CN105177159A

CN105177159A - 焦磷酸测序法检测aldh2基因分型的引物对及试剂盒

Info

Publication number: CN105177159A
Application number: CN201510673492.5A
Authority: CN
Inventors: 滕祥云; 周姗
Original assignee: CHANGSHA 3G BIOTECH CO LTD
Current assignee: CHANGSHA 3G BIOTECH CO LTD
Priority date: 2015-05-14
Filing date: 2015-10-18
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明涉及一种焦磷酸测序法检测乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因分型的测序引物对及其试剂盒，属于体外核酸检测技术领域。所述引物对包括正向扩增引物、反向扩增引物及测序引物，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记；所述试剂盒包括正向扩增引物、含有反向扩增引物的PCR反应液、测序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶及Taq聚合酶。本发明提供的所述试剂盒具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点；此外，还具有可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高的优点。

Description

焦磷酸测序法检测ALDH2基因分型的引物对及试剂盒

技术领域

本发明涉及体外核酸检测技术领域，尤其涉及一种焦磷酸测序法检测乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因分型的引物对及试剂盒。

背景技术

人类乙醛脱氢酶(Aldehydedehydrogenasegene，ALDH)是一种四联体蛋白，催化乙醛和其他脂肪族醛氧化。目前，已发现ALDH有19种同工酶，主要有ALDH1～4四种，其中ALDH2最为重要。在肝和胃中具有很高的表达量，是乙醇代谢途径中最重要的酶之一。

ALDH2基因位于人类第12号染色体(12q24.2)，它的主要多态性是rs671，即位于外显子12的G1510A。由于ALDH2基因存在G1510A多态性，导致氨基酸序列第487位上的谷氨酸被赖氨酸所替换(即，Glu487Lys)，其中具有催化活性的野生型称为G等位基因(即，ALDH2*1)，而催化能力失活的变异型称为A等位基因(即，ALDH2*2)。统计表明，在亚洲的黄种人群中，ALDH2*2是频率最高且最重要的突变型。

研究发现，突变型基因ALDH2*2的存在能导致ALDH2活力的严重缺失，并与过度饮酒导致的酒精依赖、酒精性中毒、酒精性肝病及消化道癌症等疾病之间存在深刻的联系。

一、ALDH2与酒精性疾病的关系：

乙醛脱氢酶(ALDH)和乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase，ADH)在人体内共同组成了人体乙醇脱氢酶系，负责催化人体的乙醇分解代谢。ALDH2在肝和胃中具有很高的表达量,是乙醇代谢途径中最重要的酶之一。

肝中的乙醇脱氢酶负责将乙醇(酒的成分)氧化为乙醛，生成的乙醛作为底物进一步在乙醛脱氢酶催化下转变为无害的乙酸(醋的成分)。乙醛毒性高于乙醇，是造成宿醉的主要原因之一。而且乙醛被怀疑具有致癌性，它与人类肿瘤的发生存在一定的关系。负责人体内乙醛转化的主要是肝中的乙醛脱氢酶(ALDH)。

因此，过度的饮酒行为，不仅使ALDH2*2携带者对酒精产生依赖,还可能引起肝癌等的酒精性肝病(Alcoholicliverdisease,ALD)。酒精性肝病是长期、大量饮酒所引起的肝脏病变,已成为现代社会的主要健康隐忧之一。研究显示，携带ALDH2变异基因型者大量饮酒将显著增加罹患肝癌的危险性。

二、ALDH2与硝酸甘油治疗的关系：

硝酸甘油是治疗心绞痛的经典药物，研究发现硝酸甘油的舒血管作用是通过释放一氧化氮(NO)所介导。但临床上部分病人舌下含服硝酸甘油不仅不能迅速有效地缓解心绞痛，反而使心肌缺血加重。近来发现，ALDH2与硝酸甘油转化为NO密切相关。有研究表明，ALDH2*1基因型的患者硝酸甘油治疗心绞痛的疗效明显优于ALDH2*2患者，且前者迅速起效率也明显高于后者。

三、ALDH2与其他疾病的关系：

虽然摄入人体的乙醇有90％以上是在肝脏内完成代谢过程的，但其在摄入过程中与消化道上皮细胞的直接接触也不容忽视。在饮酒人群中，尤其是重度饮酒者，由于其上消化道长期地与大量酒精直接接触，该区域出现癌变(如食道癌、口咽癌等)的几率明显提高。研究发现，ALDH2*2突变与饮酒人群患消化道癌的风险之间具有显著的相关性。此外，ALDH2*2突变与胃癌的易感性也存在一定的相关性。由此可见，ALDH2*2突变是增加区域性癌化几率的重要因素之一。

