CN108753954A - 痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途 - Google Patents
痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108753954A CN108753954A CN201810672906.6A CN201810672906A CN108753954A CN 108753954 A CN108753954 A CN 108753954A CN 201810672906 A CN201810672906 A CN 201810672906A CN 108753954 A CN108753954 A CN 108753954A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- connector
- sequence
- probe
- library
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本发明提供了一种痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途,涉及基因检测的技术领域,该捕获探针组包含了95个基因的编码区域,能针对特定的编码区域进行捕获,并进行高深度测序,使测序目标基因精准,测序成本降低。使用上述捕获探针组进行文库构建能对目标基因进行有效富集,降低样本量的要求,同时也能更好地控制测序成本。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,尤其是涉及一种痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途。
背景技术
痴呆是指由于神经退行性变、脑血管病变、感染、外伤、肿瘤、营养代谢障碍等多种原因引起的,以认知功能缺损为主要临床表现的一组临床综合征,多见于老年人群。除表现有定向、记忆、学习、语言理解、思维等多种认知功能损害外,多数病人还表现有行为异常,并且终将导致其工作及社会生活功能下降或丧失。痴呆的患病率高,致残、致死率高,为增龄性疾病,已成为西方发达国家老年人群中仅次于癌症、心脏病和脑卒中的第四位死因,加之其病程长,医疗和照料负担重,直接和间接医疗费用均很高(2010年全球用于痴呆的总花费达6040亿美元),已成为老龄化社会面临的重要卫生服务问题和社会经济负担问题。我国每年新发痴呆病例约为180万;根据2010年第六次全国人口普查结果,全国登记总人口为13.4亿,其中65岁及以上人口占13.26%,根据65岁以上人群痴呆患病率(4.8%),我国现有痴呆患者至少已达850万。
测序技术可以帮助我们对痴呆相关基因有更全面的了解,而现有测序技术中还未出现对痴呆相关基因的目标区域测序,因此如需检测痴呆相关基因需要对待测样品进行全基因组测序或者外显子测序,由于痴呆相关的基因目前已报到的已有200多个,使用常规的Sanger测序或者全外显子测序的成本均较高,不利于高通量的对痴呆相关基因进行测序分析。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种痴呆相关基因的捕获探针组,缓解了现有技术中缺少一种能够有效捕获痴呆相关基因的技术手段的问题。
本发明的第二目的在于提供一种用于文库构建的试剂盒,缓解了现有技术中缺少一种能够有效捕获痴呆相关基因的产品的问题。
本发明的第三目的在于提供一种文库构建方法,实现对痴呆相关基因进行有效富集,降低后续检测成本的目的。
本发明的第四目的在于提供一种上述捕获探针组、试剂盒和文库构建方法在痴呆相关基因筛查中的用途,以达到更深入的对痴呆相关基因进行研究的目的。
为解决上述技术问题,本发明特采用如下技术方案:
一种痴呆相关基因的捕获探针组,所述捕获探针组捕获的基因和所述基因的染色体坐标信息如下表所示:
所述捕获探针组的设计按照如下规则:
(a)探针长度为90-150bp;
(b)探针设计合并相邻区域;
(c)探针设计区间为目标区间向两翼扩展20bp;
(d)探针参考为基因组正义链;
(e)探针两翼的共有序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;
(f)探针设计中通过比对全基因组信息确保探针特异性;
(g)探针GC含量以40%-60%为标准,GC含量变化幅度偏离标准含量每增加10%,探针在该区域探针数量增加50%。
(h)在基因组非捕获区域有近似序列的探针,每有一个近似序列,则该区域探针数量增加100%;所述近似序列为与探针序列的同源性至少为95%的序列。
优选地,所述捕获探针组中的探针经过标记物标记,优选为经过生物素标记。
本发明还提供了一种用于文库构建的试剂盒,所述试剂盒包含上述捕获探针组;
优选地,所述试剂盒还包括用于富集捕获的靶序列的PCR扩增引物:所述PCR扩增引物具有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列。
优选地,所述试剂盒还包括用于多样本杂交捕获的接头,所述接头包括Adapters1、Adapters2、Adapters3和Adapters4中至少两组;
接头Adapters1由Adapters1-1及Adapters1-2经退火形成;所述Adapters1-1具有如SEQ ID NO.5所示序列,所述Adapters1-2具有如SEQ ID NO.6所示序列;
接头Adapters2由Adapters2-1及Adapters2-2经退火形成,所述Adapters2-1具有如SEQ ID NO.7所示序列,所述Adapters2-2具有如SEQ ID NO.8所示序列;
接头Adapters3由Adapters3-1及Adapters3-2经退火形成,所述Adapters3-1具有如SEQ ID NO.9所示序列,所述Adapters3-2具有如SEQ ID NO.10所示序列;
接头Adapters4由Adapters4-1及Adapters4-2经退火形成,所述Adapters4-1具有如SEQ ID NO.11所示序列,所述Adapters4-2具有如SEQ ID NO.12所示序列。
