CN116024315A - 一种基于链置换反应的多价双锁钥系统及其在核苷酸多态性检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于链置换反应的多价双锁钥系统及其在核苷酸多态性检测中的应用，用于高度特异性和快速的核苷酸多态性测定。只有当目标作为唯一的“钥”被引入并执行两次匹配操作以分别激活两个支点介导的链位移反应时，系统才能被定义为“On”状态，而系统在缺少任何一步骤都保持“Off”状态。最重要的是，这种使用两个不同的靶标片段作为输入的两次匹配策略为同时区分单核苷酸多态性和双核苷酸多态性提供了一种有效的方法，其不同位置的突变碱基甚至彼此相距甚远，这种双锁设计具有比普通单锁系统更强的鉴别能力。Multi‑DLK系统在血清中的稳定性能以及癌细胞中真实样品测定的最终应用显示了该平台在临床诊断方面的潜力。

Description

一种基于链置换反应的多价双锁钥系统及其在核苷酸多态性检测中的应用

技术领域

本发明涉及核苷酸多态性检测技术领域，特别涉及一种基于链置换反应的多价双锁钥系统及其在核苷酸多态性检测中的应用。

背景技术

DNA探针是应用于分辩核苷酸多态性时不可替代的选择，核苷酸多态性已被公认为是重要的遗传生物标志物。越来越多的证据表明，某些多态性与各种人类疾病有关，特别是像恶性肿瘤这样的高度致命性疾病。对此，开发用于肿瘤相关核苷酸多态性测定的实用DNA平台对于疾病诊断至关重要。

一般来说，最直接的方法是在核苷酸多态性的关键点上进行特异性酶催化反应，包括引物延伸、裂解和连接。传统的DNA探针是基于杂交的方法，并且精确设计用于报告靶标与其核苷酸多态性之间的杂交差异。典型的发夹形分子信标探针，以易于设计和实用应用著称，已被广泛应用于各个领域，例如核酸测定、分子识别和荧光成像。而来自一个或两个突变碱基微不足道的热力学变化，使分子信标探针辨别能力有限，不能明显地展示目标物种和突变物种之间的微小差异。

相比之下，链置换反应(SDR)是基于杂交的新型技术，在动态DNA纳米技术中起着至关重要的作用，在DNA电路、DNA纳米计算机和生物传感器的开发中发挥着强大的功能。SDR是由一个单链入侵者与支点区域杂交通过分支迁移释放锁链，从而形成更稳定的双链结构。考虑到支点在SDR中的关键作用并且长度要短得多(通常为5-8nt)，使支点成为用于单个或多个突变点识别的结构域，与典型的发夹形分子信标相比，不匹配的碱基的比例显著增加，增强了辨别能力和急剧的热力学变化，将目标物种和突变物种之间的微小差异放大。

但是，目前的SDR技术应用于核苷酸多态性检测时，由于仅包含一个锁链，因此仅能检测单个靶点位置的核苷酸多态性，无法同时区分不同位置的核苷酸多态性点，降低了检测的效率。除此之外，一个锁链序列的特异性较低，容易被入侵链非特异性解锁，产生假阳性结果，这种不具备高度靶标特异性的检测结果可能会直接影响临床诊断的精度，造成误诊。因此现有的单锁链SDR技术无法满足高精度诊断的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：本发明公开了一种基于SDR反应的多价双锁钥系统，解决现有SDR检测核苷酸多态性时存在的效率低，特异性较差的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种Multi-DLK系统，当Multi-DLK系统检测模板(目的基因)的核苷酸多态性时，首先依赖于^TSDR₁和^TSDR₂这两个连续的支点介导的链置换反应(可形象化为两把锁)，利用单链靶序列的入侵依次置换出两条锁链(即同时打开两把锁)，这种锁链的依次置换过程为靶序列提供了两次筛选并形成正交激活策略，从而暴露出Linker中的回文末端作为引物，进而启动由Klenow聚合酶(KFP)进行核苷酸多态性测定的高度靶特异性链置换扩增(^TSSDA)。

按照上述反应原理，^TSDR₁和^TSDR₂链置换反应的每个检测单元包含两条单链DNA锁链，当两条单链DNA锁链同时被靶序列置换后产生阳性指示。本申请中的阳性指示即为启动由Klenow聚合酶(KFP)进行核苷酸多态性测定的高度靶特异性链置换扩增，并由此产生较高强度的荧光。

