CN108823288A

CN108823288A - 一种检测模块及方法

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Publication number: CN108823288A
Application number: CN201810576135.0A
Authority: CN
Inventors: 许文涛; 罗云波; 苗苗; 杜再慧; 田晶晶; 梁志宏; 黄昆仑
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-06-06
Filing date: 2018-06-06
Publication date: 2018-11-16
Anticipated expiration: 2038-06-06
Also published as: CN108823288B

Abstract

本发明提供了一种检测模块及方法。本发明基于EXPAR串联消解型HCR建立了一种检测模块及方法。当待检测物中含有靶标物质时，通过本发明建立的用于EXPAR反应的模块和方法扩增形成大量的消解单链，实现靶标物质的检测信号的放大，然后再将形成的大量消解单链用于消解本发明改造的消解型HCR产物，实现靶标物质检测信号的转换。在一个具体的实施方式中，本发明通过对HCR中使用的发夹结构进行改造，对超分子双链串联体改造升级，使核酸发夹不仅可以自组装成DNA双链，同时还可以被核酸单链高效消解。实现信号的双重感应。在一个具体的实施方式中，将本发明设计改造的消解型发卡序列、消解序列应用于实际检测时，检测的灵敏度高，最低能检测到1nM的X底物。

Description

一种检测模块及方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测模块及方法。

背景技术

食品安全风险因子来源上大致可以分为生物源安全风险因子和非生物源性安全风险因子。生物源安全风险因子较为典型的如食源性致病菌和在致毒机制研究中具有重要生物学意义的microRNA；非生物源性食品安全风险因子如环境中的重金属。除此之外，食品安全风险因子种类繁多，不同种类风险因子间的联系愈发紧密，但目前想实现不同类型的风险因子的同时检测，还是一个技术难题。传统的检测方法依赖于大型的仪器设备或者免疫分析法等，通常耗时且不能进行现场检测。而一些生物学检测往往对于被检测的靶物质选择性较高，且同样很少可以通用性检测。

发明内容

本发明提供了一种检测模块及方法。本发明基于EXPAR(ExponentialAmplification Reaction，EXPAR)串联消解型HCR(Hybridization chain reaction，HCR)建立了一种检测模块及方法。当待检测物中含有靶标物质时，通过本发明建立的用于EXPAR反应的模块和方法扩增形成大量的消解单链，实现靶标物质的检测信号的放大，然后再将形成的大量消解单链用于消解本发明改造的消解型HCR产物，实现靶标物质检测信号的转换。如果靶标物质为核酸序列，则以该核酸序列的部分或全部作为EXPAR反应的引物序列，如果靶标物质是非核酸物质如金属离子，则可先通过金属核酶将金属离子转化为核酸序列信号，例如，当待测物中含有待测金属离子时，金属核酶被激活，切割模板序列，释放待检测的目标靶序列，然后将该目标靶序列作为EXPAR反应的引物序列，实现后续的检测。本发明建立的一种基于EXPAR串联消解型HCR的检测模块及方法，为生物源安全风险因子和非生物源性安全风险因子的通用检测提供了一个新的通用平台，丰富了现有检测技术和方法，为新的检测产品或方法的研发提供了一个新的平台和思路。

本发明的一个目的是提供一种检测模块，所述模块包括发卡型核酸序列1、发卡型核酸序列2和促发子核酸序列：

所述发卡型核酸序列1从5’端到3’端依次包括序列a、b、c、d、b’；

所述发卡型核酸序列2从5’端到3’端依次包括序列b’、a’、e、b、d’；

所述促发子核酸序列从5’端到3’端依次包括序列b’、a’；

所述b与b’的核酸序列反向互补杂交，所述a与a’的核酸序列反向互补杂交，所述d与d’的核酸序列反向互补杂交，所述c、e包括核苷酸个数为1个以上的任意核酸序列。

具体的，所述模块包括下述1)-3)所述中的至少一种：

1)所述c、e包括核苷酸个数为15个的任意核酸序列；具体的，所述c为5’-AAAAAAAAAAAAAAA-3’；所述e为5’-GGGGGGGGGGGGGGG-3’；

2)所述b、b’的核苷酸个数为18个；

3)所述a、a’、d、d’的核苷酸个数为6个。

具体的，所述模块包括下述1)-3)所述中的至少一种：

1)所述促发子核酸序列为序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述促发子具有相同功能的核苷酸序列；

所述功能包括与所述发卡型核酸序列1的部分核苷酸序列反向互补杂交；或打开所述发卡型核酸序列1的发卡结构，使得所述发卡型核酸序列1变为单链状态；

2)所述发卡型核酸序列1为序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述发卡型核酸序列1具有相同功能的核苷酸序列；

所述功能包括与所述促发子的部分和/或全部核苷酸序列反向互补杂交；且与所述发卡型核酸序列2的部分核苷酸序列反向互补杂交，或使得所述发卡型核酸序列2变为单链状态；

3)所述发卡型核酸序列2为序列表中SEQ ID №：8所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：8所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述发卡型核酸序列2具有相同功能的核苷酸序列；

所述功能包括与所述发卡型核酸序列1的部分核苷酸序列反向互补杂交，或使得所述发卡型核酸序列1变为单链状态。

本发明的另一个目的是提供一种检测模块，所述模块包括发卡型核酸序列1、发卡型核酸序列2和促发子核酸序列，所述模块包括下述1)-3)：

1)所述促发子核酸序列为序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述SEQ ID №：4具有相同功能的核苷酸序列；

