CN109797197A - 一种单链分子标签接头及单链dna建库方法及其在检测循环肿瘤dna中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单链分子标签接头及单链DNA建库方法及其在检测循环肿瘤DNA中应用，单链分子标签接头，包括：14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列、和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基“U”，该单链核酸序列经退火变性会形成茎环结构；本发明通过单链DNA建库，解决现有检测技术中对液态活检特别是ctDNA片段短、浓度低、碎片化、灵敏度低技术问题；实现准确辨别基因组坐标始末位点相同的测序reads是来自同一还是多个原始细胞释放出来的cfDNA，并将来源于同一个细胞的原始正负链的测序reads配对起来分析的目的，从而降低测序的重复劳动，提高对假阳性突变的分辨率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是一种单链分子标签接头及单链DNA建库方法及其在检测循环肿瘤DNA中应用。
背景技术
血浆游离DNA又称cfDNA(cell free DNA)，是指外周中游离于细胞外的DNA，cfDNA的来源既包括正常细胞，也有异常细胞(如肿瘤细胞)或者外源的微生物(如病毒DNA)，具体包括自身正常细胞代谢的凋亡小体，肿瘤细胞碎片，外泌体等。
循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA)ctDNA是指外周循环血中含有多种与癌症相关的突变基因，主要由肿瘤细胞脱落或凋亡后释放出而进入循环系统的DNA。ctDNA来自肿瘤细胞本身，是一种高度灵敏、特异性的特征性肿瘤生物标志物，可通过对其进行基因检测，进行定性、定量以及动态追踪观察肿瘤中发生突变的基因，从而为患者治疗前肿瘤分子分型、靶向治疗决策、治疗过程中肿瘤动态和负荷变化评估，以及实时监测治疗有效性等方面提供有效信息。来自宾夕法尼亚大学Abramson癌症中心的研究人员发现，与单独的实体组织NGS 检测相比，NGS液体活检能够识别出更多的非小细胞肺癌突变，帮助临床发现更多患者的靶向突变。在检测的靶向突变数量上，液体活检几乎是单独组织活检的两倍。此外，研究结果还表明，通过液体活检检测出靶向突变的患者，对靶向治疗的反应良好，86％的患者完全反应或部分反应，或保持稳定状态。“实体组织活检仍然是准确诊断的关键，但是我们现在已经证明，液体活检项目可以增加诊断价值，而且当实体组织活检无法进行时，它可以作为一种可行的替代方法”，研究作者Carpenter说道，“鉴于靶向治疗的快速发展，液体活检应该被纳入常规护理标准。”
然而，精确测序ctDNA存在三个巨大的技术障碍：首先是血浆中的ctDNA含量极低，且多为小片段分子特点，部分为受损伤的双链DNA和单链DNA，导致提取较为困难，损失量大，检测灵敏度较低，因此限制了其在临床上的应用。其次是由于后续的建库过程中经过末端修复、腺苷酸化、加接头以及PCR扩增等多步骤后，样本会损失更多，进一步限制了检测灵敏度，因此增加每步实验的效率对提高ctDNA的检出灵敏度都至关重要。最后，基于PCR方法的特意扩增或捕获，随着测序深度的提高而存在大量背景噪音，已严重限制了靶向测序技术在更高数据精度要求的检测。
对于某些低丰度，损伤的双链DNA和单链DNA的检测，以这些额外单链DNA作为模板的话可以显著增加目标DNA的模板量，有利于最终目的DNA捕获。Gansauge,M T等发明了一种单链DNA建库，该方法在单链模板和单链接头的连接步骤，使用的为Circ连接酶II。该方法解决的这种短片段易降解的古生物DNA的建库问题，但连接效率为较低，需要较长的连接时间，成本高。于是他们后续进行了优化，推出新版本ssDNA2.0，其更换了接头引物，同时将Circ连接酶II用常规的T4 DNA连接酶替换，模板用量降低、文库产量和富集度都有扩高，其成本降低近7倍。从建库的效率上来讲，单链建库建库要高很多，相对于基于454平台的双链建库效率要高6倍左右，测序深度高1.9倍左右。
ctDNA含量非常少，以10ml外周血为例，从中可以提取到cfDNA含量约30ng，ctDNA在所有cfDNA中的比例非常少，按1％计算,只有约300pg，也就是大约45个细胞裂解的DNA量，实际情况下，如果是做早期筛查，ctDNA的含量可能相当于5000个细胞中只有1-2个细胞是肿瘤细胞，所以对检测方法的敏感性要求非常高。
同时由于DNA的氧化损伤或脱氨基损伤、PCR扩增中DNA聚合酶引入的突变(每个碱基出现错误的概率在10-6～10-4之间)，尤其是在第一轮扩增引入错误，以及测序仪器读取碱基时引入的错误，测序得到的每个碱基出现错误的概率在10-3～10-2之间，即每1000个碱基就会出现1 至10个错误碱基。因此，低于该频率的基因变异将无法准确检测。
目前，已经有针对超低频基因变异检测的建库测序方法，主要是在原始双链DNA分子模板两端引入分子标签序列unique molecular identifiers(UMI)。根据这些分子标签，可以在去除冗余的过程中将PCR和测序等过程中带来的系统突变排除掉，可以大大降低低频突变的假阳性率。已有大量文章或商业化产品引入分子标签技术。在没有分子条形码技术之前，受制于常规技术的局限，二代测序的用户通常将变异检测域值设置为3-5％的等位基因频率，而SureSelect XT HS大大提高了变异检出的灵敏度，可以检测突变频率<1％的稀有变异。
因此，需要结合上面的两项技术，对现有的超低频基因变异检测的建库测序方法进行改进，以提高对超低频基因变异检测的灵敏度，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种单链分子标签接头及单链DNA建库方法及其在检测循环肿瘤DNA中应用，本发明通过单链DNA建库，解决现有检测技术中对液态活检特别是ctDNA片段短、浓度低、碎片化、灵敏度低技术问题；其次基于分子标签技术和单链文库建库特点，实现准确辨别基因组坐标始末位点相同的测序reads是来自同一还是多个原始细胞释放出来的cfDNA，并将来源于同一个细胞的原始正负链的测序reads配对起来分析的目的，从而降低测序重复工作，提高对假阳性突变的分辨率。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种单链分子标签接头，包括：14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列、和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火变性会形成茎环结构。
一种单链DNA建库方法，包括如下步骤：
3’末端接头的制备；
5’末端接头的制备；
样本核酸在磷酸酶的作用下去磷酸化及变性处理：高温处理，将原来双链的DNA变性为单链DNA；
3’端接头连接：将单链DNA产物和3’端双链DNA接头进行碱基配对，并头进行连接反应；
3’端接头连接链霉亲和素：将连接反应得到的连接产物通过链霉亲和素磁珠进行吸附，固定在链霉亲和素磁珠上；
延伸：将连接过链霉亲和素的单链连接产物为模板，将3’末端接头作为引物进行延伸，获得双链DNA产物；
5’端接头连接：将双链DNA产物和5’端双链DNA接头进行分子间的双链连接；
链霉亲和素清洗及文库洗脱回收。
前述的一种单链DNA建库方法，