优选地，所述检测单元包括单链Linker序列，两条单链DNA锁链依次与Linker序列互补配对，其中仅与Linker的3’端配对的锁链携带荧光标记，所述Linker的3’端携带猝灭标记。

优选地，所述Linker的5’端偶联有生物素，若干检测单元均通过生物素连接于链霉亲和素上。进一步地，通过空间限制效应可以进一步提高生物传感的性能，因为它可以增加DLK的局部浓度，并且比其自由状态时缩短了分子间的距离，这使得靶标在以链霉亲和素为中心的四个DLK之间渐进式行走，以实现高效率的链置换电路。最后，在Linker上杂交的目标分子可以被释放并继续启动反应循环的回合。该电路过程可以自主继续，直到所有多DLK组装成网格模式的DNA-蛋白质复合物(GDPHs)。

优选地，所述与Linker 3’端配对的锁链5’端偶联有FAM荧光基团以用于信号传导，所述Linker的3’端偶联有BHQ-1作为猝灭剂。

优选地，所述Linker与靶序列的互补区域内至少包含两个支点序列。

作为对上述发明构思的验证，本发明选择肿瘤抑制基因p53基因作为靶标模型，将目标p53基因分为Ta和Tb两部分并合称为靶标ST，分别作为^TSDR₁和^TSDR₂的入侵者。以评估Multi-DLK在核苷酸多态性测定中的应用。具体地，所述Linker的序列如SEQ ID No.1所示，所述与Linker的3’端配对的锁链序列如SEQ ID No.2所示，另一条锁链的序列如SEQ IDNo.3所示。

一种上述基于链置换反应的多价双锁钥系统的制备方法，具体步骤如下：

步骤1：按单链溶液：10×Blue缓冲液：H₂O体积比为3:2:14.4配置反应液一，将反应液一加热反应后，逐渐冷却至室温；然后加入链霉亲和素溶液并组装反应即得；所述单链溶液中含有Linker、锁链一和锁链二共三种单链DNA。

优选地，所述Linker、锁链1和锁链2的浓度均为10μM；所述链霉亲和素溶液的浓度为9.6μM，链霉亲和素溶液与单链溶液的体积比为1:5。

优选地，所述反应液一的反应条件为95℃下加热反应5分钟，所述链霉亲和素溶液加入后37℃反应1h。

一种基于链置换反应的多价双锁钥系统在核苷酸多态性检测中的应用，包括如下步骤：

步骤1：向制备完成的多价双锁钥系统中加入靶序列、Klenow聚合酶(KFP)和dNTP并在37℃下反应2小时；

步骤2：将反应溶液用1×Blue缓冲液稀释10倍至最终体积，并通过荧光计激发并测定荧光光谱。

Multi-DLK系统在功能上可分为三部分：其中两部分是连续的以支点介导的链置换反应，称为^TSDR₁和^TSDR₂，为目标序列提供两次筛选并形成正交激活策略从而暴露出Linker中的回文末端作为引物，这是使用Klenow聚合酶的关键，以启动第三部分中由Klenow聚合酶(KFP)进行核苷酸多态性测定的高度靶特异性链置换扩增(^TSSDA)。

本发明获得的有益效果：

本发明涉及的是一种基于SDR反应的多价双锁钥(Multi-DLK)系统，该系统可以被精确激活以执行支点介导的正交DNA电路(ODC)，以实现高度靶标特异性的链位移扩增(^TSSDA)用于精准的临床诊断。通过正交激活的策略可以提高特异性，且基于使用两个不同的靶标片段作为输入方式，可以达到两次匹配，这为同时区分不同位置的核苷酸多态性点提供了一种方法。本发明还展示了Multi-DLK系统在胎牛血清中稳定的性能，以及癌细胞中真实样品测定的应用，这表明该平台在临床诊断方面的巨大潜力。该检测方法为区分多种核苷酸多态性检测提供新的方法、开辟新的见解，并易于在疾病诊断、药物开发和癌症治疗之中推广应用。