2)所述发卡型核酸序列1为序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述SEQ ID №：5具有相同功能的核苷酸序列；

3)所述发卡型核酸序列2为序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述SEQ ID №：6具有相同功能的核苷酸序列；

所述与所述SEQ ID №：4具有相同功能的核苷酸序列包括与所述SEQ ID №：5的部分核苷酸序列反向互补杂交；或打开所述SEQ ID №：5的发卡结构，使得所述SEQ ID №：5呈单链状态；

所述与所述SEQ ID №：5具有相同功能的核苷酸序列包括与所述SEQ ID №：4的部分和/或全部核苷酸序列反向互补杂交；且与所述SEQ ID №：6的部分核苷酸序列反向互补杂交，或使得所述SEQ ID №：6呈单链状态；

所述与所述SEQ ID №：6具有相同功能的核苷酸序列包括与所述SEQ ID №：5的部分核苷酸序列反向互补杂交，或使得所述SEQ ID №：5呈单链状态。

具体的，本发明任一所述模块还包括核酸序列3和核酸序列4；

所述核酸序列3从5’端到3’端依次包括序列f、g、x’；

所述核酸序列4从5’端到3’端依次包括序列h、i、j；

所述g、i中包含内切酶识别和/或酶切核酸序列的反向互补杂交序列；

具体的，所述内切酶识别和/或酶切核酸序列的反向互补杂交序列为5'-GACTC-3'；

具体的，所述g为5'-AACTGACTCGG-3'；所述i为5'-AACAGACTCGG-3'；

所述x’包含与待测靶标核酸序列互补杂交的核酸序列；

所述f、h或j均各自包含a’、e。

具体的，所述模块还包括下述1)-3)所述中的至少一种：

1)所述f、h或j均各自从5’端到3’端依次包括b’的部分核酸序列、a’、e、b的部分核酸序列；具体的，所述b’的部分核酸序列包括b’的3’端的部分核苷酸序列；所述b的部分核酸序列包括b的5’端的部分核苷酸序列；

2)所述f、h、j任意一条序列的反向互补杂交序列，与所述发卡型核酸序列2的互补杂交的△G，是所述发卡型核酸序1与所述发卡型核酸序2互补杂交的△G的两倍以上；具体的，为两倍；

3)所述f、h、j任意一条序列的反向互补杂交序列，与所述发卡型核酸序列2互补杂交所需要的最低反应温度，要低于所述发卡型核酸序1或所述发卡型核酸序2自身的解链温度Tm。

具体的，所述模块包括下述1)-2)所述中的至少一种：

1)序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述核酸序列3具有相同功能的核苷酸序列；

所述相同功能包括与待测靶标核酸序列互补杂交，且其本身的互补杂交链与所述发卡型核酸序列2的部分核苷酸序列反向互补杂交；

2)序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述核酸序列4具有相同功能的核苷酸序列；

所述相同功能包括其本身的互补杂交链与所述发卡型核酸序列2的部分核苷酸序列反向互补杂交。

本发明的还一个目的是提供一种检测传感器，所述传感器包括本发明任一所述的检测模块；所述传感器还包括下述1)-5)所述中的至少一种：

1)HCR反应缓冲液；具体为：8.0mM Na₂HPO₄,2.5mM NaH₂PO₄,2.0mM MgCl₂,and0.15mM NaCl,溶剂为水，pH 7.4；

2)DNA聚合酶；具体为Bst.polymerase；

3)内切酶；具体为Nt.Bst.NBI；

4)EXPAR反应缓冲液；具体为NE buffer 3.1、Themofer buffer；

5)dNTP。

本发明的再一个目的是提供一种检测方法，所述方法包括下述1)或2)：

1)利用权利要求1、2、3和/或4任一所述模块进行HCR反应，获得HCR产物；

进行消解反应，所述消解反应包括：将待测物与HCR反应产物或HCR反应完成后的反应体系混合孵育；

对消解反应结果进行检测，如果HCR反应产物发生降解，则待测物中含有待测靶标核酸序列；

2)利用权利要求1、2、3和/或4任一所述检测模块进行HCR反应，获得HCR产物；

利用权利要求5、6和/或7任一所述检测模块中的核酸序列3和核酸序列4与待测物一起进行EXPAR反应，获得EXPAR反应产物；

进行消解反应，所述消解反应包括：将所述EXPAR反应产物或EXPAR反应完成后的反应体系，与HCR反应产物或HCR反应完成后的反应体系混合孵育；

对消解反应结果进行检测，如果HCR反应产物发生降解，则待测物中含有待测靶标核酸序列。

具体的，所述HCR反应包括：将所述发卡型核酸序列1和发卡型核酸序列2分别分装到反应管中用水溶解，在PCR仪上热变性，然后缓慢降至室温，最后放于4℃稳定1个小时，将所述促发子核酸序列、稳定后的发卡型核酸序列1和发卡型核酸序列2加入反应缓冲液中，室温孵育30min-4h，具体的37℃孵育1h，即得HCR产物。

