CN111455073A - 幽门螺旋杆菌分型与耐药检测的扩增和测序引物及试剂盒 - Google Patents

幽门螺旋杆菌分型与耐药检测的扩增和测序引物及试剂盒 Download PDF

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CN111455073A CN202010223884.2A CN202010223884A CN111455073A CN 111455073 A CN111455073 A CN 111455073A CN 202010223884 A CN202010223884 A CN 202010223884A CN 111455073 A CN111455073 A CN 111455073A
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Abstract

本发明公开了一种用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变检测的扩增和测序引物及其试剂盒。试剂盒内包括PCR扩增用的反应液A，包被引物对的反应管，以及测序用引物H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11。本发明可一次性在相同PCR反应条件下对幽门螺旋杆菌所有11个目的序列进行扩增，再用测序引物按设定程序进行测序。PCR反应体系中带荧光染料，可以直接通过荧光值的升高位置来判定扩增结果，避免电泳带来的不便和污染。引物直接包被在反应管中，避免使用引物时配置繁琐。该试剂盒可用于检测幽门螺旋杆菌毒力分型及耐药基因，本发明可用于对临床活检标本和石蜡包埋的标本进行检测，能为幽门螺旋杆菌治疗提供细菌的分型和耐药信息。

Description

幽门螺旋杆菌分型与耐药检测的扩增和测序引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及基于聚合酶链反应(PCR)和DNA测序技术的分子生物学方法，尤其涉及一种用于幽门螺旋杆菌基因分型和耐药突变检测的扩增和测序引物及其试剂盒。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是能够在人的胃中存活的唯一微生物种类，定植的幽门螺杆菌可引起慢性炎症、消化性溃疡甚至胃癌，统计数据表明国内有50-60％的人有Hp的感染。作为胃癌的最重要的致病因子之一，Hp在1994年被世界卫生组织将其定为I类致癌原。Robin warren和Barry Marshall也因为发现幽门螺杆菌和胃病的关系而获得2005年的诺贝尔生理学或医学奖。
Hp包括多种亚菌型，携带不同基因型的菌的毒性和导致的临床疾病不同，与毒素相关的基因有cagA、vacA、dupA、iceA、UreA等等，可用于分型并对临床治疗提供参考。数据表明，20％～30％的感染者没有发病但检测发现其终身携带Hp；50％以上Hp感染者引发慢性炎症，并且程度不等；10％～15％Hp感染者引发消化性溃疡；只有极少数的感染者出现了胃部恶性肿瘤，结果说明只有部分Hp引起疾病产生，而不同Hp亚型引起疾病的严重程度不同、结局状态不同。目前，还未开发出检测全面、结果准确的幽门螺旋杆菌基因突变测序检测试剂盒用于临床诊断。本发明基于聚合酶链反应(PCR)和DNA测序技术，通过设计、筛选得到一套理想的对幽门螺旋杆菌分型与耐药进行扩增和测序的引物，达到全面检测幽门螺旋杆菌基因是否发生突变的目的，进行准确的基因分型，为HP分型和耐药提供检测手段。
发明内容
本发明的目的是克服现有分子诊断技术中检测幽门螺旋杆菌突变类型多、检测不全面的缺陷，提供一套优化引物用于PCR扩增和测序，能在相同条件下一次性进行11个目的基因序列的扩增PCR，顺利扩增和测序幽门螺旋杆菌基因的分型和耐药相关区域。
本发明第二个目的是提供一种配套此引物进行幽门螺旋杆菌分型与耐药突变检测的特定的PCR反应程序，达到快速扩增的目的。
本发明第三个目的是提供一种对临床标本进行幽门螺旋杆菌进行序列分析的荧光PCR扩增试剂盒。
本发明的技术方案概述如下：
用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变检测的扩增和测序引物，包括UreA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，16S rRNA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4，rdxA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，23S rRNA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8，gyrA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，PBP1的扩增和测序引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，cagA的扩增和测序引物为SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14，vacAs的扩增和测序引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，vacAm的扩增和测序引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，vacAi的扩增和测序引物为SEQ IDNO.19和SEQ ID NO.20，vacAii的扩增和测序引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。
配套扩增幽门螺旋杆菌序列的PCR反应，为95℃预变性3min后，94℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸35s，进行35个循环，然后保存在25℃；及时取出进行测序。
一种用于对幽门螺旋杆菌分型与耐药突变检测的扩增和测序试剂盒：
试剂A：由2mL缓冲液组成，包含
Figure BDA0002427008160000031
Green I染料，0.2mM dNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris-HCl、80mMKCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4、100U TaqDNA聚合酶；
试剂H1：由针对UreA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.1；
试剂H2：由针对16S rRNA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.3；
试剂H3：由针对rdxA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.5；
试剂H4：由针对23S rRNA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.7；
试剂H5：由针对gyrA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.9；
试剂H6：由针对PBP1的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.11；
试剂H7：由针对cagA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.13；
试剂H8：由针对vacAs的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.15；
试剂H9：由针对vacAm的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.17；
试剂H10：由针对vacAi的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.19；
试剂H11：由针对vacAii的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.21；
包被引物的PCR反应管：
一号反应管：含有针对UreA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.1和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.2；
二号反应管：含有针对16S rRNA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.3和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.4；
三号反应管：含有针对rdxA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.5和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.6；
四号反应管：含有针对23S rRNA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.7和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.8；
五号反应管：含有针对gyrA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.9和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.10；
六号反应管：含有针对PBP1的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.11和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.12；
七号反应管：含有针对cagA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.13和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.14；
八号反应管：含有针对vacAs的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.15和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.16；