优选地,所述试剂盒还包括用于文库杂交前封闭的Hyb Block,所述Hyb Block包括如SEQ ID NO.13所示序列;
优选地,SEQ ID NO.13经硫代磷酸键修饰。
优选地,所述试剂盒还包括与探针上的标记物亲和的磁珠;
优选地,所述试剂盒中的捕获探针组中的探针经生物素标记,所述磁珠为亲和素偶联的磁珠,所述磁珠优选为链霉亲和素偶联的磁珠;
优选地,所述试剂盒还包含用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液;
优选地,所述试剂盒还包含用于洗脱物理吸附或非特异性杂交的清洗液。
本发明还提供了一种文库构建方法,所述文库构建方法包括使用上述捕获探针组或上述试剂盒捕获痴呆相关基因。
优选地,所述文库构建方法包括在DNA片段加接头Adapters1、接头Adapters2、接头Adapters3或接头Adapters4;
优选地,给已经加过接头的DNA文库添加测序标签,所述DNA文库中包括含有接头Adapters1的DNA片段、含有接头Adapters2的DNA片段、含有接头Adapters3的DNA片段和含有接头Adapters4的DNA片段中的至少一种DNA片段。
优选地,所述文库构建包括如下步骤:
a)样品采集与提取:收集待测样品并提取基因组DNA;
b)DNA片段化:将DNA打断至150-200bp的DNA片段;
c)末端修复,对经打断后的DNA样品进行末端修复和添加A-Tailing,然后对产物进行纯化;
d)添加接头:添加接头Adapters1、接头Adapters2、接头Adapters3或接头Adapters4,然后进行纯化;
e)添加测序标签:给已经加过接头的DNA文库通过PCR扩增添加测序标签,所述DNA文库中包括含有接头Adapters1的DNA片段、含有接头Adapters2的DNA片段、含有接头Adapters3的DNA片段和含有接头Adapters4的DNA片段中的至少一种DNA片段,然后进行纯化;
f)目标基因杂交和捕获:使用Hyb Block将DNA文库进行杂交前的封闭,然后使用所述捕获探针组与文库进行杂交捕获,然后对捕获到的靶序列进行富集。
本发明还提供了一种上述捕获探针组、上述试剂盒或上述文库构建方法在痴呆相关基因筛查中的用途;
优选地,所述痴呆相关基因筛查包括对使用上述文库构建方法构建的文库进行测序;
优选地,所述测序为基于Illumina测序平台的双末端测序,然后将测序结果与数据库进行对比。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供的痴呆相关基因的捕获探针组包含了95个基因的编码区域,能针对特定的编码区域进行捕获,并进行高深度测序,使测序目标基因精准,测序成本降低。
本发明提供的用于文库构建的试剂盒中包含上述捕获探针组,能够有效的捕获相关基因,可以降低相关基因的检测成本并且提高检测的灵敏度。
本发明提供的文库构建方法使用了上述基因的捕获探针组,并且基于液相杂交的序列捕获技术对目标基因进行富集。本发明提供的文库构建方法能对目标基因进行有效富集,降低样本量的要求,同时也能更好地控制测序成本。
本发明提供的上述捕获探针组、试剂盒和文库构建方法在相关基因筛查中的用途,可以更深入的对相关基因特点进行研究,不仅包括筛查样本中是否包含某些特点,还可以进一步的对这些基因的的SNP(单核苷酸突变),Indel(碱基的插入缺失)CNV(拷贝数变异)进行分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3提供的用于多样本杂交捕获的接头Adapters1;
图2为本发明实施例3提供的用于多样本杂交捕获的接头Adapters2;
图3为本发明实施例3提供的用于多样本杂交捕获的接头Adapters3;
图4为本发明实施例3提供的用于多样本杂交捕获的接头Adapters4;
图5为本发明实施例4提供多样本杂交捕获的接头在实际多样本杂交中4种文库的结构情况。;
图6为本发明实施例4提供的打断后的DNA样品峰图;
图7为本发明实施例4加完index的DNA片段的峰图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。需要说明的是,实施例中的反应体系和反应条件仅是一种举例。实施例中各步骤中的反应体系和反应条件均可以在可接受的范围内进行调整,以优化反应条件,本发明对此不做限制;探针长度根据合成的平台长度会有差异,本实施例中探针的长度为121bp,可以理解的是,只要复合本发明提供的探针的设计规则即可。
实施例1痴呆相关基因的捕获探针组
本实施例提供了一组用于捕获痴呆相关基因的捕获探针,该捕获探针组捕获的基因和所述基因的染色体坐标信息如下表所示:
所述捕获探针组的设计符合如下规则:
(a)探针长度为121bp;
(b)探针设计合并相邻区域;
(c)探针设计区间为目标区间向两翼扩展20bp;
(d)探针参考为基因组正义链;
(e)探针两翼的共有序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;
编号 | 序列(5’-3’) |
SEQ ID NO.1 | ATCGCACCAGCGTGT |
SEQ ID NO.2 | CACTGCGGCTCCTCA |
(f)探针设计中通过比对全基因组信息确保探针特异性;
(g)探针GC含量以40%-60%为标准,GC含量变化幅度偏离标准含量每增加10%,探针在该区域探针数量增加50%。
(h)在基因组非捕获区域有近似序列的探针,每有一个近似序列,则该区域探针数量增加100%;所述近似序列为与探针序列的同源性至少为95%的序列。
实施例2用于文库构建的试剂盒
本实施例提供了一种构建痴呆相关基因的文库的试剂盒,该试剂盒包含如下试剂:
①实施例1提供的痴呆相关基因的捕获探针组,并且该探针组经过生物素标记;和用于捕获杂交靶序列的经链霉亲和素标记的磁珠。
②用于多样本杂交捕获的接头,所述接头包括Adapters1、Adapters2、Adapters3和Adapters4中至少两组;
接头Adapters1由Adapters1-1及Adapters1-2经退火形成;Adapters1-1具有如SEQ ID NO.5所示序列,Adapters1-2具有如SEQ ID NO.6所示序列;