综上所述，对患者进行ALDH2基因分型检测，具有显著的临床意义：

通过检测ALDH2基因分型，了解其对药物代谢速率快与慢的状况，可以适时合理调整相关药物用药剂量，提高疾病疗效及降低治疗过程中的毒副反应发生概率；

通过检测ALDH2基因分型，指导临床治疗过程中正确使用硝酸甘油，减少用药无效情况；

通过检测ALDH2基因分型，揭示个体酒精代谢能力的差异，从而防止个体过量饮酒、降低酒精性中毒以及肝脏癌病的几率；

通过检测ALDH2基因分型，揭示重大疾病的高危倾向，如ALDH2基因与食道癌、口咽癌、胃癌、冠心病及心肌梗死等风险的相关性；检测结果将对指导患者的日常生活大有助益，也将有助于医生给与其指导意见，对相关疾病预防和恶化的临床干预具有重大意义。

焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(即，确定DNA中核苷酸的顺序)方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析岀峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦磷酸测序技术检测ALDH2基因分型的产品。

目前，现有技术中，主要采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、手工或自动测序及序列特异性引物PCR等方法检测ALDH2基因分型，这些方法存在检测结果准确性不高、检测周期长及操作繁琐的缺点，难以满足临床检验的标准要求。

发明内容

为了解决上述方法检测ALDH2基因分型过程中存在检测结果准确性不高、检测周期长、操作繁琐及难以满足临床检验要求的技术问题，本发明提供一种检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并有效满足临床检验要求的焦磷酸测序法检测ALDH2基因分型的引物对及试剂盒。

本发明提供了一种焦磷酸测序法检测ALDH2基因分型的引物对，所述ALDH2基因检测的多态性位点为ALDH2*2，所述引物对包括：

正向扩增引物：5’-TCACCCTTTGGTGGCTACA-3’(SEQIDNO.1)；

反向扩增引物：5’-CCCCAACAGACCCCAATC-3’(SEQIDNO.2)；

测序引物：5’-CACACTCACAGTTTTCACTT-3’(SEQIDNO.3)；

其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。

本发明还提供了一种焦磷酸测序法检测ALDH2基因分型的试剂盒，所述ALDH2基因检测的多态性位点为ALDH2*2，所述试剂盒包括：

正向扩增引物：5’-TCACCCTTTGGTGGCTACA-3’(SEQIDNO.1)；

PCR反应液，所述PCR反应液含有反向扩增引物：5’-CCCCAACAGACCCCAATC-3’(SEQIDNO.2)；

测序引物：5’-CACACTCACAGTTTTCACTT-3’(SEQIDNO.3)；

其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。

在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：

ALDH2*2阳性对照品1，其为插有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的ALDH2*2野生纯合子质粒；

ALDH2*2阳性对照品2，其为所述ALDH2*2野生纯合子质粒与插有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的ALDH2*2突变纯合子质粒组成的质粒混合物；

ALDH2*2阳性对照品3，其为插有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的ALDH2*2突变纯合子质粒；

其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述ALDH2*2阳性对照品2中所述ALDH2*2突变纯合子质粒和所述ALDH2*2野生纯合子质粒的数量比为1:1。

在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：质控品(controloligo)和空白对照品，所述质控品的序列为：TAYGGTTTGCA(SEQIDNO.4)；所述空白对照品为水；质控品的序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测PyroMarkQ24测序仪的各项性能指标。

所述PCR反应液还含有其他组份，分别为常规的10×PCRBuffer、dNTPS和H₂O，各组分按常规体积比配置(10×PCRBuffer、dNTPs、H₂O及PCR反应液中反向扩增引物的体积比为5：3：37.5：1)。

所述试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，由5'-磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。

本发明还提供了如上所述的引物对在制备用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂中的应用。

本发明还提供了如上所述的试剂盒在制备用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂中的应用。

相较于现有技术，本发明提供的焦磷酸测序法检测ALDH2基因分型的引物对及试剂盒具有以下有益效果：

一、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测ALDH2*2基因分型时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、半个小时完成一次上机反应、直接给出检测位点频率分析及结果直观的优点；

二、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测ALDH2*2基因分型时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于临床检验的要求；

三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品、阳性对照品和质控品，使得所述试剂盒在检测ALDH2*2基因分型时，可以更好的确保检测结果的准确性。

附图说明

图1为临床样品ALDH2*2野生型的焦磷酸测序图；

图2为临床样品ALDH2*2突变杂合型的焦磷酸测序图；

图3为临床样品ALDH2*2突变纯合型的焦磷酸测序图；

图4为临床质控品controloligo的焦磷酸测序图；

图5为临床空白对照品的焦磷酸测序图；

图6至图8为多组设计引物的焦磷酸测序图；其中图6及图7的测序结果均不准确，只有图8的测序结果真实可靠。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：试剂盒的制备

