CN116875712A - 一种基于荧光标记毛细管电泳的结核分枝杆菌复合群多靶位检测系统 - Google Patents

一种基于荧光标记毛细管电泳的结核分枝杆菌复合群多靶位检测系统 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于荧光标记毛细管电泳的结核分枝杆菌复合群（MTBC）多靶位检测系统，所述的多靶位包括MTBC三种管家基因IS6110、rpoB和HSP65。本发明首次采用IS6110、rpoB和HSP65作为一个组合用于MTBC的联合检测，并采用国家参考品对检测系统的性能进行评价，包括符合率、最低检出限、特异性、重复性和抗干扰能力，该检测系统各项性能均达标。本发明为结核病分子检测提供了一种更全面的检测手段，有助于减少结核病的误诊和漏诊。

Description

一种基于荧光标记毛细管电泳的结核分枝杆菌复合群多靶位 检测系统
技术领域
本发明属于医学诊断技术领域，具体而言，涉及一种基于荧光标记毛细管电泳的结核分枝杆菌复合群多靶位检测系统。
背景技术
结核病是威胁人类健康的重大疾病之一。根据世界卫生组织《2022年全球结核病报告》，2021年估计有1060万人患结核病，患病人数比2020年增加4.5%，共有160万人死于结核病（包括18.7万艾滋病毒阳性者）。早诊断是减少结核病发病和死亡的关键环节，诊断的滞后导致个体化治疗的延误和结核分枝杆菌的传播。结核病分子生物学诊断技术因其检测快速，能够为临床提供时效性检测结果，现已广泛应用于结核病诊断。
结核病分子生物学诊断技术是以临床标本为检测对象，结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）相关基因为诊断标志物，完成对标本中是否含有MTBC核酸的一系列检测方法。目前，MTBC病原学诊断的主要靶标为基因组中特有保守的管家基因，常用的靶标基因包括16SrRNA、IS6110、HSP65和rpoB基因等。然而目前在用的所有结核病分子检测系统均只检测单一基因，这在一定程度上容易引起结核病的误诊。同时，在临床检测实验室通常只采用一种结核病分子检测系统用于常规检测，当引物结合区出现点突变或其他类型的突变时，将引起MTBC检测的假阴性，从而导致结核病的漏诊。针对现有结核病分子生物学诊断技术的不足，亟需研发一种操作简便、价格低廉、可用于临床标本直接检测且检测位点高通量的实验方法。
荧光标记毛细管电泳技术系采用不同颜色的荧光染料标记引物，将扩增的PCR产物在毛细管泳道电泳，利用软件进行图像收集和分析扩增片段大小。荧光标记毛细管电泳技术最大可分离1000个碱基对(Base pair, bp)的DNA片段，可以将只差1个bp的DNA片段进行分离，同时还具有以下优点：①省时省力；②数据自动化处理，降低人为误差，准确计算扩增片段大小；③不同批次反应数据也可统一处理；④可以进行样品高通量、位点高通量的检测。总之，荧光标记毛细管电泳具有通量高、效率高、精密度高和重复性好等特点。目前，荧光标记毛细管电泳技术已广泛应用在简单重复序列检测、微卫星序列检测和细胞系鉴定等领域,在结核分枝杆菌复合群检测方面研究未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于构建基于荧光标记毛细管电泳的MTBC多靶位检测系统,对MTBC三种管家基因IS6110、rpoB和HSP65进行联合检测，为结核病分子检测提供一种更全面的检测手段，减少结核病的误诊和漏诊。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案内容如下：
本发明人首先使用多序列比对工具网站筛选MTBC三种管家基因IS6110、rpoB和HSP65的特异性序列，利用引物设计软件设计特异性引物，并根据扩增子大小采用不同荧光分子进行标记，最终成功设计3对特异性引物，所述的3对引物的核苷酸序列分别为：
MTBC-rpoB
rpoB-F:5’ 6-FAM-CCAATTCATGGACCAGAACAA 3’
