CN111518931A

CN111518931A - 牛奶中3种致病菌多重pcr诊断试剂盒

Info

Publication number: CN111518931A
Application number: CN202010332452.5A
Authority: CN
Inventors: 张亚楠; 赵贵; 陈锡龙; 焦仁刚; 姜玲玲; 余波
Original assignee: GUIZHOU INSTITUTE OF ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY
Current assignee: GUIZHOU INSTITUTE OF ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2020-08-11

Abstract

本发明公开了一种牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒。所述试剂盒的引物是金黄色葡萄球菌femB基因序列、大肠杆菌phoA基因序列和沙门氏菌invA基因序列的特异性引物。本发明通过对多重PCR反应进行优化，通过优化试验，确定该试剂盒的多重PCR的最佳扩增程序为：95℃5min；95℃30s，50～60℃35s，72℃45s，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。本发明提供的多试剂盒可以对临床牛奶样本中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定。试验结果证实，该试剂盒检测时间短、敏感性好、特异性高，具有广阔的应用前景。

Description

牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒

技术领域

本发明属于食源性致病菌检测技术领域，尤其是牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒。

背景技术

食源性致病菌是引起人类健康和食品安全的主要因素之一，而微生物污染是导致牛奶质量问题的重要因素，因此牛奶中的致病菌成为消费者关注的焦点。而我国对原料奶的质量要求远低于乳业发达国家。我国乳品新国标中仅规定了生奶中细菌的最低检出总数(少于2×10⁶个/mL)，未对牛奶中具体的细菌种类进行规定，这忽视病原菌的检测。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌则是牛奶源主要的致病菌，这些食源性致病菌严重影响着人和动物的健康。因此，需要快捷、灵敏地方法对牛奶中食源性致病菌进行检测。

目前也有不少关于牛奶食源性致病菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的检测研究，但没有关于牛奶中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌这3种致病菌的同时检测研究。

如公开号为CN104911249A的专利公开了一种快速检测奶源动物以及原料乳中金黄色葡萄球菌的试剂盒；所述试剂盒包括(1)牛奶中微生物的提取试剂，(2)PCR检测试剂，其中包括3对特异性的mntc基因的引物，(3)阳性对照，(4)阴性对照和(5)空白质控标准品。

又如公开号为CN108570512A的专利公开金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针，包括分别以金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7 wzx基因、沙门氏菌invA基因为对象的三组引物和探针，并建立了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法。本发明的PCR检测方法灵敏度高：金黄色葡萄球菌和沙门氏菌灵敏度为10⁵copies/μL，而大肠杆菌灵敏度10⁴copies/μL。该专利技术虽然实现了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的同时检测，但是荧光定量PCR耗材昂贵，目前在县级基层以及养殖场还没有普及，且操作技术要求高，对操作环境洁净度要求高，由于环境污染易产生假阳性。

发明内容

本发明的目的在于提供牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒。

多重PCR(multiplex PCR，mPCR)方法可同时检测多种病原体，且具有特异性强、灵敏度高、检测时间短和检测成本低等特点，适合大量临床样本(特别是混合感染样本)中病原体的快速检测。本发明研究者以金黄色葡萄球菌femB基因序列、大肠杆菌phoA基因序列和沙门氏菌invA基因序列，分别设计3对特异性引物，建立一种能够同时快速检测牛奶中三种食源性致病菌的多重PCR方法。

具体是通过以下技术方案实现的：

牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，包括Ⅰ液，Ⅰ液为混合引物，由以下引物组成：

金黄色葡萄球菌上引物：5′-CGAGCATCATGGCTTTACAACT-3′

金黄色葡萄球菌下引物：5′-CAAATCCAGCACGCTCTTCAGT-3′

大肠杆菌上引物：5′-CGATGCCTTACCGCTTAC-3′

大肠杆菌下引物：5′-TTTCCCTGCCATTCACC-3′

沙门氏菌上引物:5′-ATTACTTGTGCCGAAGAGCC-3′

沙门氏菌下引物：5′-CCCTTTGCGAATAACATCCT-3′。

优选地，所述试剂盒还包括Ⅱ液，Ⅱ液为2U/μL DNA聚合酶。

优选地，所述试剂盒还包括PCR反应混合溶液(Premix Ex Taq)，其组成为：5mmol/μL氯化镁、1000pmol/μL dNTP 4.0μL、25mmol/μL Tris-HCl、0.2μL Taq。

