CN104975100A - 人类aldh2基因多态性检测特异性引物和试剂盒 - Google Patents

人类aldh2基因多态性检测特异性引物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明适用于生物技术以及医学领域，提供了用于人类ALDH2基因多态性检测的特异性引物和试剂盒，其中所述试剂盒包括特异性引物，特异性探针，内标系统，Taq酶，UNG酶。本发明所提供的用于检测ALDH2基因多态性的引物和试剂盒具有特异性强、敏感度高、操作简单快速、高通量、安全、结果判读客观等优势。

Description

人类ALDH2基因多态性检测特异性引物和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种人类ALDH2基因多态性检测特异性引物和试剂盒。
背景技术
人类乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)是一种催化乙醛以及其他脂肪族醛氧化的四联体蛋白酶。目前,已发现有19种ALDH同工酶，研究较为深入的主要有胞质同工酶ALDH1和线粒体同工酶ALDH2，其中ALDH2在肝脏和胃中具有很高的表达量，是人体乙醇代谢途径中关键酶之一。
人类ALDH2基因位于人类第12号染色体的12q24.2，总长约44kb，含有13个外显子，编码有517个氨基酸残基的多肽，目前发现存在His47Arg、Glu479Lys、Glu504Lys等多种突变体，其中主要突变体是Glu504Lys(rs671)，即位于12号外显子的单碱基突变G1510A。正常的等位基因记为ALDH2*1(*1510G)，突变的等位基因记为ALDH2*2(*1510A)。ALDH2*2在人类各族群中的分布是不同的，研究显示中国人ALDH2*2的频率为16％，日本人24％，泰国人5％，韩国人15％，印度人2％，但在白种人与黑人人群中频率很低，甚至完全缺乏。研究显示，突变型等位基因ALDH2*2的乙醛脱氢酶活性及硝酸酯酶活性基本丧失。
ALDH2*2/*2纯合突变型乙醛脱氢酶活性约为ALDH2*1野生型的2％，ALDH2*1/*2杂合突变型乙醛脱氢酶活性约为ALDH2*1野生型的13-14％。突变型基因ALDH2*2的存在与酒精性中毒、酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)、消化道癌症等疾病有关。研究显示，携带ALDH2*2突变基因型者大量饮酒将显著增加患肝癌的危险性。在饮酒人群中，尤其是重度饮酒者，由于其上消化道长期地与大量酒精直接接触，该区域出现癌变(食道癌、口咽癌等)的几率较高。此外，ALDH2*2显性突变与胃癌的易感性也存在一定的联系。研究显示，ALDH2*2突变人群患肝癌、食道癌、口腔癌的概率分别是ALDH2*1野生人群的3倍、12.95倍、11.72倍以上。
ALDH2同时也是硝酸甘油有效代谢物NO形成的关键，ALDH2*2突变会导致硝酸酯酶活性降低，使得硝酸甘油在体内生物转化过程受阻，有效活性产物NO生成减少，进而导致硝酸甘油治疗心绞痛效果降低。研究表明，ALDH2*1基因型的患者硝酸甘油治疗心绞痛的疗效明显优于ALDH2*2患者，野生型ALDH2对硝酸甘油的催化活性(Vmax/Km)大约是突变型的10倍，且前者迅速起效率也明显高于后者。ALDH2*2/*2纯合突变型硝酸酯酶活性约为ALDH2*1野生型的6-7％，ALDH2*1/*2杂合突变型硝酸酯酶活性约为ALDH2*1野生型的8-15％。同时，ALDH2突变基因携带者服用硝酸甘油无效风险也在大幅增加，ALDH2纯合及杂合突变型使用无效率达到42.4％，大约为ALDH2野生型的3倍。ALDH2基因多态性如表1所示。
表1：ALDH2基因多态性
目前针对基因多态性的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis，HRM)，荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。因此，需要建立一种快速有效的检测少量样本的ALDH2基因多态性的方法。
发明内容
本发明实施例的目的在于，克服现有技术中的不足，提供一种人类ALDH2基因多态性检测特异性引物和试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中，样本量少时基因多态性检测效果不理想的问题。
本发明提供了一种人类ALDH2基因多态性检测特异性引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种人类ALDH2基因多态性检测试剂盒，所述试剂盒含有本发明所述的特异性引物。
所述试剂盒还包括一组如SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4荧光定量PCR探针序列，且所述荧光定量PCR探针的5’端有FAM或VIC修饰，3’端有NFQ-MGB修饰。
试剂盒采用Taqman探针法，建立了在同一反应管检测同一基因两种不同多态性的多重荧光定量PCR检测方法，通过能特异性识别野生型和突变型模板的探针序列，有效区分同一基因的两种多态性，同时引入内标系统和UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定地对样品进行分型检测。本发明的试剂盒具有以下优点：1.可以准确检测单个样品的基因型；2.可以准确检测1ng基因组DNA的基因型；3.针对ALDH2的基因型设计SNP分型探针，可以特异性扩增识别对应基因的多态性；4.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；5.在同一反应管中检测同一基因两种多态性，操作简便，能在90分钟内完成检测，且结果判读方法简单客观，便于分析。
附图说明
图1为ALDH2*1/*1纯合野生样本43例检测结果；
图2为ALDH2*1/*2杂合突变样本16例检测结果；
图3为ALDH2*2/*2纯合突变样本1例检测结果；
图4为ALDH2*1/*1纯合野生样本40例检测结果；
图5为ALDH2*1/*2杂合突变样本9例检测结果；
图6为ALDH2*2/*2纯合突变样本1例检测结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施仅仅用以解释本发明，并不限定本发明。
本发明的一个方面提供了一种人类ALDH2基因多态性检测特异性引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种用于人类ALDH2基因多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，1组特异性引物，1组荧光定量PCR探针和内标系统，Hot Start Taq酶，UNG酶。
