CN109913535A - 荧光定量检测核基因组拷贝数及人线粒体基因组拷贝数的方法 - Google Patents

Abstract

一种荧光定量检测核基因组拷贝数及人线粒体基因组拷贝数的方法，通过分别选取人核基因组DNA和线粒体基因组中的一个单拷贝基因，设计引物和探针，然后将序列片段转入PMD‑18T载体中，经转化后提取质粒得到其拷贝数并作为参考标准品；在实际检测时，以参考标准品的Cq值制作标准曲线比较得到待测样品中的核基因组DNA的拷贝数和线粒体基因组DNA的拷贝数。本发明为定量分析人不同组织细胞中线粒体基因组拷贝数提供了方法，特异性高，操作简单，只需荧光定量PCR仪就能完成线粒体基因组拷贝数的快速检测。

Description

荧光定量检测核基因组拷贝数及人线粒体基因组拷贝数的 方法

技术领域

本发明涉及一种分子生物学领域的技术，具体涉及一种基于TERT和16S_rRNA基因的荧光定量检测核基因组拷贝数及人线粒体基因组拷贝数的方法。

背景技术

随着高通量测序技术的飞速发展和生物信息技术的完善，mtDNA的全测序分析已经逐渐成为mtDNA检测的主要手段。能够使得法医工作者获得更全面的线粒体基因组DNA信息，可以提高mtDNA检测识别率的同时，也可以更好的对mtDNA的异质性进行分析。在法医物证的应用中，需要对mtDNA的起始拷贝数进行准确定量从而保证分析结果的准确性。

如何准确的测定mtDNA的拷贝数是一个难题，一方面线粒体细胞器很小，其基因组DNA也只有16569bp，同时一个细胞内可以有多套线粒体基因组DNA，因此难以采用电子显微镜或者染色等物理和化学的方法进行定量计数；另一方面在提取mtDNA时，产物中往往含有nDNA，直接采用分光光度计(NanoDrop)或者Qubit等检测手段都不能准确反映出mtDNA的拷贝数。目前，实时荧光PCR技术的发展为解决mtDNA的定量这一难题提供了研究思路。该方法的原理主要是通过在核基因组和线粒体基因组中分别选取一个单拷贝基因，构建定量克隆质粒，然后制备相关基因的标准曲线，最后定量分析线粒体基因组拷贝数与核基因组拷贝数的比值；由于一个细胞只有一个核基因组，因此这个比值可以认为是一个细胞中所具有的线粒体基因组DNA的平均拷贝数。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种荧光定量检测核基因组拷贝数及人线粒体基因组拷贝数的方法，为定量分析人不同组织细胞中线粒体基因组拷贝数提供了方法，特异性高，操作简单，只需荧光定量PCR仪就能完成线粒体基因组的快速检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明通过分别选取人核基因组DNA和线粒体基因组中的一个单拷贝基因，设计引物和探针，然后将序列片段转入PMD-18T载体中，经转化后提取质粒得到其拷贝数并作为参考标准品；在实际检测时，以参考标准品的Cq值制作标准曲线比较得到待测样品中的核基因组DNA的拷贝数和线粒体基因组DNA的拷贝数。

所述的线粒体基因组DNA的数量即：每个细胞中的线粒体基因组拷贝数＝2×线粒体基因组拷贝数/核基因组DNA拷贝数。

所述的参考标准品，通过筛选核基因和mtDNA序列及其引物，并经过对Taqman探针的优化后，将包含有各基因实时定量PCR引物扩增区间的序列片段采用先扩增、后连接，最后采用TA克隆的方法转入到PMD-18T载体中，通过转化将连接的质粒载体转入大肠杆菌中进行培养后质粒提取、检测提取后质粒的拷贝数。

所述的筛选是指：

1、核基因和mtDNA序列的筛选：核基因片段选自位于5号染色体上的人端粒反转录酶(TERT)基因的一段为扩增目的片段，该基因在人体内为双拷贝基因且不存在假基因的干扰；线粒体单拷贝基因则选自16S_rRNA基因的一段为扩增片段，该序列一方面不存在假基因的干扰；另一方面该基因在人群中序列相对保守，具有较低的自发突变频率。

所述的TERT基因，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

2、引物筛选：针对核基因TERT和线粒体DNA基因16S_rRNA分别设计扩增引物和荧光定量引物及荧光定量探针。两个基因的扩增片段长度为600bp左右，荧光定量引物约为100-120bp之间，这样的目的是：使标准品的PCR扩增效率和受检样品的扩增效率尽可能同步，以便提高检测的灵敏度和准确性。

