CN117512153A - 用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组、试剂盒及应用 - Google Patents

用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组、试剂盒及应用；本发明引物探针组，包括如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.7所示核酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.8所示核酸序列的通用下游引物、如SEQ ID NO.9所示核酸序列的通用探针、如SEQ ID NO.10所示核酸序列的阻滞探针和如SEQ ID NO.11‑SEQ ID NO.13所示核酸序列的ACTB内参基因引物和探针；本发明引物探针组检测23S rRNA基因及其A2142G、A2143G、A2142C、A2144T、G2141A和A2115G突变型，灵敏度高、结果可靠、检测速度快。

Description

用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组、试剂 盒及应用
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组、试剂盒及应用。
背景技术
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是一种黏附于胃黏膜以及细胞间隙的革兰阴性弯曲螺杆菌，我国感染率为56%。H.pylori感染可引起消化性溃疡、胃炎等胃部疾病，约1%的感染者会发展成胃癌，其传染力很强，20%左右的感染者会有明显的临床症状，H. pylori的根除使胃癌发生率降低39%，是胃癌的一级预防措施，且用药治疗后肠道菌群的改变会恢复，因此无不良后果。
克拉霉素的作用机制是抗生素与细菌核糖体的亚基结合，抑制核糖体的活性，从而抑制蛋白质的合成。而幽门螺杆菌的23S核糖体RNA(rRNA)基因V区的点突变（A2142G/A2143G位点）可以导致核糖体构象的改变，进而改变抗生素结合位点，使得克拉霉素亲和力减弱，出现克拉霉素耐药。但除了上述两个突变外，还有研究发现了一些新的突变，这些新突变和经典突变之间的差异可能在于克拉霉素最低抑菌浓度(minimum inhibitoryconcentration, MIC)不同。了解23S rRNA基因相关位点的突变情况，对于评估患者的耐药情况有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组、试剂盒及应用，以实现对幽门螺杆菌分型及耐药基因突变的检查，以评估患者的耐药情况。
为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组，包括如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7所示核酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.8所示核酸序列的通用下游引物、如SEQ ID NO.9所示核酸序列的通用探针和如SEQ ID NO.10所示核酸序列的阻滞探针。
进一步，还包括如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.13所示核酸序列的ACTB内参基因引物和探针。
进一步，用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的基因为23S rRNA基因及其A2142G、A2143G、A2142C、A2144T、G2141A和A2115G突变型。
第二方面，本发明提供一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的试剂盒，包括上述引物探针组。
进一步，包括浓度为5μM的各上游引物和通用下游引物、浓度为2.5μM的通用探针、ACTB内参基因探针及阻滞探针和PCR反应缓冲液。
第三方面，本发明提供一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的系统，包括采集模块、扩增模块、荧光检测模块和数据分析模块；
所述采集模块用于对待测粪便样本进行待测核酸样本提取；
所述扩增模块用于针对23S rRNA 基因及其A2142G、A2143G、A2142C、A2144T、G2141A和A2115G 突变型分别配制反应体系并进行ARMS-qPCR扩增，所述反应体系包括所述引物探针组；
所述荧光检测模块用于对ARMS-qPCR扩增时进行荧光检测；
