CN111733258B - 一种黑水虻分子鉴定引物、试剂盒和鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黑水虻分子鉴定引物、试剂盒和鉴定方法。109F3：5’‑CCCGGGCTTATTTCACTT‑3’；109B3：5’‑CAATTGATGAATTAGCAAGAACA‑3’；109FIP：5’‑ATGAAGGGTAGCTAATCAACTGAAACAGCTACAATAATTATTGCCGT‑3’；109BIP：5’‑CCTATTCACCCGCAATTATTTGAGCCTCCTGTTAATCCCCCTAC‑3’。本发明的分子鉴定引物，按照本发明的鉴定方法能够鉴定出黑水虻。具有特异性高、操作简单、实施快捷、准确率高的优点。

Description

一种黑水虻分子鉴定引物、试剂盒和鉴定方法
技术领域：
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种黑水虻分子鉴定引物、试剂盒和鉴定方法。
背景技术：
黑水虻(Black soldier fly),Hermetia illucens L.学名亮斑扁角水虻，幼虫营腐食性、发育快速、产生生物量大，同时含有大量的蛋白质、脂肪和矿物质，可用于生产具有较高经济价值的动物饲料。经过多年研究，黑水虻人工饲养的技术已逐渐成熟，且以黑水虻为主体的废弃物生物处理技术发展迅速，如处理餐厨垃圾(Newton，et al.1977；Bondari，et al.1987；St-Hilaire，et al.2007；俞国辉等，2009；张佳鑫等，2019)，又如处理和再利用跨境生物制品(国家重点研发计划2017YFF0210204)。随着黑水虻产业化应用日渐广泛，其产生的大量幼虫以粗虫粉为主要形式，迅速进入饲料产业。黑水虻虫粉与黄粉虫粉，大麦虫粉外观相似，极易混淆，因此在生产应用过程中，虫粉区分成为亟待解决的一大难题，而分子生物学手段，则可以准确迅速的完成生物产品鉴定。
传统的分子生物学鉴定手段，主要通过设计特异性引物，常规PCR的方法完成，常规PCR过程往往需要昂贵的仪器设备、专业的技能型人才、复杂的操作过程、冗长的试验周期等，不能适应基层及现场的快速检测需要，大大限制了相关技术的推广应用，且针对单一位点设计的引物，其结果准确性不高。
2000年，由日本荣研株式会社的N.Tsugunori等人开发了一种新型的核酸等温扩增方法-环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术，利用该技术只需在恒温条件下孵育几十分钟即可快速完成核酸的指数级扩增，无需购置昂贵的PCR仪器，操作简单、快速，产物易于检测，特别适用于基层和现场一线的快速检测。短短几年时间，该技术已经在医疗卫生、食品安全、胚胎鉴定、动植物检验检疫、转基因产品等多个领域的检测中得到了广泛应用(胡成等，2015)。
发明内容：
本发明的目的是提供鉴定黑水虻的分子鉴定引物。
本发明的黑水虻的分子鉴定引物，包括以下任一组引物组：
引物组35：
35F3：5’-ACATAAGTTTCTGGTTACTTCC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
35B3：5’-ATCGCATATTGATTACTGTTGT-3’，如SEQ ID NO.2所示；
35FIP：5’-AGTTCAACCGGTTCCTGCTCCTCTCTCACTCTTTTATTAGCCT-3’，如SEQ ID NO.3所示；
35BIP：5’-CGCTGGTATTGCTCATAGTGGACCCTAAAATTGAAGAAATCCCG-3’，如SEQ IDNO.4所示；
引物组109：
109F3：5’-CCCGGGCTTATTTCACTT-3’，如SEQ ID NO.5所示；
109B3：5’-CAATTGATGAATTAGCAAGAACA-3’，如SEQ ID NO.6所示；
109FIP：5’-ATGAAGGGTAGCTAATCAACTGAAACAGCTACAATAATTATTGCCGT-3’，如SEQ IDNO.7所示；
109BIP：5’-CCTATTCACCCGCAATTATTTGAGCCTCCTGTTAATCCCCCTAC-3’，如SEQ IDNO.8所示；。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定黑水虻的试剂盒，其含有上述黑水虻的分子鉴定引物和LAMP反应试剂。
本发明的第三个目的是提供一种鉴定黑水虻的方法，其是提取待测物的基因组DNA，用上述黑水虻的分子鉴定引物作为引物，待测物的基因组DNA作为模板，经过LAMP反应，然后对扩增产物进行电泳分析，能扩增出条带的待测物则含有黑水虻，无法扩增出条带的待测物则不含有黑水虻。
优选，所述的LAMP反应的反应体系是以25μL计：模板DNA 1.0μL，ddH2O12.5μL，20μmol/L FIP 1.0μL、20μmol/L BIP 1.0μL,10μmol/L F3 0.5μL、10μmol/L B3 0.5μL,10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5μL，10mmol/L dNTP Mixture 3.5μL，50mmol/L MgSO41.5μL，8U/μL BstDNA Polymerase 1.0μL，反应条件为，63℃孵育60min，80℃灭活10min。
本发明的分子鉴定引物，按照本发明的鉴定方法能够鉴定出黑水虻。具有特异性高、操作简单、实施快捷、准确率高的优点。
附图说明：
图1是黑水虻CO1基因LAMP特异性引物对黑水虻虫粉与黄粉虫、大麦虫虫粉的鉴定实验电泳图，其中泳道1-2分别为黑水虻虫体DNA 35、109引物组扩增产物；泳道3-4分别位黑水虻虫粉DNA 35、109引物组扩增产物；泳道5-6分别为阴性对照；泳道7为Marker；泳道8-9分别为黄粉虫虫粉DNA 35、109引物组扩增产物；泳道10-11分别为大麦虫虫粉DNA 35、109引物组扩增产物。
图2是黑水虻虫粉LAMP引物组35的灵敏度检测，其中泳道1为Marker；泳道2-7分别为稀释浓度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的黑水虻虫粉DNA；泳道8为阴性对照。；
图3是黑水虻虫粉LAMP引物组109灵敏度检测，泳道1为阴性对照；泳道2-7分别为稀释浓度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的黑水虻虫粉DNA；泳道8为Marker。
图4是CO1常规PCR灵敏度检测，泳道1为Marker；泳道2-7分别为稀释浓度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的黑水虻虫粉DNA。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例中所用材料说明：
DNA提取：天根生化科技(北京)有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)。
引物合成：生工生物工程上海股份有限公司。
10×Bst DNA Polymerase Buffer：生工生物工程上海股份有限公司。
dNTP Mixture：生工生物工程上海股份有限公司。
MgSO4：生工生物工程上海股份有限公司。
BstDNA Polymerase：生工生物工程上海股份有限公司。
ddH2O：天根生化科技(北京)有限公司。
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1：黑水虻CO1基因LAMP特异性引物对黑水虻虫粉、黄粉虫虫粉、大麦虫虫粉的鉴定实验
DNA提取：参照天根生化科技(北京)有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)。
提取黑水虻虫体、黑水虻虫粉、黄粉虫虫粉和大麦虫虫粉的基因组DNA作为模板。
引物设计与合成：生工生物工程上海股份有限公司。序列如下：
Figure BDA0002550175290000051
反应体系：以25μL计：模板DNA 1.0μL，ddH2O 12.5μL，FIP、BIP(20μmol/L)各1.0μL,F3、B3(10μmol/L)各0.5μL,10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5μL，dNTP Mixture(10mmol/L)3.5μL，MgSO4(50mmol/L)1.5μL，BstDNA Polymerase(8U/μL)1.0μL，混匀后轻微离心。反应条件为，63℃孵育60min，80℃灭活10min。以黑水虻虫体DNA为阳性对照，ddH2O为阴性对照。
结果判断：扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
实验结果：
由图1可见，35、109两个引物组在黑水虻虫体DNA及黑水虻虫粉DNA中的扩增清晰可见。而在黄粉虫虫粉DNA和大麦虫虫粉DNA，无扩增引物。
实施例2：
灵敏度检测：将实施例1提取的黑水虻虫粉DNA模板(0.52μg/μl)以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释梯度进行稀释，分别进行LAMP(方法同实施例1)和常规CO1基因PCR(CO1常规PCR引物序列：1490F：5’-GGTCAACAAATCTAAAGATATTGG-3’，2198R：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’，模板是黑水虻虫粉DNA模板)，比较两种方法的灵敏度。
实验结果如图2、3、4所示，检测结果表明，LAMP引物灵敏度要好于常规PCR引物，其中LAMP引物组35的灵敏度是常规PCR的100倍。
序列表
<110> 广东省生物资源应用研究所
<120> 一种黑水虻分子鉴定引物、试剂盒和鉴定方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acataagttt ctggttactt cc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcgcatatt gattactgtt gt 22
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agttcaaccg gttcctgctc ctctctcact cttttattag cct 43
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgctggtatt gctcatagtg gaccctaaaa ttgaagaaat cccg 44
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccgggctta tttcactt 18
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caattgatga attagcaaga aca 23
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaagggta gctaatcaac tgaaacagct acaataatta ttgccgt 47
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctattcacc cgcaattatt tgagcctcct gttaatcccc ctac 44