优选地，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照。

优选地，所述阴性对照为超纯水，阳性对照为金黄色葡萄球菌femB基因、大肠杆菌phoA基因、沙门氏菌invA基因三基因的克隆质粒。

优选地，所述试剂盒包括：40μLⅠ液、250μLⅡ液、250μL PCR反应混合溶液(PremixEx Taq)、20μL阴性对照、20μL阳性对照；Ⅰ液由10μmol/L的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌上下引物等体积组成。

优选地，所述试剂盒的PCR扩增体系为：Premix Taq 25μL，DNA混合模板2μL，10μmol/L的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌上下引物各1μL，ddH₂O加至50μL。

优选地，所述试剂盒的扩增程序为：95℃5min；95℃30s，50～60℃35s，72℃45s，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。

优选地，所述试剂盒的扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

优选地，所述电泳检测：在233bp、444bp和724bp处显示出目的产物条带，则表明检测病原菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的试剂盒，能从金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的混合模板中同时扩增出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌特异性目的条带；且各引物与模板之间没有明显的互相干扰，能同时实现牛奶中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的检测。而且，其它的病原菌牛结核杆菌、多杀性巴氏杆菌、牛支原体为模板，进行PCR扩增试验时，均未出现目的条带，特异性高。

本发明提供的试剂盒，敏感性好，对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌同时检测时，最低检测量分别为：133.3pg/mL,13.3pg/mL,13.3pg/mL。

本发明提供的多试剂盒可以对临床牛奶样本中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定。试验结果证实，该试剂盒检测时间短、敏感性好、特异性高，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测结果，M：DL2000；1：沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌多重PCR产物；2：沙门氏菌单一PCR产物；3：大肠杆菌单一PCR产物；4：金黄色葡萄球菌单一PCR产物；5、6：多重PCR阴性对照。

图2为多重PCR敏感性与特异性试验结果，M：D2000；1～10：10^－1～10^－10稀释的细菌DNA的PCR结果；11：牛结核杆菌；12：多杀性巴氏杆菌；13：牛支原体；14：牛结核杆菌+多杀性巴氏杆菌+牛支原体；15：阴性对照。

图3为沙门氏菌单一PCR敏感性试验结果，M：D2000；1～11：10^-1～10^-11稀释的沙门氏菌DNA的PCR结果；12、13：阴性对照。

图4为大肠杆菌单一PCR敏感性试验结果，M：Marker DL2000；M：D2000；1～11：10^-1～10^-11稀释的大肠杆菌DNA PCR结果；12、13：阴性对照。

图5为金黄色葡萄球菌单一PCR敏感性试验结果，M：D2000；1～11：10^-1～10^-11稀释的大肠杆菌DNA PCR结果；12～15：阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例1

1、试验材料

1.1菌株

大肠杆菌

25922标准株、沙门氏菌

13076标准株、金黄色葡萄球菌

6538标准株、牛结核杆菌DNA、多杀性巴氏杆菌DNA、牛支原体DNA，均由贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室保存。

1.2主要试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；DL2000DNA Marker、Premix Taq(EX Taq version 2.0plus dye)等购自宝生物(大连)工程有限公司；LB液体培养基、营养琼脂培养基等均购自广州环凯微生物科技有限公司。

2、试验方法

2.1引物的设计与合成

参考GenBank中的金黄色葡萄球菌femB基因序列(检索号：GQ284649.1)、大肠杆菌phoA基因序列(检索号：NC_011750.1)和沙门氏菌invA基因序列(检索号：M90846.1)，经比对分析后，采用Primer Premier 5.0分别设计各基因的特异性引物，引物的序列与目的片段大小见表1。