接头Adapters2由Adapters2-1及Adapters2-2经退火形成,Adapters2-1具有如SEQ ID NO.7所示序列,Adapters2-2具有如SEQ ID NO.8所示序列;
接头Adapters3由Adapters3-1及Adapters3-2经退火形成,Adapters3-1具有如SEQ ID NO.9所示序列,Adapters3-2具有如SEQ ID NO.10所示序列;
接头Adapters4由Adapters4-1及Adapters4-2经退火形成,Adapters4-1具有如SEQ ID NO.11所示序列,Adapters4-2具有如SEQ ID NO.12所示序列。
编号 | 序列(5’-3’) |
SEQ ID NO.5 | TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCGTCT |
SEQ ID NO.6 | GACGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC |
SEQ ID NO.7 | TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCGATT |
SEQ ID NO.8 | ATCGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC |
SEQ ID NO.9 | TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCCTAT |
SEQ ID NO.10 | TAGGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC |
SEQ ID NO.11 | TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCACTT |
SEQ ID NO.12 | AGTGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC |
③用于文库杂交前封闭的Hyb Block,具有如SEQ ID NO.13所示序列:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-/3SpC3/-3’,其中-/3SpC3/-表示硫代磷酸修饰。
④用于富集捕获的靶序列的PCR扩增引物,具有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列:
⑤用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液(Hyb Buffer):10×SSPE,10×Denhardt’s,10mM EDTA和0.2%SDS。
⑥用于洗脱物理吸附或非特异性杂交的清洗液Wash Buffer 1:1×SSC/0.1%SDS和Wash Buffer 2:0.1M NaOH。
实施例3多样本杂交捕获的接头合成
将DNA寡核苷酸单链Adapters1-1和Adapters1-2使用超纯水稀释到100μM,然后将100μl稀释后的Adapters1-1和Adapters1-2在PCR管中混匀,然后放置在PCR仪器上,运行以下程序:95℃5min,而后关闭PCR仪使其自然降温1个小时,产物即为使用杂交捕接头,如图1所示。接头Adapters2、接头Adapters3和接头Adapters4的合成方法同接头Adapters1,分别如图2-图4所示。
实施例4一种文库构建方法
本实施例提供了一种文库构建方法,该文库中共包含4个不同的外周血样本,该文库用于基于Illumina平台的双端测序。
该实施例使用了实施例1提供的痴呆相关基因的捕获探针组,并且基于液相杂交的序列捕获技术对靶序列进行富集。液相杂交技术路线是:1)制备杂交探针库,2)使用探针对目标基因进行富集,3)将富集后的DNA序列用高通量测序仪进行测序。使用液相杂交技术能对目标基因进行有效富集,降低样本量的要求,同时也能更好地控制测序成本。
使用液相杂交技术除了能分析基因的SNP(单核苷酸突变),Indel(碱基的插入缺失)外,还能对捕获基因的CNV(拷贝数变异)进行分析。可靠的SNP、Indel和CNV的检测结果可以为解释痴呆相关疾病的患病机理和指导治疗痴呆相关疾病药物的研发和使用。
该文库构建方法包括如下步骤:
1.DNA提取和打断
使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取4个不同外周血样本中DNA。
使用Bioruptor Pico DNA打断仪,待冷循环仪温度降至4℃后,设置参数ON 30s,OFF 30s为1个循环,每10cycles为一轮,共进行3轮,每组结束后将样品置于振荡器上充分混匀,短暂离心后进行下一轮打断。
取1μl样品使用QSEP 100进行片段检测,正常打断后样品检测主峰约在150bp-200bp,如图6所示。
2.末端修复
预先从-20℃保存的试剂盒中取出10×T4PNK Buffer和Natural dNTP Mix,将其置于冰上融化并用Vortex充分混匀直至Buffer中没有任何固体不溶物,将酶从-20℃冰箱取出置于-20℃冰盒上。
在4个1.5ml的离心管中分别配制末端修复反应体系,如下所示:20℃温浴30min。反应后产物使用Ampure XP磁珠进行纯化,溶解于20μl TE中。
试剂 | 体积 |
来自1的样品 | 41μl |
10×T4PNK Buffer | 5μl |
10mM dNTP Mix | 1μl |
T4DNA Polymerase | 1μl |
T4PNK | 1μl |
Klenow Fragment | 1μl |
Total | 100μl |
3.末端加“A”(A-Tailing)
在4个1.5ml的离心管中分别配制末端加“A”反应体系,如下所示:37℃温浴30min。反应后产物使用Ampure XP磁珠进行纯化,溶解于25μl TE中。
试剂 | 体积 |
来自2的样品 | 19.5μl |
10×Blue Buffer | 2.5μl |