九号反应管：含有针对vacAm的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.17和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.18；
十号反应管：含有针对vacAi的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.19和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.20；
十一号反应管：含有针对vacAii的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.21和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.22。
本发明优点：
提供一种用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变检测的扩增和测序引物及其试剂盒。其优点在于：1)提供了一套可进行快速HP基因分型和耐药分析的PCR引物和优化的测序引物，一次性扩增所有幽门螺旋杆菌基因所有11个目的序列的序列用于后续测序；2)反应体系中带荧光染料，可以直接通过荧光定量PCR观察扩增结果，避免电泳带来的不便和污染；3)引物直接包被在反应管中，避免引物配置的繁琐和困难。通过优化实验反应体系和反应条件，组成简单、快速、灵敏、特异的检测试剂盒，可用于对临床标本的检测，减少人力和物力，提供更多的实验信息。
附图说明
图1为人幽门螺旋杆菌片段测序结果(按从上到下和从左到右的顺序分别为UreA、16S rRNA、rdxA、23S rRNA、gyrA、PBP1、cagA、vacAs、vacAm、vacAi基因)。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
本发明的扩增和测序引物核苷酸序列为：
SEQ ID NO.1 5’-ACATTGCGAGCGGGACAG-3’
SEQ ID NO.2 5’-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3’
SEQ ID NO.3 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
SEQ ID NO.4 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
SEQ ID NO.5 5’-AATTTGAGCATGGGGCAGA-3’
SEQ ID NO.6 5’-GAAACGCTTGAAAACACCCCT-3’
SEQ ID NO.7 5’-CCACAGCGATGTGGTCTCAG-3’
SEQ ID NO.8 5’-CTCCATAAGAGCCAAAGCCC-3’
SEQ ID NO.9 5’-TTTRGCTTATTCMATGAGCGT-3’
SEQ ID NO.10 5’-GCAGACGGCTTGGTARAATA-3’
SEQ ID NO.11 5’-CACGAGCACCGGTAAGATTT-3’
SEQ ID NO.12 5’-GCGACAATAAGAGTGGCA-3’
SEQ ID NO.13 5’-GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG-3’
SEQ ID NO.14 5’-CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA-3’
SEQ ID NO.15 5’-ATGGAAATACAACAAACAC-3’
SEQ ID NO.16 5’-CTGCTTGAATGCGCCAAAC-3’
SEQ ID NO.17 5’-CAATCTGTCCAATCAAGCGA-3’
SEQ ID NO.18 5’-GCGTCTAAATAATTCCAAGG-3’
SEQ ID NO.19 5’-GTTGGGATTGGGGGAATGCC-3’
SEQ ID NO.20 5’-TTAATTTAACGCTGTTTGAA-3’
SEQ ID NO.21 5’-GTTGGGATTGGGGGAATGCC-3’
SEQ ID NO.22 5’-GATCAACGCTCTGATTTGA-3’
实施例1
一套用于幽门螺旋杆菌扩增和测序用的特异性引物，包括UreA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，16S rRNA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4，rdxA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，23S rRNA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，gyrA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，PBP1的扩增和测序引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，cagA的扩增和测序引物为SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14，vacAs的扩增和测序引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，vacAm的扩增和测序引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，vacAi的扩增和测序引物为SEQ IDNO.19和SEQ ID NO.20，vacAii的扩增和测序引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。
实施例2
一种用于对幽门螺旋杆菌进行扩增和测序的试剂盒，由下列试剂组成：
试剂A：由2mL缓冲液组成，包含
Figure BDA0002427008160000061
Green I染料，0.2mM dNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris-HCl、80mMKCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4、100U TaqDNA聚合酶；
试剂H1：由针对UreA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.1；
试剂H2：由针对16S rRNA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.3；
试剂H3：由针对rdxA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.5；
试剂H4：由针对23S rRNA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.7；
试剂H5：由针对gyrA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.9；
试剂H6：由针对PBP1的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.11；
试剂H7：由针对cagA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.13；
试剂H8：由针对vacAs的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.15；
试剂H9：由针对vacAm的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.17；
试剂H10：由针对vacAi的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.19；
试剂H11：由针对vacAii的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.21；
包被引物的PCR反应管：
一号反应管：含有针对UreA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.1和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.2；
二号反应管：含有针对16S rRNA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.3和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.4；
三号反应管：含有针对rdxA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.5和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.6；
四号反应管：含有针对23S rRNA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.7和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.8；
五号反应管：含有针对gyrA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.9和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.10；
六号反应管：含有针对PBP1的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.11和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.12；
七号反应管：含有针对cagA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.13和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.14；
八号反应管：含有针对vacAs的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.15和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.16；