rpoB-R:5’ TACACGATCTCGTCGCTAACC 3’
MTBC-IS6110
IS6110-F:5’ TAMRA-TACGGTGCCCGCAAAGTG 3’
IS6110-R:5’ AGGCGTCGGTGACAAAGG 3’
MTBC-HSP65
HSP65-F:5’ 6-FAM-AGCGATTTCGGCGGGTGA 3’
HSP65-R:5’ TCTTGTTGACGACCAGGGTG 3’
上述的rpoB-F、IS6110-F和HSP65-F中的“-F”均指相应的管家基因5’端荧光基团修饰的正向引物，而rpoB-R、IS6110-R和HSP65-R中的“-R”均指相应的管家基因5’端的反向引物。
为了保证检测系统的特异性，本发明人首先查询MTBC和鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、猿分枝杆菌、土地分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌20种常见非结核分枝杆菌的IS6110、rpoB和HSP65编码基因序列，采用ClustalOmega进行序列比对，获得MTBC在IS6110、rpoB和HSP65三个编码基因的特异性序列，并应用Blast验证序列的特异性；随后，在引物设计初步完成后再应用Primer Blast验证引物序列的特异性。通过以上两个步骤，确保检测系统对于MTBC的特异性。
本发明还提供一种利用上述特异性引物组的MTBC多靶位检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
① 提取疑似MTBC菌液的DNA；
② 以步骤①提取的DNA为模板，利用设计的特异性引物组进行多重PCR扩增；
③ 将步骤②中所获得的PCR产物进行毛细管电泳；
④ 对步骤③的毛细管电泳结果进行分析，实现对MTBC的多靶位检测。
其中，步骤①DNA提取的方法采用改良Chelex-100法：该方法简单，快速，不涉及有机溶剂，并且不需要多次转移试管，可最大程度避免转管过程中菌量的丢失。同时，考虑到MTBC细胞壁的脂质含量较高，为提高DNA提取效率，在DNA提取过程中添加10ul蛋白酶K（10mg/ml）。提取的DNA用NanoDrop One仪器检测DNA的质量和浓度，将合格的DNA置于-20℃冰箱保存、备用。
其中，步骤②的多重PCR扩增反应体系采用50μL：8μL MgCl2（25mmol/L），5μL PCRBuffer（不含Mg2+），2μL Taq酶（5U/μL），1μL dNTP（10mmol/L），5μL 50ng/μLDNA模板，各0.5μL 10μM/μL的荧光修饰正向引物，各0.5μL 10μM/μL的反向引物，26μL ddH2O补足50μL体系；多重PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火1min、72 ℃延伸1min、共35个循环，72℃充分延伸1min，4℃保存。
其中，步骤③采用以下具体操作进行毛细管电泳：取1μL多重PCR扩增产物、9μL预混液Mix：LIZ 500分子量内标与HiDi缓冲液按1:130的混匀液，混合加入96孔PCR板中，金属浴加热99℃预变性3min，-20℃冷却后，使用3130 DNA测序仪进行毛细管电泳。
其中，步骤④中使用Gene mapper 3.2软件进行数据整理和图像分析，将毛细管电泳检测结果进行四舍五入后，可以一次性检测MTBC三种管家基因IS6110、rpoB和HSP65：
MTBC-rpoB对应的扩增片段大小为270bp；
MTBC-IS6110对应的扩增片段大小为271bp；
MTBC-HSP65对应的扩增片段大小为346bp。