所述数据分析模块用于对荧光检测的结果进行分析。
进一步，所述数据分析模块包括分型判定单元和耐药突变类型判定单元；
所述分型判定单元用于根据待测样本检测内参基因的JOE通道Ct值和检测目的基因的FAM通道Ct值进行幽门螺旋杆菌分型；若JOE通道有信号且其Ct值＜38并且FAM通道Ct值≥37或无扩增，则待测样本为阴性，若JOE通道有信号且其Ct值＜38并且FAM通道有信号且Ct值＜37，则待测样本为阳性；
所述耐药突变类型判定单元用于若待测样本为阳性，则根据FAM通道Ct值和JOE通道Ct值进行耐药突变类型判定；耐药突变类型判定包括确定FAM通道Ct值≤42且扩增曲线为"S"型和JOE通道Ct值≤38且扩增曲线为"S"型，计算FAM通道Ct值与JOE通道Ct值的差值，若该差值小于该FAM通道检测突变类型的cut-offΔCt值，则该待测样本为阳性；若FAM通道无信号、其Ct值大于等于42或该差值大于等于该FAM通道检测突变类型的cut-offΔCt值，则该待测样本为阴性。
进一步，所述扩增模块中ARMS-qPCR扩增的反应程序为：50℃、5min，UNG酶消化；95℃、10min活化；95℃、15s，65℃、5s，60℃、35s，循环45次；25℃、10s，降温。
第四方面，本发明提供所述用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组或试剂盒在制备检测克拉霉素耐药基因及突变型试剂或芯片中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明的引物、探针检测粪便样本23S rRNA基因突变灵敏度高，可无创检测临床样本中的微量突变模板(≥0.1ng )，结果可靠，与突变检测“金标准”直接测序法的结果符合率＞95％ (为100％)。 此外该方法检测速度快，操作简单，结果判读客观，闭管反应污染少，适合于在临床中大规模开展。采用qPCR进行检测在3个工作日内即可得到检测结果，检测的敏感性好，一次检测多个样本，为提高生物临床检测水平，普及应用奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例1幽门螺杆菌阳性样本 A2142G基因突变型扩增曲线图。
图2为本发明实施例1幽门螺杆菌阳性样本 A2143G基因突变型扩增曲线图。
图3为本发明实施例1幽门螺杆菌阳性样本 A2142C基因突变型扩增曲线图。
图4为本发明实施例1幽门螺杆菌阳性样本 A2144T基因突变型扩增曲线图。
图5为本发明实施例1幽门螺杆菌阳性样本 G2141A基因突变型扩增曲线图。
图6为本发明实施例1幽门螺杆菌阳性样本A2115G基因突变型扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
需要说明的是，这些实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下本方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。
本发明采用的技术方案是：
1、针对 23S rRNA 基因的野生型设计HP 23S rRNA引物、23S rRNA 基因的A2142G突变型设计ARMS引物、23S rRNA 基因的A2143G突变型设计ARMS引物、23S rRNA 基因的A2142C突变型设计ARMS引物、23Sr RNA 基因的A2144T突变型设计ARMS引物、23Sr RNA 基因的G2141A突变型设计ARMS引物、23Sr RNA 基因的A2115G突变型设计ARMS引物。
2、针对 23S rRNA 基因设计阻滞探针、通用Taqman探针、PCR通用下游引物。
3、本发明设计了内参，针对内参基因 ACTB 基因设计上下游引物及特异性的探针，该引物可以特异性的扩增 ACTB 基因的一段序列，该探针可与 ACTB 特异性结合。
4、引物、探针的合成，具体见表1。
表1 引物探针及核苷酸序列表
SEQ ID 基因 引物探针（5‘-3’）
NO.1 HP23S-F ACCCGCGGCAAGACTGA
NO.2 A2142G-F ACCCGCGGCAAGACTGG
NO.3 A2143G-F CCCGCGGCAAGACGTAG
NO.4 A2142C-F GGCCGCGGCAAGACTGC
NO.5 A2144T-F CCGCGGCAAGACGGCAT
NO.6 G2141A-F TACCCGCGGCAAGAAGA
NO.7 A2115G-F GTGAAATTGTAGTGGAGGTTAG
NO.8 HP23S-R CAAGGATGGCTCCATAAGAGCC
NO.9 HP23S-P FAM-TTCAAAGCCTCCCACCTATCCTGCGCA-BHQ1
