CN110079584A

CN110079584A - 基于3d-hcr水凝胶的汞离子快速可视化检测方法

Info

Publication number: CN110079584A
Application number: CN201910247622.7A
Authority: CN
Inventors: 许文涛; 罗云波; 邵向丽; 朱龙佼; 冯瑜祥; 黄昆仑
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN110079584B

Abstract

本发明提供一种基于3D‑HCR水凝胶的汞离子快速可视化检测方法。根据T碱基和Hg²⁺结合形成“T‑Hg²⁺‑T”碱基‑金属离子复合物，设计Hg²⁺诱导型的恒温指数扩增实现信号的识别与放大，结合DNA水凝胶与AuNPs实现信号的二次放大与可视化，整合建立一种检测Hg²⁺的宏量、可视化传感平台，实现了Hg²⁺的定性、定量检测。

Description

基于3D-HCR水凝胶的汞离子快速可视化检测方法

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，具体地说，涉及一种基于3D-HCR水凝胶的汞离子快速可视化检测方法。

背景技术

Hg²⁺是一种全球性重金属污染物。释放到环境中的Hg²⁺可在大气沉降和海洋环流的作用下进入淡水或海洋，并经过食物链的累积，最终对人类的生命健康造成威胁。因此，实现Hg²⁺的快速、灵敏检测对环境保护和人类健康具有重要意义。

与其他金属离子一样，Hg²⁺的检测方法也经历了由仪器分析到传感器检测的过程。仪器分析法包括原子吸收光谱法，原子发射光谱法，原子荧光光谱法和质谱法等。仪器分析法在灵敏度和准确性方面具有明显的优势，但昂贵的设备和繁琐的样品处理过程使其难以广泛应用。传感器检测法弥补了仪器分析法的不足。利用传感器检测的核心思路是构建敏感元件和换能元件。在搭建检测汞的传感器时，敏感元件利用汞与多种不同基团相互作用的性质实现了Hg²⁺的特异性捕获，如荧光基团、核酸、纳米粒子、肽、蛋白质、酶等。换能元件则将传感器对汞的识别信息转换成可检测的信号，实现Hg²⁺的定量检测。

与蛋白质相比，DNA具有许多理想的特性。首先，DNA易于进行化学合成且具有较低的合成成本；第二，DNA高度稳定，可以经过多次变性复性过程而不改变与金属离子结合的性质。第三，DNA高度可编辑，可以在DNA序列的多个位点进行化学修饰，从而增加金属离子与DNA的亲和力或特异性，对DNA序列的调整也使得传感器具有更好的通用性。根据Hg²⁺与胸腺嘧啶可以T-Hg²⁺-T的方式结合，研究人员利用T-Hg²⁺-T结构，建立了大量检测Hg²⁺的核酸传感器，或将该结构用于Hg²⁺诱捕，单核苷酸多态性(SNP)检测等。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于3D-HCR水凝胶的汞离子快速可视化检测方法。

本发明构思如下：通过构建基于恒温指数扩增技术(EXPAR)，三维杂交链式反应(3D-HCR)水凝胶和金纳米粒子(AuNPs)的Hg²⁺可视化检测的方法，实现了Hg²⁺的定性、定量检测。EXPAR是一种新型核酸扩增技术，能够在较短时间内(30min)，实现目标序列的扩增。本发明利用T-Hg²⁺-T结构对传统的EXPAR进行改造，构建Hg²⁺浓度响应型的EXPAR实现Hg²⁺识别，并将Hg²⁺的化学信号转化为核酸信号。EXPAR的扩增产物可以触发3D-HCR反应生成3D-HCR水凝胶。3D-HCR水凝胶是线性HCR在宏观领域的拓展，即在线性HCR的基础上，通过改变发夹的结构，使得发夹相互交联形成高度锁水的三维网络。同时，形成的3D-HCR水凝胶对AuNPs具有很好的束缚能力，且3D-HCR水凝胶对AuNPs的束缚能力取决于水凝胶的致密性，而水凝胶的致密性又取决于EXPAR扩增产物的浓度，最终取决于体系中的Hg²⁺的浓度，从而实现对Hg²⁺的快速和超灵敏检测。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种汞离子响应型超快扩增可视化传感器，包括：(1)EXPAR扩增体系，(2)酶切体系，(3)3D-HCR及显色检测体系。