本发明还采用结核分枝杆菌 PCR 检测试剂盒用国家参考品（中国食品药品检定研究院，中国）对构建的多靶位检测系统的性能进行评价，包括符合率、最低检出限、特异性和重复性。同时，选取弱阳性样本，分别加入干扰物质溶液（包括血液、脓、白细胞和血红蛋白），评估该检测系统的抗干扰能力。结果显示，该检测系统阴性符合率和阳性符合率均为100%，最低检出限浓度为1×102个菌/mL。对浓度为1×102个菌/mL的样本进行10次重复检测，结果均为阳性。采用该系统检测13种常见非结核分枝杆菌培养物菌株及32种临床常见呼吸道病原菌，结果均为阴性。同时，该检测系统不受血液、脓、白细胞和0.2%血红蛋白等的干扰。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
① 本发明成功构建基于荧光标记毛细管电泳的MTBC多靶位检测系统,可以一次性检测MTBC三种管家基因IS6110、rpoB和HSP65。同时，本发明对该检测系统的性能进行了评价，包括符合率、最低检出限、特异性、重复性和抗干扰能力，该检测系统各项性能均达标。综上，本发明为结核病分子检测提供一种更全面的检测手段，有助于减少结核病的误诊和漏诊。
② 本发明通过查询MTBC和20种常见非结核分枝杆菌的IS6110、rpoB和HSP65编码基因序列，进行序列比对，获得MTBC在这三个基因的特异性序列，并应用Blast验证序列的特异性；随后，在引物设计初步完成后再应用Primer Blast验证引物序列的特异性。通过以上两个步骤，保证该检测系统对于MTBC的高特异性。
附图说明
图1是H37RV毛细管电泳检测结果；
图2是IS6110测序结果与标准序列的比对；
图3是rpoB测序结果与标准序列的比对；
图4是HSP65测序结果与标准序列的比对；
图5是国家参考品中阴性参考品检测结果示例；
图6是国家参考品中阳性参考品检测结果示例；
图7是国家参考品S1检测结果；
图8是国家参考品S2检测结果；
图9是国家参考品S3检测结果；
图10是国家参考品S4检测结果；
图11是国家参考品特异性检测结果示例；
图12是国家参考品重复性检测结果示例；
图13是抗干扰能力检测结果（血液）；
图14是抗干扰能力检测结果（脓）；
图15是抗干扰能力检测结果（白细胞）；
图16是抗干扰能力检测结果（血红蛋白）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；各实施例中所用生物、化学试剂，如无特殊说明，均为常规试剂，均可通过商购获得。
实施例1 基于荧光标记毛细管电泳的MTBC多靶位检测用特异性引物组的构建
该特异性引物组由3对引物组成，所述的引物的构建过程为：
① 特异性序列筛选
登录数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）,查询MTBC和鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、猿分枝杆菌、土地分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌等20种常见NTM病原体的IS6110、rpoB和HSP65编码基因序列，采用Clustal Omega进行序列比对，获得MTBC在IS6110、rpoB和HSP65三个编码基因的特异性序列，并应用Blast验证序列的特异性。
② 引物设计
应用Primer Premier 5在三个基因的特异性序列段设计引物组合，引物设计原则：①引物长度一般在15-30 bp之间；②GC含量在40%-60%之间；③引物序列在模板内应当没有相似性较高的序列；④引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右；⑤避免引物二聚体、发夹结构的形成。随后应用Primer Blast验证引物序列的特异性。引物设计完成后应考虑特异性引物的配对上游引物或配对下游引物在MTBC三个基因中的错配情况。如存在错配，应考虑通用引物的可行性。如果不行，则应重新设计引物。最终成功设计3对特异性引物，并根据扩增子大小采用不同荧光分子进行标记，所述的3对引物的核苷酸序列分别为：
MTBC-rpoB
rpoB-F:5’ 6-FAM-CCAATTCATGGACCAGAACAA 3’
rpoB-R:5’ TACACGATCTCGTCGCTAACC 3’
