CN110951913B

CN110951913B - 绿苋，凹头苋与反枝苋相互鉴别的分子特异性标记引物及方法

Info

Publication number: CN110951913B
Application number: CN202010023871.0A
Authority: CN
Inventors: 魏艺聪; 车苏容; 卢伟
Original assignee: Fujian University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Fujian University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2040-01-09
Also published as: CN110951913A

Abstract

本发明公开了绿苋，凹头苋与反枝苋相互鉴别的分子特异性标记引物及方法，属于生物技术领域。依据绿苋，凹头苋与反枝苋的matK基因序列，设计上游特异性正向引物AalF：5’‑TTTCAAAAAGGAATCGAAGATAA‑3’、AblF：5’‑CGAATCCATTTTTACGGAAACA‑3’、AreF：5’‑GGGACTCAATTCTTCAGTAATACCA‑3’和下游通用反向引物matKR：5’‑AATAATGAGAAAGATTTCGGCAT‑3’。利用特异性引物分别构建多重PCR体系和荧光定量PCR反应体系，实现对绿苋，凹头苋与反枝苋相互之间的快速、准确的定性和定量鉴别。

Description

绿苋，凹头苋与反枝苋相互鉴别的分子特异性标记引物及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及绿苋，凹头苋与反枝苋相互鉴别的分子特异性标记引物及方法。

背景技术

药用植物绿苋（Amaranthus albus L.）全草可入药，也常被称为“白苋”，具有清热解毒的功效，外敷可以治疮肿，牙疳，虫咬，在民间也常被作为野菜应用。凹头苋（Amaranthus blitum L.）全草入药，用作缓和止痛、收敛、利尿、解热剂。反枝苋（Amaranthus retroflexus L. ）主要用于治腹泻、痢疾、痔疮肿痛出血等症。三者形态相似，且具有类似的分布地，常伴生，很容易相混淆与误用。但是他们有不同的属性和药用价值，特别在民间名称不统一，容易导致相互混用。因此，急需对三者进行准确鉴别的方法，以确保准确用药。

绿苋，凹头苋与反枝苋通过形态学和组织学技术是很难识别的。在过去的几年中，利用化学分析技术如TLC、HPLC 、MS等方法进行识别中药材。虽然这些方法在某种程度上可以补充形态学或组织学鉴定的局限性，但化学指纹图谱只能检测部分化合物，只能提供有限的物种组成信息，不能进行准确鉴别，特别是在和它极为相似的物种鉴别中。因此，建立准确鉴别绿苋，凹头苋与反枝苋产品的方法对监测质量至关重要。

随着分子生物学的发展，DNA分子标记如RAPD、ISSR和SSR等分子标记， ITS（Internal transcribed spacer）等DNA条形码技术提供了可靠的识别药材的方法。然而，这些基于基因组DNA的分子标记技术容易受到基因组DNA降解的影响，由于核基因组DNA比叶绿体DNA拷贝数少，在加工过的药材中更容易遭破坏而导致无法通过其分子标记技术进行鉴别。叶绿体matK基因序列作为DNA条形码，它可以很容易利用通用引物进行扩增，这一序列已被证明可用于对多种植物在种水平的识别，被广泛用于植物产品的检测。本课题组在前期研究中也发现，对于干燥或经加工过的药材，基于叶绿体DNA matK基因序列的鉴别技术比基于核基因组DNA的分子标记技术更为稳定有效。

本研究对绿苋，凹头苋与反枝苋的matK基因序列进行测序，分析其序列结构和特征，寻找单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism SNP)分子标记，设计分别识别绿苋，凹头苋与反枝苋的特异识别引物，建立多重PCR技术，可快速简单鉴别绿苋，凹头苋与反枝苋的方法。本发明为一种绿苋，凹头苋与反枝苋相互鉴别的分子鉴别提供了有效方法，对有效的鉴别和保护3种中药种质资源具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绿苋，凹头苋与反枝苋相互鉴别的分子特异性标记引物及方法，该方法能快速简单的进行绿苋，凹头苋与反枝苋相互鉴别。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