其中，所述EXPAR扩增体系包括模板链和底物链，任选包含双重扩增模板链：

底物链X1：5′-CTA CAC GCG ATT CAT GAG TC TTTA-3′

模板链X’-Y’：5′-CTG GCT CCT GTG ATT GTG CTC TAG T TTTT GACTC ATG AATCGC GTG TAG-3′

双重扩增模板链Y’-Y’：5′-CTG GCT CCT GTG ATT GTG CTC TAG AACA GACTC CTGGCT CCT GTG ATT GTG CTC TAG-3′。

所述酶切体系包括Nt.BstNBI切刻内切酶。

所述3D-HCR及显色检测体系包括：两条引物、3D-HCR缓冲液和AuNPs包被液：

引物H1：5′-GAT CGC GAT C CTG GCT CCT GTG ATT GTG CTC TAG ACA TCG CTAGAG CAC AAT CAC AGG-3′

引物H2：5′-CTAGAG CAC AAT CAC AGG AGC CAG TTTT CCT GTG ATT GTG CTC TAGCGA TGT-3′

3D-HCR缓冲液：2.5mM NaH₂PO₄·2H₂O,8mM Na₂HPO₄·12H₂O,150mM NaCl,2mMMgCl₂·6H₂O,pH 7.4。

所述AuNPs包被液的制备方法如下：1)在圆底烧瓶中加入超纯水196mL，1％氯金酸1mL加热至沸腾；然后加入1％柠檬酸三钠3mL，反应一段时间后可见液体颜色逐渐加深至黑色，而后变为樱桃红色，5min后停止加热，冷却至室温，得到AuNPs溶液，避光4℃保存；

2)以PBS缓冲液为溶剂配制10％BSA溶液，每1mL AuNPs溶液中加入20μL BSA溶液，混合孵育40min即得AuNPs包被液。

第二方面，本发明提供所述传感器在检测汞离子中的应用。所述检测为定性检测或定量检测。

第三方面，本发明提供基于核酸纳米金3D水凝胶的汞离子快速可视化定性检测方法，利用所述传感器对汞离子进行定性检测，包括如下步骤：

方案I：单重EXPAR扩增

S1、向反应管中加入待测样品、模板链X1、底物链X’-Y’、dNTPs和水，95℃变性5min，然后37℃孵育30min，得到体系1；

S2、EXPAR扩增反应：向体系1中加入Bst DNA聚合酶和Thermpol Buffer，55℃孵育10min，进行EXPAR扩增反应，得到体系2；

S3、酶切反应：向体系2中加入Nt.BstNBI切刻内切酶和BalbBuffer 3.1，55℃孵育20min，得到产物Y(作为促发子，序列5′-CTA GAG CAC AAT CAC AGG AGC CAG-3′)；

S4、HCR反应及显色检测：将引物H1、H2分别溶解于所述3D-HCR缓冲液中，95℃变性10min后冷却至室温，分别得到H1液和H2液；将产物Y溶解于所述3D-HCR缓冲液中，得到Y液；将H1液、H2液、Y液、AuNPs包被液和3D-HCR缓冲液加入反应管中，37℃孵育过夜，进行HCR反应；肉眼监测反应结果，若所得反应混合液分层，且上清液为无色或浅红色，下层为红色的水凝胶，则反应结果为阳性，待测样品中含有汞离子。

方案II：双重EXPAR扩增

S1′、双重EXPAR扩增反应：向反应管中加入待测样品、模板链X1、底物链X’-Y’、双重扩增模板链Y’-Y’、dNTPs和水，95℃变性5min，然后37℃孵育30min，得到体系1′；

S2′、酶切反应：向体系1′中加入Bst DNA聚合酶和Thermpol Buffer，55℃孵育10min，进行双重EXPAR扩增反应，得到体系2′；

S3′、向体系2′中加入Nt.BstNBI切刻内切酶和BalbBuffer 3.1，55℃孵育20min，得到产物Y(作为促发子，序列5′-CTA GAG CAC AAT CAC AGG AGC CAG-3′)；

S4′、HCR反应及显色检测：将引物H1、H2分别溶解于所述3D-HCR缓冲液中，95℃变性10min后冷却至室温，分别得到H1液和H2液；将产物Y溶解于所述3D-HCR缓冲液中，得到Y液；将H1液、H2液、Y液、AuNPs包被液和3D-HCR缓冲液加入反应管中，37℃孵育过夜，进行HCR反应；肉眼监测反应结果，若所得反应混合液分层，且上清液为无色或浅红色，下层为红色的水凝胶，则反应结果为阳性，待测样品中含有汞离子。