1mM dATP | 2.5μl |
Klenow(3’-5’exo-) | 0.5μl |
Total | 25μl |
4.Adapter连接
在4个1.5ml的离心管中配制分别Adapters连接反应体系,每个样本分别使用Adapters1-4中的一个Adapters,如下所示,N=1-4的整数。20℃温浴15min。反应后产物使用Ampure XP磁珠进行纯化,溶解于21μl TE中:
5.PCR扩增加index
对来自步骤4的样品进行PCR扩增,同时加上测序标签(index),参考图5所示。
步骤4中的4个样品分别添加接头Adaptes 1、接头Adaptes 2、接头Adaptes 3或接头Adaptes 4,4个样品添加的接头无重复。然后在该步骤中将这四种样品混合后添加相同的index序列。采用该方法可在后续杂交捕获的步骤中同时捕获多个样品,然后在测序后依据接头Adaptes 1-接头Adaptes4的序列差异将各样品的数据拆出。并且由于该文库已经将痴呆相关基因捕获,因此在后续的测序过程中并不需要生产过大的数据量,因此将每个样品构建成具有独一的index的文库,不利于后续测序时文库的定量。需要说明的是,该实施例只是以4个样品为例,可选地,也可以只将2个样品或者3个样品分别添加不同的接头Adaptes N,然后在添加相同的Index,其他步骤均与该实施例相同,本发明对此不做限制。
PCR反应体系及反应条件如下:
试剂 | 体积 |
来自步骤4的样品 | 21μl |
HiFi Mix | 25μl |
Index primers 1 | 2μl |
Index primers 2 | 2μl |
Total | 50μl |
在PCR仪中运行下列程序:
反应后产物使用Ampure XP磁珠进行纯化。溶解于50μl TE中。使用NanoDrop 1000检测PCR产物浓度。使用Qubit 3.0进行文库定量,文库浓度>25ng/μl参考为合格文库。使用QSEP 100检测,文库主峰要在220-320bp左右,主峰前后无杂峰,如图7所示。
6.杂交
将Hyb Block及Hyb Buffer从冰箱取出,冰上融化,融化后将Hyb Buffer置于金属浴上65℃预热。
按照以下体系将样品文库与Hyb block混匀,标记为B。
Component | Volume for capture |
样品文库1 | 600ng |
样品文库2 | 600ng |
样品文库3 | 600ng |
样品文库4 | 600ng |
Hyb Block | 5μl |
将Hyb Buffer置于室温融化,未加热前会有沉淀出现,混匀后置于65℃水浴锅内预热,完全溶解后(无沉淀及浑浊物)取20μl Hyb Buffer置于新的200μl PCR管内,盖好管盖,标记为A,继续置于65℃水浴锅内孵育待用。
取5μl RNase Block与2μl Probe置于200μl PCR管内,轻轻吸打混匀,短暂离心后置于冰上待用,标记为C。
设置PCR仪参数,heat lid 100℃,95℃,5min;65℃,hold;
将PCR管B置于PCR仪上,运行以上程序。
PCR仪温度降至65℃时,将PCR管A置于PCR仪上孵育,盖上PCR仪热盖;5min后,将C置于PCR上孵育,盖上PCR仪热盖;将PCR管C放置入PCR仪2min后,把移液器调至13μl,从PCR管A中吸取13μl Hyb Buffer移至PCR管C中,吸取全部PCR管B中样品移至PCR管C中,轻轻吸打10次,充分混匀,避免产生大量气泡,密封管盖,盖上PCR仪热盖,65℃孵育过夜(8-16h)。
7.捕获
提前分装Wash Buffer 2(每个捕获需要1.8ml),并置于ThermoMixer上65℃预热。
保持杂交产物PCR管C在PCR仪上,将杂交后PCR管C的产物加入到200μL Biotin-bed中,用移液器吸打6次混匀,置于旋转混匀仪上(10rpm/min)室温结合30min后将离心管置于磁力架上2min,然后移除上清液。
向离心管内加入500μL的Wash Buffer 1,轻轻吸打6次混匀,重悬磁珠,并于漩涡混合仪上振荡5s混匀样品,室温下孵育样品15min。
加入500μl的65℃预热的Wash Buffer 2,涡旋混匀5s,置于ThermoMixer上65℃孵育10min,转速800转/min进行清洗。
短暂离心,将离心管放于磁力架上2min,移除上清。重复洗2次清洗,共计3次。最后一次彻底移除除Wash Buffer2(可用10μl移液器移除残留)。
向离心管中加入25μL Nuclease-free water,从磁力架上取下离心管,轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
8富集
获后需要对DNA文库进行富集,根据下表配制Mix
Component | Volume for 4capture |
来自上一步的样品 | 30μl |
Post PCR Buffer | 18μl |
Post PCR Primer(25μM) | 1μl |
Post DNA Polymerase | 1μl |
Total volume | 50μl |
将PCR产物纯化后,文库使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量,使用QSEP 100进行文库片段长度测定,文库长度约在220-320bp之间。
实施例5痴呆相关基因筛查
本实施例提供了一种痴呆相关基因筛查的方法,该方法通过对实施例4构建的文库进行测序进行痴呆相关基因筛查。将实施例4制备得到的文库于Illumina测序平台中进行双末端测序,同时对样品上的标签序列也进行测序。通过数据分析测序数据的来源,并进行数据分析。数据通过BWA与UCSChg19数据库进行比对。结果如下表所示:
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南大学湘雅医院
杭州祥音生物医药科技有限公司
<120> 痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcgcaccag cgtgt 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cactgcggct cctca 15