根据前期测序所得的绿苋，凹头苋与反枝苋的matK基因序列，分析其特异性SNP位点，分别设计特异识别绿苋的上游特异性正向引物AalF：5’-TTTCAAAAAGGAATCGAAGATAA -3’；特异性识别凹头苋的上游特异性正向引物AblF：5’-CGAATCCATTTTTACGGAAACA-3’；特异性识别反枝苋的上游特异性正向引物AreF：5’-GGGACTCAATTCTTCAGTAATACCA-3’；设计下游通用反向引物matKR：5’-AATAATGAGAAAGATTTCGGCAT-3’。

以上述特异性正向引物和通用反向引物，建立多重PCR反应体系，定性鉴别分析绿苋，凹头苋与反枝苋。

所述构建多重PCR体系为：总量为20 μL，从植物中提取1 0 ng的基因组DNA作为扩增模版，加入1μL 1×TransStart TopTaq DNA聚合酶 (TransGen 公司)，2μL 10×TransStart TopTaq Buffer，dNTP 2.5mM，0.2μM下游引物matkR和上游的3个特定的引物AalF、AblF与AreF各0.1 μM，其余为无菌水。构建多重PCR体系反应程序如下： 95°C 预变性2分钟， 95°C 变性30 s， 52°C引物退火30s和72°C 延伸2分钟，32个循环；最后一个循环在72°C 延伸7分钟，以确保完整的延伸PCR产物。绿苋生成648 bp特异性片段，凹头苋生成517bp特异性片段，反枝苋生成236 bp特异性片段。

以上述特异性正向引物和通用反向引物，建立荧光定量PCR反应体系定量鉴别分析绿苋，凹头苋与反枝苋。

所述荧光定量PCR：应用可特异识别绿苋的上游特异性引物AalF与下游引物AalR：5'-CAAGAAGGGCTCCAAAAGAC-3'；特异识别凹头苋的上游特异性引物AblF与下游引物AblR：5'-GACATTGCCAGAAAGCGATA-3'；特异识别反枝苋的上游特异性引物AreF与下游引物matKR进行定量鉴别分析，构建荧光定量PCR进行40个循环，反应体系如下：总量为20 μL，从植物中提取10 ng的基因组DNA作为扩增模版，10μL 2×SYBR Green Real-time PCR MasterMix (TaKaRa) ，0.2μM 上游特异正向引物，0.2μM下游反向引物，其余为无菌水；反应程序如下：在实时定量PCR仪器（ABI7900）中，50℃预变性2分钟，95℃预变性10分钟，在95℃变性15 s，引物退火58℃ 15s和在72℃延伸 30 s，40个循环。

引物AalF和AalR用于混合产品中绿苋的定量分析；引物AblF和AblR用于混合产品中凹头苋的定量分析。引物AreF和matKR用于混合产品中反枝苋的定量分析。所有引物的浓度均为0.2 μM。实时定量PCR方法用于定量分析方法可由相对定量分析方法R=2^-△△Ct法推导出来，由于同一DNA样品中以其总DNA为模板进行扩增，混合样品总模版DNA相应的Ct（total）值是恒定的，即特定一个混合样品中的Ct（total）值是不变的。则绿苋(Aal)与凹头苋（Abl）的混杂比率在同一个样本中可以通过这个公式计算：

R_Aal/Abl=2^-△△Ct=2^{-{[Ct(Aal)- Ct（total）]-[Ct(Abl)-Ct（total）]}}=2^{Ct(Abl)-Ct(Aal)}

Ct（total）)为总混合样本的Ct值，Ct(Aal)为引物AalF和AalR的Ct值，即代表绿苋含量的Ct值，Ct(Abl)为引物AblF和AblR的Ct值，即代表凹头苋含量的Ct值。以此类推，则可以计算其他二者之间的混杂比例。

本发明的优点在于：

由于仅根据某些特征活性化学成分的存在进行鉴别，易受植物成长环境等外在条件的影响，很难进行准确鉴别，特别是混合样品的鉴别。本方法基于遗传背景的进行分子定性定量鉴别，不受药材的产地等外在因素的影响，相对于化学方法，更为准确，也更为简单方便。