对应于方案I，步骤S1中反应体系为：待测样品、1μM模板链X1 6μL、1μM底物链X’-Y’6μL、2.5mM dNTPs 3μL和水6.8μL；

步骤S2中反应体系为：向体系1中加入8U/μL Bst DNA聚合酶0.1μL和10×Thermpol Buffer 3μL；

步骤S3中反应体系为：向体系2中加入10U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶1.2μL和BalbBuffer 3.1 1.5μL；

步骤S4中反应体系为：3D-HCR缓冲液中引物H1、引物H2、产物Y和AuNPs的终浓度分别为320μM、320μM、6.4μM和18nM。

对应于方案II，步骤S1′中反应体系为：待测样品、1μM模板链X1 6μL、1μM底物链X’-Y’6μL、1μM双重扩增模板链Y’-Y’6μL、2.5mM dNTPs 3μL和水6.8μL；

步骤S2′中反应体系为：向体系1′中加入8U/μL Bst DNA聚合酶0.1μL和10×Thermpol Buffer 3μL；

步骤S3′中反应体系为：向体系2′中加入10U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶1.2μL和BalbBuffer 3.1 1.5μL；

步骤S4′中反应体系为：3D-HCR缓冲液中引物H1、引物H2、产物Y和AuNPs的终浓度分别为320μM、320μM、6.4μM和18nM。

第四方面，本发明提供基于核酸纳米金3D水凝胶的汞离子快速可视化定量检测方法，利用所述传感器对汞离子进行定量检测，包括如下步骤：

A、制作标准曲线：

利用已知浓度的汞离子溶液，构建具有不同汞离子浓度的EXPAR扩增体系，EXPAR扩增、酶切、HCR反应与显色检测步骤与方案I或II所述方法中的步骤相同；

以汞离子浓度为横坐标，(A₀-A)/A₀为纵坐标(A₀和A分别代表不存在汞离子和存在不同浓度汞离子时上清液OD₅₂₄值)，绘制标准曲线；

B、按照方案I或II所述的方法对待测样品进行检测，将测得的OD₅₂₄值代入标准曲线，计算得到待测样品中汞离子的含量，实现对汞离子的定量检测。

汞离子浓度的线性检测范围为0.5-10nM。最低检测限可达0.2nM。

优选地，显色检测步骤中，采用酶标仪测定上清液OD₅₂₄值。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明通过优化EXPAR扩增反应的底物链、模板链序列、3D-HCR水凝胶的缓冲液组分、HCR引物浓度及孵育时间，将3D-HCR水凝胶与AuNPs结合在一起，构建了检测Hg²⁺的宏量、可视化传感平台，实现了Hg²⁺的定性、定量检测。本发明基于3D-HCR水凝胶的汞离子快速可视化检测方法具有以下优点：

(一)具有良好的特异性。双重EXPAR中的T-T错配结构是该传感器良好特异性的基础。该结构能够特异识别和结合Hg²⁺，且结构不易受到常见二价离子的干扰。

(二)灵敏度高。与“turn-on”型传感器相比，“turn-off”型传感在低靶物质浓度区间具有更高的灵敏度。同时，EXPAR双重放大及3D-HCR的进一步放大使灵敏度大大提升。

(三)能够实现Hg²⁺的定性、定量检测。肉眼检测限为1nM，如果利用酶标仪进行定量检测，检测的最低限可达0.2nM。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中EXPAR模板结构对生成产物Y的影响。其中，1：X1；2：X’-Y’；3：X1+X’-Y’；4：以X1为模板的EXPAR(+)；5：以X1为模板的EXPAR(-)；6：X2；7：X’-Y’；8：X2+X’-Y’；9：以X2为模板的EXPAR(+)；10：以X2为模板的EXPAR(-)；11：X3；12：X’-Y’；13：X3+X’-Y’；14：以X3为模板的EXPAR(+)；15：以X3为模板的EXPAR(-)。

图2为本发明较佳实施例中EXPAR与biEXPAR扩增效率对比。其中，1:X1；2:X’-Y’；3:Y’-Y’；4:EXPAR(+)；5:biEXPAR(+)。

图3为本发明较佳实施例中AuNPs的表征。其中，(a)紫外-可见光谱图；(b)SEM图。

图4为本发明较佳实施例中缓冲液对3D-HCR水凝胶的影响。其中，①3D-HCR缓冲液；②1×TAE-Mg²⁺缓冲液；③Tris-HCl B1缓冲液。“+”为阳性，“-”为阴性。