MTBC-IS6110
IS6110-F:5’ TAMRA-TACGGTGCCCGCAAAGTG 3’
IS6110-R:5’ AGGCGTCGGTGACAAAGG 3’
MTBC-HSP65
HSP65-F:5’ 6-FAM-AGCGATTTCGGCGGGTGA 3’
HSP65-R:5’ TCTTGTTGACGACCAGGGTG 3’
上述的rpoB-F、IS6110-F和HSP65-F中的“-F”均指相应的管家基因5’端荧光基团修饰的正向引物，而rpoB-R、IS6110-R和HSP65-R中的“-R”均指相应的管家基因5’端的反向引物。
实施例2 一种基于荧光标记毛细管电泳的MTBC多靶位检测方法及验证。
该方法包括以下步骤：
① 提取疑似MTBC菌液的DNA
采用改良Chelex-100法提取DNA，具体操作步骤如下：
a.取1mL菌液置于1.5mL离心管中，13000转/分，离心3分钟。
b.去上清液，留下底部沉淀物。
c.加入200ul，5％的Chelex-100，再加入10ul蛋白酶K（10mg/ml）。
d.混匀后，离心管置56℃水浴至少6－8小时或过夜。
e.取出离心管，快速振荡10秒钟。
f.置沸水中煮沸8分钟。
g.取出离心管，快速振荡10秒钟，13000转/分，离心3分钟。
h.提取的DNA存在于上清液中。
该方法简单，快速，不涉及有机溶剂，并且不需要多次转移试管，可最大程度避免转管过程中菌量的丢失。提取的DNA用NanoDrop One仪器检测DNA的质量和浓度，将合格的DNA置于-20℃冰箱保存、备用。
② 以步骤①提取的DNA为模板，利用设计的特异性引物组进行多重PCR扩增
多重PCR扩增反应体系采用50μL：8μL MgCl2（25mmol/L），5μL PCR Buffer（不含Mg2 +），2μL Taq酶（5U/μL），1μL dNTP（10mmol/L），5μL 50ng/μLDNA模板，各0.5μL 10μM/μL的荧光修饰正向引物，各0.5μL 10μM/μL的反向引物，26μL ddH2O补足50μL体系；多重PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火1min、72 ℃延伸1min、共35个循环，72℃充分延伸1min，4℃保存。
③ 将步骤②中所获得的PCR产物进行毛细管电泳
取1μL多重PCR扩增产物、9μL预混液Mix：LIZ 500分子量内标与HiDi缓冲液按1:130的混匀液，混合加入96孔PCR板中，金属浴加热99℃预变性3min，-20℃冷却后，使用3130DNA测序仪进行毛细管电泳。
④ 对步骤③的毛细管电泳结果进行分析，实现对MTBC的多靶位检测
使用Gene mapper 3.2软件进行数据整理和图像分析，将毛细管电泳检测结果进行四舍五入后，可以一次性检测MTBC三种管家基因IS6110、rpoB和HSP65：
MTBC-rpoB对应的扩增片段大小为270bp；
MTBC-IS6110对应的扩增片段大小为271bp；
MTBC-HSP65对应的扩增片段大小为346bp。
以结核分枝杆菌标准株H37RV（ATCC 27294）对该检测方法进行验证，毛细管电泳检测结果见图1，提示该检测方法可行。为进一步验证该检测方法的可靠性，本发明人对结核分枝杆菌标准株H37RV经多重PCR扩增后的产物进行测序（上海生工，中国），测序区间包括MTBC三种管家基因IS6110、rpoB和HSP65的对应扩增区域，测序结果与标准序列的对比见图2至图4，结果显示，在IS6110、rpoB和HSP65三种管家基因中，扩增片段大小均与预期一致，且序列一致性依次为99.3%、99.3%和98.8%。
实施例3 MTBC多靶位检测系统的性能评价
① 符合率。符合率包括阴性符合率和阳性符合率。购买结核分枝杆菌 PCR 检测试剂盒用国家参考品（中国食品药品检定研究院，中国），对其中阴性参考品（编号：N1-N15）和阳性参考品（编号：P1-P15）采用构建的多重检测系统进行检测，随后计算阴性符合率和阳性符合率。检测结果示例分别见图5和图6，经计算，该多重检测系统的阴性符合率和阳性符合率均为100%。