Claims (4)

1.一种黑水虻的分子鉴定LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组的核苷酸序列如下所示：
F3：5’-ACATAAGTTTCTGGTTACTTCC-3’；
B3：5’-ATCGCATATTGATTACTGTTGT-3’；
FIP：5’-AGTTCAACCGGTTCCTGCTCCTCTCTCACTCTTTTATTAGCCT-3’；
BIP：5’-CGCTGGTATTGCTCATAGTGGACCCTAAAATTGAAGAAATCCCG-3’。
2.一种鉴定黑水虻的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的黑水虻的分子鉴定LAMP引物组和LAMP反应试剂。
3.一种鉴定黑水虻的方法，其特征在于，提取待测物的基因组DNA，用权利要求1的黑水虻的分子鉴定LAMP引物组作为引物，待测物的基因组DNA作为模板，经过LAMP反应，然后对扩增产物进行电泳分析，能扩增出条带的待测物则含有黑水虻，无法扩增出条带的待测物则不含有黑水虻。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的LAMP反应的反应体系是以25 µL计：模板DNA 1.0 µL，ddH2O 12.5µL，20 µmol/ L FIP 1.0µL、20 µmol/ L BIP 1.0µL, 10µmol/ L F3 0.5µL、10 µmol/ L B3 0.5µL, 10× Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 µL，10 mmol/L dNTP Mixture 3.5 µL，50 mmol/L MgSO4 1.5µL，8U/µL Bst DNA Polymerase1.0 µL，反应条件为，63 ℃孵育60 min，80 ℃灭活10 min。
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