NO.10 HP23S-YZ AGACGGAAAGACCCCGTGATAA-C3Spacer
NO.11 ACTB-F GGAGCGGGTGGCATTT
NO.12 ACTB-R GATGGGGCCAACACCTCT
NO.13 ACTB-P JOE-AGCAAGATTTCCCTACTG-BHQ1
对待测粪便样本核酸进行提取、纯化和浓度测定，核酸提取产物的浓度范围需在10-100 ng/μL，纯度范围需在1.6-2.1之间。
5、ARMS-qPCR
qPCR反应在7管内完成，不需要额外的开管/移液操作，大大提高了检测通量，并降低了污染的风险。本试剂盒中引入了dUTP/UDG防污染系统。热敏感(Heat-labile)UDG在室温下即可将含U的污染物迅速降解；热启动的Taq DNA Polymerase的优越性能，配合经过优化的缓冲体系，本试剂盒检测灵敏度可达到0.1 pg总RNA或<10拷贝的RNA模板。
6、阴性阳性标准品制备
阳性质控：根据试剂盒PCR扩增基因片段序列，人工合成23S rRNA 基因野生型和23S rRNA 基因 A2142G、 A2143G、 A2142C、 A2144T、 G2141A、 A2115G 六种突变型及ACTB内参基因，目标片段克隆 pMD18-T 载体合成，购自 生工生物工程（上海）股份有限公司。
阴性质控：根据试剂盒PCR扩增基因片段序列，人工合成ACTB内参基因，目标片段克隆 pMD18-T载体合成，购自 生工生物工程（上海）股份有限公司。
无模板对照（NTC）: 无菌双蒸水。
7、本发明实施过程如下：
试剂盒组成成份见表2。
表2 试剂盒组成成分表
试剂盒 组成
HP 23S rRNA PCRMix1 Taq酶、dNTP、镁离子、缓冲液、核苷酸SEQ01、核苷酸SEQ08、核苷酸SEQ09、核苷酸SEQ11、核苷酸SEQ12、核苷酸SEQ13；
A2142G突变检测PCR Mix2 Taq酶、dNTP、镁离子、缓冲液、核苷酸SEQ02、核苷酸SEQ08、核苷酸SEQ09、核苷酸SEQ10、核苷酸SEQ11、核苷酸SEQ12、核苷酸SEQ13；
A2143G突变检测PCR Mix3 Taq酶、dNTP、镁离子、缓冲液、核苷酸SEQ03、核苷酸SEQ08、核苷酸SEQ09、核苷酸SEQ10、核苷酸SEQ11、核苷酸SEQ12、核苷酸SEQ13；
A2142C突变检测PCR Mix4 Taq酶、dNTP、镁离子、缓冲液、核苷酸SEQ04、核苷酸SEQ08、核苷酸SEQ09、核苷酸SEQ10、核苷酸SEQ11、核苷酸SEQ12、核苷酸SEQ13；
A2144T突变检测PCR Mix5 Taq酶、dNTP、镁离子、缓冲液、核苷酸SEQ05、核苷酸SEQ08、核苷酸SEQ09、核苷酸SEQ10、核苷酸SEQ11、核苷酸SEQ12、核苷酸SEQ13；
G2141A突变检测PCR Mix6 Taq酶、dNTP、镁离子、缓冲液、核苷酸SEQ06、核苷酸SEQ08、核苷酸SEQ09、核苷酸SEQ10、核苷酸SEQ11、核苷酸SEQ12、核苷酸SEQ13；
A2115G突变检测PCR Mix7 Taq酶、dNTP、镁离子、缓冲液、核苷酸SEQ07、核苷酸SEQ08、核苷酸SEQ09、核苷酸SEQ10、核苷酸SEQ11、核苷酸SEQ12、核苷酸SEQ13；
质控品 阳性质控品、阴性质控品、空白质控品
其中，上表中试剂中的反应缓冲液mix根据表3内容进行配制：
表3试剂配制表
(1)引物浓度的优化 ：在反应体系其它条件相同的情况下，将引物浓度分别从1μM至 10μM 作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳引物浓度是5μM。
(2) 探针浓度的优化 ：在反应体系其他条件相同的情况下，将探针浓度分别从1μM 至 5μM 作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是2.5μM。
(3) 酶的优化 ：在反应体系中加入各种酶，通过对试验结果的分析比较，将酶上样量分别从0.1μL 至 1μL，通过对试验结果的分析比较，确定最佳酶的上样量为0.4μL。
(4) 镁离子浓度的优化 ：在反应体系其它条件相同的情况下， 将 qPCR 反应液组分镁离子浓度分别从 10mM 至 50mM，通过对试验结果的分析比较，确定最佳镁离子浓度是 34mM。
(5) 退火温度的优化 ：在反应体系其它条件相同的情况下，进行梯度 PCR(56-66℃退火温度)，通过对试验结果的分析比较，确定最佳退火温度是 60℃。
经优化，用于检测待测样本中的 23S rRNA 是否突变的 PCR 试剂为1-7 组成 ：