② 最低检出限。选用结核分枝杆菌 PCR 检测试剂盒用国家参考品（中国食品药品检定研究院，中国）中最低检出限参考品（编号：S1-S4），采用构建的多重检测系统进行检测，确定最低检出限浓度。随后对该浓度参考品进行20次重复测定。参考品检测结果见图7至图10，可见该检测系统最低检出限浓度为1×102个菌/mL。随后对该浓度参考品进行20次重复测定，检出19次靶核酸，符合说明书至少检出18次靶核酸的要求。
③ 特异性。选取鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、猿分枝杆菌、土地分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、细胞旁分枝杆菌、洲分枝杆菌、耐热分枝杆菌、转黄分枝杆菌和哥伦比亚分枝杆菌25种NTM培养物菌株及41种临床常见呼吸道病原菌，具体菌种见表1，分别加入样本保存液，提取DNA并调整终浓度至106拷贝数/mL，采用构建的多重检测系统进行检测，对其检测特异性进行评估。检测结果均为阴性，检测结果示例见图11，说明该检测系统特异性良好。
表1 用于检测特异性的菌种
序号 菌种名称 序号 菌种名称 序号 菌种名称
1 鸟分枝杆菌 23 耐热分枝杆菌 45 流感嗜血杆菌
2 胞内分枝杆菌 24 转黄分枝杆菌 46 副流感嗜血杆菌
3 脓肿分枝杆菌 25 哥伦比亚分枝杆菌 47 化脓性链球菌
4 龟分枝杆菌 26 鼻疽诺卡氏菌 48 唾液链球菌
5 偶发分枝杆菌 27 豚鼠诺卡氏菌 49 伤寒杆菌
6 海分枝杆菌 28 屎肠球菌 50 鲍氏志贺菌
7 溃疡分枝杆菌 29 粪肠球菌 51 格氏李斯特菌
8 堪萨斯分枝杆菌 30 鸟肠球菌 52 缓症链球菌
9 胃分枝杆菌 31 肺炎链球菌 53 无乳链球菌
10 戈登分枝杆菌 32 金黄色葡萄球菌 54 白色念珠菌
11 蟾蜍分枝杆菌 33 表皮葡萄球菌 55 卡他莫拉菌
12 玛尔摩分枝杆菌 34 腐生葡萄球菌 56 淋病奈瑟菌
13 嗜血分枝杆菌 35 头状葡萄球菌 57 福氏志贺菌
14 瘰疬分枝杆菌 36 溶血葡萄球菌 58 铜绿假单胞菌
15 耻垢分枝杆菌 37 粪产碱杆菌 59 醋酸钙不动杆菌
16 苏尔加分枝杆菌 38 嗜麦芽窄食单胞菌 60 粘质沙雷菌
17 猿分枝杆菌 39 大肠埃希菌 61 肺炎克雷伯菌
18 土地分枝杆菌 40 阴沟肠杆菌 62 弗式柠檬酸杆菌
19 隐藏分枝杆菌 41 产气肠杆菌 63 摩氏摩根菌
20 日内瓦分枝杆菌 42 奇异变形杆菌 64 藤黄微球菌
21 细胞旁分枝杆菌 43 普通变形杆菌 65 星形诺卡氏菌
22 洲分枝杆菌 44 鲍曼不动杆菌 66 巴西诺卡氏菌
④ 重复性。选用结核分枝杆菌 PCR 检测试剂盒用国家参考品（中国食品药品检定研究院，中国）中重复性参考品（编号：J1-J10），采用构建的多重检测系统进行检测，评估检测系统重复性。10次检测结果均为阳性，检测结果示例见图12，说明该检测系统重复性良好。
⑤ 抗干扰能力。选取200CFU/mL的MTB标准菌株H37RV，采用构建的多重检测系统进行检测，随后分别加入干扰物质溶液[包括5%最终样品浓度（血液、脓和白细胞）和0.2%(血红蛋白)]后再次检测，至少重复测定 3 次以上，观察上述任何一种潜在的干扰物质是否有抑制作用。检测结果见图13至图16，可见上述任何一种潜在的干扰物质对构建的多重检测系统均无抑制作用。

Claims (9)

1.一种检测结核分枝杆菌复合群（MTBC）的多靶位检测系统，其特征在于，所述的多靶位包括MTBC三种管家基因IS6110、rpoB和HSP65,所述的检测系统基于荧光标记毛细管电泳技术。
2.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌复合群的多靶位检测系统，其特征在于，包括以下步骤：①提取疑似MTBC菌液的DNA；②以步骤①提取的DNA为模板，利用设计的特异性引物组进行多重PCR扩增；③将步骤②中所获得的PCR产物进行毛细管电泳；④对步骤③的毛细管电泳结果进行分析，实现对MTBC的多靶位检测。