3’末端接头的制备的具体过程如下：
制备PCR试剂，PCR试剂的配方包括：
用移液器将PCR试剂混匀，瞬时离心将样品收集至管底，再将样品置于PCR仪中，PCR 程序如下：
95℃ 1min，
95℃-10℃ -0.1℃/sec，
10℃ 5min。
前述的一种单链DNA建库方法，
上链序列采用CL78(SEQ ID NO.1)，序列为：
5’Pho-AGATCGGAAG[C3Spacer]10-TEG-biotin3’，该接头序列5’端磷酸化修饰，3’端生物素化修饰，中间引入10个C3相隔臂和TEG分子；
下链序列采用CL93(SEQ ID NO.2)，序列为：
5’AmC12-AACTTCCGATCTNNNNNN-AmC7 3’，该接头序列5’端采用amino linker C12修饰，3’端含有6个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C7修饰；
下链序列采用CL106(SEQ ID NO.3)，序列为：
5’AmC12-AACTTCCGATCTNNNNNN-AmC3 3’，3’端含有6个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C3修饰；
下链序列采用CL110(SEQ ID NO.4)，序列为：
5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中间含有aminolinker C12修饰，3’端含有8个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C6修饰；
下链序列采用CL136(SEQ ID NO.5)，序列为：
5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中间含有amino linker C12修饰，3’端含有7个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C6修饰；
下链序列采用CL137(SEQ ID NO.6)，序列为：
5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中间含有amino linker C12修饰，3’端含有8个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C6修饰。
前述的一种单链DNA建库方法，
5’末端接头的制备的具体过程如下：
PCR试剂包括：
用移液器将PCR试剂混匀，瞬时离心将样品收集至管底，再将样品置于PCR仪中，PCR 程序如下：
95℃ 1min，
95℃-14℃ -0.1℃/sec，
14℃ 5min。
前述的一种单链DNA建库方法，
上链序列或下链序列为：接头序列Bell_adatpor或接头序列Bell_TA_adapter；
Bell_adatpor的序列为：
5’GAGCACACGTCTGATANNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAUATCTCTCTCAGAC GTGTGCTC 3'(SEQ ID NO.9)，
Bell_adatpor的序列包含14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火后形成平末端的茎环结构；
Bell_TA_adapter的序列为：
5’GAGCACACGTCTGATANNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAUATCTCTCTCA GACGTGTGCTCT 3'(SEQ ID NO.10)，
Bell_TA_adapter的序列包含14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火后形成带T的粘末端茎环结构。
前述的一种单链DNA建库方法，
上链序列采用CL53(SEQ ID NO.7)，序列为：5’CGACGCTCTTC-ddC3'，3'端双脱氧修饰；
下链序列采用CL73(SEQ ID NO.8)，序列为：
5’Pho-GGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAG*T*G*T*A 3'，3'端末位4个碱基硫代修饰。
前述的一种单链DNA建库方法，
延伸的具体过程如下：
配制延伸反应液，延伸反应液的配方包括：
将具有连接过链霉亲和素的单链连接产物的磁珠加入延伸反应液，再加入2～5μl聚合酶，混匀，瞬时离心将样品收集至管底，再将样品置于PCR仪中，PCR程序如下：
25℃ 5min，
35℃ 25min；
洗涤，移除上清；
聚合酶采用Klenow fragment或Klenow fragment exo-。
前述的一种单链DNA建库方法，
3’末端接头的制备；
5’末端接头的制备；
样本核酸在磷酸酶的作用下去磷酸化及变性处理：高温处理，将原来双链的DNA变性为单链DNA；
3’端接头连接：将单链DNA产物和3’端双链DNA接头进行碱基配对，并头进行连接反应；
3’端接头连接链霉亲和素：将连接反应得到的连接产物通过链霉亲和素磁珠进行吸附，固定在链霉亲和素磁珠上；
延伸：将连接过链霉亲和素的单链连接产物为模板，3’端接头已知序列设计引物进行延伸，获得双链DNA产物；
5’端接头连接：将双链DNA产物和5’端双链DNA接头进行分子间的双链连接；
去除脱氧尿嘧啶核苷；
链霉亲和素清洗及文库洗脱回收。
一种单链分子标签接头在检测循环肿瘤DNA中的应用，包括如下内容：
提取检测血浆中游离的cfDNA；
3’末端接头的制备；
采用单链分子标签接头进行5’末端接头的制备，所述单链分子标签接头，包括：14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列、和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火变性会形成茎环结构；
样本核酸在磷酸酶的作用下去磷酸化及变性处理：高温处理，将原来双链的DNA变性为单链DNA；
3’端接头连接：将单链DNA产物和3’端双链DNA接头进行碱基配对，并头进行连接反应；
3’端接头连接链霉亲和素：将连接反应得到的连接产物通过链霉亲和素磁珠进行吸附，固定在链霉亲和素磁珠上；
延伸：将连接过链霉亲和素的单链连接产物为模板，3’端接头已知序列设计引物进行延伸，获得双链DNA产物；
5’端接头连接：将双链DNA产物和5’端双链DNA接头进行分子间的双链连接；
链霉亲和素清洗及文库洗脱回收。
本发明的有益之处在于：
本发明提供了针对液态活检特别是cfDNA二代测序文库构建时，有效回收单链和受损伤的模板DNA，进行独特的单链建库的二代测序文库构建。现在的cfDNA二代测序技术，绝大部分用常规的双链DNA文库构建的方法，只能够检测没有受损伤的双链DNA，本发明的方法通过单链建库的方法成功实现单链和受损伤的cfDNA的建库，同时模板用量降低、文库产量和富集度都有扩高。
本发明通过单链建库，将起始模板放大，可以用于10-100个位点甚至1000个位点的靶向捕获/靶向扩增。同时，由于cfDNA断裂的随机性，基于单链建库后，通过正反引物配合通用引物，能很大程度提供捕获的效率，特别是基于PCR方法特意扩增捕获，单侧引物结合概率是双侧引物结合概率的一倍。