PCR 试剂 1 为 HP 23S rRNA野生型检测管反应体系 ：20μL，由 qPCR 反应缓冲液mix 12.5μL、通用下游引物 1.5μL ( 终浓度 5μM)、HP 23S rRNA 野生型的 ARMS 引物1.5μL( 终浓度 5μM)、通用 TaqMan 探针0.75μL ( 终浓度 2.5μM)、ACTB上游引物1.5μL(终浓度 5μM)、ACTB下游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB TaqMan探针0.75μL( 终浓度 2.5μM)、模板 DNA 5μL (终浓度 10-100 ng/μL) 和水组成。
PCR 试剂 2 为 A2142G突变型检测管反应体系 ：20μL，由 qPCR 反应缓冲液mix12.5μL、通用下游引物 1.5μL ( 终浓度 5μM)、A2142G突变型的 ARMS 引物 1.5μL( 终浓度 5μM)、通用 TaqMan 探针0.5μL ( 终浓度 2.5μM)、阻滞探针 0.5μL ( 终浓度5μM)、ACTB上游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB下游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB TaqMan探针0.5μL( 终浓度 2.5μM)、模板 DNA 5μL (终浓度 10-100 ng/μL) 和水组成。
PCR 试剂 3 为 A2143G突变型检测管反应体系 ：20μL，由 qPCR 反应缓冲液mix12.5μL、通用下游引物 1.5μL ( 终浓度 5μM)、A2143G突变型的 ARMS 引物 1.5μL( 终浓度 5μM)、通用 TaqMan 探针0.5μL ( 终浓度 2.5μM)、阻滞探针 0.5μL ( 终浓度5μM)、ACTB上游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB下游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB TaqMan探针0.5μL( 终浓度 2.5μM)、模板 DNA 5μL (终浓度 10-100 ng/μL) 和水组成。
PCR 试剂 4 为 A2142C突变型检测管反应体系 ：20μL，由 qPCR 反应缓冲液mix12.5μL、通用下游引物 1.5μL ( 终浓度 5μM)、A2142C突变型的 ARMS 引物 1.5μL( 终浓度 5μM)、通用 TaqMan 探针0.5μL ( 终浓度 2.5μM)、阻滞探针 0.5μL ( 终浓度5μM)、ACTB上游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB下游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB TaqMan探针0.5μL( 终浓度 2.5μM)、模板 DNA 5μL (终浓度 10-100 ng/μL) 和水组成。
PCR 试剂 5 为 A2144T突变型检测管反应体系 ：20μL，由 qPCR 反应缓冲液mix12.5μL、通用下游引物 1.5μL ( 终浓度 5μM)、A2144T突变型的 ARMS 引物 1.5μL( 终浓度 5μM)、通用 TaqMan 探针0.5μL ( 终浓度 2.5μM)、阻滞探针 0.5μL ( 终浓度5μM)、ACTB上游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB下游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB TaqMan探针0.5μL( 终浓度 2.5μM)、模板 DNA 5μL (终浓度 10-100 ng/μL) 和水组成。
PCR 试剂 6 为 G2141A突变型检测管反应体系 ：20μL，由 qPCR 反应缓冲液mix12.5μL、通用下游引物 1.5μL ( 终浓度 5μM)、G2141A突变型的 ARMS 引物 1.5μL( 终浓度 5μM)、通用 TaqMan 探针0.5μL ( 终浓度 2.5μM)、阻滞探针 0.5μL ( 终浓度5μM)、ACTB上游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB下游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB TaqMan探针0.5μL( 终浓度 2.5μM)、模板 DNA 5μL (终浓度 10-100 ng/μL) 和水组成。