表1引物信息

Table 1 Primer information

2.2细菌DNA的提取

将-80℃保存的菌株分别接种于相应的营养肉汤复苏，划线于相应的固体培养基37℃培养过夜，挑取单菌落于液体培养基中，置于37℃，200rpm摇床中培养12h。参照细菌基因组提取试剂盒说明书进行提取细菌DNA，将提取的DNA模板于－20℃保存。

2.3多重PCR体系的建立

2.3.1单一PCR扩增及产物的鉴定

单一PCR反应采用25μL反应体系：Premix Taq(EX Taq version 2.0plus dye)12.5μL，模板DNA 1μL，上、下游引物各0.5μL，ddH₂O加至25μL。反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。取5μL PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，阳性产物送往生工生物工程股份有限公司进行测序分析。将测序结果在NCBI网站进行Blast分析，确认目的基因。

2.3.2多重PCR体系的建立及条件的优化

对多重PCR反应条件，包括退火温度(50～60℃)和引物浓度(5～20μmol/L)进行优化，以确定最佳反应条件，同时以双蒸水作为空白对照。多重PCR反应在50μL反应体系中进行：Premix Taq(EX Taq version 2.0 plus dye)25μL，3种细菌DNA混合模板2μL，3对上、下游引物各1μL，ddH₂O加至50μL。反应程序：95℃5min；95℃30s，50～60℃35s，72℃45s，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。取5μLPCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2.4敏感性试验

将2.3.1测序比对无误的DNA片段连到PUC57载体上，构建同时携带三个基因的质粒，并转化到大肠杆菌工程菌DH5α中，作为阳性菌株保存。提取阳性菌株的质粒，用蛋白质核酸仪测定浓度后，经10倍梯度稀释后作为单一PCR反应和多重PCR反应的模板，用优化后的PCR反应程序进行扩增，检测该方法的敏感性。

2.5特异性试验

以混合核酸(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、牛结核杆菌、多杀性巴氏杆菌、牛支原体的核酸为模板分别进行多重PCR反应，鉴定该方法的特异性。

2.6重复性实验

用建立的多重PCR方法，多次重复检测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌及3种细菌的混合阳性样本，验证多重PCR的稳定性。

2.7多重PCR对临床样品的检测

将临床采集的未经巴氏杀菌的25份鲜牛奶样品(生乳)，参照GB19301-2010测定生乳中微生物菌落总数。同时，将样品简单增菌(样品与增菌液＝1：25倍)后采用细菌基因组提取试剂盒进行提取细菌DNA，进行多重PCR和单一PCR扩增。

参照GB27342-2009将25份鲜牛奶样品经63℃～65℃、30min杀菌处理得到巴氏杀菌乳，参照国标GB4789.3平板计数法、GB4789.10定性检验、GB4789.4分别对大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌进行检测。同时，经简单增菌后提取细菌DNA，进行多重PCR和单一PCR检测。

3、试验结果

3.1单一PCR扩增及产物的鉴定

单一PCR结果表明，扩增片段分别为各细菌的特异性条带。测序结果证实金黄色葡萄球菌femB的大小为233bp，大肠杆菌phoA的大小为444bp，沙门氏菌invA的大小为724bp，均与预期大小相符。经BLAST比对分析，结果显示各细菌基因测序结果与NCBI上公布序列同源性达100％。

3.2多重PCR反应体系的建立及条件的优化

通过对退火温度和引物浓度等条件进行优化，确定多重PCR反应在50μL反应体系中的最佳反应条件为：退火温度52℃，引物浓度10μmol/L；最佳反应程序：95℃5min；95℃30s，52℃35s，72℃45s，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。各细菌的特异性引物均有效扩增出了其目的片段，分别为724bp(沙门氏菌)，444bp(大肠杆菌)、233bp(金黄色葡萄球菌)，引物间无非特异性片段产生(见图1)。