本发明提供了8个随机核苷酸分子标签接头，基因组坐标始末位点相同的DNA片段加上完全相同的8个随机核苷酸分子标签接头的概率极低，那么对于基因组坐标始末位点相同的测序reads，就很容易判断它们来自同一还是多个原始细胞释放出来的cfDNA，从而降低测序重复工作。同时，对单一单链文库进行建库，可以有效的将来自同一个双链DNA模板的正链和负链匹配，排除PCR导致的错误，提高了对假阳性的分辨率，从而保证了对cfDNA中超低频突变的检测能力并矫正其扩增错误和测序错误。经过分子标签技术、背景去噪和正负链修正结合去噪之后，其背景噪音降到万分之一，且可以检测突变频率为0.02％的样本，与目前基于杂交探针法捕获技术检测灵敏度相当(即0.02％-0.05％)。因此，能有效地降低大量背景噪音，降低假阳性率、提高结果的准确性。
附图说明
图1为核酸序列Bell_adaptor退火后二级结构图；
图2为核酸序列Bell_TA_adaptor退火后二级结构图；
图3为线性5’末端接头构建文库的流程图，其中Single strand dissociation为单链变性之后再Dephosphorylation(去磷酸化)，经过Primer annealing(引物退火)及T4DNA ligase(T4 DNA 连接酶)连接，然后固定到Streptavidin magnetic beads(链霉亲的磁珠)，后续经Primer annealing(引物退火)及Klenow fragmen的amplification(扩增过程)，形成双链，与亚玲结构的接头(8-nt barcode),在T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)将接头连接上去，5端接头被User酶(User digestion)移除U碱基，最后用P5/P7引物扩增文库(P5primer/P7primer)；
图4为茎环接头构建的平末端文库的流程图，其中Single strand dissociation为单链变性之后再Dephosphorylation(去磷酸化)，经过Primer annealing(引物退火)及T4 DNA ligase(T4 DNA 连接酶)连接，然后固定到Streptavidin magnetic beads(链霉亲的磁珠)，后续经Primer annealing(引物退火)及Klenow fragmen的amplification(扩增过程)，形成双链，与亚玲结构的接头(8-nt barcode),在T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)将接头连接上去，5端接头被User酶(User digestion)移除U碱基，最后用P5/P7引物扩增文库(P5primer/P7primer)；
图5为茎环接头构建的TA连接文库的流程图，其中Single strand dissociation为单链变性之后再Dephosphorylation(去磷酸化)，经过Primer annealing(引物退火)及T4 DNA ligase(T4 DNA 连接酶)连接，然后固定到Streptavidin magnetic beads(链霉亲的磁珠)，后续经Primer annealing(引物退火)及Klenow fragmen的amplification(扩增过程)，形成双链，与亚玲结构的接头(8-nt barcode),在T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)将接头连接上去，5端接头被User酶(User digestion)移除U碱基，最后用P5/P7引物扩增文库(P5primer/P7primer)；
图6为基于单链文库构建的文库大小分布图，其中横坐标为样本迁移的时间(Migration time)，纵坐标是为样本的荧光信号(RFU)；
图7为线性5’末端接头构建文库read覆盖度全图；
图8为茎环接头构建的平末端文库read覆盖度全图；
图9为茎环接头构建的TA连接文库read覆盖度全图；
图10为本发明实验三中ddPCR和单链建库等位基因突变频率比较示意图，其中横坐标为数字PCR检测到的突变频率(multant Frequence(％))，纵坐标是为基于NGS检测到的突变频率 (multant Frequence(％))；
图11为本发明实验四中来源于血浆中游离的ctDNA经单链建库，靶向扩增后的文库与来源于肿瘤基因组(tumor DNA,tDNA)的10个位点的突变信息比对结果图，其中横坐标为基因，纵坐标为突变频率。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种单链分子标签接头，包括：14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列、和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火变性会形成茎环结构。
作为一种实施例，包括：Bell_adatpor和Bell_TA_adapter；
Bell_adatpor的序列为：
5’GAGCACACGTCTGATANNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAUATCTCTCTCAGAC GTGTGCTC 3'(SEQ ID NO.9)，
Bell_adatpor的序列包含14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火后形成平末端的茎环结构；如图1为核酸序列Bell_adaptor退火后二级结构图。
Bell_TA_adapter的序列为：
5’GAGCACACGTCTGATANNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAUATCTCTCTCA GACGTGTGCTCT 3'(SEQ ID NO.10)，
Bell_TA_adapter的序列包含14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火后形成带T的粘末端茎环结构，图2为核酸序列Bell_TA_adaptor退火后二级结构图。
作为一种实施例，如下演示一种单链DNA建库方法，包括如下步骤：
一，3’末端接头的制备
用移液器轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，按以下程序操作。
需要说明的是：上文只是一种实施例，上链序列和下链序列还可以采用如下所示的实施例；
上链序列采用CL78(SEQ ID NO.1)，序列为：
5’Pho-AGATCGGAAG[C3Spacer]10-TEG-biotin3’，该接头序列5’端磷酸化修饰，3’端生物素化修饰，中间引入10个C3相隔臂和TEG分子；
下链序列采用CL93(SEQ ID NO.2)，序列为：
5’AmC12-AACTTCCGATCTNNNNNN-AmC7 3’，该接头序列5’端采用amino linker C12修饰，3’端含有6个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C7修饰；
下链序列采用CL106(SEQ ID NO.3)，序列为：
5’AmC12-AACTTCCGATCTNNNNNN-AmC3 3’，3’端含有6个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C3修饰；
