CN104846085A - 人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，dNTP，MgCl2，4组特异性引物，4组特异性探针，内标系统，HotStart Taq酶、UNG酶。本发明用于检测SLCO1B1和ApoE基因多态性的试剂盒具有特异性强、敏感度高、操作简单快速、高通量、安全、结果判读客观等优势。

Description

人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，尤其涉及一种快速有效地检测少量样本的SLCO1B1和ApoE基因多态性的试剂盒。

背景技术

他汀类药物(statins)是三羟基三甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，自从问世以来就成为世界上临床使用最为广泛的降脂药，该类药物对抑制心脑血管疾病也有显著作用。他汀类药物通过竞争性抑制HMG-CoA(三羟基三甲基戊二酰辅酶A)还原酶从而减少胆固醇的生物合成，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低，进而达到降低血脂的作用，是目前防治冠心病、脑中风、高血脂、动脉粥样硬化的首选用药。

有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)参与多种药物的转运，在他汀类药物代谢中负责将血液中的药物转移至肝脏中直接发挥药效或代谢转化为有活性的物质，由定位在12号染色体上的SLCO1B1基因编码。研究表明SLCO1B1基因具有遗传多态性，其中388A>G、521T>C是两种常见的单核苷酸多态性，可以形成4种单倍型SLCO1B1*1a(388A-521T)、SLCO1B1*1b(388G-521T)、SLCO1B1*5(388A-521C)和SLCO1B1*15(388G-521C)。突变型SLCO1B1基因引起编码的OATP1B1转运蛋白活力减弱，表现为肝脏摄取药物能力降低，引起他汀类药物血药浓度上升，增加横纹肌溶解症或肌病的发生风险。

载脂蛋白E(ApoE)通过多种途径参与机体的脂质代谢调节，是影响机体血脂水平的重要内在因素。ApoE多态性被认为是高脂蛋白血症及动脉粥样硬化性血管病的易感候选基因。人类ApoE基因定位于19号染色体上，有4个外显子和3个内含子，主要有两种单核苷酸多态性526C>T和388T>C，可以形成3种单倍型分别是ApoE3(388T-526C)、ApoE2(388T-526T)、ApoE4(388C-526C)。文献报道，ApoE4携带者患冠心病的风险要高40％，并且他汀类药物对ApoE4携带者疗效往往不佳或无疗效，而对ApoE2携带者的降脂作用最强。

表1：SLCO1B1和ApoE基因多态性

目前针对基因多态性的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis，HRM)，荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。因此，需要建立一种快速有效的检测少量样本的SLCO1B1和ApoE基因多态性的方法。

发明内容

本发明目的在于，克服现有技术中的不足，提供一种SLCO1B1和ApoE基因多态性的检测试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中，样本量少时基因多态性检测效果不理想的问题。本试剂盒可用于高通量、低成本快速检测SLCO1B1和ApoE基因多态性，其灵敏度高，特异性强，可适用于EDTA、柠檬酸盐抗凝新鲜全血或血浆中提取的人类基因组DNA的检测。

本发明提供了一种SLCO1B1和ApoE基因多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，HotStart Taq酶，UNG酶，4组特异性引物，4组特异性探针和内标系统。

在本发明的一些实施方案中，所述4组特异性引物序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6；SEQID NO:7、SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11与SEQ IDNO:12。在本发明的一些实施方案中，所述4组特异性探针序列分别为SEQ IDNO:13与SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17与SEQID NO:18，SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:20，且所述特异性探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。

在本发明的一些实施方案中，所述内标系统包含内标引物和内标探针。所述内标引物序列为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22,所述内标探针序列为SEQ IDNO:23。在一些实施方案中，所述内标探针5’端修饰有ROX，3’端修饰有BHQ2。

在本发明的一些实施方案中，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有7种质粒DNA混合液，所述7种质粒DNA分别含有4种不同的SLCO1B1等位基因和3种不同的ApoE等位基因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。