所述的探针的优化是指：在荧光实时定量PCR反应中探针的浓度直接影响着实验结果，本发明共测试了探针的五个反应终浓度浓度，浓度梯度依次为0.05pmol/μL、0.1pmol/μL、0.2pmol/μL、0.4pmol/μL、0.8pmol/μL，最终探针的最佳反应终浓度为0.2pmol/μL。

技术效果

与现有技术相比，本发明能够直接针对人核基因组DNA和mtDNA进行分别定量，从而实现不同个体、不同组织及不同细胞内线粒体DNA拷贝数的快速检测：特异性高，操作简单，只需荧光定量PCR仪就能完成线粒体基因组的快速检测，且构建了PMD-18T-TERT-16S_rRNA克隆载体，减少定量时不同克隆载体造成的系统误差。

附图说明

图1是构建的荧光定量质粒PMD-18T-TERT-16S_rRNA克隆载体示意图；

图中：1-pMD18T载体、2-TERT基因探针位置、3-插入的TERT基因片段、4-16S_rRNA探针位置、5-插入的16S_rRNA基因片段；

图2是PMD-18T-TERT-16S_rRNA标准品制作的荧光实时定量PCR反应标准曲线，图中横坐标显示了标准品的稀释倍数，纵坐标显示了Cq值，图中斜线上的点自下至上分别稀释倍数为1、0.1、0.01、0.001、0.0001和0.00001时的Cq值。

具体实施方式

本实施例具体包括以下步骤：

步骤1、针对选取的TERT基因和16s_rRNA基因，设计相对应的扩增引物，TERT基因的克隆扩增上游引物(如Seq ID No.2所示)，具体为：5'-CTCATTCCCACCCTTGAAATTGC-3'，反向克隆扩增引物(如Seq ID No.3所示)，具体为：5'-agcgGCTTCCTCAGGAACACCAAGAAG-3'；16s_rRNA上游克隆扩增引物序列(如Seq ID No.4所示)，具体为：5'-aagcCGCTTTGACTGGTGAAGTCTTAGC-3'，反向克隆扩增引物(如Seq ID No.5所示)，具体为：5'-CGTTCAAGCTCAACACCCACTAC-3'，其中小写字母序列为粘性末端，可以将这两段PCR产物通过二次PCR连接起来，其中第一次扩增的PCR反应体系为30μL，其中包括15μL的2×PCRreaction buffer(TOYOBO公司)，1μL的浓度为10umol/μL的正反向扩增引物，0.4μL的高保真扩增酶(TOYOBO公司)，1μL的扩增模板和2μL的dntp，最后用ddH₂O补足体积至30μL总体积。PCR扩增反应在ABI 9700扩增仪上进行，采用60℃退火，共30个循环，反应结束后采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，观察这两段序列的扩增情况，克隆片段长度分别为508bp和677bp。将这两段扩增产物纯化后等量混合，加入16s_rRNA的下游扩增克隆引物和TERT的上游扩增克隆引物，加入Taq酶和dNTP进行退火连接扩增，构成长度为1185bp的16s_RNA-TERT长片段。

步骤2、荧光定量质粒模板的构建：将上述步骤1中的16s_rRNA-TERT扩增产物凝胶纯化回收；根据PMD-18T载体试剂盒说明，把相应的回收片段连接到质粒载体中，再进一步把连接好的载体转化入E.coli DH5α感受态细胞，利用蓝白斑筛选、鉴定、获得阳性克隆菌株。挑取含有阳性克隆的单克隆菌落扩大培养，用质粒提取试剂盒抽提重组质粒。利用Qubit2.0测定提取的重组质粒的浓度，采用双链DNA拷贝数计算器(http://cels.uri.edu/gsc/cnDNA.html)将质粒质量换算成拷贝数(拷贝数/μL)，此即为用于16s_rRNA-TERT基因定量的标准品模板。

步骤3、荧光定量引物及探针的设计：根据荧光PCR的引物和探针设计原则，采用oligo7软件设计TERT基因和16s_rRNA的定量引物及探针，TERT基因的定量引物序列为：上游引物(如Seq ID No.6所示)，具体为：5'-CTTCCAGACACTTCTCCCCATTG-3'，下游引物(如SeqID No.7所示)，具体为：5'-GGTTCACCTTCACGTTTTGATGG-3'，探针序列(如Seq ID No.8所示)，具体为：5'-FAM-CGAGGCCAGAGCAGTGAACAGAGGAGGC-BQ1-3'(FAM为一种荧光基团，BQ1为荧光淬灭基团)，检测长度为122bp；16s_rRNA的定量引物序列和探针序列分别为：上游引物(如Seq ID No.9所示)，具体为：5'-CGCTTTGACTGGTGAAGTCTTAG-3'，下游引物(如Seq IDNo.10所示)，具体为：5'-CAGGTCCTAAACTACCAAACCTG-3'，探针序列(如Seq ID No.11所示)，具体为：5'-FAM-GACCTCGGAGCAGAA CCCAACCTCCGAGC-BQ1-3'，检测长度为105bp。