下链序列采用CL110(SEQ ID NO.4)，序列为：
5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中间含有aminolinker C12修饰，3’端含有8个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C6修饰；
下链序列采用CL136(SEQ ID NO.5)，序列为：
5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中间含有amino linker C12修饰，3’端含有7个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C6修饰；
下链序列采用CL137(SEQ ID NO.6)，序列为：
5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中间含有amino linker C12修饰，3’端含有8个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C6修饰。
二，5’末端接头的制备
上链序列采用CL53(SEQ ID NO.7)，序列为：5’CGACGCTCTTC-ddC3'，3'端双脱氧修饰；
下链序列采用CL73(SEQ ID NO.8)，序列为：
5’Pho-GGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAG*T*G*T*A 3'，3'端末位4个碱基硫代修饰。
优选接头序列Bell_adatpor，优选接头序列Bell_TA_adatpor，
上链序列或下链序列为：接头序列Bell_adatpor或接头序列Bell_TA_adapter；
Bell_adatpor的序列为：
5’GAGCACACGTCTGATANNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAUATCTCTCTCAGAC GTGTGCTC 3'(SEQ ID NO.9)，
Bell_adatpor的序列包含14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火后形成平末端的茎环结构；
Bell_TA_adapter的序列为：
5’GAGCACACGTCTGATANNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAUATCTCTCTCA GACGTGTGCTCT 3'(SEQ ID NO.10)，
Bell_TA_adapter的序列包含14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火后形成带T的粘末端茎环结构。
其体系如下：
用移液器轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，按以下程序操作。
三，样本核酸在磷酸酶的作用下去磷酸化及变性处理；
用移液器轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，按以下程序操作。
立即冰浴。
四，3’端接头连接；
用移液器轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，37℃反应1小时。
五，3’端接头连接链霉亲和素；
取20μl的MyOne C1磁珠(Thermo Fisher Scientific)，用500μl的1×BWT+SDS缓冲液(1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0),0.05％Tween-20,0.5％SDS)清洗2遍，最后用250μl的1×BWT+SDS悬浮，将上述连接产物加入到磁珠中，于37℃反应20min。反应结束之后，于磁力架上移除上清，加入0.1×BWT+SDS(0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0),0.05％Tween-20,0.5％SDS)洗涤一次，并去除上清，加入100μl 0.1×SSC+SDS 缓冲液(15mM NaCl,100mM Sodium Citrate,0.1％SDS)洗涤一次，并去除上清。最后用200μl 0.1×BWT(0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH8.0),0.05％Tween-20)悬浮，于磁力架上移除上清。
六，延伸；
配制延伸反应液
其中CL130序列为5’GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC*GA*TC*T 3'(SEQ IDNO.11)，3'端末位4个碱基硫代修饰。将上述得到的磁珠中加入延伸反应液，于65℃反应2min，后立即冰浴2-5min，加入2μl Klenow fragment(10U/μl)，作为一种优选，延伸反应的聚合酶可以选用Klenow fragment(Thermo Fisher Scientific)，也可以选用Klenowfragment exo-(Thermo Fisher Scientific)。用移液器轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，按以下程序操作。
反应结束之后，于磁力架上移除上清，加入0.1×BWT+SDS(0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0),0.05％Tween-20,0.5％SDS)洗涤一次，并去除上清，加入100μl 0.1×SSC+SDS缓冲液(15mM NaCl,100mM Sodium Citrate,0.1％SDS)洗涤一次，并去除上清。最后用200μl 0.1×BWT(0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH8.0),0.05％ Tween-20)悬浮，于磁力架上移除上清。
七，5’端接头连接；
配制延伸反应液
用移液器移入上述磁珠中，并轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于 PCR仪中，22℃反应1h。
反应结束之后，于磁力架上移除上清，加入0.1×BWT+SDS(0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0),0.05％Tween-20,0.5％SDS)洗涤一次，并去除上清，加入100μl 0.1×SSC+SDS缓冲液(15mM NaCl,100mM Sodium Citrate,0.1％SDS)洗涤一次，并去除上清。最后用200μl 0.1×BWT(0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH8.0),0.05％ Tween-20)悬浮，于磁力架上移除上清。
八，去除脱氧尿嘧啶核苷，优选NEB的USER酶(NEB China,M5505S)。