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agatttggta aggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctttcccta cacgacgctc ttccgatcgt ct 32
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gacgatcgga agagcacacg tctgaactcc agtcac 36
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tctttcccta cacgacgctc ttccgatcga tt 32
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atcgatcgga agagcacacg tctgaactcc agtcac 36
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tctttcccta cacgacgctc ttccgatcct at 32
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
taggatcgga agagcacacg tctgaactcc agtcac 36
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tctttcccta cacgacgctc ttccgatcac tt 32
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agtgatcgga agagcacacg tctgaactcc agtcac 36
<210> 13
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
Claims (10)
1.一种痴呆相关基因的捕获探针组,其特征在于,所述捕获探针组捕获的基因和所述基因的染色体坐标信息如下表所示:
所述捕获探针组的设计按照如下规则:
(a)探针长度为90-150bp;
(b)探针设计合并相邻区域;
(c)探针设计区间为目标区间向两翼扩展20bp;
(d)探针参考为基因组正义链;
(e)探针两翼的共有序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;
(f)探针设计中通过比对全基因组信息确保探针特异性;
(g)探针GC含量以40%-60%为标准,GC含量变化幅度偏离标准含量每增加10%,探针在该区域探针数量增加50%。
(h)在基因组非捕获区域有近似序列的探针,每有一个近似序列,则该区域探针数量增加100%;所述近似序列为与探针序列的同源性至少为95%的序列。
2.根据权利要求1所述的捕获探针组,其特征在于,所述捕获探针组中的探针经过标记物标记,优选为经过生物素标记。
3.一种用于文库构建的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含权利要求1或2所述的捕获探针组;
优选地,所述试剂盒还包括用于富集捕获的靶序列的PCR扩增引物:所述PCR扩增引物具有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括用于多样本杂交捕获的接头,所述接头包括Adapters1、Adapters2、Adapters3和Adapters4中至少两组;
接头Adapters1由Adapters1-1及Adapters1-2经退火形成;所述Adapters1-1具有如SEQ ID NO.5所示序列,所述Adapters1-2具有如SEQ ID NO.6所示序列;
接头Adapters2由Adapters2-1及Adapters2-2经退火形成,所述Adapters2-1具有如SEQ ID NO.7所示序列,所述Adapters2-2具有如SEQ ID NO.8所示序列;
接头Adapters3由Adapters3-1及Adapters3-2经退火形成,所述Adapters3-1具有如SEQ ID NO.9所示序列,所述Adapters3-2具有如SEQ ID NO.10所示序列;
接头Adapters4由Adapters4-1及Adapters4-2经退火形成,所述Adapters4-1具有如SEQ ID NO.11所示序列,所述Adapters4-2具有如SEQ ID NO.12所示序列。
5.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括用于文库杂交前封闭的Hyb Block,所述Hyb Block包括如SEQ ID NO.13所示序列;
优选地,SEQ ID NO.13经硫代磷酸键修饰。
6.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括与探针上的标记物亲和的磁珠;
优选地,所述试剂盒中的捕获探针组中的探针经生物素标记,所述磁珠为亲和素偶联的磁珠,所述磁珠优选为链霉亲和素偶联的磁珠;
优选地,所述试剂盒还包含用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液;
优选地,所述试剂盒还包含用于洗脱物理吸附或非特异性杂交的清洗液。
7.一种文库构建方法,其特征在于,所述文库构建方法包括使用权利要求1或2所述的捕获探针组或权利要求3-6中任一项所述的试剂盒捕获痴呆相关基因。
8.根据权利要求7所述的文库构建方法,其特征在于,所述文库构建方法包括在DNA片段加接头Adapters1、接头Adapters2、接头Adapters3或接头Adapters4;
优选地,给已经加过接头的DNA文库添加测序标签,所述DNA文库中包括含有接头Adapters1的DNA片段、含有接头Adapters2的DNA片段、含有接头Adapters3的DNA片段和含有接头Adapters4的DNA片段中的至少一种DNA片段。