所述特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。扩增包含ALDH2*1和ALDH2*2基因多态性的DNA片段。
ALDH2*1上游引物5’-TTGGAGCCCAGTCAC-3’SEQ IDNO:1
ALDH2*2下游引物5’-CCTCAAGCCCCAAC-3’SEQ IDNO:2
在本发明的一种实施方式中，所述PCR缓冲液中含有1.0～5.0mM的MgCl2，1.0～5.0mM的dNTPs，即dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0～5.0mM。
所述荧光定量PCR探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有非荧光淬灭基团NFQ(Non-Fluorescent Quencher)，该基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时该荧光定量PCR探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右，因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。
优选地，所述荧光定量PCR探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.3特异性检测ALDH2*1的模板DNA；SEQ ID NO.4特异性检测ALDH2*2的模板DNA；
各探针序列列举如下：
ALDH2*1检测探针5’-FAM-TACACTGAAGTGAA-NFQ-MGB-3’
ALDH2*2检测探针5’-VIC-CATACACTAAAGTGAA-NFQ-MGB-3’
本发明的具体实施方式汇总，由于待检测的样品中的某些成分可能导致PCR出现部分或完全抑制，故使用内标系统监测该荧光定量PCR反应是否存在抑制；此外，扩增仪可能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异；另外人为加样错误也可能导致假阴性结果的出现，因此本发明实施例中采用内标系统来消除上述隐患，保证了检测结果的准确性。该内标系统优选包含内标引物和内标探针，本发明实施例中也可采用本领域技术人员熟知的其它内标系统。
优选地，所述内标系统包含内标引物和内标探针。所述内标引物的序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，所述内标探针序列为SEQID NO.7，本发明实施例中的内标探针5′端标记有报告基团ROX，3′端标记有不发光荧光淬灭基团BHQ2。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号。因此检测到的信号强度就代表了模板DNA的拷贝数。
优选地，所述内标引物、探针为：
内标正向引物F:5’-CGCAATACCTCCGGATT-3’SEQ IDNO:5
内标反向引物R:5’-TCCGCAGAGGCACTGAG-3’SEQID NO:6
ROX-5’-GGTCGCTGCATGGCTG-3’-BHQ2SEQ ID NO:7。
优选地，本发明实施例中的酶溶液中含有Taq酶，其为PCR反应所必需且该酶溶液还含有UNG酶，其中UNG(uracil-N-glycosylase)酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，其特点是最佳活性温度为50℃，95℃灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链。在PCR反应中，使用UNG酶可预防非特异性PCR扩增和污染。
优选地，本发明实施例中的检测试剂盒还包括阳性对照液和空白对照液，设置阳性对照和空白对照可监测实时定量PCR反应的正常进行，所述阳性对照液中含有2种质粒DNA，2种质粒DNA中分别含有不同的ALDH2等位基因。该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这2种质粒浓度相同，均为2500copies/μl；所述空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。
本发明实施例的另一目的在于提供一种ALDH2基因多态性的检测方法，该检测方法包括以下步骤：
(1)获得待测样品基因组DNA；
(2)利用所述特异性引物、荧光定量PCR探针、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系统、进行荧光定量PCR反应。
优选地，以25μl反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：
上述体系仅为例证性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。
具体地，在上述25μl反应体系中，所述各条引物包括所述特异性引物和内标引物，所述各条探针包括所述荧光定量PCR探针和内标探针，所述样品为基因组DNA。
具体地，所述荧光定量PCR反应的程序为：37℃处理10分钟，95℃预变性5分钟，预变性后按照以下程序进行40个循环：95℃15秒，60℃1分钟。
在上述PCR反应后，所得结果按表2进行结果判定：
表2.结果判定
本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，同时该检测方法操作简单快速，能在90分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。
以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。
实施例1
制备本发明的人类ALDH2基因多态性检测试剂盒，包括以下步骤：
1.引物及探针合成：
设计并合成1组能扩增含人类ALDH2基因多态性区域的外围引物SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2；1组荧光定量PCR探针SEQ IDNO.3与SEQ ID NO.4，并在SEQ ID NO.3的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团，在SEQ ID NO.4的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团。将引物、探针分别制备成100μM的母液储存。
2.制备内标系统：设计并合成针对人类基因组的1对内标引物，该引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；设计并合成内标探针，该探针为SEQ ID NO.7。将该内标引物、探针分别配制成100μM的母液储存。