步骤4、用于实时定量PCR分析的标准品制备：用无DNAase ddH₂O分别将上述定量后的标准品按照10倍梯度稀释成10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²拷贝(每个梯度浓度体积为1000μL)，分别采用不同的引物扩增，制作出如图2所示的标准曲线，此处要求标准曲线的相关系数达到0.997-0.999之间，以充分保证标准曲线的线性关系。

步骤5、未知样本中线粒体基因组拷贝数和核基因组拷贝数的检测：在一个96孔PCR反应板上，将待测样本和已知拷贝数的PMD-18T-TERT-16s_rRNA按照梯度稀释为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²拷贝作为标准品，同时进行已知样品和未知样品的实时定量PCR反应，具体按照以下操作：PCR反应体积为25μL，其中包括12.5μL 2×QuantifilerPCR reactionbuffer(ThermoFisher公司)，1μL模板DNA，0.5μL的上、下游引物，0.5μL的Taqman探针(0.2pmol/μL)，最后用ddH₂O补足体积至25μL。每个DNA样本设置三个重复，每个PCR反应板上同时设置3个空白对照(不含有任何DNA模板)。反应程序为：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，60℃延伸1分钟，共40个循环。

步骤6、mtDNA含量计算和核基因组DNA计算：根据质粒标准品得到的标准曲线，对未知待测样品中的mtDNA拷贝数和核基因组DNA拷贝数分别进行定量计算，由于人核基因组为二倍体，故可以通过下列公式计算出平均每个细胞中mtDNA的拷贝数：mtDNA拷贝数/细胞＝2×线粒体基因组拷贝数/核基因组DNA拷贝数。

本发明构建了一个同时包含人核基因组DNA和线粒体DNA的克隆载体，设计了特异性的引物与探针，能够分别对人核基因组DNA和mtDNA的拷贝数进行定量。与之前的定量载体相比，融合载体的构建能够减少定量时不同克隆载体造成的系统误差。同时也能更精确的反应同一组织或者同一细胞中mtDNA拷贝数与核DNA拷贝数的差异。该系统最低能够检测到含有10个mtDNA拷贝数的样本。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

序列表

<110> 上海市刑事科学技术研究院

<120> 荧光定量检测核基因组拷贝数及人线粒体基因组拷贝数的方法

<130> f-b052e

<141> 2017-12-12

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3879

<212> DNA

<213> 融合载体全序列(PMD18T-16sRNA-TERT)

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 420

acgattctca ttcccaccct tgaaattgcg aagaggatta taggtaacct gcaggcaccc 480

tcgccagagc gtctgtgctt ccagacactt ctccccattg ccggcaaccc ggctccactg 540

ccgcgcccag cctcctctgt tcactgctct ggcctcggcg cctggaaacc gcgtgtccat 600

caaaacgtga aggtgaacct cgtaagttta tgcaaactgg acaggaggga gagcagaggc 660

agagatcacc gtgtccactc gacgtcctga gcgaaaagcc acgtgtgccc acgtgacgat 720

ggagacagga ggaccagggc tctgcctgcc cccttttctg agcccctact gcattcagct 780

ctggggcctg ggccctcgac ggccaccacc tcctcacctg ggctcctgcg cagccaagcg 840

cagtcccgca cgctcatctt ccacgtcagc tcctgcagcg agagcttggc atgcttcccc 900

agggagatga acttcttggt gttcctgagg aagccgcttt gactggtgaa gtcttagcgt 960

gtactgctcg gaggttgggt tctgctccga ggtcgcccca accgaaattt ttaatgcagg 1020

tttggtagtt taggacctgt gggtttgtta ggtactgttt gcattaataa attaaagctc 1080

catagggtct tctcgtcttg ctgtgtcatg cccgcctctt cacgggcagg tcaatttcac 1140

tggttaaaag taagagacag ctgaaccctc gtggagccat tcatacaggt ccctatttaa 1200

ggaacaagtg attatgctac ctttgcacgg ttagggtacc gcggccgtta aacatgtgtc 1260

actgggcagg cggtgcctct aatactggtg atgctagagg tgatgttttt ggtaaacagg 1320

cggggtaaga tttgccgagt tccttttact ttttttaacc tttccttatg agcatgcctg 1380

tgttgggttg acagtgaggg taataatgac ttgttggttg attgtagata ttgggctgtt 1440

aattgtcagt tcagtgtttt aatctgacgc aggcttatgc ggaggagaat gttttcatgt 1500

tacttatact aacattagtt cttctatagg gtgatagatt ggtccaattg ggtgtgagga 1560

gttcagttat atgtttggga ttttttaggt agtgggtgtt gagcttgaac gaatctctag 1620

aggatccccg ggtaccgagc tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 1680

attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 1740

ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 1800

agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 1860

gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 1920

ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 1980

gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 2040

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 2100

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 2160

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 2220

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 2280

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 2340

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 2400

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 2460

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 2520

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 2580

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 2640

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 2700

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 2760

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 2820

accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 2880

ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 2940

gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 3000

agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 3060

ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 3120

ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 3180

gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 3240

ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 3300

tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 3360

tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 3420

cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 3480

tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 3540

gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 3600

tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 3660

ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 3720

attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 3780

cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 3840

taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 3879

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 正向引物序列(TERT基因)

<400> 2

ctcattccca cccttgaaat tgc 23

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 反向引物序列(TERT基因)

<400> 3

agcggcttcc tcaggaacac caagaag 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 正向克隆扩增引物(16s_rRNA)

<400> 4

aagccgcttt gactggtgaa gtcttagc 28

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 反向克隆扩增引物(16s_rRNA)

<400> 5

cgttcaagct caacacccac tac 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 定量上游引物序列(TERT基因)

<400> 6

cttccagaca cttctcccca ttg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 定量下游引物序列(TERT基因)

<400> 7

ggttcacctt cacgttttga tgg 23

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 探针序列(TERT基因)

<400> 8

cgaggccaga gcagtgaaca gaggaggc 28

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 定量上游引物序列(16s_rRNA)

<400> 9

cgctttgact ggtgaagtct tag 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 定量下游引物序列(16s_rRNA)

<400> 10

caggtcctaa actaccaaac ctg 23

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 探针序列(16s_rRNA)

<400> 11

gacctcggag cagaacccaa cctccgagc 29

Claims (8)

1.一种荧光定量检测核基因组拷贝数及人线粒体基因组拷贝数的方法，其特征在于，通过分别选取人核基因组DNA和线粒体基因组中的一个单拷贝基因，设计引物和探针，然后将序列片段转入PMD-18T载体中，经转化后提取质粒得到其拷贝数并作为参考标准品；在实际检测时，以参考标准品的Cq值制作标准曲线比较得到待测样品中的核基因组DNA的拷贝数和线粒体基因组DNA的拷贝数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的线粒体基因组DNA的数量即：每个细胞中的线粒体基因组拷贝数＝2×线粒体基因组拷贝数/核基因组DNA拷贝数。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的参考标准品，通过筛选核基因和mtDNA序列及其引物，并经过对Taqman探针的优化后，将包含有各基因实时定量PCR引物扩增区间的序列片段采用先扩增、后连接，最后采用TA克隆的方法转入到PMD-18T载体中，通过转化将连接的质粒载体转入大肠杆菌中进行培养后质粒提取、检测提取后质粒的拷贝数。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的扩增，其引物包括：TERT基因的克隆扩增上游引物：5'-ctcattcccacccttgaaattgc-3'，反向克隆扩增引物：5'-agcggcttcctcaggaacaccaagaag-3'；16s_rRNA上游克隆扩增引物序列：5'-aagccgctttgactggtgaagtcttagc-3'，反向克隆扩增引物：5'-cgttcaagctcaacacccactac-3'。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的连接，其引物包括：TERT基因的定量引物序列为：上游引物：5'-cttccagacacttctccccattg-3'，下游引物：5'-ggttcaccttcacgttttgatgg-3'，探针序列：5'-fam-cgaggccagagcagtgaacagaggaggc-bq1-3'，检测长度为122bp；16s_rRNA的定量引物序列和探针序列分别为：上游引物：5'-cgctttgactggtgaagtcttag-3'，下游引物：5'-caggtcctaaactaccaaacctg-3'，探针序列：5'-fam-gacctcggagcagaa cccaacctccgagc-bq1-3'，检测长度为105bp。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的筛选是指：

1)核基因和mtDNA序列的筛选：核基因片段选自位于5号染色体上的人端粒TERT基因的一段为扩增目的片段，该基因在人体内为双拷贝基因且不存在假基因的干扰；线粒体单拷贝基因则选自16S_rRNA基因的一段为扩增片段；

2)引物筛选：针对核基因TERT和线粒体DNA基因16S_rRNA分别设计扩增引物和荧光定量引物及荧光定量探针。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征是，所述的TERT基因，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的探针的优化是指：在荧光实时定量PCR反应中探针的浓度直接影响着实验结果，本发明共测试了探针的五个反应终浓度浓度，浓度梯度依次为0.05pmol/μL、0.1pmol/μL、0.2pmol/μL、0.4pmol/μL、0.8pmol/μL，最终探针的最佳反应终浓度为0.2pmol/μL。