具体的，所述HCR反应中，所述促发子核酸序列终浓度为10nM，所述发卡型核酸序列1和发卡型核酸序列2的终浓度各自均为100nM。

具体的，所述EXPAR反应包括：将待测物、核酸序列3、核酸序列4、聚合酶和内切酶的反应缓冲液、dNTP、超纯水置于反应管中混匀于55℃加热2min以上，具体为3min以上，再具体为5min；取出反应管加入聚合酶、内切酶、超纯水混匀，置于PCR仪中55℃，40个循环以上，具体为250个循环。

再具体的，所述EXPAR反应中，所述聚合酶的终浓度包括0.4～1.0U，再具体的为0.4U；所述内切酶的终浓度包括0.04～0.1U，再具体的为0.04U。

再具体的，所述聚合酶为Bst.polymerase；所述内切酶为Nt.Bst.NBI。

再具体的，所述取出反应管加入聚合酶、内切酶、超纯水混匀前，可加入荧光染料；所述荧光染料具体为SYBR Green I。

具体的，所述消解反应中，所述混合孵育包括37℃孵育3h。

具体的，所述检测包括：琼脂糖凝胶电泳或荧光检测。

本发明的最后一个目的是提供本发明任一所述检测模块、本发明任一所述传感器、本发明任一所述检测方法的应用。

具体的，所述应用包括下述1)-3)所述中的至少一种：

1)用于检测生物样品；

具体的，所述生物样品包括转基因产品、微生物；

具体的，用于检测生物样品时，可选取生物样品中的特征序列的一部分或全部，作为待测靶标核酸序列；

2)用于检测非生物样品；

具体的，所述非生物样品包括金属；

具体的，将本发明任一所述模块、传感器或检测方法，作为通用平台，检测金属离子时，可先通过金属核酶将金属离子的信号转换为核酸序列信号，然后将该转换的核酸序列作为通用平台的待测靶标核酸序列；

3)用于制备检测生物样品或非生物样品的产品及其相关产。

本发明的有益效果包括：

本发明基于EXPAR(Exponential Amplification Reaction，EXPAR)串联消解型HCR(Hybridization chain reaction，HCR)建立的一种检测模块及方法，是一种新的检测产品或方法，该模块或方法丰富了现有检测技术和方法，为新的检测产品或方法的研发提供了一个新的平台和思路。

在一个具体的实施方式中，本发明通过对HCR中使用的发夹结构进行改造，对超分子双链串联体改造升级，使核酸发夹不仅可以自组装成DNA双链，同时还可以被核酸单链高效消解。实现信号的双重感应。

在一个具体的实施方式中，本发明建立的EXPAR，20-30min内可扩增出大量的消解单链，时间短效率高。

在一个具体的实施方式中，本发明建立的消解型HCR，30min内便可以将消解型HCR产物进行消解，时间短效率高。

在一个具体的实施方式中，将本发明设计改造的消解型发卡序列、消解序列应用于实际检测时，检测的灵敏度高，最低能检测到1nM的X底物。

附图说明

图1为实时定量PCR验证所建立的EXPAR的扩增效率的结果图，其中，图A为不同X浓度时的扩增曲线图，图B为不同X浓度时的扩增效率图。

图2为实时定量PCR验证DNA聚合酶的浓度对于EXPAR的影响实验结果图，其中，图A,B,C,D分别依次代表DNA聚合酶的浓度为0.04U，0.06U,0.08U,0.1U时的扩增曲线结果图，1为实验组的扩增曲线，2为空白对照组的扩增曲线。

图3为实时定量PCR验证DNA切克内切酶的浓度对于EXPAR的影响实验结果图，其中，图A,B,C,D分别依次代表DNA切克内切酶的浓度为0.4U，0.6U,0.8U,1.0U时的扩增曲线结果图，1为实验组的扩增曲线，2为空白对照组的扩增曲线。

图4为用于消解型HCR与传统HCR的发卡结构的自组装效果及促发效率比较实验结果图，其中M代表分子量标记；序号1-20分别代表不同反应体系或条件的实验结果，具体的：1、100nM的H1；2、100nM的D-H2；3、100nM的H2；4、100nM的D-H2；5、100nM的H1/H2；6、100nM的D-H1/D-H2；7,9,11,13,15,17,19：100nM的H1/H2，10nM的促发子，反应时间分别依次为30min,1h,90min,2h,150min,3h,4h；8,10,12,14,16,18，20：100nM的D-H1/H2，10nM的促发子，反应时间分别依次为30min,1h,90min,2h,150min,3h,4h。

图5为消解反应结果的电泳图，其中M代表分子量标记；序号1-8分别代表不同反应体系的实验结果，具体的：1、100nM的D-H1；2、100nM的D-H2；3、100nM的D-H1/D-H2，10nM的促发子；4、消解型HCR自组装产物,消解链Y浓度为1nM；5、消解型HCR自组装产物,消解链Y浓度为10nM；6、消解型HCR自组装产物,消解链Y浓度为100nM；7、消解型HCR自组装产物,消解链Y浓度为1μM；8、消解型HCR自组装产物,，消解链Y浓度为10μM。

图6为消解反应的产物灰度校准曲线，虚线表示对数据的线性拟合。

图7为消解单链Y1、Y、Y3的消解反应结果图，其中M代表分子量标记；序号1-6分别代表不同反应体系的实验结果，具体的：1、100nM的D-H1/D-H2；2、100nM的D-H1/D-H2，10nM的促发子；3、100nM的D-H1/D-H2，10nM的促发子；4、消解型HCR自组装产物+消解链Y1浓度为1μM；5、消解型HCR自组装产物+消解链Y浓度为1μM；6、消解型HCR自组装产物+消解链Y3浓度为1μM。

