CN106544419B - 检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物、探针及试剂盒 - Google Patents
检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物、探针及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物、探针及试剂盒。其中检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物和探针,包括检测ApoE基因T388C、C526T多态性位点的引物和探针,以及检测SLCO1B1基因A388G、T521C多态性位点的引物和探针。本发明涉及的ApoE和SLCO1B1基因多态性检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择,具有特异性强,灵敏度高,实验周期短,操作简单,安全无毒,成本低等显著优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因多态性检测技术领域,特别涉及检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物、探针及试剂盒。
背景技术
他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,是最为经典和有效的降脂药物,广泛应用于高脂血症的治疗。同时在急性冠状动脉综合征患者中早期应用能够起到抑制血管内皮的炎症反应、稳定粥样斑块、改善血管内皮功能、延缓动脉粥样硬化(AS)程度、抗炎、保护神经和抗血栓等作用。
人类载脂蛋白E(ApoE)基因位于19号染色体上,有4个外显子和3个内含子,ApoE基因两个最常见的突变为T388C和C526T,能形成3个单倍体,分别为E2(388T-526T)、E3(388T-526C)、E4(388C-526C),可形成6个基因型(E3/3、E2/3、E3/4、E/4/4、E2/2、E2/4)。研究表明,ApoE的基因位点具有遗传多态性,多态性与个体血脂水平及动脉粥样硬化的发生发展密切相关。E2等位基因携带者,其血液中ApoE浓度高,胆固醇含量低,对动脉粥样硬化有防护作用;而E4等位基因携带者,则血液中ApoE浓度低,胆固醇及三酰甘油含量高,是动脉粥样硬化的潜在危险因素。另外,ApoE基因多态性是他汀类药物调脂疗效出现个体差异的重要原因之一,研究表明,E2等位基因携带者对于他汀类药物的疗效优于E3,E4携带者。
有机阴离子转运多肽1B1(OATP1Bl)参与他汀类药物的转运,其编码基因为SLCO1B1,人类SLCO1B1基因位于12号染色体上,全长108.59kb,有14个编码外显子和一个非编码外显子。SLCO1B1基因的两个最常见的突变为A388G和T521C,能形成可以形成4种单倍体,分别是SLCO1B1*1a(388A-521T)、SLCO1B1*1b(388G-521T)、SLCO1B1*5(388A-521C)和SLCO1B1*15(388G-521C)。SLCO1B1多态性可造成他汀类药物药动学的改变,突变型SLCO1B1基因可使OATP1B1与底物的亲和力降低,转运活性下降,阻碍他汀类药物的代谢,造成进入外周循环的药物增多,增加肌毒性副作用的发生风险。
目前,针对ApoE和SLCO1B1基因多态性检测的方法有多种,主要包括DNA测序法和高分辨率溶解曲线法。DNA测序法虽然是金标准,但步骤繁琐,耗时长。高分辨率溶解曲线法,快速,简便,经济实用,但是受仪器温度控制,假阳性高。因此需要建立一种快速操作方便,快速,特异性好、灵敏的基因检测方法。
发明内容
为了克服现有技术检测能力的不足,本发明在Taqman探针法的基础上提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的ApoE基因T388C、C526T和SLCO1B1基因A388G、T521C多态性位点的引物和探针,以及试剂盒。
本发明针对不同基因位点分别设计野生型和突变型ARMS引物和Taqman-MGB探针,结合荧光定量PCR反应,对从样本提取的基因组DNA进行检测,一次性就可以实现对载体蛋白E(ApoE)基因T388C和C526T、有机阴离子转运多肽1B1编码基因(SLCO1B1)A388G和T521C的基因多态性进行检测,通过实时荧光PCR仪上收集信号,计算野生型和突变型的△Ct值来确定样本DNA的基因型。本发明的具体技术方案说明如下:
本发明提供了一组检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物和探针,包括检测ApoE基因T388C、C526T多态性位点的引物和探针,以及检测SLCO1B1基因A388G、T521C多态性位点的引物和探针,具体核苷酸序列如下:
(1)ApoE基因T388C位点:
T388C位点突变型ARMS上游引物:
5’-CGGACATGGAGGACGAGC-3’(SEQ ID NO.1);
T388C位点野生型ARMS上游引物:
5’-CGGACATGGAGGACGAGT-3’(SEQ ID NO.2);
T388C位点公用的下游引物:
5’-CTGCAGGTCATCGGCATC-3’(SEQ ID NO.3);
T388C位点公用的探针:
5’-CGCCTGGTGCAGTAC-3’(SEQ ID NO.4);
(2)ApoE基因C526T位点:
C526T位点突变型ARMS上游引物:
5’-GCCTGATACACTGCCTGGCA-3’(SEQ ID NO.5);
C526T位点野生型ARMS上游引物:
5’-GCCTGATACACTGCCTGGCG-3’(SEQ ID NO.6);
C526T位点公用的下游引物:
5’-GCCTCGCCTCCCACCT-3’(SEQ ID NO.7);
C526T位点公用的探针:
5’-CTTCTGCAGGTCATCG-3’(SEQ ID NO.8);
(3)SLCO1B1基因A388G位点:
A388G位点突变型ARMS上游引物:
5’-AGGTATTCTAAAGAAACTAATGTCG-3’(SEQ ID NO.9);
A388G位点野生型ARMS上游引物:
5’-AGGTATTCTAAAGAAACTAATGTCA-3’(SEQ ID NO.10);
A388G位点公用的下游引物:
5’-ACTATCTCAGGTGATGCTCTATTGA-3’(SEQ ID NO.11);
A388G位点公用的探针:
5’-CAACATCGACCTTATCC-3’(SEQ ID NO.12);
(4)SLCO1B1基因T521C位点:
T521C位点突变型ARMS上游引物:
5’-TCTGGGTCATACATGTGGATATATCCG-3’(SEQ ID NO.13);
T521C位点野生型ARMS上游引:
5’-CTGGGTCATACAAGTGGATCTATGT-3’(SEQ ID NO.14);
T521C位点公用的下游引物:
5’-GCGAAATCATCAATGTAAGAAAGC-3’(SEQ ID NO.15);
T521C位点公用的探针:
5’-CATGGGTAATATGCTTCG-3’(SEQ ID NO.16);
所述探针均为TaqmanMGB探针,探针为5’端标记荧光报告基团和3’端标记荧光淬灭基团的寡核苷酸。
本发明还提供一种检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒,包括上述检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物和探针。
优选地,上述检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒,还包括内部质控引物对及Taqman探针:
上游引物:5’-CTGCTCGGTCTTGCTATCAAAG-3’(SEQ ID NO.17);
下游引物:5’-CACTTCGCCCTGTTCTTCAAC-3’(SEQ ID NO.18);
探针:5’-CAACGCTCCGCTCCACAAACTCATCATA-3’(SEQ ID NO.19);
探针寡核苷酸的5’端标记荧光报告基团,3’端标记荧光淬灭基团,且均不同于检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的探针两端标记的荧光报告基团和荧光淬灭基团。
优选地,上述检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒,还包括dNTPs、PCR缓冲液、矿物油和超纯水。
优选地,上述检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒,还包括FastmasterPremix。
优选地,上述检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒,还包括阳性对照品,所述阳性对照品包括分别含有ApoE 388T、ApoE 388C、ApoE 526C、ApoE 526T、SLCOB1388A、SLCOB1388G、SLCOB1521T和SLCOB1521C的8种质粒及内控质粒。
与现有技术相比,本发明运用ARMS引物区分野生型和突变型基因,有如下有益效果和显著进步:
(1)灵敏度高,可以准确检出低至1ng的基因组DNA。对于保存时间过长以及口腔拭子这些提取浓度很低的样本能准确检出;
(2)特异性强,对于高至500ng及以上的基因组DNA不会出现非特异性的结果。可以减少稀释样本的过程,提取出的样本直接上母液都能准确检测而不会出现非特异性;
(3)适用于多种样本类型:本发明不仅能检测常规的EDTA抗凝的全血细胞DNA,还能检测提取质量差的口腔拭子,还可以直接检测全血细胞裂解红细胞后的白细胞,检测结果准确度高。
(3)成本低,ARMS分型法相对于Taqman探针分型法,不仅能保留Taqman的高灵敏度和高特异性,而且还能节约成本,ARMS引物合成快速简单,合成成本低,扩增效果更佳。
