CN117625818A - 一种基于raa-lfd法用于检测幽门螺杆菌感染的引物和探针组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于RAA‑LFD法用于检测幽门螺杆菌感染的引物和探针组合及其应用，所述引物和探针组合中，16s rRNA引物如SEQ ID NO.1‑2所示，ureA引物如SEQ ID NO.4‑5所示，16s rRNA探针如SEQ ID NO.3所示，ureA探针如SEQ ID NO.6所示。利用本发明的引物和探针组合，可以实现RAA‑LFD检测幽门螺杆菌，该反应体系在37℃条件下，仅需30min即可获得结果，并且辅助侧向流动试纸条(LFD)，可用于快速、可视化、现场检测幽门螺杆菌，辅助临床诊断HP的感染，进一步控制传播，对已患病人群的的病情实时监测和愈后诊断。
Description
技术领域
本发明属于幽门螺杆菌检测技术领域，具体涉及一种基于RAA-LFD法用于检测幽门螺杆菌感染的引物和探针组合及其应用。
背景技术
在所有可引发胃肠道肿瘤中的致病因素中，幽门螺旋杆菌(HP)是最重要的致病因素之一。现阶段临床针对HP感染的治疗，主要是“三联疗法”和“四联疗法”，仅能依靠医生的经验以及院内的抗生素用药偏好。因各地区流行的菌株耐药情况不同，容易造成一次治疗根除率不高，浪费医疗资源，因此临床迫切需要一种快速、灵敏且高特异性的现场检测方法，用于预防HP的进一步传播和对已患病人群的的病情实时监测和愈后诊断。
HP感染有多种检测方法，胃黏膜组织活检作为HP诊断的金标准，具有侵入性，因此不适用于筛查或普查。RUT机制是HP产生的尿素酶可分解检测剂中的尿素，生成NH3与CO2，使苯酚磺酞由黄变红，来诊断是否HP阳性。但HP在胃内的分布不一，其检测结果受细菌数量、取材部位、观察时间等多种因素的影响。细菌培养阳性是其诊断的金标准，但是由于HP是一种微需氧菌，需要严格的培养条件，这对医院检验科的技术设备均有较高要求。血清HP检查的主要是Ig G抗体，其原理在于测定HP感染后产生的全身性抗体。由于HP感染难以自行消失，HP阳性一般即提示HP感染。不足之处在于其在HP根除后6～8个月内仍可以被检测到，无法区分当前和既往感染，往往具有较高的假阳性率。粪便HP抗原检测在临床上近年来应用越来越广泛，其优点在于无创且取材简单、花费少、操作简便，患者容易接受，可通过免疫层析法、酶免疫测定法来检测。此方法优点是样本易采集，检测快速，然而准确性较低。UBT尿素呼气试验(13C、14C)使用与RUT相同的原理，但是结果需要昂贵的光谱仪，并且由于其它胃肠道尿素分解细菌而导致误诊。UBT用于监测HP的根除需要病人停药4-8周，且由于放射性因素，不推荐儿童或孕妇使用。
PCR核酸检测技术可以靶向检测HP毒力和非毒力相关基因，相对于其他检测方法具有高特异性、高灵敏性，但传统的PCR检测需要昂贵的自动化热循环仪和专业技术，且检测时间长，不适合现场检测。重组酶辅助扩增(RAA)是其中一种新型的等温核酸扩增方法，具有发展成为快速即时检测试剂盒的潜力。但目前尚未有该技术通过检测HP双靶从而辅助诊断HP感染的方案被报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于RAA-LFD法用于检测幽门螺杆菌感染的引物和探针组合及其应用，介导RAA反应的主要元件有3个，包括重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶，该反应体系在37℃条件下，仅需20min即可获得结果，并且辅助侧向流动试纸条(LFD)，可用于快速、可视化、现场检测幽门螺杆菌，辅助临床诊断HP的感染，进一步控制传播，对已患病人群的的病情实时监测和愈后诊断。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于RAA-LFD法用于检测幽门螺杆菌感染的引物和探针组合，包括16s rRNARAA正向引物、16s rRNA RAA反向引物、ureA RAA正向引物、ureA RAA反向引物、16s rRNARAA探针、ureA RAA探针；