3.制备其他试剂：制备PCR缓冲液，其中含有1.0mM的MgCl2，dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0mM；制备酶混合液，其中含有Taq酶0.5×103U/ml，UNG酶0.1×103U/ml。
4.制备阳性对照液和空白对照液，该阳性对照液中含有2种质粒DNA，这些质粒DNA中分别含有本发明试剂盒涉及的ALDH2*1和ALDH2*2基因2种不同的多态性质粒，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为2500copies/μl；该空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。
5.PCR反应液配制：
6.组装试剂盒：试剂盒中包含1管检测ALDH2基因ALDH2*1和ALDH2*2多态性的PCR反应液，根据PCR反应体系各成分使用量，计算12人份和24人份两种规格各成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。
实施例2
用实施例1制备的人类ALDH2基因多态性检测试剂盒对部分有饮酒史的患者进行检测。
本实施例中收集60例有饮酒史的患者的抗凝全血样样品，从其中提取基因组DNA，用实施例1中得到的ALDH2基因多态性检测试剂盒检测待检样品的ALDH2的基因多态性情况。
1.血液样品基因组DNA提取：取全血300μl，加入900μl的细胞裂解液CL，颠倒混匀，静置5min，10,000rpm(11,500×g)离心1min，吸去上清，留下细胞沉淀，向离心收集到的细胞沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。加入20μl Proteinase K溶液，混匀。加200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮(如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止)。加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复操作步骤7，12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。取2μl所得溶液测OD值以确定DNA浓度，然后将样品DNA稀释到10ng/μl。
2.样本的荧光定量PCR检测
将步骤1中稀释后的DNA样品依次取2μl分别加入到23μl的实施例1的试剂盒的ALDH2检测反应体系中，使反应体系总体积为25μl，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：
95℃5min；
95℃15s，60℃1min，40个循环；每个循环后收集FAM、VIC和ROX的荧光信号。
3.样本的检测结果分析：
60例样品的检测结果如下：
ALDH2*1/*1纯合野生样本43例，其中一个检测结果如图1所示；ALDH2*1/*2杂合突变样本16例，其中一个检测结果如图2所示；ALDH2*2/*2纯合突变样本1例，其中一个检测结果如图3所示；
上述60例样本荧光定量PCR检测结果与测序结果一致。以上结果表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于人类ALDH2基因多态性检测的结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。
实施例3
用实施例1制备的人类ALDH2基因多态性检测试剂盒对部分冠心病患者进行检测。
本实施例中收集50例冠心病患者的抗凝全血样品，从其中提取基因组DNA，用实施例1中得到的ALDH2基因多态性检测试剂盒检测待检样品的ALDH2的基因多态性情况。
1.血液样品基因组DNA提取
取全血300μl，加入900μl的细胞裂解液CL，颠倒混匀，静置5min，10,000rpm(11,500×g)离心1min，吸去上清，留下细胞沉淀，向离心收集到的细胞沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。加入20μlProteinaseK溶液，混匀。加200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮(如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止)。加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复操作步骤7，12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。取2μl所得溶液测OD值以确定DNA浓度，然后将样品DNA稀释到10ng/μl。
2.样本的荧光定量PCR检测
将步骤1中稀释后的DNA样品依次取2μl分别加入到23μl的实施例1的试剂盒的ALDH2检测反应体系中，使反应体系总体积为25μl，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：
95℃5min；
95℃15s，60℃1min，40个循环；每个循环后收集FAM、VIC和ROX的荧光信号。
3.样本的检测结果分析：
50例样品的检测结果如下：
ALDH2*1/*1纯合野生样本40例，其中一个检测结果如图4所示；ALDH2*1/*2杂合突变样本9例，其中一个检测结果如图5所示；ALDH2*2/*2纯合突变样本1例，其中一个检测结果如图6所示；
上述50例样本荧光定量PCR检测结果与测序结果一致。以上结果表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于人类ALDH2基因多态性检测的结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种人类ALDH2基因多态性检测特异性引物，其特征在于，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种人类ALDH2基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括一组如SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4所示的荧光定量PCR探针序列，且所述荧光定量PCR探针的5’端有FAM或VIC修饰，3’端有NFQ-MGB修饰。