9.根据权利要求7或8所述的文库构建方法,其特征在于,所述文库构建包括如下步骤:
a)样品采集与提取:收集待测样品并提取基因组DNA;
b)DNA片段化:将DNA打断至150-200bp的DNA片段;
c)末端修复,对经打断后的DNA样品进行末端修复和添加A-Tailing,然后对产物进行纯化;
d)添加接头:添加接头Adapters1、接头Adapters2、接头Adapters3或接头Adapters4,然后进行纯化;
e)添加测序标签:给已经加过接头的DNA文库通过PCR扩增添加测序标签,所述DNA文库中包括含有接头Adapters1的DNA片段、含有接头Adapters2的DNA片段、含有接头Adapters3的DNA片段和含有接头Adapters4的DNA片段中的至少一种DNA片段,然后进行纯化;
f)目标基因杂交和捕获:使用Hyb Block将DNA文库进行杂交前的封闭,然后使用所述捕获探针组与文库进行杂交捕获,然后对捕获到的靶序列进行富集。
10.一种权利要求1或2所述的捕获探针组、权利要求3-6中任一项所述的试剂盒或权利要求7-9中任一项所述的文库构建方法在痴呆相关基因筛查中的用途;
优选地,所述痴呆相关基因筛查包括对权利要求7-9中任一项所述的文库构建方法构建的文库进行测序;
优选地,所述测序为基于Illumina测序平台的双末端测序,然后将测序结果与数据库进行对比。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810672906.6A CN108753954B (zh) | 2018-06-26 | 2018-06-26 | 痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810672906.6A CN108753954B (zh) | 2018-06-26 | 2018-06-26 | 痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108753954A true CN108753954A (zh) | 2018-11-06 |
CN108753954B CN108753954B (zh) | 2022-11-18 |
Family
ID=63977974
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810672906.6A Active CN108753954B (zh) | 2018-06-26 | 2018-06-26 | 痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108753954B (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109628558A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-04-16 | 北京优迅医学检验实验室有限公司 | 一种用于高通量测序检测基因突变的捕获探针及其应用 |
CN110373469A (zh) * | 2019-08-02 | 2019-10-25 | 重庆大学附属肿瘤医院 | 一种子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针及其制备方法 |
CN110684765A (zh) * | 2019-09-20 | 2020-01-14 | 浙江大学 | 痴呆相关致病基因捕获探针的筛选方法、捕获基因组和产品及应用 |
CN112226502A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-15 | 福建医科大学附属协和医院 | 一种认知障碍和运动障碍相关基因的捕获方法和试剂盒 |
CN113046431A (zh) * | 2021-03-16 | 2021-06-29 | 杭州惠煜医疗科技有限公司 | 一种用于获取遗传性帕金森病致病基因突变相关信息的检测方法 |
CN114277146A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-04-05 | 中南大学湘雅三医院 | 一种诊断腓骨肌萎缩症的探针组合、试剂盒及应用 |
Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000002919A1 (en) * | 1998-07-13 | 2000-01-20 | Merck & Co., Inc. | Growth hormone secretagogue related receptors and nucleic acids |
US6492505B1 (en) * | 1999-02-01 | 2002-12-10 | Incyte Genomics, Inc. | Composition for detection of genes encoding membrane-associated proteins |
EP1274835A1 (en) * | 2000-03-13 | 2003-01-15 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human nim1 kinase |
CN101921841A (zh) * | 2010-06-30 | 2010-12-22 | 深圳华大基因科技有限公司 | 基于Illumina GA测序技术的HLA基因高分辨率分型方法 |
CN103198238A (zh) * | 2012-01-06 | 2013-07-10 | 深圳华大基因科技有限公司 | 药物相关基因型别数据库、基因分型及药物反应检测 |
US20140329697A1 (en) * | 2011-11-15 | 2014-11-06 | Bgi Tech Solutions Co., Ltd. | Constructing method of high-throughput sequencing library and use thereof |