本发明的SLCO1B1和ApoE基因多态性的检测试剂盒可以简单快速检测基因多态性，并且所述检测包括以下步骤：(1)设计并筛选含有SLCO1B1和ApoE的检测探针，ARMS引物，通用引物；(2)使用从非细胞体系或细胞体系中提取的基因组DNA作为模板DNA；(3)进行实时荧光定量PCR扩增：每个样本的SLCO1B1基因多态性和ApoE基因多态性检测分4管进行PCR反应。

本发明SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒采用Taqman探针法，建立了在同一反应管检测同一基因两种不同多态性的多重荧光定量PCR检测方法，本发明SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒采用ARMS引物特异性扩增目的模板与SNP探针特异性检测目的模板方法，对特异性检测同一基因两种多态性提供双重保证，同时引入内标系统和UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定地对样品进行分型检测。本发明的试剂盒具有以下优点：1.可以准确检测单个样品的基因型；2.可以准确检测1ng基因组DNA的基因型；3.针对SLCO1B1和ApoE的基因型设计ARMS引物和SNP分型探针，可以特异性扩增识别对应的多态性；4.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；5.在同一反应管中检测同一基因两种多态性，操作简便，能在90分钟内完成检测结果判读方法简单客观，便于分析。

附图说明

图1是SLCO1B1*1b 388A/A纯合野生样本的一个检测结果图；

图2是SLCO1B1*1b 388G/G纯合突变样本的一个检测结果图；

图3是SLCO1B1*1b 388A/G杂合突变样本的一个检测结果图；

图4是SLCO1B1*5 521T/T纯合野生样本的一个检测结果图；

图5是SLCO1B1*5 521T/C杂合突变样本的一个检测结果图；

图6是ApoE2 526C/C纯合野生样本的一个检测结果图；

图7是ApoE2 526T/T纯合突变样本的一个检测结果图；

图8是ApoE4 388T/T纯合野生样本的一个检测结果图；

图9是ApoE4 388C/C纯合野生样本的一个检测结果图；

图10是ApoE4 388T/C杂合突变样本的一个检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不限制本发明。

本发明提供了一种SLCO1B1和ApoE基因多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，HotStart Taq酶，UNG酶，4组特异性引物，4组特异性探针和内标系统。

在一些具体实施方案中，所述PCR缓冲液中含有1.0～5.0mM的MgCl₂，1.0～5.0mM的dNTP，即dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0～5.0mM。

在一些具体实施方案中，所述4组特异性引物序列为SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12；其中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10为普通PCR引物，分别扩增包含SLCO1B1*1b、SLCO1B1*5和ApoE2、ApoE4基因多态性的DNA片段；其中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12为ARMS引物，用于分别特异性扩增含有SLCO1B1*1b密码子CCT，ApoE2密码子TCT，ApoE4密码子CGC的DNA片段。3条ARMS引物分别在3’模板碱基与待扩增类型的碱基配对，同时在其3’末端倒数第2-3位增加一个或者两个碱基错配，以增强特异性。

各引物序列列举如下：

在一些具体实施方案中，所述特异性探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有非荧光淬灭基团NFQ(Non-Fluorescent Quencher)，该基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时该特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右，因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。

在一些具体实施方案中，所述4组特异性探针序列分别为SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:20，且其中SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15与SEQ ID NO:16探针分别特异性检测SLCO1B1*1b 388A、SLCO1B1*5 521T、ApoE2 526C与ApoE4 388T模板DNA，SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:20探针分别特异性检测SLCO1B1*1b 388G、SLCO1B1*5 521C、ApoE2526T与ApoE4 388C模板DNA；

各探针序列列举如下：

在一些具体实施方案中，使用内标系统监测该荧光定量PCR反应是否存在抑制，由于待检测的样品中的某些成分可能含有导致PCR出现部分或完全抑制；此外，扩增仪可能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异，另外人为加样错误也可能导致假阴性结果的出现，因此本发明一些具体实施方案中采用内标系统来消除上述隐患，保证了检测结果的准确性。该内标系统优选包含内标引物、内标探针，本发明实施例中个可采用本领域技术人员熟知的其它内标系统。

在一些具体实施方案中，所述内标系统包含内标引物、内标探针和内标模板。序列为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22,所述内标探针序列为SEQ ID NO:23；所述内标探针5’端修饰有ROX，3’端修饰有BHQ2。