图5为本发明较佳实施例中H1,H2,Y引物浓度优化结果。其中，①c(H1)＝c(H2)＝200μM；②c(H1)＝c(H2)＝320μM；③c(H1)＝c(H2)＝380μM。左边为阳性，含有Y。右边为阴性，不含Y。

图6为本发明较佳实施例中3D-HCR水凝胶成胶时间优化结果。

图7为本发明较佳实施例中3D-HCR水凝胶的流变学及扫描电镜表征结果。其中，(a)储能模量(G′)与损耗模量(G″)的频率依赖性；(b)储能模量(G′)与损耗模量(G″)的时间依赖性；(c)储能模量(G′)与损耗模量(G″)的时间依赖性.(d)3D-HCR水凝胶的扫描电镜图(750X).(e)3D-HCR水凝胶的细节图(8000X).(f)包被了AuNPs的3D-HCR水凝胶的细节图(20000X)。

图8为本发明较佳实施例中3D-HCR水凝胶-AuNPs传感器灵敏性分析结果图。其中，(a)Y浓度对3D-HCR水凝胶束缚AuNPs的影响(Y的浓度依次为：1μM，2μM，4μM，8μM，16μM，32μM)；(b)3D-HCR水凝胶-AuNPs传感器检测范围(Hg²⁺的浓度依次为：0nM,0.1nM,0.2nM,0.5nM,1nM,2nM,5nM,10nM,20nM,50nM,100nM,200nM,and 500nM)；(c)3D-HCR水凝胶-AuNPs传感器线性检测区间。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1基于3D-HCR水凝胶的汞离子快速可视化检测方法

1.实验材料

1.1EXPAR所需试剂

EXPAR体系中所用到的Bst DNA聚合酶、Nt.Bst NBI核酸内切酶(切刻内切酶)、dNTP，10×Thermpol Buffer及Buffer 3.1(BalbBuffer 3.1)均购自于美国纽英伦生物技术有限公司(New England Biolabs)。

1.2制备AuNPs试剂

氯金酸(HAuCl₄)、柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)及牛血清白蛋白(BSA)均购于美国Sigma公司。

1.3制备聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂

(1)聚丙烯酰胺凝胶：配制40％丙烯酰胺原液，配方为丙烯酰胺38g，N，N'-甲叉双丙烯酰胺2g，加入蒸馏水定容至100mL，室温避光保存。

(2)5×TBE缓冲液：称取Tris 54g，硼酸27.5g，加入20mL 0.5mol/L EDTA，调节pH至8.3，加水定容至1L。

(3)10％过硫酸铵(AP)：AP 1g加水定容到10mL，4℃下可存贮数周。

(4)TEMED(N’,N’,N’,N’-四甲基乙二胺)、SYBR Gold核酸染料、Gene Ruler超低分子量DNA Ladder和6×DNA Loading buffer均购自于赛默飞世尔科技有限公司。

2.引物序列

EXPAR及3D-HCR反应所需要的引物序列由上海英维捷基生物有限公司合成，详见表1(SEQ ID NO:1-8)。

表1实验中所用的模板链、底物链，产物及引物序列

注：下划线表示EXPAR反应中的T-T错配区；斜体表示Nt.Bst NBI核酸内切酶核酸内切酶的识别区；代表切割位点。

3.Hg²⁺响应型的EXPAR反应

首先以X’-Y’序列为模板，对单重EXPAR的模板序列的结构进行了优化，实现产物Y序列的指数扩增。其中，X1，X2，X3与X’-Y’在切割位点上游的末位的4个碱基分别为5’-TTTA-3’，5’-TTT空-3’，5’-TTTT-3’。换言之，对于序列X1与X2，二者与X’-Y’在切割位点上游有3个T-T错配用于Hg²⁺的特异性识别和结合。而X2在3’末端不含可以与X’-Y’互补的A碱基。两组的试验结果可用于判定3’端的A-T配对是否会影响Nt.BstNBI和Bst DNA聚合酶的活性。对于序列X3，X3与X’-Y’在切割位点上游T-T错配数有4个。扩增Y产物的反应过程如下：

(1)将X1，X2，X3与X’-Y’引物溶解在超纯水中，终浓度为1μM。

(2)按照表2和表3的加样及孵育顺序扩增Y产物。

表2单重EXPAR反应体系及反应过程

表3双重EXPAR反应体系及反应过程

4.3D-HCR水凝胶的制备

(1)将H1,H2,Y溶解在3D-HCR缓冲液(2.5mM NaH₂PO₄·2H₂O,8mM Na₂HPO₄·12H₂O,150mM NaCl,2mM MgCl₂·6H₂O,pH 7.4)中，终浓度分别为1000μM，1000μM，100μM；