九号反应管：含有针对vacAm的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.17和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.18；
十号反应管：含有针对vacAi的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.19和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.20；
十一号反应管：含有针对vacAii的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.21和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.22。
实施例3
用本发明试剂盒进行实时荧光定量PCR(real-time FQ PCR)扩增幽门螺旋杆菌的所有序列。首先，按实验的标本个数计算各试剂的需要量，实验步骤如下：
1.扩增反应液配置：按顺序配置反应液(1个检测标本)，加入水120μL、试剂A150μL、DNA标本30μL，共300μL；混匀。
2.各管按顺序加入25μL的扩增反应液，盖好盖子。
3.按实验设计的PCR程序进行扩增：为95℃预变性3min后，94℃变性1min，60℃退火1mins，72℃延伸35s，延伸期获取荧光值，进行35个循环，最后保存在25℃；及时取出进行测序。
4.荧光值在22-28个循环起跳，各组同时起跳认为是特异性扩增。
Figure BDA0002427008160000081
实施例4
用本发明试剂盒配套的引物进行测序：
1.PCR产物纯化(ExoI/SAP方法)：
1.1配制纯化体系：核酸外切酶1(ExoI)6μL+虾解酶(SAP)12μL+水6μL，共24μL，混匀。
1.2取配制的纯化体系2μL与每个扩增产物8μL混合(共11个)，加入另个空白的反应板内。
1.3将反应板放在PCR仪以上，37℃30min，80℃20min，反应后可在4℃冰箱内保存1周左右。
2.测序反应：
2.1 10μL PCR纯化产物中每孔加入20μL水，充分混匀后，离心。
2.2配制测序反应体系：取4.8μL BDT Ready Reaction Premix(2.5×)加21.6μLBDT缓冲液(5×)加69.6μL Deionised water混合。每次取8μL上述混合液分别与H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11各1μL充分混匀，快速离心。
2.3每孔PCR产物稀释液取1μL至反应孔中(11孔)，每孔加入9μL测序反应混合液，混匀，快速离心。
2.4将反应板放在PCR仪上，反应板顶部置PCR密封压力垫，以防止液体蒸发，关上PCR仪,运行测序反应：96℃10s后，进行25个循环为96℃10s，50℃10s，60℃2min，最后保存15℃并取出。
3.测序反应产物纯化：
3.1每孔测序反应孔内加入1μLEDTA、1μL NaAc和25μL无水乙醇，充分震荡混匀30s。室温放置15min，3000rpm离心30min.
3.2倒置反应板，调节转速，500rpm离心1min
3.3每孔测序反应产物中加入50μL 70％乙醇，3000rpm离心10min。
3.4倒置反应板，500rpm离心1min。
3.5室温避光静置30min,充分挥发板内乙醇。
3.6每孔内加入甲酰胺10μL，封板，放在PCR以上95℃2min，迅速放入-20℃冰箱内冷却3-5min.
4.测序仪读板检测：使用ABI3500测序仪对测序结果进行检测。测序结果使相应的测序软件进行数据分析，见图1。
实施例5
测序结果与幽门螺旋杆菌标准序列进行比对：
1.测序结果进行剪切，获得准确的测序靶片段序列；
2.将幽门螺旋杆菌标准测序和测序结果输入软件进行比对；
3.核对突变性质并分析所针对的耐药性。
序列表
<110> 温州医科大学附属第一医院
<120> 幽门螺旋杆菌分型与耐药检测的扩增和测序引物及试剂盒
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(.18)
<400> 1
acattgcgag cgggacag 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
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cgcccaatct cactttatcg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
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<221> primer_bind
<222> (1)..(.20)
<400> 3
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(.19)
<400> 4
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(.19)
<400> 5
aatttgagca tggggcaga 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(.21)
<400> 6
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<210> 7
<211> 20
<212> DNA
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<221> primer_bind
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<400> 7
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<211> 20
<212> DNA
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<221> primer_bind
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<400> 8
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<210> 9
<211> 21
<212> DNA
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<400> 9
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<210> 10
<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<222> (1)..(.20)
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<210> 11
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<212> DNA
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cacgagcacc ggtaagattt 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(.18)
<400> 12
gcgacaataa gagtggca 18
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
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<400> 13
gataacaggc aagcttttga gg 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
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<400> 14
ctgcaaaaga ttgtttggca ga 22
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
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<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(.19)
<400> 15
atggaaatac aacaacac 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(.19)
<400> 16
ctgcttgaat gcgccaaac 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(.20)
<400> 17
caatctgtcc aatcaagcga 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(.20)
<400> 18
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<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
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<221> primer_bind
<222> (1)..(.20)
<400> 19
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<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(.20)
<400> 20
ttaatttaac gctgtttgaa 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(.20)
<400> 21
gttgggattg ggggaatgcc 20
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(.19)
<400> 22
gatcaacgct ctgatttga 19