CN104419757A (zh) * | 2013-09-04 | 2015-03-18 | 中南大学湘雅医院 | 一种新的耳聋相关基因突变检测体系及试剂盒 |
CN105002172A (zh) * | 2015-07-31 | 2015-10-28 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 检测eapp基因表达的试剂在诊治阿尔茨海默病中的应用 |
CN105063186A (zh) * | 2011-11-10 | 2015-11-18 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于治疗、诊断和监测阿尔茨海默病的方法 |
CN105524981A (zh) * | 2014-09-28 | 2016-04-27 | 浙江大学 | 目标基因的捕获试剂盒及捕获方法 |
CN105624796A (zh) * | 2014-11-07 | 2016-06-01 | 天津华大基因科技有限公司 | 芯片及其在检测耳聋相关基因中的用途 |
CN106282361A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-01-04 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 用于捕获血液病相关基因的基因捕获试剂盒 |
CN106676169A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-05-17 | 上海派森诺医学检验所有限公司 | 一种用于乳腺癌易感基因brca1和brca2突变检测的杂交捕获试剂盒及其方法 |
CN106995936A (zh) * | 2017-05-17 | 2017-08-01 | 中南大学湘雅医院 | 一种癫痫脑病基因芯片及其应用 |
CN107937515A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-04-20 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 一种阿尔茨海默的诊疗基因靶点及其应用 |
-
2018
- 2018-06-26 CN CN201810672906.6A patent/CN108753954B/zh active Active
Patent Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000002919A1 (en) * | 1998-07-13 | 2000-01-20 | Merck & Co., Inc. | Growth hormone secretagogue related receptors and nucleic acids |
US6492505B1 (en) * | 1999-02-01 | 2002-12-10 | Incyte Genomics, Inc. | Composition for detection of genes encoding membrane-associated proteins |
EP1274835A1 (en) * | 2000-03-13 | 2003-01-15 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human nim1 kinase |
CN101921841A (zh) * | 2010-06-30 | 2010-12-22 | 深圳华大基因科技有限公司 | 基于Illumina GA测序技术的HLA基因高分辨率分型方法 |
CN105063186A (zh) * | 2011-11-10 | 2015-11-18 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于治疗、诊断和监测阿尔茨海默病的方法 |
US20140329697A1 (en) * | 2011-11-15 | 2014-11-06 | Bgi Tech Solutions Co., Ltd. | Constructing method of high-throughput sequencing library and use thereof |
CN103198238A (zh) * | 2012-01-06 | 2013-07-10 | 深圳华大基因科技有限公司 | 药物相关基因型别数据库、基因分型及药物反应检测 |
CN104419757A (zh) * | 2013-09-04 | 2015-03-18 | 中南大学湘雅医院 | 一种新的耳聋相关基因突变检测体系及试剂盒 |
CN105524981A (zh) * | 2014-09-28 | 2016-04-27 | 浙江大学 | 目标基因的捕获试剂盒及捕获方法 |
CN105624796A (zh) * | 2014-11-07 | 2016-06-01 | 天津华大基因科技有限公司 | 芯片及其在检测耳聋相关基因中的用途 |
CN105002172A (zh) * | 2015-07-31 | 2015-10-28 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 检测eapp基因表达的试剂在诊治阿尔茨海默病中的应用 |
CN106282361A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-01-04 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 用于捕获血液病相关基因的基因捕获试剂盒 |
CN106676169A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-05-17 | 上海派森诺医学检验所有限公司 | 一种用于乳腺癌易感基因brca1和brca2突变检测的杂交捕获试剂盒及其方法 |
CN106995936A (zh) * | 2017-05-17 | 2017-08-01 | 中南大学湘雅医院 | 一种癫痫脑病基因芯片及其应用 |