(2)将溶解后的H1，H2置于95℃条件下，高温变性10min后取出并冷却至室温。按照H1、H2、Y的终浓度分别为320μM，320μM，6.4μM，将引物溶解于PCR管中，加入3D-HCR缓冲液，使得水凝胶的总体积为50μL；

(3)将PCR管放置37℃恒温箱中孵育过夜。

5.聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶配方如表4所示，电压和电泳时长分别为120V，90min。电泳结束后，将聚丙烯酰胺凝胶浸泡于用1×TBE缓冲液中，加入稀释10000倍的SYBR Gold核酸染料，室温避光色10min，之后用1×TBE洗涤两次，每次10min。用BioDoc-It凝胶成像系统采集图像。

表4聚丙烯酰胺凝胶的配制

6.金纳米粒子的制备与包被

将烧制AuNPs所需的圆底烧瓶、量筒等玻璃容器置于酸酐缸中浸泡过夜，以去除盐离子的干扰。取出后用蒸馏水清洗3次。在圆底烧瓶中加入超纯水250mL，用电热套加热至沸腾，圆底烧瓶中的蒸馏水废弃不用。随后，在圆底烧瓶中重新加入超纯水196mL、1％氯金酸1mL并加热至沸腾。一次性加入3mL的1％柠檬酸三钠。一段时间后可观察到圆底烧瓶中的液体颜色逐渐加深至黑色，而后变为樱桃红色。5min后停止加热，冷却至室温后，避光4℃保存。

AuNPs表面上带有正电荷，BSA带有负电荷，两者通过静电吸附作用结合，可防止AuNPs在高盐浓度的水凝胶形成缓冲液中的聚合。AuNPs包被方案为：以PBS缓冲液为溶剂配制10％BSA溶液，每1mL AuNPs溶液中加入20μL BSA溶液，在血液混匀仪上旋转孵育40min即可。

7.可视化3D-HCR水凝胶的制备

(1)按照H1、H2、Y、AuNPs(15nm)的终浓度分别为320μM，320μM，6.4μM，18nM，将引物溶解于PCR管中，加入3D-HCR缓冲液，使得水凝胶的总体积为50μL；

(2)将PCR管放置37℃恒温箱中孵育过夜。

8.基于核酸纳米轨道(核酸纳米金3D水凝胶)的Hg²⁺快速可视化检测方法的设计原则

3D-HCR水凝胶是在线性HCR基础上，通过改变发夹的结构和结合方式，形成的核酸纳米轨道状的多孔性三维结构，是一种宏量的纳米材料。AuNPs同样具有纳米级的粒径，并具有良好的光学特性，被广泛应用于比色传感平台。本发明结合双重EXPAR，3D-HCR水凝胶和AuNPs，建立了可视化Hg²⁺检测生物传感平台。在Hg²⁺存在的情况下，Hg²⁺与T碱基形成T-Hg-T结构，诱导EXPAR的扩增。EXPAR的扩增产物Y序列，可作为3D-HCR水凝胶的促发子。形成3D-HCR水凝胶需要包含3个组分：Y，H1，H2。与传统的线性HCR不同，3D-HCR中的H1的粘性末端含有长度为10nt的回文序列，退火后，粘性末端互相结合形成H1二聚体结构。当体系中没有Y时，H1,H2以发夹结构的形式稳定共存；当体系中含有Y时，Y与H1结合并打开H1的发夹结构，从而使H1露出新的粘性末端，打开H2发夹。经过多次循环，复杂的分支状链接会形成三维网络结构，即DNA水凝胶。

3D-HCR水凝胶是一种多孔性结构，其孔隙可以束缚AuNPs。在加入Y前先加入BSA包被的AuNPs，AuNPs游离在溶液中，体系呈现均匀的红色溶胶状态。再加入Y，水凝胶生成，AuNPs被束缚在凝胶的孔隙中。此时加入缓冲液，可观察到体系呈现明显的分层：上层是无色至浅红色的缓冲溶液，下层是红色的水凝胶。