PCR 试剂 7 为 A2115G突变型检测管反应体系 ：20μL，由 qPCR 反应缓冲液mix12.5μL、通用下游引物 1.5μL ( 终浓度 5μM)、A2115G突变型的 ARMS 引物 1.5μL( 终浓度 5μM)、通用 TaqMan 探针0.5μL ( 终浓度 2.5μM)、阻滞探针 0.5μL ( 终浓度5μM)、ACTB上游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB下游引物1.5μL( 终浓度 5μM)、ACTB TaqMan探针0.5μL( 终浓度 2.5μM)、模板 DNA 5μL (终浓度 10-100 ng/μL) 和水组成。
8、储存条件及有效期
试剂盒在-20±5℃存储，有效期为12个月；开封后有效期为6个月；反复冻融3次有效。
9、适用仪器
ABI 7500荧光PCR仪
10、样本要求
样本类型：粪便样本， 取样量在1g~10g之间。
取样要求：粪便样本为水样便时请勿采样；采样前 24 h 内，请避免食用过度油腻的食物。
样本保存：用细胞保存液保存的样本可在室温下保存和运输，总时间不应超过 15天；若不能及时处理，可于-20 ℃±5 ℃保存 6 个月或-80 ℃±5 ℃保存 12 个月，冻融次数不超过 4 次。
11、检验方法
（1）试剂准备
从试剂盒中取出PCR反应液，室温解冻，充分融化后，轻轻振荡混匀，并作短暂离心备用。
根据待检样本数（n），计算需要的反应数为n+3（阴性质控品、阳性质控品、无模板对照），每个反应分装PCR反应液各20μL。
（2）核酸提取
参考所购买的商用试剂盒说明书进行操作核酸提取或纯化。
（3）加样
加样：在准备好试剂的PCR反应管中分别加入待测样本核酸。每个PCR反应中各加5μL 核酸，如表4，盖紧管盖后，瞬时低速离心。注意：密封后的PCR板可在2-8°C最多放置4小时。
表4 PCR Mix与样本混合情况表
加入组分 体积（μL） 说明 采集荧光
PCR Mix 1-7 20 *（反应数+损耗） FAM、JOE
DNA模板 5 样本DNA/质控品/纯化水 -
总体积 25 每个PCR管加入20μL混合液+5μL模板 -
（4）PCR扩增
样本设置：根据样本类型设置样本编号，PCR仪的8联排加样布局见表5。表中PC代表阳性质控品(Positive Control)，NC代表阴性质控品(Negative Control) ，NTC代表无模板对照(No Template Control) ，S代表检测样本(sample)。
表5 8联排加样布局表
8联排管 1 2 3 4
A S1-1 S2-1 S3-1 ……
B S1-2 S2-2 S3-2 ……
C S1-3 S2-3 S3-3 ……
D S1-4 S2-4 S3-4 ……
E S1-5 S2-5 S3-5 ……
F S1-6 S2-6 S3-6 ……
G S1-7 S2-7 S3-7 ……
H PC NC NTC ……
荧光通道选择：目的基因每个样本选择FAM通道，ACTB基因每个样本选择JOE通道;参比荧光（Passive Reference）设置为none。
反应条件设定（反应体积设定为25μL），见表6。
表6 反应条件表
X为荧光检测时刻。
保存文件，运行程序。
（5）结果分析
反应结束后自动保存结果，使用仪器配套软件自动分析结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在2～8、End 值可设在10～20，荧光阈值（Threshold）设定原则以阈值线刚好超过阴性质控品品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值显示为undet），点击Analysis自动获得分析结果。
（6）结果判定
PCR反应有效性判定
用质控品验证 PCR 反应的有效性：阳性质控品和阴性质控品的 PCR均满足表7的参数要求时，则认为本次 PCR 反应有效。
表7 PCR反应有效性参数信息
阴性、阳性质控Ct值合格之后方可对待测样本结果进行判定，见表8。
待测样本的JOE通道应有信号且Ct值＜38，若Ct值≥38 或无扩增，则建议重新提取DNA或重新取样。待测样本HP 23S rRNA PCR 反应孔的FAM通道若Ct值≥37 或无扩增，说明该样本无幽门螺杆菌感染；若FAM通道有明显信号且Ct值＜37，说明该样本存在幽门螺杆菌感染，则进行后续突变结果的判断。
表8 PCR 反应有效性参数信息
突变结果的判断：确定待测样本六个突变检测反应孔（A2142G突变检测反应孔、A2143G突变检测反应孔、 A2142C突变检测反应孔、 A2144T突变检测反应孔、 G2141A突变检测反应孔和A2115G突变检测反应孔）的FAM通道Ct值（Ct值≤42）与ACTB的JOE通道Ct值（Ct值≤38），计算Δ Ct（Δ Ct=突变检测反应孔Ct值-内参反应孔Ct值）。通过比较Δ Ct与cut-off Δ Ct值之间的关系来判读结果，如表9所示进行判断。