由于叶绿体DNA比基因组DNA的拷贝数更多，在干燥及加工后的产品中更为稳定，本方法利用叶绿体DNA作为检测对象，比利用基因组DNA作为检测对象，更适合用于对在干燥及加工后的产品的鉴定。

本方法可对绿苋，凹头苋与反枝苋相互进行分子定性定量鉴别，准确确定3种混淆品的存在与否及混杂比例，效率更高，更便捷。

附图说明

图1绿苋，凹头苋与反枝苋相互鉴别引物设计示意图。

图2利用引物matKR，AalF、AblF与AreF多重PCR的产物凝胶电泳（M : DNA ladder；1-6：绿苋；7-12：凹头苋；13-18：反枝苋。

图3引物对AalF、AalR的Ct/x曲线图。

图4引物对AblF、AblR的Ct/x曲线图。

图5引物对AreF、matKR的Ct/x曲线图。

具体实施方式

1 仪器

PCR 仪(Eppendorf，型号5332) ，实时定量PCR仪（ABI7900），电泳系统( 北京市六一仪器厂，型号DYY-12) ，低温冷冻离心机(Eppendorf，型号5810R) ，凝胶成像分析仪(BIO-RAD ChemiDoc XRS)，微量移液器(Eppendorf) 。

2试剂

2×CTAB 提取液，1×TAE 缓冲液，琼脂糖( Promega 公司) ，溴化乙锭( Fluka公司) ，TransStart®TopTaq DNA Polymerase ( 北京全式金公司)，三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇均为国产分析纯。

3 材料

本研究实验样品是由福建中医药大学魏艺聪鉴定并收集的采自不同产地的样品：分别从中国不同产地上收集10个绿苋，凹头苋与反枝苋样本。

方法

4.1 基因组DNA提取：

⑴ 取5 g新鲜的绿苋，凹头苋与反枝苋叶片剪碎，置于经过杀菌的研钵中，加入0.5 gPVP粉末，再加入液氮迅速研磨，将粉末收集于袋子中，置于-20 ℃保存，长时间保存则置于-80 ℃中；

⑵ 取10 mLCTAB溶液于65 ℃水中预热，再加0.2 mL(200μL)巯基乙醇于预热的CTAB中（巯基乙醇：CTAB溶液=1:50）；

⑶ 取步骤（1）获得的粉末0.2 g于2 mLEP管（离心管），迅速加入1 mL预热的含有巯基乙醇的CTAB溶液（样品低温时加入），振荡2分钟左右将其放入65 ℃水浴锅，水浴约1小时；（每20分钟振荡一次，可适当多振荡几次）

⑷ 往管中加入600μL氯仿-异戊醇混合液（氯仿：异戊醇体积比=24:1，必须在通风橱操作），摇匀5分钟，再将其置于15-20 ℃以12000rpm离心10分钟；

⑸ 取600μL上清液，再加入1.2mL（2倍）预冷的无水乙醇或360μL（0.6倍）异丙醇，置于-20 ℃沉淀约3小时或过夜；

⑹ 取出EP管于4 ℃条件下以12000 rmp离心10分钟，去掉上清液，倒置于吸水纸数分钟；

⑺ 再加入700 μL70％乙醇，上下颠倒数次，洗涤沉淀，后于4 ℃条件下以12000rmp离心10分钟，去掉上清液，再重复一遍，最后置于超净台中吹干；（注意：不可吹干过度）