3D-HCR水凝胶束缚AuNPs的能力与Y的浓度呈正相关。当Y浓度低，水凝胶孔径大时，其对AuNPs的束缚力弱。当加入缓冲液时，部分AuNPs被释放至缓冲液中，使溶液呈现红色；当Y浓度高，水凝胶孔径小时，更多的AuNPs被束缚在水凝胶中，释放进入缓冲液的AuNPs浓度低，溶液颜色浅。Y的生成量与EXPAR体系中Hg²⁺浓度呈正相关。因此，可通过测定上清液吸光度值实现Hg²⁺的定量检测。

9.电泳分析Hg²⁺响应型的EXPAR反应

对EXPAR引物的结构进行优化，得到了能特异识别并结合Hg²⁺的模板结构。以X1,X2,X3分别结合X’-Y’模板，促发单重EXPAR反应。以EXPAR(-)表示体系中不加入Hg²⁺，EXPAR(+)表示体系中加入Hg²⁺，且Hg²⁺的浓度为1μM。其反应结果如图1所示。

由图1可知，当以X1,X’-Y’为模板时，在Hg²⁺存在情况下可以产生明显的Y条带。而当体系中没有Hg²⁺时，没有Y条带生成。而以X2/X3及X’-Y’为模板时，无论加不加Hg²⁺，都不能产生明显的Y条带。由此可知，切割位点末端的A-T配对有利于Nt.BstNBI和Bst DNA聚合酶的切割或延伸，而T-Hg²⁺-T错配难以作为Nt.Bst NBI和Bst DNA聚合酶的作用位点。因此，在后续实验中，我们选择X1,X’-Y’为EXPAR生成Y产物的模板。

EXPAR作为传感器中实现信号放大的单元，起到了增加传感器灵敏度的作用。双重EXPAR在EXPAR体系中增加了Y’-Y’序列，实现了信号的双重放大。图2为EXPAR与双重EXPAR生成Y产物后经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)得到的结果。由图2可知，双重EXPAR扩增后产生的Y条带，其浓度要高于普通EXPAR。

10.AuNPs的表征

如图3a所示，AuNPs的紫外-可见吸收光谱在524nm处有最大吸收峰。利用JOEL透射电子显微镜JEM2100观察制备出的AuNPs，如图3b所示，AuNPs在体系中的分散性良好，呈规则的圆球状，平均直径约15nm。

11.3D-HCR水凝胶体系的优化

首先对生成3D-HCR水凝胶的反应条件和反应时间进行探索。比较了缓冲液种类、模板浓度、孵育时间对3D-HCR水凝胶生成的影响，并证明了3D-HCR水凝胶的特异性，与AuNPs的兼容性及凝胶束缚AuNPs的能力与I链浓度的关系。为实现Hg²⁺的定量检测进行了可行性论证。

11.1缓冲液对3D-HCR水凝胶生成的影响

配制三种缓冲液3D-HCR缓冲液、1×TAE-Mg²⁺缓冲液(40mM Tris,20mM乙酸,2mMEDTA,12.5mM Mg2+,pH 7.4)、Tris-HCl B1缓冲液(10mM Tris，1mM MgCl₂，pH 7.4)。阳性组、阴性组中的H1、H2终浓度均为320μM。阳性组加入Y 6.4μM，阴性体系中不加。37℃条件下孵育过夜后，结果如图4所示。

由图4可知，对于三种缓冲液而言，只有H1与H2共存时均无法促发3D-HCR。在加入Y后，3D-HCR缓冲液生成凝胶的效果最好。1×TAE-Mg²⁺缓冲液也能够促发水凝胶的形成，但凝胶中还含有大量的游离水，结构疏松，成胶不完全。三种缓冲液中，Tris-HCl缓冲液的凝胶效果最差，阳性组与阴性组呈现差别不大的溶胶状态。

11.2 H1,H2引物浓度对3D-HCR水凝胶的影响

水凝胶的形成需要促发子Y和发夹H1,H2均达到一定的浓度水平。模板浓度过低时，形成的凝胶结构疏松，或不能形成凝胶，以溶胶的形式存在。模板浓度过高时，个别不稳定的发夹之间可能互相交联，在没有促发子Y的情况下就形成松散的凝胶结构。因此，对引物浓度进行了优化，结果如图5所示。

由图5可知，随着H1,H2浓度的增加，阳性组形成的水凝胶中游离水的含量降低。③组阴性条件下也能形成松散的凝胶，说明体系中存在少量解链的发夹，彼此之间能够形成交联。当H1，H2浓度为320μM时，阳性组成胶状态良好，阴性组不能成胶，两组的差异最明显。因此，本发明选用的引物浓度为c(H1)，c(H2)＝320μM，Y＝6.4μM。