图8为消解时间优化实验的结果图，其中序号1-8分别代表不同反应体系或条件的实验结果，具体的：1、100nM的D-H1/D-H2；2、100nM的D-H1/D-H2,10nM的促发子；3、D-HCR+EXPAR,3h；4、D-HCR+EXPAR,150min；5、D-HCR+EXPAR,2h；6、D-HCR+EXPAR,90min；7、D-HCR+EXPAR,1h；8、D-HCR+EXPAR,30min。

图9为EXPAR串联消解型HCR检测模块的灵敏度实验结果图，其中序号1-11分别代表不同反应体系的实验结果，具体的：1、100nM的D-H1；2、100nM的D-H2；3、100nM的D-H1/D-H2，10nM的促发子；4、100nM的消解链Y；5、D-HCR，EXPAR体系X浓度为10pM；6、D-HCR，EXPAR体系X浓度为100pM；7、D-HCR，EXPAR体系X浓度为1nM；8、D-HCR，EXPAR体系X浓度为10nM；9、D-HCR，EXPAR体系X浓度为100nM；10、D-HCR，EXPAR体系X浓度为1uM；11、D-HCR，EXPAR体系X浓度为10uM。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体的，所有合成的DNA序列在英维捷基有限公司合成；SYBR Gold核酸染料，GeneRuler超低分子量DNA Ladder和6×DNA上样缓冲液均购自于赛默飞世尔科技有限公司；Bst DNA聚合酶，Nt.Bst NBI核酸内切酶和相应的buffer购自于美国纽英伦生物技术有限公司；超纯水来自于Milli-Q净化系统，其它试剂均为分析纯。琼脂糖凝胶电泳图像由美国UVP公司的BioDoc-It系统获得；琼脂糖凝胶成像系统使用的是美国UVP公司的Bio Doc-It成像系统。Realtime PCR使用的是美国ABI公司的产品。

实施例1、EXPAR串联消解型HCR检测模块中使用的核苷酸序列及其设计方法

(一)EXPAR使用到的核苷酸序列

本实施例设计的EXPAR使用到的核苷酸序列如表1所示。

表1

(二)传统HCR和消解型HCR核苷酸序列

本实施例设计的用于传统HCR和消解型HCR的核苷酸序列如表2所示。

表2

表2中，hairpin H1为发卡1，hairpin H2为发卡2，用于传统HCR；D-H1为消解发卡1，D-H2为消解发卡2，用于消解型HCR。

(三)EXPAR串联消解型HCR通用模块的设计方法

本实施例用序列X代表待检测的目标靶序列。在实际检测过程中，可根据待测靶标物质设计出引物序列，然后将该引物序列作为EXPAR的引物，替换上述表1中的序列X，即可实现任意待测核酸靶标物质的检测。

如果是非核酸的物质检测，则先通过功能核酸转化，如金属离子的检测，可先通过金属核酶将金属离子转化为核酸序列信号(例如，当待测物中含有待测金属离子时，金属核酶被激活，切割模板序列，释放待检测的目标靶序列)，然后将该转化的核酸序列替换待检测的目标靶序列X即可实现检测。

1)EXPAR所用核苷酸序列的设计方法

如表1所示，根据上述表1中的引物序列X(5'-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3')设计X'-Y'对应的与X互补的序列X'部分，X'-Y'包含序列X'(5'-CTATACAACCTACTACCTCA-3')和序列Y'(5'-GATTCTGTTTGGCCGGGGGGGGGGGGGGGACAGAATCCGAAGC-3')，中间被9个碱基隔断(5'-CTGACTCGG-3')。在DNA聚合酶以及dNTP存在时，X引物可以沿着模板X'-Y'进行延伸产生包含切克内切酶的识别位点(5'-GAGTC-3')和Y(5'-GCTTCGGATTCTGTCCCCCCCCCCCCCCCGGCCAAACAGAATC-3')的序列。序列5'-GAGTC-3'是切克内切酶的识别位点，在位于识别位点下游端第四个碱基处DNA单链(Y)被切割。通过酶切割之后，DNA单链识别位点之后的碱基在DNA聚合酶作用下再次延伸，产生Y链，Y链再次被切克内切酶切割。经过无数次循环后，就会产生无数个Y链。紧接着，Y链可与模板Y'-Y'互补配对，与上面原理相同，在DNA聚合酶，内切酶和dNTP的作用下,经过无数次的循环，Y链被大量的产生和置换。SYBR Green I染料可以嵌合到双链形成的过程中，产生荧光。通过使用该染料，实时定量检测Y链的产量。

需要特别指出的是，由靶标物质设计的引物，用于EXPAR扩增，扩增出的产物Y链就是消解型HCR中的消解链。

2)消解型HCR所用核苷酸序列的设计方法

传统HCR包括促发子、发卡1和发卡2(例如表2中的促发子、hairpin H 1、hairpinH2)，在促发子的作用下，发卡1和发卡2会交替打开发卡结构并同时生成一个具有缺口的DNA长双链。