往步骤七的离心管中加入5μl的10×CutSmart，并加入43μl双蒸水，并轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，加入2μl的User酶，37℃反应30min。反应结束之后，于磁力架上移除上清，加入0.1×BWT+SDS(0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH8.0),0.05％Tween-20,0.5％SDS)洗涤一次，并去除上清，加入100μl 0.1×SSC+SDS缓冲液(15 mM NaCl,100mM Sodium Citrate,0.1％SDS)洗涤一次，并去除上清。最后用200μl 0.1×BWT (0.1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0),0.05％Tween-20)悬浮，于磁力架上移除上清。
九，文库洗脱回收；
往磁珠中加入50μl的EBT(10mM Tris-HCl(pH 8.0),0.05％Tween-20)轻轻吹打混匀，将样品置于PCR仪中，95℃反应1min，于磁力架上吸取上清保存，即为文库。
如图3-4所示，△实验一，应用分子标签接头进行cfDNA文库构建及检测，且对比使用3 种5’末端接头，双链接头CL53/CL73，Bell_adaptor，Bell_TA_adaptor，得到的cfDNA文库的 Barcode数，验证本发明的单链分子标签接头能够使得文库具有优秀的覆盖率。
实验过程如下所示：
1.cfDNA的提取：
根据QIAGEN公司提供的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)试剂盒的使用说明书，使用该试剂盒对血浆中游离的cfDNA进行提取。
2.cfDNA文库的构建：
参考上文实施例，将步骤3的DNA变成cfDNA，即
反应制备3份，分别用于3种5’末端接头，即双链接头CL53/CL73，Bell_adaptor，Bell_TA_adaptor。其它步骤同其中实施例1，步骤7)结束之后，Bell_adaptor和Bell_TA_adaptor 两种文库，增加一个步骤：脱氧尿嘧啶核苷的去除，优选NEB的USER酶(NEB China,M5505S)。构建出三种cfDNA文库，即平端cfDNA文库，Bell平端cfDNA文库，Bell_TA_cfDNA文库。
3.文库质检：
以文库分子为模板，进行PCR扩增，PCR体系如下
SEQ ID NO.12：
ACACTCTTTCCCTACACGAC；
SEQ ID NO.13：
GTGACTGGAGTTCAGAGTGT；
PCR反应程序：
PCR产物进行片段分析仪Qsep100进行分析，结果如图6，片段大小270bp左右，符合预期大小。
4.上机测序：
按照illumina novaSeq 6000测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及150bp双端测序。
通过illumina测序仪对PCR产物进行测序，每个样本测序深度大约10层，50G数据量。
实验结果分析：从图7-9中可以看出文库具有良好的均一性和全基因组read覆盖度。其中又对Bell平端cfDNA文库，Bell_TA cfDNA文库的Barcode数进行了统计，分别为87581个和 98845个,在均一性和全基因组read覆盖度相似的情况下，Bell_TA cfDNA文库的Barcode数优于 Bell平端cfDNA文库的Barcode数，后续接头优选Bell_TA的。
△实验二，对检测方法的检测限进行测试；
应用分子标签接头进行超低频基因变异检测过程如下：
使用标准品cell-Free DNA reference standard(苏州安可济生物科技有限公司， AGSTD-SZ-TP-01)进行验证，其含有突变频率5％,1％,0.1％和0％核酸分子，核酸片段大小为 150bp±10％(135～165bp)。模板信息如下：
本实施案例对检测方法的检测限进行测试，按照以下步骤进行
1.低频突变标准品准备
使用上述cfDNA标准品进行EGFR基因21外显子位点检测，突变频率分别为0％、0.1％、 1％、5％，分别命名为：S0、S1、S2、S3。
2.文库构建
S0、S1、S2、S3分别安排实施例2中的建库方法进行单链文库构建，构建起始模板量为 30ng，采用Bell_TA_adapter接头作为5’末端接头。
3.文库的定量
按照Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher Scientific,Q32854)说明书进行操作，测定文库的浓度。
4.靶位点的PCR扩增
设计合成858位点正向引物5EGFR858F(SEQ ID NO.14)及反向引物3EGFR858R(SEQID NO.15)、790位点正向引物5EGFR790F(SEQ ID NO.16)及反向引物3EGFR790R(SEQ IDNO.17)、750位点正向引物5EGFR750F(SEQ ID NO.18)及反向引物3EGFR750R(SEQ IDNO.19)。
以构建的单链文库为模板，进行靶向扩增，PCR体系如下：
每个位点分别用相应的F引物或R引物扩增一管，轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，PCR程序如下：
PCR结束之后，取1μlPCR产物作第二轮接头特异性扩增，PCR体系如下
P7引物中含有不同的index序列，区别不同样本。其中同一个突变频率的样本用同一个 index序列，同时同一突变频率的正负链引物扩增的样本，也以不同的index区分开。
轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，PCR程序如下：
使用60μl Ampure XP beads(Beckman,A63881)进行纯化，30μl Elution缓冲液洗脱；
5.文库的质检与定量
按照KAPA Library Quantifcation Kit(Kapa biosystems,Cat No.KK4854)
说明书进行操作，使用伯乐CFX 96Touch实时荧光定量PCR仪检测，参试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量。建库文库达到上机要求浓度，可用于上机测试。
6.上机测序：
按照illumina novaSeq 6000测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及150bp双端测序。将高通量测序下机数据经过质控过滤后，进行BWA比对，用于评估文库的特异性，分析结果见下表:
其中F或R代表以正向引物或反向引物构建的文库。
同时分析了样本的突变频率检测情况，如下表:
实验结果分析：经过分子标签技术、背景去噪和正负链修正结合去噪之后，其背景噪音降到万分之一，测定数据与理论数据一致性达95％以上；且可以检测突变频率为0.1％以上的样本，说明采用单链DNA建库的方法灵敏度高。
实验三，ddPCR和单链建库等位基因突变频率比较实验；
应用分子标签接头进行多位点的超低频基因变异检测过程如下：
本实施例以以下基因突变为例对本发明进行验证：EGFR基因突变c.2573T＞G，p.L858R、c.2369C＞T，T790M、del E746-A750；KRAS基因突变c.34G＞T，p.G12C；NRAS 基因突变c.35G＞A，p.G12D，NRAS基因突变c.182A＞G，p.Q61R；BRAF基因突变c.1799T ＞A，p.V600E；PIK3CA基因突变c.1624G＞A，p.E542K，PIK3CA基因突变c.3140A＞G， p.H1074R，具体信息如下：