所述16s rRNA RAA正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述16s rRNA RAA反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述ureA RAA正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述ureA RAA反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述16s rRNA RAA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述ureA RAA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述16s rRNA RAA反向引物的5’端标记有Biotin；所述16s rRNA RAA探针的5’端进行荧光基团FAM修饰，第31位碱基G被THF替代，3’端修饰C3 spacer。
优选地，所述ureA RAA反向引物的5’端标记有TAMRA；所述ureA RAA探针的5’端标记有Dig，第31位碱基C被THF替代，3’端修饰C3 spacer。
上述的引物和探针组合在制备幽门螺杆菌的检测试剂、检测试剂盒或检测试纸条中的应用。
一种幽门螺杆菌的RAA-LFD检测试剂盒，包括上述的引物和探针组合。
优选地，还包括RAA反应试剂和侧向流动试纸条；所述RAA反应试剂包括缓冲液V、乙酸镁和纯化水。
基于上述的RAA-LFD检测试剂盒的检测方法，提取待测样品DNA作为模板，利用试剂盒中的引物和探针组合进行RAA扩增，采用侧向流动试纸条对RAA扩增产物进行检测。
优选地，所述RAA扩增的反应体系为：缓冲液V 25μL、10μM 16s rRNA正向引物1.0μL、10μM ureA正向引物1.0μL、10μM 16s rRNA反向引物1.0μL、10μM ureA反向引物1.0μL、10μM 16s rRNA探针0.3μL、10μM ureA探针0.3μL、乙酸镁溶液5μL、DNA模板4μL、纯化水11.4μL；反应体系中，上游引物、下游引物的终浓度均为0.2μM，探针的终浓度均为0.006μM。
优选地，所述RAA扩增的反应条件为：37℃，20min。
本发明的有益效果如下：
和现有幽门螺杆菌分子生物学检测方法相比，本发明中RAA-LFD的方法对大型检测设备依赖性低，无需专业人员操作，仅需恒温检测设备及离心机，即可在37℃、30min内(RAA扩增时间为20min，LFD试纸条显色时间为10min以内)高特异性针对幽门螺杆菌16srRNA和ureA进行双靶标快速检测。相对于单靶标提高了准确性，可以作为一种有效POCT检测手段更好的应用于临床进行幽门螺杆菌感染的鉴定。
附图说明
图1为RAA-LFD检测结果判断标准；
图2为实施例1中RAA-LFD检测时间的优化：A为琼脂糖凝胶图，B为试纸条图；
图3为实施例1中RAA-LFD检测温度的优化：A为琼脂糖凝胶图，B为试纸条图；
图4为实施例1中RAA-LFD检测灵敏度的研究：A为琼脂糖凝胶图，B为试纸条图；
图5为实施例1中RAA-LFD特异性研究：A为琼脂糖凝胶图，B为试纸条图；
图6为实施例2中44例临床样本HP的16s rRNA、ureA的RAA-LFD检测结果；
图7为实施例2中44例临床胃液样本16s rRNA的PCR检测结果；
图8为实施例2中44例临床胃液样本ureA的PCR检测结果。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
1、取HP培养平板，刮取菌落溶于无菌生理盐水中，提取HP DNA，用作反应模板。
2、用PCR的方法作为对照方法，针对幽门螺旋杆菌的靶基因16s rRNA、ureA设计PCR引物、RAA引物、RAA探针，具体如下：
从NCBI database(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找到不同菌株HP 16s rRNA基因序列：>NR_119304.1、>NR_114587.1、>NR_044761.1，ureA不同菌株基因序列：>NZ_CP071982.1、>AF373556.1、>AF373568.1、>AF373564.1。用DNA-MAN软件分别对上述序列进行比对找出保守区域，根据PCR以及RAA引物探针设计原则，使用Primer Premier 5.0设计相应引物和探针，用Oligo7进行参数评估，通过NCBIPrimer-BLAST来确定引物探针的特异性。