本发明通过对传统HCR中的发卡1和发卡2的改造，设计出消解发卡1和消解发卡2(例如表2中的D-H1、D-H2)。

消解发卡1和消解发卡2不仅具备传统HCR中发卡1和发卡2的功能，即在促发子的作用下，消解发卡1和消解发卡2会交替打开发卡结构并同时生成一个具有缺口的DNA长双链，而且还可以通过上述EXPAR扩增所大量形成的消解链Y对具有缺口的DNA长双链进行消解和拆分。加入消解链Y后，Y与HCR上双链缺口处互补配对，将长双链进行拆分。最后结合琼脂糖凝胶电泳或其他检测平台或者技术就可以实现靶物质的快速检测。

具体的消解型HCR的发卡结构的设计如下所述：

通过热力学计算，以及通过Integrated DNA Technology(IDT)公司的网站服务器The OligoAnalyzer 3.1，可以得到表2所示hairpin H1、hairpin H2、D-H1、D-H2四条供能的“燃料”核酸发夹的自由能ΔG(kcal·mole-1)和解链温度Tm(℃)，具体如表3所示的核酸发卡能量及结构参数。

表3

由表3总结出的传统杂交链式反应搭建需要的几个设计原则：

(1)两个发夹(例如hairpin H1和hairpin H2)都同时需要有茎、环、尾部单链支点三部分组成，且两个发夹的总体自由能相差较小(约在-18～-20左右)；

(2)反应温度远低于发夹的解链温度，为了能保持稳定的发夹结构存在和实验的操作的便捷性，一般设置为室温；

(3)茎环结构中的茎是维持发夹稳定的主要结构，需要大于15bp以上；

(4)两个发夹(例如hairpin H1和hairpin H2)一个尾部单链支点如果是在3’末端，另外一个则在5’末端，反之亦然，一般交错的方式设计尾部单链支点。

由表3结合表2可以总结出消解型杂交链式反应中发卡结构的几个设计原则：

(1)在保证两个发夹结构(例如D-H1和D-H2)可以自组装的前提下，需设计裸露的单链(例如D-H1中的连续的15个A和D-H2中连续的15个G)，裸露的单链的长度不能太长,以保证两个发卡结构在促发子的作用下，自组装形成的带裸露单链的DNA长双链结构的稳定性；此外，裸露的单链需要设计到两个发夹结构(例如D-H1和D-H2)中每一个发夹结构的单链环状区；

(2)与消解链结合的碱基设计到了其中一个发夹结构(例如D-H2)的单链环状区(例如D-H2中，与消解链结合的碱基设计到了D-H2的单链环状区和小部分茎区)；两个发夹结构(例如D-H1和D-H2)之间的互补序列设计到了各自发卡结构中的尾部单链支点区和茎区(例如D-H1和D-H2之间的互补序列分别设计到了D-H1和D-H2中的尾部单链支点区、茎区和小部分单链环状区)；

(3)反应温度远低于发夹的解链温度，即反应温度要低于Tm值；

(4)消解链与HCR产生的长双链结合产生的△G需是发卡自组装的两倍以上。

实施例2、EXPAR反应体系、反应条件的建立与优化

(一)EXPAR反应体系、反应条件的建立

本实施例建立的EXPAR反应体系分为A,B两个体系，分别如表4、表5所示。采用real-time PCR方法验证建立的EXPAR反应体系。

A体系如表4所示。

表4

B体系如表5所示。

表5

EXPAR反应条件：

将A体系中除SYBR Green I的样品加好后混匀，装在反应管中，放于55℃加热5min。取出后加入SYBR Green I(尽量避光)。将B体系加入A体系中，离心混匀反应物，放于实时定量PCR仪中反应。设计程序为55℃，250个循环。

实验结果如图1A所示，随着引物X的浓度的升高，实验组与空白对照之间POI值(荧光曲线最大斜率处所对应的时间值)差值变小，表明扩增效率随着引物X的浓度的升高而增大。在X的浓度为0.1nM～10μM范围内，扩增单链时间为20min～30min左右(一个循环数为4秒，加上15秒的读数时间)。如图1B所示，当引物X浓度为1μM时，扩增单链的效率(实验组与空白对照之间POI值相差倍数)约为2.3倍。

(二)EXPAR反应体系的优化

EXPAR是依赖酶的扩增反应，所以优化该反应中的DNA聚合酶和切克内切酶的浓度对于反应的灵敏性至关重要。

1)EXPAR反应体系中DNA聚合酶浓度优化：

使用表4、表5所建立的EXPAR反应体系,不同的是，X的终浓度设置为100nM，切克内切酶Nt.Bst.NBI的终浓度设置为0.4U，并设置不同浓度的DNA聚合酶Bst.polymerase作为实验组；每个实验组分别设置一个反应体系中不含有核酸单链X的空白对照组。按照上述步骤(一)所建立的EXPAR反应条件进行实时定量PCR反应。

实验结果如图2所示。图2中，图A,B,C,D中的曲线1分别为DNA聚合酶Bst.polymerase的浓度依次为0.04U，0.06U,0.08U,0.1U时的扩增曲线，曲线2为对应的不加核酸单链X的空白对照组的扩增曲线。图2实验结果显示，随着DNA聚合酶Bst.polymerase浓度的加大，实验组与空白对照之间POI值(荧光扩增曲线最大斜率处所对应的时间值)差值变小，图2A中的差值最大，即最佳DNA聚合酶Bst.polymerase的浓度为0.04U。