11.3 3D-HCR水凝胶生成时间优化

为尽可能缩短实现Hg²⁺检测的时间，本发明对水凝胶的成胶过程进行了监测。3D-HCR水凝胶的成胶过程如图6所示。

由图6可知，反应前6h，体系呈现溶胶状态，肉眼不能观察到块状凝胶的生成。8～10h体系出现松散的凝胶。12h后，水凝胶成胶情况良好，大量游离水被锁在水凝胶中。因此，本发明所选择的孵育时间为12h。

12.3D-HCR水凝胶的表征

水凝胶的功能和应用在很大程度上取决于其力学性能。对3D-HCR水凝胶的进行了动态力学测试研究它的流变性能(图7a-c)。如图7a所示，在0.1～10Hz的扫描频率下，3D-HCR水凝胶的储能模量G′始终大于损耗模量G″，该结果表明，3D-HCR水凝胶具有凝胶特性。如图7b所示，在固定频率下扫描300s，G′始终大于G″，再次证明水凝胶的稳定存在。此外，3D-HCR水凝胶的流变学行为对温度敏感，如图7c所示，当温度高于42℃左右时，G′迅速下降，当温度高于62℃时G″甚至高于G′，这说明62℃是凝胶到溶胶转变点。用SEM表征3D-HCR水凝胶的结构特性，如图7d所示，水凝胶真空干燥后的样品具有典型的三维交联形貌。为了进一步了解3D-HCR水凝胶的结构细节，在高倍镜下观察水凝胶结构的微观细节，如图7e所示，水凝胶交联结构的表面覆盖着致密的盐颗粒。用同样的方法表征束缚了AuNPs的3D-HCR水凝胶的微观结构，如图7f所示，束缚了AuNPs的水凝胶表面颗粒的尺寸与普通的水凝胶非常相似，但是表面形态有着明显的差异，这可能是由盐颗粒在球状的AuNP上的覆盖引起的。

13.Hg²⁺的定量检测

促发子Y的浓度与凝胶的密度具有相关关系,Y浓度高，生成的3D-HCR水凝胶宏观上更为紧实；Y浓度低，生成的3D-HCR水凝胶较为松散。本发明以AuNPs作为显色介质描述3D-HCR水凝胶对AuNPs的束缚能力，其结果如图8a所示。

在优化后的实验条件下，以Hg²⁺浓度为横坐标，(A₀-A)/A₀为纵坐标(A₀和A分别代表不存在汞离子和存在不同浓度汞离子时上清液OD₅₂₄值)，绘制标准曲线，实现对Hg²⁺的定量检测。3D-HCR水凝胶-AuNPs传感器的检测范围及线性区间如图8b所示。在0～100nM范围内，随着Hg²⁺浓度的增加，水凝胶上清液的OD值降低，并在100nM后达到稳定。如图8c所示，当Hg² ⁺浓度为0.5～10nM时，传感器对Hg²⁺浓度的响应是线性的，其线性相关性可表征为y＝0.0458x+0.2088，相关系数R²＝0.9577。图8c中的内嵌图像是线性区间范围内，肉眼观察到AuNPs的颜色变化，说明该传感器实现了Hg²⁺的可视化检测。对于目视检测，可在1～10nM的浓度范围内观察到明显的颜色变化。如果利用酶标仪进行定量检测，检测的最低限可达到0.2nM。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 基于3D-HCR水凝胶的汞离子快速可视化检测方法

<130> KHP191110795.4

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctacacgcga ttcatgagtc ttta 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctacacgcga ttcatgagtc ttt 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctacacgcga ttcatgagtc tttt 24

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctggctcctg tgattgtgct ctagtttttg actcatgaat cgcgtgtag 49

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctggctcctg tgattgtgct ctagaacaga ctcctggctc ctgtgattgt gctctag 57

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctagagcaca atcacaggag ccag 24

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatcgcgatc ctggctcctg tgattgtgct ctagacatcg ctagagcaca atcacagg 58

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctagagcaca atcacaggag ccagttttcc tgtgattgtg ctctagcgat gt 52