附图说明

图1为Multi-DLK系统检测靶标示意图。其中，图1A为Multi-DLK为检测器组装示意图；图1B为以P53基因为例的各序列。Multi-DLK为检测器，检测器与靶标形成具有网格模式的DNA-蛋白质复合物(GDPHs)；图中F代表FAM标记，Q代表BHQ-1猝灭标记，B-代表生物素，toehold1为支点1序列；toehold2为支点2序列；FMR1和FMR2为p53基因上与支点1和支点2互补的序列。

图2为Multi-DLK系统通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征。

图3为Multi-DLK系统对不同靶标浓度的荧光谱图以及线性拟合方程。

图4为Multi-DLK系统和Multi-SLK对SNP和DNP检测性能的比较。

图5为Multi-DLK系统各种突变类型的辨别能力。

图6为使用10％FBS(胎牛血清)评估Multi-DLK系统在生理状态下对核苷酸多态性检测的性能。

图7为Multi-DLK系统对真实样品检测p53肿瘤抑制基因的可行性。

具体实施方式

下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

实施例1：一种基于SDR反应的多价双锁钥(Multi-DLK)系统的制备：

实验方法如下：

步骤1：Multi-DLK系统的组装在20μL的体积中进行，该溶液含有等量(1μL，10μM)的Linker，Lock 1和Lock 2，2μL10×Blue缓冲液和14.4μL H₂O。在95℃下加热5分钟后，将溶液逐渐冷却至室温。

步骤2：然后加入(0.6μL，9.6μM)链霉亲和素(SAV)并37℃反应1小时。

步骤3：使用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳对Multi-DLK系统逐步组装进行表征。逐渐缓慢移动的条带(泳道a-c)以及通过捕获四个DLK连接在链霉亲和素(SAV)上来构建多DLK系统，泳道d中出现更慢的移动条带证明了这一点。泳道a为linker，泳道b为linker和Lock2，泳道c为linker、Lock 1和Lock 2，泳道d为linker、Lock 1、Lock 2和SAV(结果见图2)。

实施例2：Multi-DLK系统对不同靶标浓度的灵敏度

将检测的靶标Ta和Tb浓度设为0fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM根据步骤2中的方法进行荧光测量。图3A是Multi-DLK系统在存在10fM至50nM的各种目标浓度下的荧光发射光谱。图3B为峰值荧光强度对10fM至50nM范围内目标浓度的依赖性。传感系统分别在低(图3C)和高(图3D)目标浓度范围内的线性响应。

测量结果显示本发明对于所检测靶标具有较宽的线性范围，以荧光信号F与靶标浓度C作线性拟合方程，检测限为10fM具有良好的灵敏度(结果如图3所示)。

实验方法如下：

步骤1：首先制备完成Multi-DLK系统(体积为15.5μL)。然后加入等量的Ta和Tb(各加入0.5μL)，0.5μL的KFP(5U/μl)，3μL的dNTP(10mM)，总反应体系为20微升在37℃下反应2小时。

步骤2：对于荧光测量，将20μL反应溶液用1×Blue缓冲液稀释至200μL的最终体积，使得Ta和Tb的终浓度为所设置的浓度，并通过F-7000荧光计(日本日立)在设定激发波长为492nm，发射波长范围从500到600nm，光电倍增管检测器电压设置为600V，入射狭缝和发射狭缝都设置为5nm，并记录发射光谱。

实施例3：Multi-DLK系统对核苷酸多态性检测的高特异性

实验一：本发明检测了不同的单核苷酸多态性(SNP)和双核苷酸多态性(DNP)。如图4所示，SNP和DNP可以同时有效地鉴定(相对荧光强度小于检测靶标ST时的50％)，为了进行比较，设计了一个仅配备一把锁(Lock 2)的多价单锁和钥(Multi-SLK)系统，而此系统无法有效识别SNP和DNP，这表明双锁和钥策略的卓越性能，是用于核苷酸多态性测定强有力的工具。将目标p53基因分为Ta和Tb两部分并利用这两个区域的单碱基突变和双碱基突变以评估Multi-DLK在核苷酸多态性测定中的应用。图4A为配备两把锁的Multi-DLK系统对不同的单核苷酸多态性(SNP)和双核苷酸多态性(DNP)检测的性能，图4B为配备一把锁的Multi-DLK系统。