2)EXPAR反应体系中DNA切克内切酶浓度优化：

使用表4、表5所建立的EXPAR反应体系,不同的是，X的终浓度设置为100nM，DNA聚合酶Bst.polymerase的终浓度设置为0.04U，并设置不同浓度的DNA切克内切酶Nt.Bst.NBI作为实验组；每个实验组分别设置一个反应体系中不含有核酸单链X的空白对照组。按照上述步骤(一)所建立的EXPAR反应条件进行实时定量PCR反应。

实验结果如图3所示。图3中，图A,B,C,D中的曲线1分别为DNA切克内切酶Nt.Bst.NBI的浓度依次为0.4U，0.6U,0.8U,1.0U时的扩增曲线，曲线2为对应的不加核酸单链X的空白对照组的扩增曲线。实验结果显示，随着酶浓度的加大，实验组与空白对照之间POI值(荧光曲线最大斜率处所对应的时间值)差值变小，图3A中的差值最大，即最佳DNA切克内切酶Nt.Bst.NBI的浓度为0.4U。

实施例3、消解型HCR的建立与优化

(一)消解型HCR的自组装效果、促发效率验证及自组装反应条件的建立

将实施例1表2中用于传统HCR的hairpin H1和hairpin H2作为对照组(下述描述中hairpin H1简称为H1,hairpin H2简称为H2)，用于消解型HCR的D-H1和D-H2作为实验组，分别比较当各个发卡结构的浓度为100nM、实施例1表2中的促发子浓度为10nM、自组装反应时间分别为30min、1h、90min、2h、150min、3h、4h时，实验组和对照组的自组装效果和促发效率。

1)自组装反应体系：两个发卡结构各为100nM、促发子10nM、反应缓冲液(8.0mMNa₂HPO₄,2.5mM NaH₂PO₄,2.0mM MgCl₂,and 0.15mM NaCl,溶剂为水，pH 7.4)

2)自组装反应过程及条件：将英捷公司合成两个发卡结构的核酸干粉，分别10000r/min离心10min，加蒸馏水溶解至10μM，再将两个发卡结构的蒸馏水溶液分装到PCR小管，在PCR仪上95℃热变性5min，然后缓慢降至室温，最后放于4℃稳定1个小时。将促发子，两个发卡结构的蒸馏水溶液加入反应缓冲液中，并使得促发子终浓度为10nM，两个发卡结构的终浓度各自均为100nM，室温37℃孵育30min-4h，得到不同自组装反应时间的杂交链式反应(HCR)的自组装产物。

自组装反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳进行自组装效果的验证和促发效率的比较，结果如图4所示。

图4实验结果显示，消解型HCR总体的扩增效率即泳道10，12，14，16，18，20中的弥散条带亮度明显比传统的HCR条带亮，说明相同反应条件下，消解型HCR搭载的产物更多。与传统HCR相比，实施例1设计的用于消解型HCR的发卡结构的自组装效果更好。对比在不同的自组装反应时间里，实验组和对照组的自组装效果，消解型HCR总体的扩增效率(泳道10，12，14，16，18，20)高于传统HCR(泳道9，11，13，15，17，19)。这可能因为消解型HCR由于插入很多用于消解反应的碱基在发夹的单链环处，可搭载更长的DNA自组装长双链。显然虽然DNA长双链进行了改造，但并没有影响发夹之间的自组装效率。但是在自组装反应时间为半个小时的时间内，消解型HCR没有搭载好长双链(泳道8)，半小时之后才开始搭载，且随着时间变化，搭载长双链数量多于传统HCR。由图4可知，消解型HCR产物随着反应时间的延长而增加，自组装反应时间1～3小时内都可以搭载较好的长双链。自组装反应时间为3h时，消解型HCR产物有降解(泳道18条带亮度变暗)。当自组装反应时间由1h延长时，消解型HCR产物的量基本保持不变，因此在后续实验中选择1h为消解型HCR延伸反应时间即自组装反应时间。

(二)消解型HCR解组装效果验证

人工合成消解单链Y(5'-GCTTCGGATTCTGTCCCCCCCCCCCCCCCGGCCAAACAGAATC-3')用于消解型HCR自组装反应的产物中，进行消解验证。

1)消解反应体系组成：

由实施例1表2中的D-H1、D-H2在促发子促发下形成的带缺口的DNA长双链自组装反应产物，自组装反应体系、过程及条件按照本实施例上述(一)所述进行，其中自组装反应时间为1个小时；取该自组装反应完成后的反应体系50μL，加入人工合成的消解单链Y，使得消解单链Y的终浓度分别依次为1nM、10nM、100nM、1μM、10μM。

2)消解反应过程及条件：37℃孵育3h。

消解反应完成后，通过2％琼脂糖凝胶电泳进行消解反应效果的验证，结果如图5和图6所示。

图5实验结果显示，泳道3出现很多弥散条带，分子量在100bp～750bp之间。弥散条带表明发夹发生了自组装反应，搭载了DNA长双链。通过加入不同浓度的消解单链Y，HCR产物被拆分成了很多分子量在100～250bp的DNA小片段(泳道4,5，6，7，8)，且随着消解单链Y浓度增加，产生的消解产物量越多。根据泳道4,5，6，7，8在100～250bp处呈现的条带(虚线框中的消解产物条带)，做灰度分析，得到消解单链Y与消解产物量的标准曲线，如图6所示，在消解单链Y浓度1nM～10μM范围内，消解单链Y的浓度与图5中消解产物呈现的灰度值呈线性关系，回归方程为y＝19.16x+41.18，相关系数为0.9768。