在16s rRNA RAA反向引物的5’端标记生物素(Biotin)；在16s rRNA RAA探针的5’端进行荧光基团FAM修饰，3’端修饰C3 spacer，在探针31bp处，将碱基G替换为THF。
在ureA RAA反向引物的5’端标记TAMRA；在ureA RAA探针的5’端标记Dig，3’端修饰C3 spacer，在探针31bp处，将碱基C替换为THF。
PCR引物及RAA-LFD相关引物探针序列如下表1所示，所有引物、探针、扩增产物均通过了测序。
表1PCR引物及RAA-LFD相关引物探针序列
3、对照组实验——16s rRNA、ureA的PCR反应步骤
(1)反应体系的准备：按下表2配制反应体系。
表2PCR反应体系
| 组分 | 用量 |
| TB Green Premix Ex TaqII(2×)(Tli RNaseH Plus) | 10μL |
| PCR Forward Primer(10μM) | 0.8μL |
| PCR Reverse Primer(10μM) | 0.8μL |
| ROX Reference Dye II(50×) | 0.4μL |
| DNA模板 | 2μL |
| 灭菌水 | 6μL |
| Total | 20μL |
(2)PCR仪器(ABI-Q5)反应步骤设置
预变性：95℃30s(1个循环)；
PCR反应：95℃5s，60℃30s，72℃30s(40个循环)；
溶解曲线：95℃15s，60℃1min，95℃1s。
4、优化RAA-LFD反应检测体系时间
(1)反应体系的准备
按下表3配制反应体系：
表3单个反应体系用量(共50μL)
| 组分 | 用量 |
| 缓冲液V | 25μL |
| 引物RAA-16s rRNA-F(10μM) | 1.0μL(终浓度0.2μM) |
| 引物RAA-16s rRNA-R(10μM) | 1.0μL(终浓度0.2μM) |
| 探针RAA-16s rRNA-Probe(10μM) | 0.3μL(终浓度0.006μM) |
| 引物RAA-ureA-F(10μM) | 1.0μL(终浓度0.2μM) |
| 引物RAA-ureA-R(10μM) | 1.0μL(终浓度0.2μM) |
| 探针RAA-ureA-Probe(10μM) | 0.3μL(终浓度0.006μM) |
| 纯化水 | 11.4μL |
上述反应体系手弹混匀，并短暂离心，将41μL混合液全部加入干粉酶中使其充分重溶均匀(注意：该步骤不能用涡旋振荡仪剧烈振荡混匀)，短暂离心将液体收集至管底。
(2)加样
打开反应管，向每个反应管盖内侧加入5μL乙酸镁Ⅰ，然后向各反应单元中加入4μLHP模板DNA，移液器枪头要在液面以下加入样品，以防形成气溶胶造成污染，加完一个样品，盖紧管盖，再加下一个样品，充分混匀并再次离心收集。
(3)扩增检测
将反应管分别置于39℃恒温金属浴中静置5min、10min、20min、30min。
(4)产物分析
①吸取10μL扩增产物加入60μL纯水稀释，用相应标记的试纸条进行检测。
②苯酚-氯仿和扩增产物1:1涡旋混匀，离心后吸上清液进行琼脂糖凝胶电泳。
(5)结果分析
①试纸条法如图1所示，只出现C线为阴性，同时出现T1线、T2线和C线为阳性，质控线C显色后10min内判读结果，10min后判读无效。
②琼脂糖凝胶图上出现目的条带为阳性。
结果如图2所示，最优反应时间为20min。
5、优化RAA-LFD反应检测体系时间
步骤(1)(2)(4)(5)与上述步骤4相同。
步骤(3)中，固定反应时间为20min，反应温度分别设为25℃、37℃、39℃、42℃。
结果如图3所示，最优反应温度为37℃。
6、RAA-LFD检测体系的灵敏度
(1)将60ng/μL HP模板DNA进行10倍梯度稀释，得到60ng/μL、6ng/μL、6×10-1ng/μL、6×10-2ng/μL、6×10-3ng/μL、6×10-4ng/μL六个梯度稀释样本。
(2)反应体系的准备
按上表3配制反应体系。反应体系手弹混匀，并短暂离心，将41μL混合液全部加入干粉酶中使其充分重溶均匀(注意：该步骤不能用涡旋振荡仪剧烈振荡混匀)，短暂离心将液体收集至管底。
(3)加样