(4)检测速度快,整个检测过程只需要90分钟。
(5)应用Fastpremix预混在反应体系中,减少了酶与样本混合的步骤,减少了样本的污染,操作更简单,一步加样,避免了气溶胶污染引起的假阳性。
(6)安全:整个试剂盒不包含有毒有害物质,对操作人员和环境无危害。
总之,本发明涉及的ApoE和SLCO1B1基因多态性检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择,具有特异性强,灵敏度高,实验周期短,操作简单,安全无毒,成本低等显著优点。
附图说明
图1是实施例2中EDTA抗凝的全血提取的基因组DNA样本(样本1)的ApoE 388SNP位点对应的扩增曲线;
图2是实施例2中EDTA抗凝的全血提取的基因组DNA样本(样本1)的ApoE 526SNP位点对应的扩增曲线;
图3是实施例2中EDTA抗凝的全血提取的基因组DNA样本(样本1)的SLCO1B1388SNP位点对应的扩增曲线;
图4是实施例2中EDTA抗凝的全血提取的基因组DNA样本(样本1)的SLCO1B1521SNP位点对应的扩增曲线;
图5是实施例2中口腔拭子提取的基因组DNA样本(样本2)的ApoE 388SNP位点对应的扩增曲线;
图6是实施例2中口腔拭子提取的基因组DNA样本(样本2)的ApoE 526SNP位点对应的扩增曲线;
图7是实施例2中口腔拭子提取的基因组DNA样本(样本2)的SLCO1B1388SNP位点对应的扩增曲线;
图8是实施例2中口腔拭子提取的基因组DNA样本(样本2)的SLCO1B1521SNP位点对应的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1试剂盒组成
本实施例所列举的检测试剂盒组成有2种,分别见表1和表2。
表1试剂盒组成一
表2试剂盒组成二
实施例2:临床样本DNA的提取
一、EDTA抗凝血
本实施例是从EDTA抗凝血中提取基因组DNA,并对其进行定量,作为PCR检测的模板。采用天根的血液基因组DNA提取试剂盒,具体详述如下。
1.处理血液材料:
a.当血液样品体积小于200μL时,可加缓冲液GS补足体积至200μL,再进行下一步实验(如血液样品体积为200μL,可直接进行下一步实验,不需加入GS)。
b.当血液样品体积超过200μL时,需用细胞裂解液CL处理,具体步骤如下:在样品中加入1~2.5倍体积的细胞裂解液CL,颠倒混匀,10,000rpm(~11,500×g)离心1min,吸去上清,留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底,可重复以上步骤一次),向离心收集到的细胞核沉淀中加200μL缓冲液GS,振荡至彻底混匀。
2.加入20μL Proteinase K溶液,混匀。
3.加200μL缓冲液GB,充分颠倒混匀,56℃放置10min,其间颠倒混匀数次,溶液应变清亮,
4.加200μL无水乙醇,充分颠倒混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中),12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
6.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
7.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
8.重复操作步骤7。
9.12,000rpm(~13,400×g)离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10.将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TB,室温放置2-5min,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,将溶液收集到离心管中。
11、定量
将提取的DNA用紫外分光光度计进行定量,稀释DNA浓度到1ng/μL。
二、口腔拭子样本
本实施例是从口腔拭子中提取基因组DNA,并对其进行定量,作为PCR检测的模板。采用康为世纪的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒,具体详述如下。
1.将口腔拭子的棉签用剪刀从杆上剪下,置于2ml的离心管(自备)中,加入400μLBuffer GR。
注意:如需无RNA污染的基因组DNA,可加入4μL浓度为100mg/ml的RNase A溶液(货号:CW0601),震荡混匀。
2.加入20μL Proteinase K和400μL Buffer GL,立即涡旋震荡15秒,充分混匀。
注意:加入Buffer GL后立即充分混匀;不可将Proteinase K直接加入Buffer GL中使用。
3.56℃放置10分钟,短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底。