表9 突变结果判断表
12、检测系统设计
基于上述试剂盒实用流程，设计一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的系统，其特征在于，包括采集模块、扩增模块、荧光检测模块和数据分析模块；
采集模块用于对待测粪便样本进行待测核酸样本提取；
扩增模块用于针对23S rRNA 基因及其A2142G、A2143G、A2142C、A2144T、G2141A和A2115G 突变型分别配制反应体系并进行ARMS-qPCR扩增，反应体系包括引物探针组；
荧光检测模块用于对ARMS-qPCR扩增时进行荧光检测；
数据分析模块用于对荧光检测的结果进行分析。
实施例1
收集临床病理诊断为幽门螺杆菌阳性的25例患者(患者知情，编号为S1-S25) 的粪便样本，从粪便样本中提取基因组 DNA。测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于10ng/μL；OD260nm/OD280nm＝1.6-2.1。在临床病理诊断为幽门螺杆菌阳性的25例患者中共检测出5例23S rRNA的A2143G 突变型阳性样本、23S rRNA的A2142G突变型突变阳性样本2例，23SrRNA的 A2142C 突变型突变阳性样本1例，23S rRNA 的 A2144T 突变型突变阳性样本1例，23S rRNA 的 G2141A 突变型突变阳性样本1例，23S rRNA的A2115G突变型突变阳性样本1例，A2142G、A2143G、A2142C、A2144T、G2141A和A2115G 突变型扩增曲线图见图1-6。以上结果经一代测序验证，结果一致，具体数据见表10。
表10 25例幽门螺杆菌患者检测结果表
患者 HP 23SrRNACt值 幽门螺杆菌阳性 A2142GCt值 A2143GCt值 A2142CCt值 A2144TCt值 G2141ACt值 A2115GCt值 ACTBCt值 ΔCt 突变检测结果 一代测序检测结果 比对结果
1 29.84 阳性 \ \ \ \ \ \ 27.36 \ 阴性 阴性 一致
2 26.54 阳性 28.25 \ \ \ \ \ 24.65 3.60 阳性 阳性 一致
3 30.52 阳性 \ \ \ \ \ \ 29.36 \ 阴性 阴性 一致
4 24.15 阳性 \ 26.85 \ \ \ \ 21.58 5.27 阳性 阳性 一致
5 28.65 阳性 \ \ \ \ \ \ 26.35 \ 阴性 阴性 一致
6 23.24 阳性 \ \ \ \ \ \ 27.58 \ 阴性 阴性 一致
7 27.52 阳性 \ 28.46 \ \ \ \ 26.46 2.00 阳性 阳性 一致
8 23.65 阳性 \ \ \ \ \ \ 29.78 \ 阴性 阴性 一致
9 22.42 阳性 \ 29.35 \ \ \ \ 26.54 2.81 阳性 阳性 一致
10 28.15 阳性 \ \ \ \ \ \ 25.12 \ 阴性 阴性 一致
11 29.64 阳性 29.65 \ \ \ \ \ 29.45 0.20 阳性 阳性 一致
12 21.58 阳性 \ \ \ \ \ \ 28.65 \ 阴性 阴性 一致
13 22.52 阳性 \ \ \ \ \ \ 30.84 \ 阴性 阴性 一致
14 29.63 阳性 \ \ \ \ \ \ 29.56 \ 阴性 阴性 一致
15 21.35 阳性 \ 27.56 \ \ \ \ 22.87 4.69 阳性 阳性 一致
16 23.56 阳性 \ \ \ \ \ \ 29.65 \ 阴性 阴性 一致
17 22.89 阳性 \ \ \ \ 35.42 \ 30.24 5.18 阳性 阳性 一致
18 34.24 阳性 \ \ \ \ \ \ 29.32 \ 阴性 阴性 一致
19 36.23 阳性 \ 32.54 \ \ \ \ 30.45 2.09 阳性 阳性 一致
20 24.15 阳性 \ \ 35.62 \ \ \ 31.25 4.37 阳性 阳性 一致
21 28.45 阳性 \ \ \ \ \ 34.12 29.62 4.50 阳性 阳性 一致
22 27.15 阳性 \ \ \ \ \ \ 28.36 \ 阴性 阴性 一致
23 24.65 阳性 \ \ \ \ \ \ 29.35 \ 阴性 阴性 一致
24 29.65 阳性 \ \ \ 32.51 \ \ 30.12 2.39 阳性 阳性 一致
25 23.14 阳性 \ \ \ \ \ 29.45 \ 阴性 阴性 一致