(三)消解单链序列的优化实验

对消解单链Y的序列进行优化，如表6所示，设计了另外两组消解单链Y1和Y3，然后分别使用表3所示的Y1、Y、Y3进行消解反应实验，比较消解单链Y1、Y、Y3的消解效果。

表6

消解反应前，先进行自组装反应，生成带缺口的DNA长双链产物。

具体的，自组装反应体系、过程及条件按照本实施例上述(一)所述进行，其中，自组装反应体系选择含有实施例1表2中的D-H1、D-H2、促发子的反应体系，自组装反应时间选为1个小时。

然后进行消解反应，消解反应体系、过程及条件按照本实施例上述(二)所述进行，其中，消解反应体系中的消解单链分别采用表6所列的Y1、Y、Y3进行消解反应实验，消解反应时间选为3个小时。

最后通过琼脂糖凝胶电泳进行实验结果的检测。实验结果如图7所示。

图7实验结果表明：消解型HCR有效搭载了长双链，发生了DNA自组装运动，形成了有缺口的DNA长双链。1泳道在没有加促发子时，有缺口的DNA长双链没有进行；2，3泳道中的反应体系中因为加入了促发子，促发了D-H1/D-H2，形成了长双链结构。在4，5，6泳道中可明显看到有多条短双链，说明加入消解单链后，由于消解单链与自组装DNA长双链中的缺口处互补配对，所以发生了超分子双链体的解组装现象。

通过实验设计增加或减少消解单链Y的碱基个数、增加或减少消解单链Y与自组装产物互补的Tm值，增加或减少消解单链Y与自组装双链产物杂交互补产生的△G。

实验表明，与Y1和Y3相比，Y的消解效果最好，原因之一是当消解单链Y与自组装双链产物互补杂交的△G，是两个发卡结构D-H1和D-H2自组装的△G的两倍关系时，消解效率最高；另外一个原因是两个发卡结构之间的互补序列对解链温度的影响。在设计可消解的HCR发夹结构时，需考虑到两个发卡结构之间的(例如D-H1与D-H2)的互补程度会极大的影响解链程度，当两个发卡结构之间不完全互补时，自组装产物超分子双链串联体上会出现特有的切口，不完全互补程度越高，切口越大，本发明将切口碱基数优化到15nt时，达到了比较理想的解组装效果。这种解组装过程中呈现的切口宽度依赖性是由于两个发卡结构之间的互补程度直接影响了消解单链从双链串联体上剥落时的解链温度。

实施例4、EXPAR串联消解型HCR反应体系、条件的优化及灵敏度检测

(一)促发消解型HCR解组装的时间效应优化

消解反应的时间对于整个检测体系的高效性有着决定性的作用。消解反应过短，不能使自组装反应的产物被完全消解，而时间过长会影响检测体系的效率。因此优化消解反应的时间是EXPAR串联消解型HCR模块搭建的关键。

1)按照实施例2所建立的EXPAR扩增出消解单链Y；其中，引物X浓度选为100nM，扩增时间为30min；DNA聚合酶Bst.polymerase的浓度为0.04U；DNA切克内切酶Nt.Bst.NBI的浓度为0.4U。

2)按照实施例3(一)所建立的自组装反应体系、过程及条件进行自组装反应，生成带缺口的DNA长双链，其中，自组装反应体系选择含有实施例1表2中的D-H1、D-H2、促发子的反应体系，自组装反应时间选为1个小时。

3)消解时间优化实验；

消解反应体系：

将步骤1)反应完成后的反应体系50μL加入到50μL步骤2)反应完成后的反应体系中即得；

消解反应过程或条件：37℃孵育30min～3h。

消解反应实验的结果通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图8所示。

图8实验结果表明：消解型HCR发生了很好的自组装的反应，并搭载了大量的长双链(泳道2)。泳道1为在不加入促发子只有D-H1和D-H2的反应结果，但有分子量100bp的少量条带出现，这是因为部分发夹结构在第一次形成发夹结构之后，放置时间过久，部分发夹结构不太稳定；所以在使用前可以在95℃变性5min在缓慢降室温重新形成稳定的发夹结构。泳道3-8为在消解链Y存在的情况下的电泳结果，消解型HCR的自组装产物(D-HCR)长双链被消解，由原来的2000bp左右的长双链拆分为了200bp左右的小片段DNA链；消解时间从1h到2h时间里，消解的小片段产物越来越多，但在超过2h后消解效果降低；这与实施例3(一)中的结果相符合，在3h内自组装产物随着时间增多也增多，但3小时后自组装产物发生降解；而这里，在解组装时间超过2个小时后，解组装的产物也发生降解，产物变少。泳道8的结果表明，与实施例3(二)的消解时间相比，采用EXPAR扩增之后的反应体系消解自组装产物的时间明显减少，30min便可以将自组装产物大量消解，消解效率大大提高；这主要是因为EXPAR体系扩增了大量消解单链，所以加快了消解时间，所以后续的实验中选择30min作为EXPAR扩增体系消解自组装产物的反应时间。

(二)待测靶标物质浓度、消解单链Y浓度对消解结果的影响，及EXPAR串联消解型HCR检测模块的灵敏度实验

消解链的浓度对于HCR的消解实验有较为重要的作用。消解链的浓度直接决定了消解型HCR的消解成功率，并且消解单链的量取决于EXPAR的扩增效率和待测靶标物质的浓度。