打开反应管，向每个反应管盖内侧加入5μL乙酸镁Ⅰ，然后向各反应单元中加入4μL水(阴性对照)、六个待检模板DNA，移液器枪头要在液面以下加入样品，以防形成气溶胶造成污染，加完一个样品，盖紧管盖，再加下一个样品，充分混匀并再次离心收集。
(4)扩增检测
将反应管分别置于37℃恒温金属浴中静置20min。
(5)产物分析
①吸取10μL扩增产物加入60μL纯水稀释，用相应标记的试纸条进行检测。
②苯酚-氯仿和扩增产物1:1涡旋混匀，离心后吸上清液进行琼脂糖凝胶电泳。
(6)结果分析
①试纸条法如图1所示，只出现C线为阴性，同时出现T1线、T2线和C线为阳性，质控线C显色后10min内判读结果，10min后判读无效。
②琼脂糖凝胶图上出现目的条带为阳性。
结果如图4所示，16s rRNA的RAA-LFD最低检测限为60pg/μL(6×10-2ng/μL)，ureA的RAA-LFD最低检测限为6pg/μL(6×10-3ng/μL)。
7、RAA-LFD检测体系的特异性
(1)选用大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌6种非HP细菌作为特异性验证的细菌，刮取培养平板上的菌落于生理盐水中制成菌液，提取菌液DNA。
(2)反应体系的准备
按上表3配制反应体系。反应体系手弹混匀，并短暂离心，将41μL混合液全部加入干粉酶中使其充分重溶均匀(注意：该步骤不能用涡旋振荡仪剧烈振荡混匀)，短暂离心将液体收集至管底。
(3)加样
打开反应管，向每个反应管盖内侧加入5μL乙酸镁Ⅰ，然后向各反应单元中加入6种非HP细菌DNA、HP DNA(作为阳性对照)。移液器枪头要在液面以下加入样品，以防形成气溶胶造成污染，加完一个样品，盖紧管盖，再加下一个样品，充分混匀并再次离心收集。
(4)扩增检测
将反应管分别置于37℃恒温金属浴中静置20min。
(5)产物分析
①吸取10μL扩增产物加入60μL纯水稀释，用相应标记的试纸条进行检测。
②苯酚-氯仿和扩增产物1:1涡旋混匀，离心后吸上清液进行琼脂糖凝胶电泳。
(6)结果分析
①试纸条法如图1所示，只出现C线为阴性，同时出现T1线、T2线和C线为阳性，质控线C显色后10min内判读结果，10min后判读无效。
②琼脂糖凝胶图上出现目的条带为阳性。
结果如图5所示，16s rRNA、ureA RAA-LFD检测体系特异性好，和大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌均无交叉反应。
本实施例的实验结果可知，RAA-LFD的检测技术可以在37℃、30min内对HP感染进行鉴定；16s rRNA、ureA RAA-LFD最低检测限分别可达60pg/μL、6pg/μL；且检测体系特异性好，与大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌均无交叉反应。
本实施例的RAA-LFD检测技术与传统PCR检测的区别如下表4所示，通过表4的对比可以看出RAA-LFD方法优于传统PCR。
表4检测方法对比
实施例2RAA-LFD应用于临床样本检测
本实施例以PCR作为参考方法，以组织切片免疫荧光染色(ImmunofluorescentStaining，IFS)作为金标准，来评估实施例1的RAA-LFD幽门螺杆菌感染鉴定的临床应用价值。
1、收集来自南京市第一医院需行胃镜检查的44例病人的胃液样本，44例病人均取胃黏膜组织进行快速尿素酶(Rapid Urease Test，RUT)实验及切片免疫荧光染色检查，如下表5所示。
表5 44例样本RUT及IFS检查结果
2、提取胃液样本DNA。
3、采用实施例1所示的方法进行16s rRNA、ureA的PCR反应。
4、16s rRNA、ureA RAA-LFD检测步骤
(1)反应体系的准备
按上表3配制反应体系。反应体系手弹混匀，并短暂离心，将41μL混合液全部加入干粉酶中使其充分重溶均匀(注意：该步骤不能用涡旋振荡仪剧烈振荡混匀)，短暂离心将液体收集至管底。
(2)加样
打开反应管，向每个反应管盖内侧加入5μL乙酸镁Ⅰ，然后向各反应单元中分别加入44例样本DNA(4μL/例)，移液器枪头要在液面以下加入样品，以防形成气溶胶造成污染，加完一个样品，盖紧管盖，再加下一个样品，加样的顺序为：阴性样本/阴性质控品、待检样品DNA、阳性样本/阳性质控品，充分混匀并再次离心收集。