上述结果表明应用本发明的引物、探针检测粪便样本23S rRNA基因突变灵敏度高，可无创检测临床样本中的微量突变模板 (≥0.1ng )，结果可靠，与突变检测“金标准”直接测序法的结果符合率＞ 95％ ( 为 100％ )。 此外该方法检测速度快，操作简单，结果判读客观，闭管反应污染少，非常适合于在临床中大规模开展。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组，其特征在于，包括如SEQID NO.1-SEQ ID NO.7所示核酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.8所示核酸序列的通用下游引物、如SEQ ID NO.9所示核酸序列的通用探针和如SEQ ID NO.10所示核酸序列的阻滞探针。
2.根据权利要求1所示的用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组，其特征在于，还包括如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.13所示核酸序列的ACTB内参基因引物和探针。
3.根据权利要求1所示的用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组，其特征在于，用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的基因为23S rRNA 基因及其A2142G、A2143G、A2142C、A2144T、G2141A和A2115G 突变型。
4.一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的引物探针组。
5.根据权利要求4所述的用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的试剂盒，其特征在于，包括浓度为5μM的各上游引物和通用下游引物、浓度为2.5μM的通用探针、ACTB内参基因探针及阻滞探针和PCR反应缓冲液。
6.一种用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的系统，其特征在于，包括采集模块、扩增模块、荧光检测模块和数据分析模块；
所述采集模块用于对待测粪便样本进行待测核酸样本提取；
所述扩增模块用于针对23S rRNA 基因及其A2142G、A2143G、A2142C、A2144T、G2141A和A2115G 突变型分别配制反应体系并进行ARMS-qPCR扩增，所述反应体系包括权利要求1-3任一所述引物探针组；
所述荧光检测模块用于对ARMS-qPCR扩增时进行荧光检测；
所述数据分析模块用于对荧光检测的结果进行分析。
7.根据权利要求6所述的用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的系统，其特征在于，所述数据分析模块包括分型判定单元和耐药突变类型判定单元；
所述分型判定单元用于根据待测样本检测内参基因的JOE通道Ct值和检测目的基因的FAM通道Ct值进行幽门螺旋杆菌分型；若JOE通道有信号且其Ct值＜38并且FAM通道Ct值≥37或无扩增，则待测样本为阴性，若JOE通道有信号且其Ct值＜38并且FAM通道有信号且Ct值＜37，则待测样本为阳性；
所述耐药突变类型判定单元用于若待测样本为阳性，则根据FAM通道Ct值和JOE通道Ct值进行耐药突变类型判定；耐药突变类型判定包括确定FAM通道Ct值≤42且扩增曲线为"S"型和JOE通道Ct值≤38且扩增曲线为"S"型，计算FAM通道Ct值与JOE通道Ct值的差值，若该差值小于该FAM通道检测突变类型的cut-offΔCt值，则该待测样本为阳性；若FAM通道无信号、其Ct值大于等于42或该差值大于等于该FAM通道检测突变类型的cut-offΔCt值，则该待测样本为阴性。
8.根据权利要求6所述的用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的系统，其特征在于，所述扩增模块中ARMS-qPCR扩增的反应程序为：50℃、5min，UNG酶消化；95℃、10min活化；95℃、15s，65℃、5s，60℃、35s，循环45次；25℃、10s，降温。
9.权利要求1-3任一所述用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的引物探针组在制备检测克拉霉素耐药基因及突变型试剂或芯片中的应用。
10.权利要求4或5所述用于检测幽门螺旋杆菌分型与耐药突变的试剂盒在制备检测克拉霉素耐药基因及突变型试剂或芯片中的应用。
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