CN110241191A - 一种基于NGS同时检测mtDNA拷贝数和突变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于NGS同时检测mtDNA拷贝数和突变的方法,制备线粒体DNA和6个内参DNA片段的捕获探针,同时捕获全基因组测序文库中的线粒体DNA和内参,利用生物信息学技术分析测序数据,实现线粒体基因组突变与拷贝数的同时精准检测,具体步骤如下:1)PCR扩增;2)探针制备;3)捕获测序;4)生物信息学分析。本发明与现有技术相比的优点在于:实现在捕获测序中同时精准检测线粒体DNA低频突变和拷贝数,降低了DNA需求量,节省珍贵DNA样本,简化了实验操作,极大地降低了检测成本。在探针制备过程中随机选取6个核DNA片段作为内参,克服了以往报道的利用捕获测序数据计算拷贝数准确性差等问题,提高了相关研究结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体是指一种基于二代测序技术(NGS)同时检测mtDNA拷贝数和突变的方法。
背景技术
由于线粒体基因组(mtDNA)长期暴露于高水平活性氧的环境下,缺少组蛋白的保护和有效的DNA损伤修复系统,其变异频率远高于核基因组。已有大量研究表明mtDNA变异与多种疾病的发病风险以及预后显著相关。通过检测体液中游离mtDNA变异,有望成为一种新型的疾病早期诊断和监测技术。mtDNA变异主要包括拷贝数变异和突变两种形式。因此针对mtDNA拷贝数和突变的精准检测技术受到了相关领域研究人员的重点关注。
实时定量PCR、数字PCR以及二代测序(NGS)已经被广泛应用于mtDNA的拷贝数检测。前两者仅适用于mtDNA靶向区域的拷贝数检测,对于血浆、尿液等片段化非常严重的游离mtDNA,靶向区域的拷贝数难以准确反映mtDNA拷贝数全貌。与之相比,二代测序技术可以全面、准确地反映mtDNA拷贝数情况。
mtDNA突变的常见检测手段包括Sanger测序、PCR、二代测序以及单分子测序。Sanger测序在检测mtDNA低频突变时(异质性水平<15%)灵敏度差。成本高且耗时长,PCR技术仅限于检测mtDNA已知突变,单分子测序也逐渐应用于mtDNA突变检测,但该技术的稳定性有待提高,较高的测序错误率影响mtDNA突变检测的准确性。近年来,基于二代测序的mtDNA突变检测方法得到广泛应用。尤其是mtDNA靶向测序技术的出现,实现了线粒体基因组的高深度测序,提高了低频突变检测的灵敏度,极大降低检测成本。
本发明充分利用改进的捕获技术克服了以往线粒体基因组突变与拷贝数单独检测对DNA需求量大、操作复杂、耗时费力等问题,提供了一种经济有效的同时检测线粒体基因组突变与拷贝数的技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服以上技术缺陷,提供一种基于NGS同时检测mtDNA拷贝数和突变的方法,实现mtDNA和内参基因的同时捕获测序,克服以往mtDNA突变与拷贝数单独检测对DNA需求量大、操作复杂、成本高等问题,兼顾突变检测的测序深度要求高及拷贝数检测的内参测序深度变异小等特点,提供一种经济有效的同时检测mtDNA突变与拷贝数的技术方案。
为解决上述技术问题,本发明提供的技术方案为:一种基于NGS同时检测mtDNA拷贝数和突变的方法,制备mtDNA和6个内参DNA片段的捕获探针,同时捕获全基因组测序文库中的mtDNA和内参片段,利用生物信息学技术分析测序数据,实现线粒体基因组突变与拷贝数的同时精准检测,具体步骤如下:
1)PCR扩增:分别扩增线粒体基因组以及内参DNA片段;
2)探针制备:等摩尔混合步骤一中的PCR产物,制备生物素标记的杂交捕获探针;
3)捕获测序:提取DNA完成全基因组文库构建后,利用捕获探针对全基因组测序文库的目标区域进行捕获,将捕获后的文库分子进行二代测序;
4)生物信息分析:去除低质量reads及duplication,完成reads在参考基因组的比对,检测线粒体基因组突变;利用线粒体基因组和内参基因的测序深度,计算出线粒体基因组拷贝数。
优选的步骤一中,利用3对引物扩增整个线粒体基因组,选取6个DNA片段作为内参,减少利用全基因组测序计算线粒体拷贝数的成本和生物信息分析时长。
优选的步骤二中,将内参和mtDNA的PCR产物等摩尔混合后,利用超声打断为200-300bp的片段制作探针,可以直接反应线粒体基因组全貌。
优选的步骤三和四中,对mtDNA和6个内参DNA片段进行捕获,实现线粒体基因组突变与拷贝数的同时精准检测,对DNA样本量、实验成本、仪器需求均大幅度降低。
本发明与现有技术相比的优点在于:可以实现在捕获测序中同时精准检测线粒体DNA低频突变和拷贝数,降低了DNA需求量,可节省珍贵DNA样本(例如cfDNA等),简化了实验操作,极大地降低了检测成本。在探针制备过程中引入6个DNA片段作为内参,克服了以往报道的利用捕获测序数据计算拷贝数准确性差等问题,提高了相关研究结果的准确性。
附图说明
图1是本发明流程图。
图2是本发明生物信息学分析流程。
图3是本发明cap-mtCN和WGS-mtCN spearman相关性分析。
图4是本发明mtDNA突变检测准确性评估。
图5是本发明靶序列及对应引物序列信息。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一
本发明公开一种基于NGS同时检测mtDNA拷贝数和突变的方法,主要包括以下步骤:
1、PCR扩增:
1)在核基因组上随机选取6个核基因HEX37、ANKRD36BP2、—SLCO2B1、SERPINA1、EIF2AK3、GCG,进一步随机各取约4000bp将其作为内参片段。利用图5所示的引物序列扩增线粒体基因组和内参片段。PCR反应体系如下:
PCR反应条件:
2)使用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物特异性,进一步切胶回收PCR产物。
2、探针制备:
1)将上一步骤中的线粒体基因组和核内参对应的PCR产物等摩尔混合后,打断为约300bp的小片段。
2)打断产物经95℃变性后,加入4μl Biotin-high prime,37℃孵育过夜。产物纯化后即为mtDNA和6内参片段对应的探针。
3、捕获测序:
选择多个组织DNA样本,提取DNA后使用超声波将其打断为200-400bp的片段。DNA片段经末端修复、接头连接、片段选择、PCR扩增,产物用磁珠纯化后即为全基因组文库。将多个样品的全基因组文库(每个样品200ng)与自制的捕获探针混合用于杂交。杂交完成后,将其加入到具有链霉亲和素化磁珠的结合缓冲液中,进一步洗去杂质。最后,洗脱并扩增mtDNA和内参片段文库。获得的捕获文库用illumina HiSeq PE150进行测序。
4、生物信息分析:
测序数据生物信息学分析流程见附图2。首先将mtDNA及内参基因的靶向捕获测序结果利用BWA比对至参考基因组Hg19和rCRS,进一步利用Picard去除低质量reads及duplication,用GATK完成局部重比对后,Samtools生成pileup文件。在此基础上利用以下标准定义mtDNA突变:①该位点测序深度≥100×;②最小等位频率≥2%;③每条链上携带突变的reads≥3。同时利用pileup文件得到mtDNA平均测序深度和核内参DNA平均测序深度,并利用以下公式计算mtDNA拷贝数:
mtDNA拷贝数检测准确性评估:
将本例中组织样本采用本发明方法获得线粒体拷贝数和全基因组测序方法获得线粒体拷贝数进行spearman相关性分析,P<0.001,具体如附图3所示,差异有统计学意义。证明本发明方法可进行线粒体拷贝数的精准检测。
mtDNA突变检测准确性评估:
用已知mtDNA异质性突变个数的5个样本用本发明方法检测其突变,进一步将本方法检出的mtDNA异质性突变个数与已知突变个数进行spearman相关性分析,P<0.001,具体如附图4所示,差异有统计学意义。证明本发明方法可进行mtDNA突变的精准检测。
综上,本发明可同时实现mtDNA拷贝数和突变的精准检测。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节,也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然,根据本说明书的内容,可作很多的修改和变化,同样本发明可运用于临床组织、血浆、尿液、脑脊液等所有样本中。本说明书选取并具体描述这些实施例,是为了更好地解释本发明的原理和实际应用,从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (4)
1.一种基于NGS同时检测mtDNA拷贝数和突变的方法,其特征在于:主要包括以下步骤:
1)PCR扩增:分别扩增线粒体基因组和内参DNA片段;
2)探针制备:等摩尔混合步骤一中的PCR产物,制备生物素标记的杂交捕获探针;
3)捕获测序:提取DNA完成全基因组文库构建后,利用捕获探针对全基因组测序文库的目标区域进行捕获,将捕获后的文库分子进行二代测序;
4)生物信息分析:去除低质量reads及duplication,完成reads在参考基因组的比对,检测线粒体基因组突变;利用线粒体基因组和内参基因的测序深度,计算出线粒体基因组拷贝数。
2.根据权利要求1所述的一种基于NGS同时检测mtDNA拷贝数和突变的方法,其特征在于:步骤一中,利用3对引物扩增整个线粒体基因组,利用6对引物扩增内参DNA片段,减少利用全基因组测序计算线粒体拷贝数的成本和生物信息分析时长。
3.根据权利要求1所述的一种基于NGS同时检测mtDNA拷贝数和突变的方法,其特征在于:步骤二中,将内参片段和mtDNA的PCR产物等摩尔混合后,利用超声打断为200-300bp的片段制作探针,直接反应线粒体基因组全貌。
4.根据权利要求1所述的一种基于NGS同时检测mtDNA拷贝数和突变的方法,其特征在于:步骤三和四中,对mtDNA和6个内参DNA片段进行捕获,实现线粒体基因组突变与拷贝数的同时精准检测,对DNA样本量、实验成本、仪器需求均大幅度降低。
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