(3)扩增检测
将反应管分别置于37℃恒温金属浴中静置20min。
(4)产物分析
吸取10μL扩增产物加入60μL纯水稀释，用相应标记的试纸条进行检测。试纸条法如图1所示，只出现C线为阴性，同时出现T1线、T2线和C线为阳性，质控线C显色后10min内判读结果，10min后判读无效。
(5)结果分析
检测结果如表5、图6-8所示，采用RUT方法第4例样本未检出，而RAA-LFD的检测结果和PCR、IFS结果完全一致，证明了实施例1的引物探针以及检测体系的有效性。
以上仅为本发明的较佳实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容所做出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种基于RAA-LFD法用于检测幽门螺杆菌感染的引物和探针组合，其特征在于，包括16s rRNA RAA正向引物、16s rRNA RAA反向引物、ureA RAA正向引物、ureA RAA反向引物、16s rRNA RAA探针、ureA RAA探针；
所述16s rRNA RAA正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述16s rRNA RAA反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述ureA RAA正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述ureA RAA反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述16s rRNA RAA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述ureA RAA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述一种基于RAA-LFD法用于检测幽门螺杆菌感染的引物和探针组合，其特征在于，所述16s rRNA RAA反向引物的5’端标记有Biotin；所述16s rRNA RAA探针的5’端进行荧光基团FAM修饰，第31位碱基G被THF替代，3’端修饰C3 spacer。
3.根据权利要求1所述一种基于RAA-LFD法用于检测幽门螺杆菌感染的引物和探针组合，其特征在于，所述ureA RAA反向引物的5’端标记有TAMRA；所述ureA RAA探针的5’端标记有Dig，第31位碱基C被THF替代，3’端修饰C3spacer。
4.如权利要求1-3任一项所述的引物和探针组合在制备幽门螺杆菌的检测试剂、检测试剂盒或检测试纸条中的应用。
5.一种幽门螺杆菌的RAA-LFD检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的引物和探针组合。
6.根据权利要求5所述的一种幽门螺杆菌的RAA-LFD检测试剂盒，其特征在于，还包括RAA反应试剂和侧向流动试纸条；所述RAA反应试剂包括缓冲液V、乙酸镁和纯化水。
7.基于权利要求5或6所述的RAA-LFD检测试剂盒的检测方法，其特征在于，提取待测样品DNA作为模板，利用试剂盒中的引物和探针组合进行RAA扩增，采用侧向流动试纸条对RAA扩增产物进行检测。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述RAA扩增的反应体系为：缓冲液V25μL、10μM 16s rRNA正向引物1.0μL、10μM ureA正向引物1.0μL、10μM 16s rRNA反向引物1.0μL、10μM ureA反向引物1.0μL、10μM 16srRNA探针0.3μL、10μM ureA探针0.3μL、乙酸镁溶液5μL、DNA模板4μL、纯化水11.4μL；反应体系中，上游引物、下游引物的终浓度均为0.2μM，探针的终浓度均为0.006μM。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述RAA扩增的反应条件为：37℃，20min。
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