实验方法如下：

步骤1：按实施例1的组装方法将Multi-DLK系统在20μL的体积中进行组装，该溶液含有等量(1μL，10μM)的Linker和Lock 2，2μL10×Blue缓冲液和15.4μL H₂O。在95℃下加热5分钟后，将溶液逐渐冷却至室温。然后加入(0.6μL，9.6μM)链霉亲和素(SAV)并反应1小时。本实施例中Linker的5’端连接生物素，3’端连接BHQ-1猝灭基团，Lock2的5’端连接FAM荧光标记。

步骤2：将实施例2中使用的靶标序列替换为单碱基突变序列以及双碱基突变序列，其余反应体系和条件均与实施例2相同，反应完成后测量荧光信号，具体序列见表1。

实验二：申请人还利用取代(mA、mT、mC)、插入(iA、iT、iC、iG)和缺失(dG)等突变类型研究了Multi-DLK系统的辨别能力。只有匹配的靶标(ST)才能触发双锁系统进入打开状态，而系统在检测所有其他各种系统时保持锁定状态。图5A和图5B是在靶基因区域a部分(FMR1)、b部分(FMR2)对各种单碱基突变类型检测的鉴别能力，图5C和图5D对双碱基突变类型的检测。

实验方法如下：

根据实施例2中检测的靶标Ta和Tb替换为各种碱基突变类型的序列，其余反应体系和条件均与实施例2相同，反应完成后进行荧光测量，具体序列见表1。

实验三：为了探究Multi-DLK系统在生理状态下对核苷酸多态性测定的性能。本实验使用10％FBS(胎牛血清)进行模拟，综合以上结果表示Multi-DLK体系在核苷酸多态性测定中的高特异性和通用性。(结果如图6所示)。

实验方法如下：

步骤1：首先制备完成Multi-DLK系统(体积为13.5μL)。然后加入等量的Ta和Tb(各加入0.5μL)，0.5μL的KFP(5U/μL)，3μL的dNTP(10mM)，2μL的FBS，总反应体系为20微升在37℃下反应2小时。

步骤2：反应完成后采用实施例2的步骤2方法测量荧光信号。

表1各实验组所用靶标序列

实施例4：真实样品测定

为了评价Multi-DLK系统在临床环境中检测p53肿瘤抑制基因的可行性，对肿瘤细胞中基因组DNA的PCR产物进行了特异性检测。如实验部分所述，从两个细胞系(HeLa和A549)中提取基因组DNA，通过不对称PCR(^aPCR)扩增制备p53PCR产物，而对称PCR(^sPCR)制备的p53PCR产物则作为对照。如图7所示，显然，^sPCR产物诱导的低响应信号几乎与没有任何PCR产物的系统相同(空白组)。相反，在存在^aPCR产物的情况下检测到显着的信号增强，从而确认Multi-DLK系统的测定特异性。更引人注目的是，当使用更多提取的基因组DNA作为^aPCR的模板时，两组(HeLa和A549)的荧光强度都增加了，证明了其在临床样品分析中的潜在应用。

步骤1：细胞在10cm²的培养皿长至80％时使用全基因组提取试剂盒(TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.5.0)按照试剂盒说明书提取基因组DNA。

步骤2：对称PCR的混合溶液由正向引物(2μL,10μM)、反向引物(2μL,10μM)、2μL的基因组DNA(A549 180ng/μL,Hela 110ng/μL)、25μL的2×Taq Plus Master Mix和19μL的超纯水组成。溶液混合均匀后，按照以下程序进行PCR扩增。95℃预变性3分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，热循环35次，最后在72℃延伸5分钟。此步骤的产物为双链DNA，无法进行单链入侵，对称PCR产物仅作为对照。

步骤3：不对称PCR的混合溶液由正向引物(5μL,10μM)、反向引物(0.5μL,2μM)、2μL的基因组DNA(A549 180ng/μL，Hela 110ng/μL)、25μL的2×Taq Plus Master Mix和17.5μL的超纯水组成。热循环程序与对称PCR相同。由于正向引物和反向引物的加入量不对等，导致不对称PCR产物中存在大量的单链目标DNA，这些单链目标DNA可以作为入侵链对锁链1和锁链2进行置换，当入侵链成功地置换锁链1和锁链2时，Liner序列暴露回文序列作为引物，通过KFP参与的高度靶特异性链置换产生荧光，通过测定荧光即可快速获知目的基因的核苷酸多态性。