Claims

1.一种汞离子响应型超快扩增可视化传感器，其特征在于，包括：(1)EXPAR扩增体系，(2)酶切体系，(3)3D-HCR及显色检测体系；

所述检测体系用于对待测样品依次经由所述EXPAR扩增体系、酶切体系和3D-HCR体系进行反应后所得产物进行显色检测；

底物链X1：5′-CTA CAC GCG ATT CAT GAG TC TTTA-3′

模板链X’-Y’：5′-CTG GCT CCT GTG ATT GTG CTC TAG T TTTT GACTC ATG AAT CGCGTG TAG-3′

双重扩增模板链Y’-Y’：5′-CTG GCT CCT GTG ATT GTG CTC TAG AACA GACTC CTG GCTCCT GTG ATT GTG CTC TAG-3′；

所述酶切体系包括Nt.BstNBI切刻内切酶；

引物H1：5′-GAT CGC GAT C CTG GCT CCT GTG ATT GTG CTC TAG ACA TCG CTA GAGCAC AAT CAC AGG-3′

引物H2：5′-CTA GAG CAC AAT CAC AGG AGC CAG TTTT CCT GTG ATT GTG CTC TAGCGA TGT-3′

3D-HCR缓冲液：2.5mM NaH₂PO₄·2H₂O,8mM Na₂HPO₄·12H₂O,150mM NaCl,2mM MgCl₂·6H₂O,pH 7.4。

2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述AuNPs包被液的制备方法如下：1)在圆底烧瓶中加入超纯水196mL，1％氯金酸1mL加热至沸腾；然后加入1％柠檬酸三钠3mL，反应一段时间后可见液体颜色逐渐加深至黑色，而后变为樱桃红色，5min后停止加热，冷却至室温，得到AuNPs溶液，避光4℃保存；

3.权利要求1或2所述传感器在检测汞离子中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测为定性检测或定量检测。

5.基于核酸纳米金3D水凝胶的汞离子快速可视化定性检测方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述传感器对汞离子进行定性检测，包括如下步骤：

方案I：单重EXPAR扩增

S3、酶切反应：向体系2中加入Nt.BstNBI切刻内切酶和BalbBuffer 3.1，55℃孵育20min，得到产物Y；

S4、HCR反应及显色检测：将引物H1、H2分别溶解于所述3D-HCR缓冲液中，95℃变性10min后冷却至室温，分别得到H1液和H2液；将产物Y溶解于所述3D-HCR缓冲液中，得到Y液；将H1液、H2液、Y液、AuNPs包被液和3D-HCR缓冲液加入反应管中，37℃孵育过夜，进行HCR反应；肉眼监测反应结果，若所得反应混合液分层，且上清液为无色或浅红色，下层为红色的水凝胶，则反应结果为阳性，待测样品中含有汞离子；

方案II：双重EXPAR扩增

S3′、向体系2′中加入Nt.BstNBI切刻内切酶和BalbBuffer3.1，55℃孵育20min，得到产物Y；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中反应体系为：待测样品、1μM模板链X1 6μL、1μM底物链X’-Y’6μL、2.5mM dNTPs 3μL和水6.8μL；

步骤S2中反应体系为：向体系1中加入8 U/μL Bst DNA聚合酶0.1μL和10×ThermpolBuffer 3μL；

步骤S3中反应体系为：向体系2中加入10 U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶1.2μL和BalbBuffer3.1 1.5μL；

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1′中反应体系为：待测样品、1μM模板链X1 6μL、1μM底物链X’-Y’6μL、1μM双重扩增模板链Y’-Y’6μL、2.5mM dNTPs 3μL和水6.8μL；

步骤S2′中反应体系为：向体系1′中加入8 U/μL Bst DNA聚合酶0.1μL和10×ThermpolBuffer 3μL；

步骤S3′中反应体系为：向体系2′中加入10 U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶1.2μL和BalbBuffer 3.1 1.5μL；

8.基于核酸纳米金3D水凝胶的汞离子快速可视化定量检测方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述传感器对汞离子进行定量检测，包括如下步骤：

A、制作标准曲线：

利用已知浓度的汞离子溶液，构建具有不同汞离子浓度的EXPAR扩增体系，EXPAR扩增、酶切、HCR反应与显色检测步骤与权利要求5-7任一项所述方法中的步骤相同；

以汞离子浓度为横坐标，(A₀-A)/A₀为纵坐标，绘制标准曲线；其中，A₀和A分别代表不存在汞离子和存在不同浓度汞离子时上清液OD₅₂₄值；

B、按照权利要求5-7任一项所述的方法对待测样品进行检测，将测得的OD₅₂₄值代入标准曲线，计算得到待测样品中汞离子的含量，实现对汞离子的定量检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，汞离子浓度的线性检测范围为0.5-10nM。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，显色检测步骤中，采用酶标仪测定上清液OD₅₂₄值。