一、引物和探针的设计与合成

针对人ALDH2基因突变位于第12外显子的G1510A多态性位点，选择特异的突变位点，使用PyroMarkAssayDesign2.0软件，设计引物；其中正向扩增引物、反向扩增引物和测序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中SEQIDNO.1的5’为生物素标记。

表1.突变位点与类型：

Mutation	Base change
		ALDH2*2	ATACACTG/AAAGTGAAA

扩增序列如表2：

表2.特异性扩增引物及引物序列

二、对照品选择

使用人工合成的一段寡聚核苷酸链TAYGGTTTGCAcontrololigo为质控品；DNase/RNase-Free水为空白对照品。

三、PCR反应液组成

表3.PCR反应液组成

原料名称	体积(μL)
		10×PCR Buffer	5
dNTP	3
		ALDH2*2反向扩增引物	1
H₂O	37.5
		总体积	46.5μL

实施例2：试剂盒的使用

一、样品检测

溶解引物干粉(引物溶解后有效期为1个月)。按照模板数配制体系：取PCR反应液，加入溶好的引物、尿嘧啶DNA糖基化酶、TaqDNA聚合酶，分装体系，加入样品DNA、空白对照品或阳性对照品为模板，组成PCR反应体系。按照PCR反应程序进行PCR扩增。

ALDH2*2体系各主要成分如下：

表4.ALDH2*2体系各主要成分

该体系反应程序如下：

表5.PCR反应程序

扩增完成之后，琼脂糖凝胶检验PCR结果，以进行下一步程序。

二、焦磷酸测序

按照焦磷酸测序标准操作规程进行测序操作，主要步骤为：样品的制备和纯化，然后将纯化后的样品加入含有退火液和测序引物的MIX中上机测序。焦磷酸测序仪试剂仓中加入运行程序相应的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、酶混合物、底物混合物。质控品controloligo自带测序引物，最终浓度为0.2μM。

三、结果判断

质控品碱基检出率为100％；空白对照品检出率为0。

四、质控标准

各类对照质控品判断结果如下表：

表6.质控品标准检测结果

	对照品	标准检验结果
			1	质控品	峰高峰型正常、序列准确
2	空白对照品	碱基检出率为0

五、结果报告：

结果如图1、图2及图3所示，样品结果的判断标准如下：

表7.报告样品检测结果

	样品检测结果	报告结果
			1	ALDH2*2(G≥90％，A≤10％)	野生型
2	ALDH2*2(G≤10％，A≥90％)	突变纯合型
			3	ALDH2*2(40％≤G≤60％，40％≤A≤60％)	突变杂合型

图1显示的是临床样品检测结果中ALDH2*2的野生型，图2显示的是临床样品检测结果中ALDH2*2的突变杂合型，图3显示的是临床样品检测结果中ALDH2*2的突变纯合型；图4及图5分别显示的是临床检测结果中的质控品controloligo和空白对照品的焦磷酸测序图，图6至图8显示的是设计的多组引物的焦磷酸测序效果图，其中图8的引物为最佳(ALDH2*2，G＝99％，A＝1％)，是我们产品中选定的引物。

本发明提供的焦磷酸测序法检测ALDH2基因分型的引物对及试剂盒具有以下有益效果：

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCELISTING

<110>长沙三济生物科技有限公司

<120>焦磷酸测序法检测ALDH2基因分型的引物对及试剂盒

<160>6

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

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Claims

1.一种焦磷酸测序法检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物对，其特征在于，所述乙醛脱氢酶2基因检测的多态性位点为ALDH2*2，所述引物对包括：

正向扩增引物：5’-TCACCCTTTGGTGGCTACA-3’；

反向扩增引物：5’-CCCCAACAGACCCCAATC-3’；

测序引物：5’-CACACTCACAGTTTTCACTT-3’；

其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。

2.一种焦磷酸测序法检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂盒，其特征在于，所述乙醛脱氢酶2基因检测的多态性位点为ALDH2*2，所述试剂盒包括：

正向扩增引物：5’-TCACCCTTTGGTGGCTACA-3’；

PCR反应液，所述PCR反应液含有反向扩增引物：5’-CCCCAACAGACCCCAATC-3’；

测序引物：5’-CACACTCACAGTTTTCACTT-3’；

其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

其中，质粒载体为pMD18-T质粒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述ALDH2*2阳性对照品2中所述ALDH2*2突变纯合子质粒和所述ALDH2*2野生纯合子质粒的数量比为1:1。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：质控品和空白对照品，所述质控品的序列为：TAYGGTTTGCA。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述空白对照品为水。

7.权利要求1所述的引物对在制备用于检测ALDH2基因分型的试剂中的应用。

8.权利要求2所述的试剂盒在制备用于检测ALDH2基因分型的试剂中的应用。