4.加入400μL无水乙醇,涡旋震荡充分混匀,短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底。
5.将上步所得溶液和沉淀分两次加入到已装入收集管(Collection Tube 2ml)的吸附柱(Spin Column DS)中,一次最多不超过700μL。12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
6.向吸附柱中加入500μL Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
7.向吸附柱中加入500μLBuffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心3分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
注意:如需进一步提高DNA纯度,可重复步骤7。
8.12,000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。
9.将吸附柱置于一个新的1.5ml离心管中,向吸附柱的中间部位悬空加入50μLBuffer GE或灭菌水,室温放置2-5分钟,12,000rpm离心1分钟,收集DNA溶液,-20℃保存。
10、定量
将提取的DNA用紫外分光光度计进行定量,稀释DNA浓度到1ng/μL。
实施例3:实时荧光PCR法扩增临床样本DNA
本实施例为采用实施例1所提供的引物、探针扩增实施例2所提取的DNA样品。
检测MTHFR和MTRR基因多态性,其中荧光定量PCR反应体系为:
PCR反应液:
MgCl2:2.0~5.0mmol,
dNTP:0.2~0.8mmol,
各条引物:0.1~1.0μmol,
各条探针:0.1~1.0μmol,
Fast master premix:6~10μL或热启动酶0.3~0.6μL,
模板:10μL,
总体积:40μL。
PCR反应条件为:
第一阶段:95℃5min;
第二阶段:95℃5s,58℃30s,10个循环;
第三阶段:95℃5s,58℃30s,72℃30s,30个循环;
第三阶段:30个循环时,收集FAM和JOE信号。
检测方法如下:
1)每次PCR反应中,同时进行非模板对照(No Template Control;NTC)、阳性对照和待测样本的检测。
2)将阳性对照取出解冻后震荡混匀,并离心30s。
3)将8联PCR反应条取出解冻后离心30s,防止反应液在开盖时溅出。
4)将ddH2O(NTC)、实施例1中提取的DNA样本、阳性对照分别加入6联PCR反应条,每孔10μL。
5)将以上8联PCR反应条盖好管盖于离心机上离心30S,确保管壁上不沾有液滴。
6)将8联PCR反应条放于实时PCR仪器中。
反应条件的设置:
第一阶段:95℃4min;
第二阶段:95℃5s,58℃30s,10个循环;
第三阶段:95℃30s,58℃30s,72℃30s,30个循环;
信号收集:第三阶段72℃时收集FAM和JOE信号。
利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列,通过反应体系的突变型和野生型FAM信号的荧光强度差异来判断检测结果;JOE是内控信号,用于检测体系是否正常,样本是否漏加及初步判断样本DNA量是否在允许范围内,JOE信号应达到设定阈值(Ct值小于25);FAM是检测信号,用于检测样本的基因多态性;在内控信号达到要求后,以每个SNP位点的突变型和野生型FAM信号达到设定阈值所需的循环次数Ct值的差值作为判断标准。选择1、2号管,根据FAM信号△Ct值判断检测样本ApoE 388的基因多态性;选择3、4号管,根据FAM信号△Ct值判断检测样本ApoE 526的基因多态性;选择5、6号管,根据FAM信号△Ct值判断检测样本SLCO1B1388的基因多态性;选择7、8号管,根据AM信号△Ct值判断检测样本SLCO1B1521的基因多态性,根据表3进行结果判定:
表3基因多态性检测结果判定
附图1~8为实施例2中2份基因组DNA,用TE稀释液稀释到浓度2ng/μL,用实施例1的试剂盒在ABI 7500荧光定量PCR仪上的扩增曲线。
(1)图1~4为实施例中EDTA抗凝的全血提取的基因组DNA样本(样本1)的ApoE388、ApoE 526、SLCO1B1388、SLCO1B15214个SNP位点对应的扩增曲线。基因多态性见表4。
(2)图5~8为实施例中口腔拭子提取的基因组DNA样本(样本2)的ApoE 388、ApoE526、SLCO1B1388、SLCO1B15214个SNP位点对应的扩增曲线。扩增曲线见附图,基因多态性见表4。
表4样本检测结果
说明:EDTA抗凝血提取的基因组DNA和口腔拭子提取的基因组DNA用本发明的试剂盒检测的结果和“金标准”sanger测序的结果完全一致,试剂盒准确度高,适应样本广。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉海吉力生物科技有限公司