3.根据权利要求2所述的检测结核分枝杆菌复合群的多靶位检测系统，其特征在于，步骤①DNA提取的方法采用改良Chelex-100法：该方法简单，快速，不涉及有机溶剂，并且不需要多次转移试管，可最大程度避免转管过程中菌量的丢失，同时，考虑到MTBC细胞壁的脂质含量较高，为提高DNA提取效率，在DNA提取过程中添加10ul蛋白酶K（10mg/ml），提取的DNA用NanoDrop One仪器检测DNA的质量和浓度，将合格的DNA置于-20℃冰箱保存、备用。
4.根据权利要求2所述的检测结核分枝杆菌复合群的多靶位检测系统，其特征在于，步骤②所述的特异性引物组依据如权利要求1所述的MTBC三种管家基因IS6110、rpoB和HSP65设计，可分别与管家基因IS6110、rpoB和HSP65特异性结合，其中正向引物均带有荧光基团，所述的荧光基团为6-FAM和TAMRA，反向引物未加荧光修饰。
5.根据权利要求2所述的检测结核分枝杆菌复合群的多靶位检测系统，其特征在于，步骤②所述的特异性引物组包括3对引物，所述的3对引物的核苷酸序列分别为：
MTBC-rpoB
rpoB-F:5’ 6-FAM-CCAATTCATGGACCAGAACAA 3’
rpoB-R:5’ TACACGATCTCGTCGCTAACC 3’
MTBC-IS6110
IS6110-F:5’ TAMRA-TACGGTGCCCGCAAAGTG 3’
IS6110-R:5’ AGGCGTCGGTGACAAAGG 3’
MTBC-HSP65
hsp65-F:5’ 6-FAM-AGCGATTTCGGCGGGTGA 3’
hsp65-R:5’ TCTTGTTGACGACCAGGGTG 3’。
6.根据权利要求2所述的检测结核分枝杆菌复合群的多靶位检测系统，其特征在于，步骤②的多重PCR扩增反应体系采用50μL：8μL MgCl2（25mmol/L），5μL PCR Buffer（不含Mg2 +），2μL Taq酶（5U/μL），1μL dNTP（10mmol/L），5μL 50ng/μLDNA模板，各0.5μL 10μM/μL的荧光修饰正向引物，各0.5μL 10μM/μL的反向引物，26μL ddH2O补足50μL体系；多重PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火1min、72 ℃延伸1min、共35个循环，72℃充分延伸1min，4℃保存。
7.根据权利要求2所述的检测结核分枝杆菌复合群的多靶位检测系统，其特征在于，步骤③采用以下具体操作进行毛细管电泳：取1μL多重PCR扩增产物、9μL预混液Mix：LIZ 500分子量内标与HiDi缓冲液按1:130的混匀液，混合加入96孔PCR板中，金属浴加热99℃预变性3min，-20℃冷却后，使用3130 DNA测序仪进行毛细管电泳。
8.根据权利要求2所述的检测结核分枝杆菌复合群的多靶位检测系统，其特征在于，步骤④中使用Gene mapper 3.2软件进行数据整理和图像分析，将毛细管电泳检测结果进行四舍五入后，可以一次性检测MTBC三种管家基因IS6110、rpoB和hsp65：
MTBC-rpoB对应的扩增片段大小为270bp,
MTBC-IS6110对应的扩增片段大小为271bp,
MTBC-HSP65对应的扩增片段大小为346bp。
9.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌复合群的多靶位检测系统，其特征在于，采用结核分枝杆菌 PCR 检测试剂盒用国家参考品（中国食品药品检定研究院，中国）对检测系统的性能进行评价，包括符合率、最低检出限、特异性和重复性，同时，利用干扰物质溶液（包括血液、脓、白细胞和血红蛋白），分析该检测系统的抗干扰能力，该检测系统各项性能均达标。
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