1.样本制备与验证：将上述8株细胞系及野生型细胞株NCI-H596，将所有突变
位点均经sanger测序鉴定。将上述突变型DNA(除A549和NCI-H2347以外)分别用野生型DNA 稀释成40％的比例，将A549和NCI-H2347基因组DNA用野生型DNA稀释成80％的比例，然后八种稀释好的DNA按1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合，使得每一种突变型DNA的比例均为10％，接着用野生型DNA倍比稀释使得最终突变型与野生型的比例为1∶100，1∶1000， 1∶10000，配制野生型的DNA做为对照，比例定为100％，并混合好的比例的DNA经covaris S220打断至200～300bp，分别为S0，S1，S2，S3。4个浓度比例DNA，对9个位点的突变频率进行数字PCR和二代测序验证，其位点突变频率为1％均值(三个重复)是1％±40％，位点突变频率小于1％均值(三个重复)是突变频率±50％。
2.单链文库的构建
3种浓度(S0，S1，S2，)比例分别安排实施例2中的建库方法进行单链文库构建，构建起始模板量为30ng，采用Bell_TA_adapter接头作为5’末端接头。
3.文库的定量
按照Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher Scientific,Q32854)说明书进行操作，测定文库的浓度。
4.靶位点引物设计与PCR扩增
设计合成10个位点的正反引物，其引物名称和引物序列如下：
上述引物均不包括P7端部分接头序列
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，实际引物合成时会在引物5’端加上上述P7端部分接头序列。同时，DCK9和PPDPF两个位点为内参对照，其在三个文库中突变频率为100％，作为体系的假阳性内参对照。
以构建的单链文库为模板，进行靶向扩增，PCR体系如下：
SEQ ID NO.20：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT CT；
每管分别用相应的10个位点正向引物池F引物或反向引物池R引物各扩增一管，轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，PCR程序如下：
PCR结束之后，取1μlPCR产物作第二轮接头特异性扩增，PCR体系如下
SEQ ID NO.20：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT CT；
SEQ ID NO.21：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCC；
P7引物中含有不同的index序列，区别不同样本。其中同一个突变频率的样本用同一个index序列，同时同一突变频率的正负链引物扩增的样本，也以不同的index区分开。
轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，PCR程序如下：
使用60μl Ampure XP beads(Beckman,A63881)进行纯化，30μl Elution缓冲液洗脱；
7.文库的质检与定量
按照KAPA Library Quantifcation Kit(Kapa biosystems,Cat No.KK4854)
说明书进行操作，使用伯乐CFX 96Touch实时荧光定量PCR仪检测，参试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量。建库文库达到上机要求浓度，可用于上机测试。
8.上机测序：
按照illumina novaSeq 6000测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及150bp双端测序。将高通量测序下机数据经过质控过滤后，进行BWA比对，用于评估文库的。
实验结果：
对NGS的结果进行BWA比对，标准品的实际基因突变频率的实验结果如下表和图10所示：
与标准品的实际基因突变频率比较如图10：
结果分析：经过分子标签技术、背景去噪和正负链修正结合去噪之后，其背景噪音降到万分之一，测定数据与理论数据一致性达95％以上，且可以检测突变频率为0.02％的样本，能达到数字PCR检测的灵敏度，同时跟目前基因杂交探针法捕获技术检测灵敏度相当(即 0.02％-0.05％)。设定了两个内参基因，排除建库过程中存在假阴性的结果。同时，基于NGS 的适用性及单次单价方面均比数据PCR存在优势。
△实验四，ctDNA经单链建库靶向扩增后的文库与来源于肿瘤基因组(tumor DNA,tDNA) 的10个位点的突变信息进行比对实验：
应用分子标签接头进行临床样本基因变异检测的过程如下：
1.检测样本DNA的提取：
收集临床10例肺癌组织样本及对应血液样本，组织样本DNA提取和QIAGEN公司提供的DNeasy Blood&Tissue Kit，按照提取试剂盒的说明书进行操作。血液cfDNA提取根据QIAGEN公司提供的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)试剂盒的使用说明书进行操作。提取得到的组织DNA用Nanodrop检测OD260/OD280应介于1.8～2.1，血液游离DNA片段大小用2100检测，片段在150～200bp，血液游离DNA用Qubit 2.0定量。
2.单链文库的构建
血液游离DNA分别安排实施例2中的建库方法进行单链文库构建，构建起始模板量为20 ng，采用Bell_TA_adapter接头作为5’末端接头。
3.文库的定量
按照Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher Scientific,Q32854)说明书进行操作，测定文库的浓度。
4.靶位点引物设计与PCR扩增
设计合成10个位点的正反引物，其引物名称和引物序列如下：
上述引物均不包括P7端部分接头序列GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，实际引物合成时会在引物5’端加上上述P7端部分接头序列。同时，DCK9和PPDPF两个位点为内参对照，其在四个文库中突变频率为100％，作为体系的假阳性内参对照。
以构建的单链文库为模板，进行靶向扩增，PCR体系如下：
每管分别用相应的10个位点正向引物池F引物或反向引物池R引物各扩增一管，轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，PCR程序如下：
PCR结束之后，取1μlPCR产物作第二轮接头特异性扩增，PCR体系如下
P7引物中含有不同的index序列，区别不同样本。其中同一个突变频率的样本用同一个 index序列，同时同一突变频率的正负链引物扩增的样本，也以不同的index区分开。
轻轻吹打混匀。瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，PCR程序如下：
使用60μl Ampure XP beads(Beckman,A63881)进行纯化，30μl Elution缓冲液洗脱；