4.根据利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内标系统，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述内标引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述内标探针序列如SEQ ID No.7所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内标探针的5’端修饰有ROX，3’端修饰有BHQ2。
6.根据权利要求2-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液中含有2种质粒DNA，2种质粒DNA中分别含有不同的ALDH2等位基因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq酶和UNG酶。
8.利用权利要求1所述的特异性引物或权利要求2-7中任意一项所述的试剂盒检测ALDH2基因多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获得待测样品基因组DNA；
(2)利用所述特异性引物、荧光定量PCR探针、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系统，进行荧光定量PCR反应。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的体系为：
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的程序为：37℃处理10分钟，95℃预变性5分钟，预变性后按照以下程序进行40个循环：95℃15秒，60℃1分钟。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105132545A (zh) * 2015-08-25 2015-12-09 安徽同科生物科技有限公司 用于检测aldh2基因的引物、探针及检测方法
CN105400871A (zh) * 2015-11-16 2016-03-16 北京晋祺生物科技有限公司 Aldh2基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用
CN105441439A (zh) * 2015-12-01 2016-03-30 武汉海吉力生物科技有限公司 检测aldh2基因多态性的引物、探针和试剂盒
CN105624315A (zh) * 2016-03-17 2016-06-01 汪运山 一种ALDH2基因c.1510位点多态性检测的引物和试剂盒
CN106834518A (zh) * 2017-03-27 2017-06-13 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种检测adh1b基因和aldh2基因多态性的引物及其应用
CN106947807A (zh) * 2017-03-01 2017-07-14 上海荻硕贝肯医学检验所有限公司 用于检测人类aldh2基因多态性的引物、探针、试剂盒及方法
CN108441553A (zh) * 2018-03-13 2018-08-24 普迈德（北京）科技有限公司 一种精准检测aldh2基因多态性的试剂盒及其应用
CN112538528A (zh) * 2020-12-25 2021-03-23 上海美吉逾华生物医药科技有限公司 一种检测aldh2基因多态性的引物组及试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103184268A (zh) * 2011-12-28 2013-07-03 协和干细胞基因工程有限公司 检测乙醛脱氢酶2基因多态性的试剂盒及其扩增方法和检测方法
CN103540675A (zh) * 2013-10-31 2014-01-29 上海百傲科技股份有限公司 用于aldh2基因芯片检测的特异性引物对和探针

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103184268A (zh) * 2011-12-28 2013-07-03 协和干细胞基因工程有限公司 检测乙醛脱氢酶2基因多态性的试剂盒及其扩增方法和检测方法
CN103540675A (zh) * 2013-10-31 2014-01-29 上海百傲科技股份有限公司 用于aldh2基因芯片检测的特异性引物对和探针

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LINA ZHANG等: "Genotyping on ALDH2: Comparison of Four Different Technologies", 《PLOS ONE》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105132545A (zh) * 2015-08-25 2015-12-09 安徽同科生物科技有限公司 用于检测aldh2基因的引物、探针及检测方法
CN105400871A (zh) * 2015-11-16 2016-03-16 北京晋祺生物科技有限公司 Aldh2基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用
CN105441439A (zh) * 2015-12-01 2016-03-30 武汉海吉力生物科技有限公司 检测aldh2基因多态性的引物、探针和试剂盒
CN105624315A (zh) * 2016-03-17 2016-06-01 汪运山 一种ALDH2基因c.1510位点多态性检测的引物和试剂盒
CN106947807A (zh) * 2017-03-01 2017-07-14 上海荻硕贝肯医学检验所有限公司 用于检测人类aldh2基因多态性的引物、探针、试剂盒及方法
CN106834518A (zh) * 2017-03-27 2017-06-13 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种检测adh1b基因和aldh2基因多态性的引物及其应用
CN108441553A (zh) * 2018-03-13 2018-08-24 普迈德（北京）科技有限公司 一种精准检测aldh2基因多态性的试剂盒及其应用
CN112538528A (zh) * 2020-12-25 2021-03-23 上海美吉逾华生物医药科技有限公司 一种检测aldh2基因多态性的引物组及试剂盒

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