗，得聚苯胺-纳米金复合物；接着将信号探针溶液加入所得聚苯胺-纳米金复合物的溶液中，反应后将反应物离心去上清，沉淀经清洗后用水溶解，得聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针；
所述捕获探针修饰电极的制备方法为：将含捕获探针的溶液滴加到打磨的玻碳电极表面，反应后用水清洗，然后向电极表面滴加已硫醇溶液封闭非特异性的位点，封闭后用水清洗，得捕获探针修饰电极。
4.根据权利要求3所述捕获探针与信号探针修饰的电极的制备方法，其特征在于：所述聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针的制备方法为，将浓度为0.5M的H2SO4溶液滴加到苯胺中至H2SO4浓度为0.42M，持续搅拌，得苯胺硫酸溶液，然后将固体金胶按体积比为5:3加入苯胺硫酸溶液中，再将浓度为0.15M的过硫酸钾溶液逐滴加入含固体金胶的苯胺硫酸溶液中，加入后过硫酸钾的终浓度为0.04M，剧烈搅拌2小时，反应后将产物离心，用水清洗得到聚苯胺-纳米金复合物，接着将浓度为2μm的信号探针按体积比为1:20加入浓度为0.5M的聚苯胺-纳米金复合物中，4℃反应2小时，然后离心去上清，用水清洗数后再用水溶解，制得聚苯胺-纳米金复合物标记的信号探针。
5.根据权利要求3所述捕获探针与信号探针修饰的电极的制备方法，其特征在于：所述捕获探针修饰电极的制备为：将浓度为2.5μM的捕获探针溶液滴加到已打磨的玻碳电极表面，在18～25℃下静置16小时后用水清洗，再向电极表面滴加浓度为1mM的已硫醇溶液封闭非特异性的位点，在18～25℃条件在静置2小时后用水清洗，得捕获探针修饰电极。
6.含有权利要求1或2所述捕获探针与信号探针修饰的电极的电化学生物传感器，其特征在于：包括工作电极、对电极、参比电极和实验电解液；所述工作电极为权利要求1或2所述捕获探针与信号探针修饰的电极，所述对电极为铂电极，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述实验电解液为pH 7.4的含5mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和0.1mol/L KCl的磷酸盐缓冲液。
7.权利要求1～2任一项所述捕获探针与信号探针修饰的电极或权利要求6所述的电化学生物传感器在检测结核分枝杆菌中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150401 |