在一些具体实施方案中，所述内标系统针对人类基因组保守区域设计，具有高度的灵敏性和扩增特异性，其中包含的内标引物序列如下所示：

内标正向引物F:5’-CGCGAACTCACCCGT-3’  SEQ ID NO:21

内标反向引物R:5’-CACTAGGCGCTCACTGT-3’  SEQ ID NO:22

在一些具体实施方案中，内标探针5′端标记有报告基团，如ROX、FAM、VIC等，3′端标记有不发光荧光淬灭基团，如BHQ2等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号。因此检测到的信号强度就代表了模板DNA的拷贝数。

在一些具体实施方案中，所述内标探针为：

ROX-5’-CACCTTCCCCATGGTGTCT-3’-BHQ2  SEQ ID NO:23

在一些具体实施方案中，酶溶液中含有Taq酶，其为PCR反应所必需的且该酶溶液还含有UNG酶，其中UNG(uracil-N-glycosylase)酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，其特点是最佳活性温度为50℃，95℃灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链。在PCR反应中，使用UNG酶可预防非特异性PCR扩增和污染。

在一些具体实施方案中，本发明检测试剂盒还包括阳性对照液和空白对照液，设置阳性对照和空白对照可监测实时定量PCR反应的正常进行，所述阳性对照液中含有本发明中涉及的SLCO1B1两种多态性SLCO1B1*1b，SLCO1B1*5，ApoE两种多态性ApoE2，ApoE4的7种质粒DNA混合液，该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这7种质粒浓度相同，均为2500拷贝/μl；所述空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。

本发明另一目的在于提供一种用于检测SLCO1B1和ApoE基因多态性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)设计并筛选特异性扩增与检测SLCO1B1和ApoE基因多态性的引物组合和探针组合；制备本发明的SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒。

(2)获得待测样品基因组DNA；

(3)进行荧光定量PCR扩增：每个样本分两个反应管分别检测SLCO1B1和ApoE基因的多态性，每管中加入特异性引物组和探针组、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系统，将上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述2个反应管中并同时进行PCR反应。

在一些具体实施方案中，以25μl反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：

上述体系仅为示例性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。

具体地，在上述25μl反应体系中，所述各对引物包括上述步骤(1)中的12条特异性引物，1对内标引物，所述各条探针包括上述步骤(1)中的特异性探针，所述样品为基因组DNA。

具体地，在步骤(3)中的荧光定量PCR反应条件为：

37℃处理10分钟，95℃预变性5分钟，

40个循环：95℃15秒，60℃60秒并收集荧光信号。

在上述PCR反应后，所得结果按表1进行结果判定：

表1.结果判定

本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，同时该检测方法操作简单快速，能在90分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。

以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。

实施例1

制备本发明的SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，包括以下步骤：

1.引物及探针合成：

设计并合成4组特异性引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12，并在SEQ ID NO:13、SEQID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团，在SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团。将引物、探针分别制备成100μM的母液储存。

2.制备内标系统：设计并合成针对人类基因组设计的1对内标引物，该引物对序列为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；设计并合成内标探针，该探针为SEQ ID NO:23。将该内标引物分别配制成100μM的母液储存，内标探针配制成100μM的母液储存。

3.制备其他试剂：制备PCR缓冲液，其中含有1.0mM的MgCl₂，dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0mM；制备酶混合液，其中含有Taq酶0.5×10³U/ml，UNG酶0.1×10³U/ml。

4.制备阳性对照液和空白对照液，该阳性对照液中含有7种质粒DNA，这些质粒DNA中分别含有本发明试剂盒涉及的SLCO1B1*1b、SLCO1B1*5、ApoE2、ApoE4基因7种不同的多态性质粒，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为2500拷贝/μl；该空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。

5.PCR反应液配制：按照下表进行两个不同体系PCR反应液配制

6.组装试剂盒：试剂盒中包含4管分别检测SLCO1B1和ApoE基因多态性的PCR反应液，根据PCR反应体系各成分使用量，计算20人份规格成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。