9.文库的质检与定量
按照KAPA Library Quantifcation Kit(Kapa biosystems,Cat No.KK4854)
说明书进行操作，使用伯乐CFX 96Touch实时荧光定量PCR仪检测，参试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量。建库文库达到上机要求浓度，可用于上机测试。
10.上机测序：
按照illumina novaSeq 6000测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及150bp双端测序。将高通量测序下机数据经过质控过滤后，进行BWA比对，用于评估文库的。
将来源于血浆中游离的ctDNA经单链建库，靶向扩增后的文库与来源于肿瘤基因组 (tumor DNA,tDNA)的10个位点的突变信息进行比对，结果如下表和图11所示，
结果分析：根据上表和图11可知，将分子标签技术、背景去噪和正负链修正结合，其检测血液的ctDNA突变信息跟其肿瘤样本的体细胞突变一致性，其中NRAS_12能检测到1.2％，而且内参基因位点其去噪音之后，其突变率低于0.06％。
本发明通过单链DNA建库，解决现有检测技术中对液态活检特别是ctDNA片段短、浓度低、碎片化、灵敏度低技术问题；其次基于分子标签技术和单链文库建库特点，实现准确辨别基因组坐标始末位点相同的测序reads是来自同一还是多个原始细胞释放出来的cfDNA，并将来源于同一个细胞的原始正负链的测序reads配对起来分析的目的，从而降低测序重复工作，提高对假阳性突变的分辨率。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 杭州纽安津生物科技有限公司
<120> 一种单链分子标签接头及单链DNA建库方法及其在检测循环肿瘤DNA中应用
<141> 2019-02-11
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> *
<400> 8
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<220>
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<222> (18)..(18)
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<222> (19)..(19)
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<222> (20)..(20)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 9
gagcacacgt ctgatannnn nnnnagatcg gaagagcgtc gtgtagggaa agagtgtaat 60
ctctctcaga cgtgtgctc 79
<210> 10
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> prim_transcript
<222> (58)..(59)
<223> u
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 10
gagcacacgt ctgatannnn nnnnagatcg gaagagcgtc gtgtagggaa agagtgtaat 60
ctctctcaga cgtgtgctct 80
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> prim_transcript
<222> (29)..(30)
<223> *
<220>
<221> prim_transcript
<222> (31)..(32)
<223> *
<220>
<221> prim_transcript
<222> (33)..(34)
<223> *
<400> 11
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
acactctttc cctacacgac 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gtgactggag ttcagagtgt 20
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacaccg cagcatgtca agatcac 57
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcctcctt ctgcatggta ttctttctc 59
<210> 16
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctggg catctgcctc acctc 55
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgacatag tccaggaggc agccgaag 58
<210> 18
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgaga aagttaaaat tcccgtcgc 59
<210> 19
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcacat cgaggatttc cttgttggc 59
<210> 20
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttcc 59
Claims (10)
1.一种单链分子标签接头，其特征在于，包括：14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列、和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火变性会形成茎环结构。
2.一种单链DNA建库方法，其特征在于，包括如下步骤：
3’末端接头的制备；
5’末端接头的制备；
样本核酸在磷酸酶的作用下去磷酸化及变性处理：高温处理，将原来双链的DNA变性为单链DNA；
3’端接头连接：将单链DNA产物和3’端双链DNA接头进行碱基配对，并头进行连接反应；
3’端接头连接链霉亲和素：将连接反应得到的连接产物通过链霉亲和素磁珠进行吸附，固定在链霉亲和素磁珠上；
延伸：将连接过链霉亲和素的单链连接产物为模板，将3’末端接头作为引物进行延伸，获得双链DNA产物；
5’端接头连接：将双链DNA产物和5’端双链DNA接头进行分子间的双链连接；
链霉亲和素清洗及文库洗脱回收。
3.根据权利要求2所述的一种单链DNA建库方法，其特征在于，
3’末端接头的制备的具体过程如下：
制备PCR试剂，PCR试剂的配方包括：
用移液器将PCR试剂混匀，瞬时离心将样品收集至管底，再将样品置于PCR仪中，PCR程序如下：
95℃ 1min，
95℃-10℃ -0.1℃/sec，
10℃ 5min。
4.根据权利要求3所述的一种单链DNA建库方法，其特征在于，
所述上链序列采用CL78(SEQ ID NO.1)，序列为：