3.3特异性试验结果

PCR特异性结果如图2所示，从图中可知，以牛结核杆菌、多杀性巴氏杆菌、牛支原体以及三者混合DNA为模板分别进行多重PCR反应均未扩增出条带，说明该多重PCR特异性良好。

3.4敏感性试验结果

在优化的多重PCR反应条件中，细菌的最低检测量分别为沙门氏菌133.3pg/mL、大肠杆菌13.3pg/mL、金黄色葡萄球菌13.3pg/mL(见图2)。在单一PCR反应中，各细菌的最低检测量分别为沙门氏菌0.013pg/mL、大肠杆菌1.33pg/mL、金黄色葡萄球菌13.3pg/mL(见图3、4、5)。

3.5重复性试验结果

用建立的多重PCR方法，多次重复检测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌及3种细菌的混合阳性样本，均能扩增出相应的目的条带且单一PCR与多重PCR结果均一致。

3.6临床样本检测结果

25份未经巴氏杀菌的鲜牛奶样品(即生乳)中微生物菌落总数均小于2×10⁶，符合食品安全国家标准生乳中微生物限量的规定；而多重PCR检测结果显示(见表2)，19份大肠杆菌阳性，2份沙门氏菌+大肠杆菌双阳性，1份大肠杆菌+金黄色葡萄球菌双阳性，这与单一PCR检测结果一致，且与细菌分离鉴定结果一致。

多重PCR和单一PCR对25份巴氏杀菌乳经简单增菌后提取的细菌DNA进行检测，结果无阳性检出。同时利用巴氏杀菌乳国家标准对大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌进行传统细菌分离鉴定，结果均为阴性。

检测结果也说明了巴氏杀菌法能有效地将牛奶中的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌这三种致病菌杀死。

表2临床应用

Table 2 The clinical application of mPCR

4、讨论

多重PCR反应体系中存在多对引物和多个模板，相互之间发生作用的机率很大，很容易导致假阳性出现。因此，多重PCR的引物设计至关重要，应该选择各自相对保守的基因序列作为靶基因。本发明中所用引物参考GenBank中金黄色葡萄菌femB基因序列高度保守，是金黄色葡萄菌区别于其他葡萄球菌的一个特异性染色体标志基因，同时femB基因与细菌细胞壁的合成有关，它也是金黄色葡萄球菌产生耐药性的辅助基因。而大肠杆菌碱性磷酸酶phoA基因，是普遍存在于所有的大肠杆菌中的持家基因，具有良好的特异性，它编码的酶能催化非特异性磷酸单酯水解，对机体内磷代谢的调节有重要作用，还可以作为信号酶被广泛应用于医学疾病检测、免疫学和分析生物技术。沙门氏菌invA基因是沙门氏菌的一种侵袭蛋白基因，其编码的蛋白决定沙门氏菌对肠粘膜细胞的侵袭力，是致病性沙门氏菌存在的最直接标志。本研究根据以上3种保守基因序列，扩增片段分别为233bp、444bp、724bp，片段大小级差在200bp以上，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后易于分开，有很高的辨识度，在实际应用中不易造成误判。

影响多重PCR反应的因素有很多，其中退火温度会直接影响引物与模板DNA的结合效率，还会导致PCR反应的非特异性扩增。相关研究表明，多重PCR反应体系的退火温度要比单一PCR扩增时的退火温度低4℃左。同时，所有引物对的最适退火温度要尽可能的相同，这有助于在多重PCR反应中每对引物都有相同的扩增效率。本研究中的三对引物在单一PCR反应中退火温度为55℃时，均能保证很高的扩增效率；通过条件优化，多重PCR反应在退火温度为52℃时效果最优。

本发明构建了同时携带femB、phoA、invA三个基因的质粒，作为阳性菌株模板。这种方法可获得大量稳定的阳性模板DNA，且保证三个基因的拷贝数准确一致，有利于开展检测方法的敏感性试验，也为后续临床样品的检测提供稳定、准确的阳性对照。