实施例2

用实施例1制备的SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒对待测样品进行检测。

本实施例中收集23例高血脂或高血脂并发症患者的抗凝全血样品，从其中提取基因组DNA，用实施例1中得到的SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒检测待检样品的SLCO1B1和ApoE的基因多态性情况。

1.血液样品基因组DNA提取

取全血300μl，加入900μl的细胞裂解液CL，颠倒混匀，静置5min，10,000rpm(11,500×g)离心1min，吸去上清，留下细胞沉淀，向离心收集到的细胞沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。加入20μl ProteinaseK溶液，混匀。加200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，直至溶液变清亮(如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止)。加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复操作步骤7。12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。取2μl所得溶液测OD值以确定DNA浓度，然后将样品DNA稀释到10ng/μl，分别取2μl加入至实施例1中制得的试剂盒中并进行下一步的PCR反应。

2.样本的荧光定量PCR检测

将步骤1中稀释后的DNA样品依次取2μl分别加入到23μl的实施例1的试剂盒的SLCO1B1*1b、SLCO1B1*5、ApoE2和ApoE4检测反应体系中，使四种反应体系总体积均为25μl，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：

37℃10min；

95℃5min；

95℃15s，60℃60s，40个循环；每个循环后收集FAM、VIC和ROX的荧光信号。

3.样本的检测结果分析:23例样品的检测结果如下：

SLCO1B1*1b 388A/A纯合野生样本3例，其中一个检测结果如图1所示；

SLCO1B1*1b 388G/G纯合突变样本11例，其中一个检测结果如图2所示；

SLCO1B1*1b 388A/G杂合突变样本9例，其中一个检测结果如图3所示；

SLCO1B1*5 521T/T纯合野生样本20例，其中一个检测结果如图4所示；

SLCO1B1*5 521T/C杂合突变样本3例，其中一个检测结果如图5所示；

ApoE2 526C/C纯合野生样本21例，其中一个检测结果如图6所示；

ApoE2 526T/T纯合突变样本2例，其中一个检测结果如图7所示；

ApoE4 388T/T纯合野生样本17例，其中一个检测结果如图8所示；

ApoE4 388C/C纯合野生样本5例，其中一个检测结果如图9所示；

ApoE4 388T/C杂合突变样本1例，其中一个检测结果如图10所示。

上述23例样本荧光定量PCR检测结果与测序结果一致。以上结果表明本发明提供的检测试剂盒用于人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，HotStart Taq酶，UNG酶，4组特异性引物，4组特异性探针和内标系统，其中，所述4组特异性引物序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12。

2.如权利要求1所述的SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述4组特异性探针序列分别为SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14，SEQ IDNO:15与SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19与SEQID NO:20，且所述特异性探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。

3.如权利要求1或2所述的SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述内标引物序列为SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:22,所述内标探针序列为SEQ ID NO:23。

4.如权利要求3所述的SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述内标探针5’端修饰有ROX，3’端修饰有BHQ2。

5.如权利要求1至4任一项所述的SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有7种质粒DNA混合液，所述7种质粒DNA分别含有4种不同的SLCO1B1等位基因和3种不同的ApoE等位基因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。

6.一种用于检测SLCO1B1和ApoE基因多态性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)设计并筛选含有SLCO1B1和ApoE的检测探针，ARMS引物，通用引物；

(2)使用从非细胞体系或细胞体系中提取的基因组DNA作为模板DNA；

(3)进行实时荧光定量PCR扩增：每个样本的SLCO1B1基因多态性和ApoE基因多态性检测分4管进行PCR反应。

7.一种用于检测SLCO1B1和ApoE基因多态性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)设计并筛选特异性扩增与检测SLCO1B1和ApoE基因多态性的引物组合和探针组合；制备如权利要求1至5任选一项所述试剂盒；

(2)获得待测样品基因组DNA；

(3)进行荧光定量PCR扩增：每个样本分两个反应管分别检测SLCO1B1和ApoE基因的多态性，每管中加入特异性引物组和探针组、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系统，将上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述2个反应管中并同时进行PCR反应。