CN107937515A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-04-20 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 一种阿尔茨海默的诊疗基因靶点及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JOHN BECK 等: "Validation of next-generation sequencing technologies in genetic diagnosis of dementia", 《NEUROBIOLOGY OF AGING》 * |
查树伟 等: "《孕前耳聋基因筛查咨询知识》", 31 July 2017, 江苏大学出版社 * |
贾智英 等: "方正银鲫微卫星序列的筛选及PCR扩增产物的初步检测", 《中国水产科学》 * |
郭雄 等: "《软骨分子生物学基础与临床应用》", 31 May 2012, 西安交通大学出版社 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109628558A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-04-16 | 北京优迅医学检验实验室有限公司 | 一种用于高通量测序检测基因突变的捕获探针及其应用 |
CN110373469A (zh) * | 2019-08-02 | 2019-10-25 | 重庆大学附属肿瘤医院 | 一种子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针及其制备方法 |
CN110684765A (zh) * | 2019-09-20 | 2020-01-14 | 浙江大学 | 痴呆相关致病基因捕获探针的筛选方法、捕获基因组和产品及应用 |
CN112226502A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-15 | 福建医科大学附属协和医院 | 一种认知障碍和运动障碍相关基因的捕获方法和试剂盒 |
CN113046431A (zh) * | 2021-03-16 | 2021-06-29 | 杭州惠煜医疗科技有限公司 | 一种用于获取遗传性帕金森病致病基因突变相关信息的检测方法 |
CN114277146A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-04-05 | 中南大学湘雅三医院 | 一种诊断腓骨肌萎缩症的探针组合、试剂盒及应用 |
CN114277146B (zh) * | 2021-12-28 | 2024-05-07 | 中南大学湘雅三医院 | 一种诊断腓骨肌萎缩症的探针组合、试剂盒及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108753954B (zh) | 2022-11-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108753954A (zh) | 痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途 | |
CN103608818B (zh) | 非侵入性产前倍性识别装置 | |
CN107077537B (zh) | 用短读测序数据检测重复扩增 | |
CN106795562A (zh) | Dna混合物中的组织甲基化模式分析 | |
CN107475371B (zh) | 发现药物基因组生物标志物的方法 | |
CN108138227A (zh) | 使用具有独特分子索引(umi)的冗余读段在测序dna片段中抑制误差 | |
CN109797197A (zh) | 一种单链分子标签接头及单链dna建库方法及其在检测循环肿瘤dna中应用 | |
JP2018514205A (ja) | 次世代の塩基配列分析技法を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法 | |
CN107075730A (zh) | 循环核酸的鉴定及用途 | |
CN108485940A (zh) | 拷贝数变异的检测和分类 | |
CN108350500A (zh) | 用于检测染色体异常的核酸和方法 | |
CN106570349B (zh) | 用于目标区域捕获高通量测序的特异性肿瘤探针区域设计方法和装置以及探针 | |
CN105132407B (zh) | 一种脱落细胞dna低频突变富集测序方法 | |
CN108779487A (zh) | 用于检测甲基化状态的核酸和方法 | |
CN103173441A (zh) | 线粒体全基因组dna扩增、引物、测序及突变检测 | |
CN105734679B (zh) | 核酸靶序列捕获测序文库的制备方法 | |
CN110396539A (zh) | 用于检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒和方法 | |
CN109576346A (zh) | 高通量测序文库的构建方法及其应用 | |
CN106498036A (zh) | 一种用于高通量测序检测的药物基因组snp变异文库的构建方法及其应用 | |
CN112955958A (zh) | 用于确定短串联重复区域中的变化的基于序列图的工具 | |
CN106701936A (zh) | 乳腺癌易感基因brca1和brca2检测试剂盒及方法 | |
CN115989544A (zh) | 用于在基因组的重复区域中可视化短读段的方法和系统 | |
CN105779432A (zh) | 试剂盒及其用途 | |
CN105950709A (zh) | 试剂盒、建库方法以及检测目标区域变异的方法及系统 | |
KR102112951B1 (ko) | 암의 진단을 위한 ngs 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |