CN110453000A - 一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法，包括步骤S1，引物的设计和筛选，根据待测靶基因设计特异性引物；步骤S2，合成通用引物对；步骤S3，合成过渡性引物对；步骤S4，合成建库引物对；步骤S5，基因组的提取；步骤S6，在PCR扩增体系中加入所有的特异性引物对进行第一轮的多重扩增，回收产物并稀释，作为下一轮多重扩增的模板；步骤S7，在PCR扩增体系中加入通用引物对和所有的过渡性引物对进行第二轮的多重扩增，回收产物并稀释，作为下一轮多重扩增的模板；步骤S8，在PCR扩增体系中加入建库引物对进行第三轮的建库扩增，回收产物，获得制备完毕的文库；步骤S9，NGS靶基因测序；步骤S10，NGS分析。
Description
技术领域
本发明涉及幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型测试分析领域，尤其涉及一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法。
背景技术
目前测序文库构建的方式主要有两种，一种是使用专门的试剂盒进行建库，一种是使用扩增子PCR的方式进行建库。其中，使用试剂盒进行建库的优点是标准化程度较高，适用性强，可针对各种长度的PCR产物；但缺点是试剂昂贵，操作流程比较繁琐。另外一种扩增子建库则简单、便宜许多，但是目前技术中，扩增子建库方法多为只针对一个单独的靶基因进行扩增建库，如果想对多个不同的靶基因进行一次性建库则需要一个个进行单基因扩增重复或者采用多重PCR，但是多重PCR建库方法前期优化实验复杂而且成功率很低，能扩增的靶基因数量上限也很少。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
基于上述原因，本申请人提出了一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法，旨在克服上述问题，将常用的扩增子建库方案进行了升级，使其能够一次性的针对多个靶基因进行建库，降低了实验复杂度，简化了建库流程。
发明内容
为了满足上述要求，本发明的在于提供一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法，包括：
步骤S1，引物的设计和筛选，根据待测靶基因设计特异性引物；
步骤S2，合成通用引物对，所述通用引物对用于多重扩增体系中；
步骤S3，合成过渡性引物对，所述过渡性引物对包括通用引物序列与待测靶基因引物序列；
步骤S4，合成建库引物对，所述建库引物对包括Barcode测序引物序列与通用引物序列；
步骤S5，基因组的提取，提取样品中的细菌基因组；
步骤S6，第一次PCR处理，在PCR扩增体系中加入所有的特异性引物对进行第一轮的多重扩增，回收产物并稀释，作为下一轮多重扩增的模板；
步骤S7，第二次PCR处理，在PCR扩增体系中加入通用引物对和所有的过渡性引物对进行第二轮的多重扩增，回收产物并稀释，作为下一轮多重扩增的模板；
步骤S8，第三次PCR处理，在PCR扩增体系中加入建库引物对进行第三轮的建库扩增，回收产物，获得制备完毕的文库；其中，每份需执行建库扩增的样品对应一组含不同Barcode信息的建库引物；
步骤S9，NGS靶基因测序，使用测序SOP步骤对扩增子制备文库进行测序；
步骤S10，NGS分析，对样品中的靶基因序列进行分析。
进一步技术方案为，所述步骤S1还包括，引物扩增相应靶基因的长度需要与测序长度和分析方法结合，不能超出测序长度；所述分析方法包括SNP分析方法，所述通用引物对的Tm值均为唯一值。
进一步技术方案为，所述步骤S4还包括，所述建库引物对的 Barcode测序引物序列的种类为若干种。
相比于现有技术,本发明的有益效果在于：采用本发明的测序建库方法，通过采用多重扩增子建库技术，针对相应需要检测的多个靶基因设计出一套不同种类的引物，只要在前期的实验测试过程中认真进行引物的筛选，使各个靶基因特异性引物之间的Tm值保持均一即可使用该技术，本方法通过3次扩增能一次性为至少8个靶基因进行建库，后可直接上机进行定性或定量的检测。克服了目前试剂盒建库成本高、流程复杂，单扩增子建库无法多重扩增的两个难题。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
附图说明
图1是本发明一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法步骤中的引物类型示意图；
图2是本发明一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法步骤中第一次PCR处理的过程示意图；
图3是本发明一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法步骤中第二次PCR处理的过程示意图；
图4是本发明一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法步骤中第三次PCR处理的过程示意图；
图5是本发明一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法的具体实施例中第一次PCR处理(PCR-Step 1)的过程示意图；
图6是本发明一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法的具体实施例中第二次PCR处理(PCR-Step 2)的过程示意图；
图7是本发明一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法的具体实施例中第三次PCR处理(PCR-Step 3)的过程示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法，包括：
步骤S1，引物的设计和筛选，根据待测靶基因设计特异性引物；
步骤S2，合成通用引物对，所述通用引物对用于多重扩增体系中；
步骤S3，合成过渡性引物对，所述过渡性引物对包括通用引物序列与待测靶基因引物序列；
步骤S4，合成建库引物对，所述建库引物对包括Barcode测序引物序列与通用引物序列；
具体地，步骤S1、S2、S3、S4所得到的产物见图1所示，其中，各靶基因的特异性产物使用图1中Primer1、Primer2、Primer3表示，图1示Promegene-Super引物表示上述通用引物，图1示Promegene- Tem引物表示上述过渡性引物，图1示Promegene-Library建库引物表示上述建库引物；
步骤S5，基因组的提取，提取样品中的细菌基因组；
步骤S6，第一次PCR处理，在PCR扩增体系中加入所有的特异性引物对进行第一轮的多重扩增，回收产物并稀释，作为下一轮多重扩增的模板；
步骤S7，第二次PCR处理，在PCR扩增体系中加入通用引物对和所有的过渡性引物对进行第二轮的多重扩增，回收产物并稀释，作为下一轮多重扩增的模板；
步骤S8，第三次PCR处理，在PCR扩增体系中加入建库引物对进行第三轮的建库扩增，回收产物，获得制备完毕的文库；其中，每份需执行建库扩增的样品对应一组含不同Barcode信息的建库引物；
具体地，所述步骤S6、S7、S8分别对应图2、图3、图4，通过采用Promegene-Multi-PCR技术(即多重扩增子建库技术)，针对相应需要检测的多个靶基因设计出一套不同种类的引物，只要在前期的实验测试过程中认真进行引物的筛选，使各个靶基因特异性引物之间的Tm 值保持均一即可尝试该技术，直接拓展了技术的应用范围。本方法通过3次扩增能一次性为至少8个靶基因进行建库，后可直接上机进行定性或定量的检测。克服了目前试剂盒建库成本高、流程复杂；单扩增子建库无法多重扩增的两个难题。
步骤S9，NGS靶基因测序，使用测序SOP对扩增子制备文库进行测序；
步骤S10，NGS分析，对样品中的靶基因序列进行分析。
本方法可进行推广延伸，只要有适合的靶基因引物均适用于使用本方法进行多重扩增建库。建库大致原理如图1、图2、图3、图4所示；
其中，NGS(Next-generation Sequencing，二代测序)，DNA测序作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。1977年 Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法(一代测序)。
然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能满足研究的需要。费用更低、通量更高、速度更快的第二代测序技术应运而生。二代测序的基本原理是边合成边测序，在传统一代测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸，PCR反应体系中合成DNA的必要成分)进行PCR(聚合酶链式反应)，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)，该技术在 1983年由美国Mullis等人发明，是一种划时代、革命性的生命科学技术，用于扩增放大特定的DNA片段，它可看作是生物体外的特殊DNA 复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。利用DNA在体外 95℃高温时变性成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链模板按碱基互补配对的原则结合，再升温至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。通过指数级扩增放大起始痕量的DNA模板。
Multi-PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction，多重引物 PCR或复合PCR)，在同一PCR反应体系里加入二对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。具有系统性和经济便捷性的特点。
通过本发明特有的Promegene-H.p-Multi-PCR技术(可理解为上述步骤中利用的技术的统称)将目前市场和临床上主流的检测项目——幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的五种耐药性基因和三种细菌分型基因——进行一次性扩增子PCR建库。后续的测序分析除了可以通过VacA和CagA两个基因对样品中的幽门螺杆菌进行分型外，还可以检测与五种耐药性相关的9个热突变位点和15种突变类型，为后续评价患者感染状况和临床治疗提供依据。本方法相比于试剂盒建库，大大降低了建库的成本和操作难度，加快了样品检测得到最终结果的速度。
优选地，所述步骤S1还包括，引物扩增相应靶基因的长度需要与测序长度和分析方法结合，不能超出测序长度；所述通用引物对的Tm 值均为唯一值。
其中，所述分析方法包括但不限于SNP分析方法；
Tm值：天然状态的DNA，在比较高的温度下(70-90℃)会发生变性，这时，双螺旋解开为单链，并变成无规则线团。在光学性质上则产生“增色效应”，即紫外吸收(在260毫微米波长处)值升高。这同一般结晶的熔化现象类似。引起DNA发生“熔解”的温度范围比较窄，只有几度。通常以增色效应达到最大值的一半时的温度叫DNA的熔解温度(或熔点)，以符号Tm表示。
优选地，所述步骤S4还包括，所述建库引物对的Barcode测序引物序列的种类为若干种。
实施例：粪便样品中幽门螺杆菌的耐药类型和细菌分型的鉴定
通过查阅相关试剂盒产品、专利和文献，确定涉及了H.p幽门螺杆菌2个分型的3个相关基因——UreA基因、VacA基因和CagA基因，与五种耐药相关涉及9个热突变位点和15种突变类型的5个相关基因——RdxA基因、23S基因、Pbp1基因、GyrA基因和16S基因。
确定完毕待检测的靶基因后，对每个靶基因的耐药突变位点进行了位置上的考虑，每个靶基因设计好引物和备选引物，使分型的3个基因测序长度在300bp之内(保证能测完基因全长)，5个耐药相关基因的突变位点位于距测序两端开始碱基150bp内(保证每个基因至少有一端能够测到突变位点)。
通过实验将每个靶基因的引物和备用引物进行筛选测试，统计完毕8个靶基因引物的最佳退火温度Tm值后，将Tm值相差1℃以内的引物作为实验引物。
本方法在每一轮多重扩增后，每个扩增子都会被引入新的碱基，长度增加。
本案例包含采用粪便样品，样品采用相关的SOP提取流程处理，质量浓度检测完毕合格后稀释至2ng/μl作为初始模板。
PCR-Step 1(第一次多重扩增)：
见图5所示，在PCR扩增体系中加入所有的特异性引物对进行第一轮的多重扩增，回收产物检测浓度并稀释至1ng/μl作为第二次多重扩增的模板。
PCR-Step 2(第二次多重扩增)：
见图6所示，在PCR扩增体系中加入Promegene-Super引物对和所有的Promegene-Tem引物对进行第二轮的多重扩增，回收产物检测浓度并稀释至1ng/μl作为第三次建库扩增的模板。
PCR-Step 3(第三次建库扩增)：
见图7所示，在PCR扩增体系中加入Promegene-Library引物对进行第三轮的扩增，每个样品对应一组含不同Barcode信息的建库引物，回收产物后检测浓度，此时文库的制备完毕，采用我司相关SOP进行上机测序。
所有样品进过测序分析后，均能保证70％的有效数据量(存在约 20％-30％的错误序列)，有效数据量均来自待检测的八种基因序列信息。通过针对H.p幽门螺杆菌的分析流程，测序完成后能在半小时内快速得到样品H.p幽门螺杆菌的分型信息和耐药性信息的检测报告。
综上所述，采用本发明的测序建库方法，通过采用多重扩增子建库技术，针对相应需要检测的多个靶基因设计出一套不同种类的引物，只要在前期的实验测试过程中认真进行引物的筛选，使各个靶基因特异性引物之间的Tm值保持均一即可使用该技术，本方法通过3次扩增能一次性为至少 8个靶基因进行建库，后可直接上机进行定性或定量的检测。克服了目前试剂盒建库成本高、流程复杂，单扩增子建库无法多重扩增的两个难题。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其他各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法，其特征在于，包括：
步骤S1，引物的设计和筛选，根据待测靶基因设计特异性引物；
步骤S2，合成通用引物对，所述通用引物对用于多重扩增体系中；
步骤S3，合成过渡性引物对，所述过渡性引物对包括通用引物序列与待测靶基因引物序列；
步骤S4，合成建库引物对，所述建库引物对包括Barcode测序引物序列与通用引物序列；
步骤S5，基因组的提取，提取样品中的细菌基因组；
步骤S6，第一次PCR处理，在PCR扩增体系中加入所有的特异性引物对进行第一轮的多重扩增，回收产物并稀释，作为下一轮多重扩增的模板；
步骤S7，第二次PCR处理，在PCR扩增体系中加入通用引物对和所有的过渡性引物对进行第二轮的多重扩增，回收产物并稀释，作为下一轮多重扩增的模板；
步骤S8，第三次PCR处理，在PCR扩增体系中加入建库引物对进行第三轮的建库扩增，回收产物，获得制备完毕的文库；其中，每份需执行建库扩增的样品对应一组含不同Barcode信息的建库引物；
步骤S9，NGS靶基因测序，使用测序SOP对扩增子制备文库进行测序；
步骤S10，NGS分析，对样品中的靶基因序列进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法，其特征在于，所述步骤S 1还包括，引物扩增相应靶基因的长度需要与测序长度和分析方法结合，不超出测序长度；所述分析方法包括SNP分析方法，所述通用引物对的Tm值均为唯一值。
3.根据权利要求1所述的一种用于鉴定样品中幽门螺杆菌的细菌分型和耐药类型的二代测序建库方法，其特征在于，所述步骤S4还包括，所述建库引物对的Barcode测序引物序列的种类为若干种。
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