步骤4：随后对称PCR产物和不对称PCR产物各取5μL加入到实施例2制备的终体积为20μL的反应溶液中，按照实施例2中的方法进行反应并测量荧光。

综上，本发明涉及的是一种多价双锁钥(Multi-DLK)系统，用于高度特异性和快速的核苷酸多态性测定。其原理为只有当目标作为唯一的“钥”被引入并执行两次匹配操作以分别激活两个支点介导的链位移反应^TSDR₁和^TSDR₂时，系统才能被定义为“On”状态，而系统在缺少任何步骤后保持“Off”状态。最重要的是，这种使用两个不同的靶标片段作为输入的两次匹配策略为同时区分单核苷酸多态性和双核苷酸多态性提供了一种有效的方法，其不同位置的突变碱基甚至彼此相距甚远。此外，通过与^TSSDA结合作为信号放大器，检测限可以低至10fM。比较分析表明，这种双锁设计具有比普通单锁系统更强的鉴别能力。此外，Multi-DLK系统在血清中的稳定性能以及癌细胞中真实样品测定的最终应用显示了该平台在临床诊断方面的潜力。总而言之，这项发明提供了区分多种核苷酸多态性快速高效的新方法，对于疾病诊断，药物开发和癌症治疗具有重要的意义。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种基于链置换反应的多价双锁钥系统，其特征在于，链置换反应的每个检测单元包含两条单链DNA锁链，当两条单链DNA锁链同时被靶序列置换后产生阳性指示。

2.根据权利要求1中所述的一种基于链置换反应的多价双锁钥系统，其特征在于：所述检测单元包括单链Linker序列，两条单链DNA锁链依次与Linker序列互补配对，其中仅与Linker的3’端配对的锁链携带荧光标记，所述Linker的3’端携带猝灭标记。

3.根据权利要求2中所述的一种基于链置换反应的多价双锁钥系统，其特征在于：所述Linker的5’端偶联有生物素，若干检测单元均通过生物素连接于链霉亲和素上。

4.根据权利要求3中所述的一种基于链置换反应的多价双锁钥系统，其特征在于：所述与Linker3’端配对的锁链5’端偶联有FAM，所述Linker的3’端偶联有BHQ-1。

5.根据权利要求2中所述的一种基于链置换反应的多价双锁钥系统，其特征在于：所述Linker与靶序列的互补区域内至少包含两个支点序列。

6.根据权利要求2中所述的一种基于链置换反应的多价双锁钥系统，其特征在于：所述Linker的序列如SEQ ID No.1所示，所述与Linker的3’端配对的锁链序列如SEQ ID No.2所示，另一条锁链的序列如SEQ ID No.3所示。

7.一种如权利要求1-6中任一项所述基于链置换反应的多价双锁钥系统的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1：按单链溶液：10×Blue缓冲液：H₂O体积比为3:2:14.4配置反应液一，将反应液一加热反应后，逐渐冷却至室温；然后加入链霉亲和素溶液并组装反应即得；所述单链溶液中含有Linker、锁链一和锁链二共三种单链DNA。

8.根据权利要求7中所述的一种基于链置换反应的多价双锁钥系统的制备方法，其特征在于：所述Linker、锁链1和锁链2的浓度均为10μM；所述链霉亲和素溶液的浓度为9.6μM，链霉亲和素溶液与单链溶液的体积比为1:5。

9.根据权利要求7中所述的一种基于链置换反应的多价双锁钥系统的制备方法，其特征在于：所述反应液一的反应条件为95℃下加热反应5分钟，所述链霉亲和素溶液加入后37℃反应1h。

10.一种基于链置换反应的多价双锁钥系统在核苷酸多态性检测中的应用，其特征在于，

步骤1：向制备完成的多价双锁钥系统中加入靶序列、KFP和dNTP并在37℃下反应2小时；

步骤2：将反应溶液用1×Blue缓冲液稀释10倍至最终体积，并通过荧光计激发并测定荧光光谱。

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