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌是引起牛奶微生物污染的主要致病菌，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的高效鉴定对牛奶安全性的评价具有重要意义。本发明提供的多重PCR反应方法(试剂盒)可以对临床牛奶样本中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定。结果表明，该诊断方法检测时间短、敏感性好、特异性高，具有广阔的应用前景。

实施例2

牛奶中3种致病菌多重诊断试剂盒，试剂盒包括：40μL Ⅰ液、250μL Ⅱ液、250μLPCR反应混合溶液(Premix Ex Taq)、20μL阴性对照、20μL阳性对照；Ⅰ液由10μmol/L的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌上下引物等体积组成。

所述Ⅰ液为混合引物，由以下引物等体积组成：

金黄色葡萄球菌上引物：5′-CGAGCATCATGGCTTTACAACT-3′

金黄色葡萄球菌下引物：5′-CAAATCCAGCACGCTCTTCAGT-3′

大肠杆菌上引物：5′-CGATGCCTTACCGCTTAC-3′

大肠杆菌下引物：5′-TTTCCCTGCCATTCACC-3′

沙门氏菌上引物:5′-ATTACTTGTGCCGAAGAGCC-3′

沙门氏菌下引物：5′-CCCTTTGCGAATAACATCCT-3′。

所述试剂盒Ⅱ液为2U/μL DNA聚合酶。

所述PCR反应混合溶液(Premix Ex Taq)，PCR反应混合液(Pre mix Ex Taq)，其组成为：5mmol/μL氯化镁、1000pmol/μL dNTP 4.0μL、25mmol/μL Tris-HCl、0.2μL Taq。

所述阴性对照为超纯水，阳性对照为金黄色葡萄球菌femB基因、大肠杆菌phoA基因、沙门氏菌invA基因三种基因的克隆质粒。

在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。

序列表

序列表 sequence listing

<110> 贵州省畜牧兽医研究所

<120> 牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgagcatcat ggctttacaa ct 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caaatccagc acgctcttca gt 22

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgatgcctta ccgcttac 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttccctgcc attcacc 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

attacttgtg ccgaagagcc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccctttgcga ataacatcct 20

Claims

1.牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括Ⅰ液，Ⅰ液为混合引物，由以下引物组成：

金黄色葡萄球菌上引物：5′-CGAGCATCATGGCTTTACAACT-3′

金黄色葡萄球菌下引物：5′-CAAATCCAGCACGCTCTTCAGT-3′

大肠杆菌上引物：5′-CGATGCCTTACCGCTTAC-3′

大肠杆菌下引物：5′-TTTCCCTGCCATTCACC-3′

沙门氏菌上引物:5′-ATTACTTGTGCCGAAGAGCC-3′

沙门氏菌下引物：5′-CCCTTTGCGAATAACATCCT-3′。

2.如权利要求1所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Ⅱ液，Ⅱ液为2U/μL DNA聚合酶。

3.如权利要求1所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应混合溶液(Premix Ex Taq)，其组成为：5mmol/μL氯化镁、1000pmol/μL dNTP4.0μL、25mmol/μL Tris-HCl、0.2μL Taq。

4.如权利要求1所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照。

5.如权利要求4所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为超纯水，阳性对照为金黄色葡萄球菌fem B基因、大肠杆菌phoA基因、沙门氏菌invA基因三基因的克隆质粒。

6.如权利要求1-5所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，所述试剂盒包括：40μLⅠ液、250μLⅡ液、250μL PCR反应混合溶液(Premix Ex Taq)、20μL阴性对照、20μL阳性对照；Ⅰ液由10μmol/L的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌上下引物等体积组成。

7.如权利要求6所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR扩增体系为：Premix Taq 25μL，DNA混合模板2μL，10μmol/L的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌上下引物各1μL，ddH₂O加至50μL。

8.如权利要求7所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，所述试剂盒的扩增程序为：95℃5min；95℃30s，50～60℃35s，72℃45s，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。

9.如权利要求8所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

10.如权利要求9所述的牛奶中3种致病菌多重PCR诊断试剂盒，所述电泳检测：在233bp、444bp和724bp处显示出目的产物条带，则表明检测病原菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌。