CN110305945A - 一种基于二代测序技术的游离线粒体dna突变检测技术 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于二代测序技术的游离线粒体DNA突变检测技术，主要包括以下步骤：1)制备cfDNA单链测序文库，2)mtDNA捕获，3)数据分析。本发明与现有技术相比的优点在于：针对游离mtDNA片段化程度高，突变频率低的特征，在NGS中富集游离mtDNA序列信息，解决其低频突变检测假阳性问题，克服NUMT对于突变检测的干扰，实现游离线粒体DNA突变的精准检测。

Description

一种基于二代测序技术的游离线粒体DNA突变检测技术

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体是指一种基于二代测序技术的游离线粒体DNA突变检测技术。

背景技术

作为传统手段最有力的互补，液体活检技术在新型标志物临床检测应用中取得了突破性进展。其中，游离DNA检测成为目前最受关注也是发展最为迅猛的液体活检手段。线粒体DNA(mtDNA)拷贝数多，平均每个细胞中mtDNA的拷贝数可达103；基因组小，人类mtDNA全长仅有16,569bp，测序产生的数据量小，进而检测快速、成本低；突变率高，由于mtDNA常存在于高水平活性氧的环境下，同时缺少组蛋白保护和有效的DNA修复系统，因此其突变频率较核基因组高10倍左右；与多种疾病的预防、诊断、治疗及预后关系密切。因此，游离mtDNA突变的精准检测作为新型标志物具有独特优势。

实时定量PCR、数字PCR(dPCR)以及测序技术被广泛用于mtDNA突变检测。但前两种技术通量较低，且只能检测已知变异，测序技术可同时检测多个基因、多种类型的未知突变，有着其他技术难以比拟的优势。在测序技术中，Sanger测序技术成本高，且无法准确检测低频突变。单分子测序的高错误率干扰mtDNA突变检测的准确性。与之相比，基于二代测序(NGS)的mtDNA突变检测技术已经相对成熟，能够实现mtDNA的超深度测序，提高突变检测的灵敏度，极大地降低检测成本。但是，由于游离mtDNA突变频率低以及片段化程度高的特点，常规的mtDNA靶向测序在游离mtDNA精准检测中仍面临挑战。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供一种基于二代测序技术的游离线粒体DNA突变检测技术，针对游离mtDNA片段化程度高，突变频率低的特征，在NGS中富集游离mtDNA序列信息，解决其低频突变检测假阳性问题，克服NUMT对于突变检测的干扰，实现游离线粒体DNA突变的精准检测。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种基于二代测序技术的游离线粒体DNA突变检测技术，主要包括以下步骤：

1)制备cfDNA单链测序文库：将提取的cfDNA片段末端去磷酸化并变性为单链；利用DNA连接酶在cfDNA片段的两侧末端连接接头，接头含有12bp的随机碱基序列；通过引物延伸，将单链DNA文库变成双链文库。

2)mtDNA捕获：利用三对引物扩增mtDNA片段，并将PCR产物等摩尔混合后打断到150bp，制备生物素标记的杂交捕获探针；按照探针与模板800：1摩尔比的含量进行捕获并测序。

3)数据分析：对测序数据进行质控，利用BWA-mem软件将质控后的clean data比对至人类参考基因组hg19上，最后提取比对到线粒体参考基因组rCRS的数据进行突变位点分析。

本发明与现有技术相比的优点在于：提取血浆中的游离DNA(cfDNA)后采用单链建库的方法构建全基因组测序文库，并在测序文库两端加入12bp随机碱基序列的分子标签(UMI)。制备mtDNA捕获探针随后通过杂交捕获，富集mtDNA文库，并完成上机测序。最后，利用生物信息学技术分析测序数据，准确检测出游离mtDNA突变，充分利用改进的单链建库技术克服了游离mtDNA片段化程度高的问题，能够在cfDNA测序文库构建过程中更多地富集游离mtDNA。通过在游离mtDNA测序文库中引入分子标签，克服了PCR扩增和测序错误导致的假阳性问题，显著提高了游离mtDNA低频突变检测的准确性。通过优化游离mtDNA测序数据的生物信息学分析流程，进一步提高了mtDNA比对率，克服了核基因组线粒体假基因(NUMT)对于突变检测的干扰。最终，本发明提供了一种经济有效的游离线粒体DNA突变检测技术。

附图说明

图1是本发明一种基于二代测序技术的游离线粒体DNA突变检测技术的流程图。

图2是本发明一种基于二代测序技术的游离线粒体DNA突变检测技术生物信息学分析流程图。

图3是本发明一种基于二代测序技术的游离线粒体DNA突变检测技术单链建库与双链建库的对比图。

图4是本发明一种基于二代测序技术的游离线粒体DNA突变检测技术对于游离mtDNA分析结果

图5是本发明一种基于二代测序技术的游离线粒体DNA突变检测技术对于游离mtDNA突变检测结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。

一种基于二代测序技术的游离线粒体DNA突变检测技术，主要包括以下步骤：

1)制备cfDNA单链测序文库：将提取的cfDNA片段末端去磷酸化并变性为单链；利用DNA连接酶在cfDNA片段的两侧末端连接接头，接头含有12bp的随机碱基序列；通过引物延伸，将单链DNA文库变成双链文库，将cfDNA片段变为单链进行测序文库构建能够富集短于150bp片段，有利于增加游离mtDNA在全基因组文库中的比例；利用12bp的UMI可以消除PCR和测序错误造成的假阳性。

2)mtDNA捕获：经过摸索，我们优化了探针长度以及杂交捕获过程中探针用量，利用三对引物扩增mtDNA片段，并将PCR产物等摩尔混合后打断到150bp，制备生物素标记的杂交捕获探针；按照探针与模板800：1摩尔比的含量进行捕获并测序，提高了游离mtDNA捕获特异性。

3)数据分析：对测序数据进行质控，利用BWA-mem软件将质控后的clean data比对至人类参考基因组hg19上，最后提取比对到线粒体参考基因组rCRS的数据进行突变位点分析，调整测序数据的过滤条件，进一步提高游离mtDNA序列所占比例；在测序reads的mapping过程中，创新性的先与人类参考基因组hg19进行比对，再单独提取比对至线粒体参考基因组rCRS，有效的减少了核基因组中线粒体假基因(NUMT)对突变检测的影响。

本发明在具体实施时，整个实验流程为图1所示，具体操作步骤如下：

1、制备游离DNA单链测序文库：

1)去磷酸化和变性，在冰上配置如下反应体系：

PCR反应条件为37℃，10min；95℃2min：PCR完成后，将管快速转移到冰浴3分钟。

2)连接接头，在冰上配置如下反应体系：

将上述体系进行60℃180min孵育，孵育完成后加入stop solution 2μl。

3)使用贝克曼库尔特的Ampure bead进行纯化，洗脱体积为69μl。

4)进行PCR程序，95℃1min后,立即冰浴2min。配制如下体系：

进行PCR程序，20℃40min后，加入10ul EDTA(0.5M)。

5)对上述反应产物进行纯化，随后进行PCR扩增，反应条件如下：

2、mtDNA捕获：

1)PCR扩增

利用3对引物序列扩增线粒体基因组。PCR反应体系如下:

PCR反应条件：

2)将上一步骤中的PCR产物等摩尔混合后，打断为150bp的DNA片段。

3)打断产物经95℃变性后，加入4μl Biotin-high prime，37℃孵育过夜。产物纯化后即为mtDNA捕获探针。

4)捕获测序

将上述制备的全基因组文库(每个样品400ng)与上述捕获探针混合用于杂交。探针的使用量与mtDNA的含量摩尔比为800:1。杂交完成后，将其加入到具有链霉亲和素化磁珠的结合缓冲液中，进一步洗去杂质。最后，洗脱并PCR扩增mtDNA文库。获得的捕获文库用illumina HiSeq PE150进行测序。

3、数据分析：

测序数据生物信息学分析流程见附图2。首先对测序数据进行质控，质控条件为：①去除接头污染的Reads(Reads中接头污染的碱基数大于100bp)②去除低质量的Reads③去除含N比例大于5％的Reads。将完成数据质控的clean data比对到人类参考基因组hg19上，然后对比对得到的结果文件进行排序和去重复(去除PCR重复序列)，接下来利用GATK软件进行局部重比对，目的是将比对过程中所发现的潜在Indel(序列插入或者序列删除)的区域进行重新校正。用GATK完成局部重比对后，利用Samtools生成pileup文件。然后提取上一步得到的结果文件中比对到线粒体参考基因组rCRS的reads，在此基础上利用以下标准定义mtDNA突变:①该位点测序深度≥100×；②最小等位频率≥0.1％；③每条链上携带突变的reads≥3。

如附图3和4所示，本发明比较了10例样本单链建库和双链建库结果。使用单链建库方法，检测到更多的mtDNA，显示单链建库可以富集更多的mtDNA，符合目前文献中关于单链建库方法的报道。

如附图5所示，通过分析10例肝癌血浆样本的游离mtDNA突变，我们检测到异质性位点数与同质性位点数平均值分别为12.3与26.2，符合我们对于线粒体DNA突变的认知。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种基于二代测序技术的游离线粒体DNA突变检测技术，其特征在于：主要包括以下步骤：

1)制备cfDNA单链测序文库：将提取的cfDNA片段末端去磷酸化并变性为单链；利用DNA连接酶在cfDNA片段的两侧末端连接接头，接头含有12bp的随机碱基序列；通过引物延伸，将单链DNA文库变成双链文库。

2)mtDNA捕获：利用三对引物扩增mtDNA片段，并将PCR产物等摩尔混合后打断到150bp，制备生物素标记的杂交捕获探针；按照探针与模板800：1摩尔比的含量进行捕获并测序。

3)数据分析：对测序数据进行质控，利用BWA-mem软件将质控后的clean data比对至人类参考基因组hg19上，最后提取比对到线粒体参考基因组rCRS的数据进行突变位点分析。