Claims (2)

1.幽门螺旋杆菌分型与耐药突变检测的扩增和测序的引物，其特征在于：优化PCR引物设计的基础上，能在相同条件反应下一次性进行11个聚合酶链反应,完成HP基因目的序列的扩增；并能通过测序引物进行相关基因编码区所有11个序列测序，包括UreA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，16S rRNA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4，rdxA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，23S rRNA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，gyrA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，PBP1的扩增和测序引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，cagA的扩增和测序引物为SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14，vacAs的扩增和测序引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，vacAm的扩增和测序引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，vacAi的扩增和测序引物为SEQ IDNO.19和SEQ ID NO.20，vacAii的扩增和测序引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。
2.幽门螺旋杆菌分型与耐药突变检测的扩增和测序试剂盒，由下列试剂组成：
试剂A：由2mL缓冲液组成，包含
Figure FDA0002427008150000011
Green I染料，0.2mM dNTPs、80mM Tris-HCl、80mMKCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4、100U Taq DNA聚合酶；
试剂H1：由针对UreA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.1；
试剂H2：由针对16S rRNA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.3；
试剂H3：由针对rdxA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.5；
试剂H4：由针对23S rRNA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.7；
试剂H5：由针对gyrA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.9；
试剂H6：由针对PBP1的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.11；
试剂H7：由针对cagA的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.13；
试剂H8：由针对vacAs的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.15；
试剂H9：由针对vacAm的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.17；
试剂H10：由针对vacAi的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.19；
试剂H11：由针对vacAii的测序引物30μL水溶液，包含4μM SEQ ID NO.21；
包被引物的PCR反应管：
一号反应管：含有针对UreA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ ID NO.1和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.2；
二号反应管：含有针对16S rRNA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.3和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.4；
三号反应管：含有针对rdxA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ ID NO.5和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.6；
四号反应管：含有针对23S rRNA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.7和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.8；
五号反应管：含有针对gyrA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ ID NO.9和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.10；
六号反应管：含有针对PBP1的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ ID NO.11和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.12；
七号反应管：含有针对cagA的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ ID NO.13和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.14；
八号反应管：含有针对vacAs的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ ID NO.15和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.16；
九号反应管：含有针对vacAm的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ ID NO.17和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.18；
十号反应管：含有针对vacAi的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ ID NO.19和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.20；
十一号反应管：含有针对vacAii的扩增引物混合组成，包含1.5×10-2nmol SEQ IDNO.21和1.5×10-2nmol SEQ ID NO.22。
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