本实验通过使用10pM～10uM的X(具体为实施例1表1中的X)，扩增出的不同浓度范围的消解单链Y，去消解消解型HCR自组装产物，具体步骤为：

1)按照实施例2所建立的EXPAR扩增出消解单链Y；其中，引物X浓度分别依次选10pM～10uM范围内按10倍增加的浓度值；扩增时间为30min；DNA聚合酶Bst.polymerase的浓度为0.04U；DNA切克内切酶Nt.Bst.NBI的浓度为0.4U。

3)进行消解反应；消解反应体系和过程按照本实施例(一)所述的进行，消解时间为30min。

实验结果通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图9所示。

图9实验结果表明：消解型HCR发生了很好的自组装反应，并搭载了大量的长双链，在消解链Y的作用下，自组装的长双链产物(D-HCR)被消解成许多小的DNA片段，图中显示长度为100bp～500bp。且消解单链的量随着EXPAR体系中X浓度的增加而增加。在EXPAR中X引物浓度为10pM～1nM时，对应泳道(泳道5,6,7)虚线框中有少量的条带，但亮度(灰度值48左右)与空白对照(泳道3)相差不明显(空白对照灰度值45左右)。当EXPAR体系中X浓度大于1nM时,有较为明显的消解产物出现(泳道8，9，10，11)，DNA自组装长双链被消解链拆分成了好几个小片段，随着消解链浓度越来越大，HCR被消解的产物越来越多。

图9结果表明在自组装反应组件浓度依次为100nM的D-H1/H2，10nM的促发子条件下，搭载的超分子长双链，在EXPAR体系中X低于1nM时，消解效果不明显。当EXPAR体系中X浓度大于等于1nM时，可以将D-H1,D-H2浓度为100nM，促发子浓度为10nM的自组装体系生成的产物进行较好的消解。即本实施例建立的EXPAR串联消解型HCR检测模块的灵敏度为1nM。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测模块，所述模块包括发卡型核酸序列1、发卡型核酸序列2和促发子核酸序列，其特征在于：

所述促发子核酸序列从5’端到3’端依次包括序列b’、a’；

2.根据权利要求1所述的检测模块，其特征在于，所述模块包括下述1)-3)所述中的至少一种：

1)所述c、e包括核苷酸个数为15个的任意核酸序列；

2)所述b、b’的核苷酸个数为18个；

3)所述a、a’、d、d’的核苷酸个数为6个。

3.根据权利要求1和/或2所述的检测模块，其特征在于，所述模块包括下述1)-3)所述中的至少一种：

1)所述促发子核酸序列为序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；或将序列表中SEQID №：4所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述促发子具有相同功能的核苷酸序列；

2)所述发卡型核酸序列1为序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列；或将序列表中SEQID №：7所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述发卡型核酸序列1具有相同功能的核苷酸序列；

3)所述发卡型核酸序列2为序列表中SEQ ID №：8所示核苷酸序列；或将序列表中SEQID №：8所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述发卡型核酸序列2具有相同功能的核苷酸序列。

4.一种检测模块，所述模块包括发卡型核酸序列1、发卡型核酸序列2和促发子核酸序列，其特征在于，所述模块包括下述1)-3)：

1)所述促发子核酸序列为序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；或将序列表中SEQID №：4所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述SEQID №：4具有相同功能的核苷酸序列；

2)所述发卡型核酸序列1为序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列；或将序列表中SEQID №：5所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述SEQID №：5具有相同功能的核苷酸序列；

3)所述发卡型核酸序列2为序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列；或将序列表中SEQID №：6所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述SEQID №：6具有相同功能的核苷酸序列。

5.根据权利要求1、2、3和/或4任一所述的检测模块，其特征在于，所述模块还包括核酸序列3和核酸序列4；

所述核酸序列3从5’端到3’端依次包括序列f、g、x’；

所述核酸序列4从5’端到3’端依次包括序列h、i、j；

所述x’包含与待测靶标核酸序列互补杂交的核酸序列；

所述f、h或j均各自包含a’、e。

6.根据权利要求5所述的检测模块，其特征在于，所述模块还包括下述1)-3)所述中的至少一种：

1)所述f、h或j均各自从5’端到3’端依次包括b’的部分核酸序列、a’、e、b的部分核酸序列；

2)所述f、h、j任意一条序列的反向互补杂交序列，与所述发卡型核酸序列2的互补杂交的△G，是所述发卡型核酸序1与所述发卡型核酸序2互补杂交的△G的两倍以上；

7.根据权利要求5和/或6任一所述的检测模块，其特征在于，所述模块包括下述1)-2)所述中的至少一种：

2)序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述核酸序列4具有相同功能的核苷酸序列。

8.一种检测传感器，其特征在于，所述传感器包括权利要求1-7任一所述的检测模块；所述传感器还包括下述1)-5)所述中的至少一种：

1)HCR反应缓冲液；

2)DNA聚合酶；

3)内切酶；

4)EXPAR反应缓冲液；

5)dNTP。

9.一种检测方法，其特征在于，所述方法包括下述1)或2)：

10.权利要求1、2、3、4、5、6和/或7任一所述检测模块、权利要求8所述传感器、权利要求9所述检测方法的应用。