⑻ 在EP管中加入30-50 μL去离子水（ddH2O）或1×TE溶液，于4 ℃放置3小时或过夜，使其充分溶解，若手摇难以溶解，可用混匀机进行混匀，促其溶解；

⑼可用琼脂糖凝胶检测其是否含基因组DNA，后进行纯化。

4.2 特异性引物设计：

根据前期测序实验所得的绿苋(Amaranthus_albus，Aal)，凹头苋（Amaranthusblitum，Abl）与反枝苋(Amaranthus_retroflexus，Are)的matK基因序列，（绿苋，凹头苋与反枝苋的matK基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1 、SEQ ID NO.2 、SEQ ID NO.3所示）应用ClustalX软件，分析其特异SNP位点，选择绿苋matK基因序列第26位的绿苋特异性 SNP位点 A作为鉴别位点，为提高鉴别能力，把第 25位点的碱基由 T替换为A，设计特异识别绿苋的正向引物AalF；以第156位的凹头苋特异性 SNP位点A作为鉴别位点，并把第155位点的碱基由G替换为C，设计特异识别凹头苋的引物AblF；而以第440位的反枝苋特异性 SNP位点A作为鉴别位点，并把第439位点的碱基由G替换为C，设计特异识别反枝苋的引物AreF；并设计共同的反向引物 matkR，引物设计示意图及对应PCR扩增片段大小见图1。绿苋PCR扩增特异片段大小为648 bp，凹苋PCR扩增特异片段大小为517 bp，反枝苋PCR扩增特异片段大小为236 bp。

为了确保分子定量分析的准确性，荧光定量PCR的PCR产物必须是短片段。因此，设计下游反向通用引物AalR与上游特异性正向引物AalF相匹配用于定量分析绿苋样品,其PCR产物129 bp；设计下游反向通用引物AblR与上游特异性正向引物AblF相匹配用于定量分析凹头苋样品,其PCR产物193 bp；而特异识别反枝苋的上游特异性正向引物AreF与下游反向引物matkR则可以直接进行荧光定量PCR分析,其PCR产物236 bp；。

鉴别绿苋，凹头苋与反枝苋的正向和反向引物见表1。

表1 引物

4.3建立多重PCR体系

利用绿苋，凹头苋与反枝苋的特异性引物AalF、AblF与AreF分别与通用引物构建多重PCR体系：总体积20 μL，从植物中提取10 ng的基因组DNA作为扩增模版，加入1×TransStart TopTaq DNA聚合酶（1μL）(TransGen生物技术)，2μL 10×TransStart TopTaqBuffer，dNTP 2.5mM，0.2 μM通用反向引物matKR和三个特异性正向引物AalF、AblF与AreF各0.1 μM，其余为无菌水。反应程序如下： 95°C 预变性2分钟， 95°C 变性30 s， 52°C下引物退火30s和72°C 延伸2分钟，32个循环；最后一个循环在72℃延伸7分钟，以确保完整的延伸PCR产物。

PCR产物见图2,，从图2可知：绿苋生成了648 bp的一条特异性条带，凹头苋生成了517 bp的一条特异性条带，反枝苋生成了236 bp的一条特异性条带，表明本发明设计的特异性引物，能对绿苋，凹头苋与反枝苋进行高特异性、准确、快速的鉴别。

4.4建立荧光定量PCR 的分子定量鉴定体系

为确定该特定的引物是否适合于混合样品的分子定量分析，用梯度稀释的绿苋，凹头苋与反枝苋的混合物DNA样品进行了实时PCR检测。取162.5μg/μL 受试样本基因组DNA进行连续十倍稀释（1/10/100/1000/10000/100000倍稀释），在总体积为20μL的反应系统中加入为2μL样品基因组DNA作为模版，10μL 2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix(TaKaRa) ，0.2μM 上游特异引物，0.2μM下游引物，其余为无菌水；反应程序如下：在实时定量PCR仪器（ABI7900）中， 50℃预变性2分钟， 95℃预变性10分钟，在95℃变性15 s，引物退火58℃ 15s和在72℃延伸 30 s，40个循环。相对于特定浓度DNA的Ct值构建一个曲线见图3、图4、图5，结果表明，3对特异引物的Ct值与起始模板的对数存在线性关系，且R²>0.99，说明设计这3对引物能对未知样品进行定量测定，因此，所设计的实时荧光定量PCR是有效对该混合样品进行分子定量的方法。引物对AalF、AalR扩增的Ct值与样品相对量的对数值形成回归曲线：

y = -3.2733x + 36.261，R² = 0.9978

引物对AblF 、AblR扩增的Ct值与样品相对量的对数值形成回归曲线：

y = -3.4865x + 34.929，R² = 0.9988

引物对AreF 、matKR扩增的Ct值与样品相对量的对数值形成回归曲线：

y = -3.4725x + 35.137，R² = 0.999

混用样品的3对引物的Ct值与DNA模板的5个稀释浓度(1/10/100/1000/10000/100000倍稀释)的均存在线性关系，因此，在该稀释浓度范围内可被准确定量。绿苋，凹头苋与反枝苋品的叶绿体DNA在同一个样本易混植物中的含量比例可通过该方法计算，则绿苋(Aal)与凹头苋（Abl）的混杂比率在同一个样本中可以通过这个公式计算：

R_Aal/Abl=2^-△△Ct=2^{-{[Ct(Aal)- Ct（total）]-[Ct(Abl)-Ct（total）]}}=2^{Ct(Abl)-Ct(Aal)}，其他二者之间的混杂比例以此类推。

结果表明，实时PCR是一个足够敏感和准确的方法评估混合样品中绿苋，凹头苋与反枝苋的叶绿体DNA含量的比例，并根据这个含量进行评估绿苋，凹头苋与反枝苋混合样品的比例。因为在特定的混合样本中叶绿体DNA降解率是相对于绿苋，凹头苋与反枝苋是相同的，因此这种方法可有效对绿苋，凹头苋与反枝苋的混合样品进行分子定量分析。

表1 Ct值绘制样品的相对数量

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建中医药大学

<120> 绿苋，凹头苋与反枝苋相互鉴别的分子特异性标记引物及方法

<130> 9

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 654

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.1

<400> 1

ctttttcaaa aaggaatcga agattatttt tgttcctata taatcttctt gtatatgaat 60

acgaatccct ttttgttatt ctacgcaagc aatcctctta tttacgatca acgtcttttg 120

gagcccttct tgaacgaatc catttttacg gaaagctaaa atatctagta aaagtcaaag 180

ttaagggttt tggggttatc ctatggcttt tcaaagaacc ttttctgcat tatgttcggt 240

atcaaggaaa atgccttctg gcttcaaaag ggacatcctt tctgatgtat aaatggaaat 300

attactttat cgctttctgg caatgtcatt tttctgtgtg gtctcaacca agaagaatct 360

atatcaatca attatcaaac tattccctcg actttatggg ttttatttca aatgtgggac 420

tcaattcttc agtaatacgg agtcaaatgt tagaaaattc atttctagta gataatatta 480

ttaagaagtt tgataccata gttccaatta ttcctctggt tggctcgttg gctaaagcga 540

aattttgtaa tggattaggt catcccatta gtaagtcggt ctggaccgat ttatccgatg 600

ctgatattat tgaccgattt ggacgtatat gccgaaatct ttctcattat tata 654

<210> 2

<211> 654

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.2

<400> 2

ctttttcaaa aaggaatcga agattctttt tgttcctata taatcttctt gtatatgaat 60

acgaatccat ttttgttatt ctacgcaagc aatcctctta tttacgatca acgtcttttg 120

gagcccttct tgaacgaatc catttttacg gaaagataaa atatctagta aaagtcaaag 180

ttaaggtttt tggggttatc ctatggcttt tcaaagaacc ttttctgcat tatgttcggt 240

atcaaggaaa atgccttctg gcttcaaaag ggacatcctt tctgatgtat aaatggaaat 300

attactttat cgctttctgg caatgtcatt tttctgtgtg gtctcaacca agaagaatct 360

atatcaatca attatcaaac tattccctcg actttatggg ttttatttca aatgtgggac 420

tcaattcttc agtaatacgg agtcaaatgt tagaaaattc atttctagta gataatatta 480

ttaagaagtt tgataccata gttccaatta ttcctctggt tggctcgttg gctaaagcga 540

aattttgtaa tggattaggt catcccatta gtaagtcggt ctggaccgat ttatccgatg 600

ctgatattat tgaccgattt ggacgtatat gccgaaatct ttctcattat tata 654

<210> 3

<211> 654

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.3

<400> 3

ctttttcaaa aaggaatcga agattctttt tgttcctata taatcttctt gtatatgaat 60

acgaatccat ttttgttatt ctacgcaagc aatcctctta tttacgatca acgtcttttg 120

gagcccttct tgaacgaatc catttttacg gaaagctaaa atatctagta aaagtcaaag 180

ttaaggtttt tggggttatc ctatggcttt tcaaagaacc ttttctgcat tatgttcggt 240

atcaaggaaa atgccttctg gcttcaaaag ggacatcctt tctgatgtat aaatggaaat 300

attactttat cgctttctgg caatgtcatt tttctgtgtg gtctcaacca agaagaatct 360

atatcaatca attatcaaac tattccctcg actttatggg ttttatttca aatgtgggac 420

tcaattcttc agtaatacga agtcaaatgt tagaaaattc atttctagta gataatatta 480

ttaagaagtt tgataccata gttccaatta ttcctctggt tggctcgttg gctaaagcga 540

aattttgtaa tggattaggt catcccatta gtaagtcggt ctggaccgat ttatccgatg 600

ctgatattat tgaccgattt ggacgtatat gccgaaatct ttctcattat tata 654

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> AalF

<400> 4

tttcaaaaag gaatcgaaga taa 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> AblF

<400> 5

cgaatccatt tttacggaaa ca 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> AreF

<400> 6

gggactcaat tcttcagtaa tacca 25

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> matKR

<400> 7

aataatgaga aagatttcgg cat 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> AalR

<400> 8

caagaagggc tccaaaagac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> AblR

<400> 9

gacattgcca gaaagcgata 20

Claims

1.绿苋，凹头苋与反枝苋相互鉴别的分子特异性标记引物，其特征在于：所述引物包括如下：

鉴别绿苋的上游特异性正向引物AalF：5’- TTTCAAAAAGGAATCGAAGATAA - 3’；

鉴别凹头苋的上游特异性正向引物AblF：5’- CGAATCCATTTTTACGGAAACA - 3’；

鉴别反枝苋的上游特异性正向引物AreF：5’- GGGACTCAATTCTTCAGTAATACCA - 3’；

下游通用反向引物matKR：5’-AATAATGAGAAAGATTTCGGCAT-3’。

2.一种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物用于绿苋，凹头苋与反枝苋相互鉴别的多重PCR方法，其特征在于：多重PCR体系总体积为20 μL，从绿苋，凹头苋与反枝苋植物中提取10 ng的基因组DNA作为扩增模版，加入1μL 1×TransStart TopTaq DNA聚合酶，2μL10×TransStart TopTaq Buffer，dNTP 2.5mM，0.2μM下游通用反向引物matKR和上游的3个特异性正向引物AalF、AblF与AreF各0.1 μM，其余为无菌水；反应程序为： 95°C 预变性2分钟， 95°C 变性30 s， 52°C引物退火30s，72°C 延伸2分钟，进行32个循环；最后一个循环72°C 延伸7分钟。

3.一种利用权利要求1所述分子特异性标记引物用于绿苋，凹头苋与反枝苋相互鉴别的荧光定量PCR方法，其特征在于：以特异识别绿苋的上游特异性引物AalF与下游引物AalR：5'-CAAGAAGGGCTCCAAAAGAC-3'；特异识别凹头苋的上游特异性引物AblF与下游引物AblR：5'-GACATTGCCAGAAAGCGATA-3'；特异识别反枝苋的上游特异性引物AreF与下游引物matKR进行定量鉴别分析，构建荧光定量PCR；

反应体系如下：总量为20 μL，从绿苋，凹头苋与反枝苋植物中提取10 ng的基因组DNA作为扩增模版，10μL 2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix，0.2μM 上游特异性正向引物，0.2μM下游通用反向引物，其余为无菌水；

反应程序如下：在实时定量PCR仪器中，50℃预变性2分钟， 95℃预变性10分钟；95℃变性15 s，引物退火58℃ 15s和在72℃延伸 30 s，40个循环。