<120> 检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物、探针及试剂盒
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<400> 15
gcgaaatcat caatgtaaga aagc 24
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
catgggtaat atgcttcg 18
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctgctcggtc ttgctatcaa ag 22
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cacttcgccc tgttcttcaa c 21
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
caacgctccg ctccacaaac tcatcata 28
Claims (4)
1.检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒,包括检测ApoE基因T388C、C526T多态性位点的引物和探针,以及检测SLCO1B1基因A388G、T521C多态性位点的引物和探针,具体核苷酸序列如下:
(1)ApoE基因T388C位点:
T388C位点突变型ARMS上游引物:
5’-CGGACATGGAGGACGAGC-3’;
T388C位点野生型ARMS上游引物:
5’-CGGACATGGAGGACGAGT-3’;
T388C位点公用的下游引物:
5’-CTGCAGGTCATCGGCATC-3’;
T388C位点公用的探针:
5’-CGCCTGGTGCAGTAC-3’;
(2)ApoE基因C526T位点:
C526T位点突变型ARMS上游引物:
5’-GCCTGATACACTGCCTGGCA-3’;
C526T位点野生型ARMS上游引物:
5’-GCCTGATACACTGCCTGGCG-3’;
C526T位点公用的下游引物:
5’-GCCTCGCCTCCCACCT-3’;
C526T位点公用的探针:
5’-CTTCTGCAGGTCATCG-3’;
(3)SLCO1B1基因A388G位点:
A388G位点突变型ARMS上游引物:
5’-AGGTATTCTAAAGAAACTAATGTCG-3’;
A388G位点野生型ARMS上游引物:
5’-AGGTATTCTAAAGAAACTAATGTCA-3’;
A388G位点公用的下游引物:
5’-ACTATCTCAGGTGATGCTCTATTGA-3’;
A388G位点公用的探针:
5’-CAACATCGACCTTATCC-3’;
(4)SLCO1B1基因T521C位点:
T521C位点突变型ARMS上游引物:
5’-TCTGGGTCATACATGTGGATATATCCG-3’;
T521C位点野生型ARMS上游引物:
5’-CTGGGTCATACAAGTGGATCTATGT-3’;
T521C位点公用的下游引物:
5’-GCGAAATCATCAATGTAAGAAAGC-3’;
T521C位点公用的探针:
5’-CATGGGTAATATGCTTCG-3’;
所述探针均为TaqmanMGB探针,探针为5’端标记荧光报告基团和3’端标记荧光淬灭基团的寡核苷酸;
还包括内部质控引物对及Taqman探针:
上游引物:5’-CTGCTCGGTCTTGCTATCAAAG-3’;
下游引物:5’-CACTTCGCCCTGTTCTTCAAC-3’;
探针:5’-CAACGCTCCGCTCCACAAACTCATCATA-3’;
探针寡核苷酸的5’端标记荧光报告基团,3’端标记荧光淬灭基团,且均不同于检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的探针两端标记的荧光报告基团和荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒,其特征在于,内部质控的探针寡核苷酸的5’端标记JOE,3’端标记BHQ1;检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的探针5’端标记FAM,3’端标记MGB。
3.根据权利要求1所述的检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒,其特征在于,还包括dNTPs、PCR缓冲液、矿物油和超纯水。
4.根据权利要求3所述的检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒,其特征在于,还包括Fast master Premix。
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