5’Pho-AGATCGGAAG[C3Spacer]10-TEG-biotin3’，该接头序列5’端磷酸化修饰，3’端生物素化修饰，中间引入10个C3相隔臂和TEG分子；
所述下链序列采用CL93(SEQ ID NO.2)，序列为：
5’AmC12-AACTTCCGATCTNNNNNN-AmC7 3’，该接头序列5’端采用amino linker C12修饰，3’端含有6个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C7修饰；
所述下链序列采用CL106(SEQ ID NO.3)，序列为：
5’AmC12-AACTTCCGATCTNNNNNN-AmC3 3’，3’端含有6个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C3修饰；
所述下链序列采用CL110(SEQ ID NO.4)，序列为：
5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中间含有aminolinker C12修饰，3’端含有8个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C6修饰；
所述下链序列采用CL136(SEQ ID NO.5)，序列为：
5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中间含有aminolinker C12修饰，3’端含有7个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C6修饰；
所述下链序列采用CL137(SEQ ID NO.6)，序列为：
5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中间含有aminolinker C12修饰，3’端含有8个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C6修饰。
5.根据权利要求2所述的一种单链DNA建库方法，其特征在于，
5’末端接头的制备的具体过程如下：
PCR试剂包括：
用移液器将PCR试剂混匀，瞬时离心将样品收集至管底，再将样品置于PCR仪中，PCR程序如下：
95℃ 1min，
95℃-14℃ -0.1℃/sec，
14℃ 5min。
6.根据权利要求5所述的一种单链DNA建库方法，其特征在于，
所述上链序列或下链序列为：接头序列Bell_adatpor或接头序列Bell_TA_adapter；
所述Bell_adatpor的序列为：
5’GAGCACACGTCTGATANNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAUATCTCTCTCAGAC GTGTGCTC 3'(SEQ ID NO.9)，
所述Bell_adatpor的序列包含14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火后形成平末端的茎环结构；
所述Bell_TA_adapter的序列为：
5’GAGCACACGTCTGATANNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAUATCTCTCTCAGACGTGTGCTCT 3'(SEQ ID NO.10)，
所述Bell_TA_adapter的序列包含14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火后形成带T的粘末端茎环结构。
7.根据权利要求5所述的一种单链DNA建库方法，其特征在于，
所述上链序列采用CL53(SEQ ID NO.7)，序列为：
5’CGACGCTCTTC-ddC3'，3'端双脱氧修饰；
所述下链序列采用CL73(SEQ ID NO.8)，序列为：
5’Pho-GGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAG*T*G*T*A 3'，3'端末位4个碱基硫代修饰。
8.根据权利要求2所述的一种单链DNA建库方法，其特征在于，
延伸的具体过程如下：
配制延伸反应液，延伸反应液的配方包括：
将具有连接过链霉亲和素的单链连接产物的磁珠加入延伸反应液，再加入2～5μl聚合酶，混匀，瞬时离心将样品收集至管底，再将样品置于PCR仪中，PCR程序如下：
25℃ 5min，
35℃ 25min；
洗涤，移除上清；
所述聚合酶采用Klenow fragment或Klenow fragment exo-。
9.根据权利要求2所述的一种单链DNA建库方法，其特征在于，
3’末端接头的制备；
5’末端接头的制备；
样本核酸在磷酸酶的作用下去磷酸化及变性处理：高温处理，将原来双链的DNA变性为单链DNA；
3’端接头连接：将单链DNA产物和3’端双链DNA接头进行碱基配对，并头进行连接反应；
3’端接头连接链霉亲和素：将连接反应得到的连接产物通过链霉亲和素磁珠进行吸附，固定在链霉亲和素磁珠上；
延伸：将连接过链霉亲和素的单链连接产物为模板，3’端接头已知序列设计引物进行延伸，获得双链DNA产物；
5’端接头连接：将双链DNA产物和5’端双链DNA接头进行分子间的双链连接；
去除脱氧尿嘧啶核苷；
链霉亲和素清洗及文库洗脱回收。
10.一种单链分子标签接头在检测循环肿瘤DNA中的应用，包括如下内容：
提取检测血浆中游离的cfDNA；
3’末端接头的制备；
采用单链分子标签接头进行5’末端接头的制备，所述单链分子标签接头，包括：14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列、和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火变性会形成茎环结构；
样本核酸在磷酸酶的作用下去磷酸化及变性处理：高温处理，将原来双链的DNA变性为单链DNA；
3’端接头连接：将单链DNA产物和3’端双链DNA接头进行碱基配对，并头进行连接反应；
3’端接头连接链霉亲和素：将连接反应得到的连接产物通过链霉亲和素磁珠进行吸附，固定在链霉亲和素磁珠上；
延伸：将连接过链霉亲和素的单链连接产物为模板，3’端接头已知序列设计引物进行延伸，获得双链DNA产物；
5’端接头连接：将双链DNA产物和5’端双链DNA接头进行分子间的双链连接；
链霉亲和素清洗及文库洗脱回收。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Lin Zhiwei Inventor after: Mo Fan Inventor after: Luo Kai Inventor after: Zheng Wenyuan Inventor after: Han Ning Inventor before: Lin Zhiwei Inventor before: Mo Fan Inventor before: Luo Kai Inventor before: Zheng Wenyuan Inventor before: Han Ning Inventor before: Chen Shuqing |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190524 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |