CN107475297B - 一种表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，主要涉及一种表达鸭2型腺病毒(DADV2)fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用。所述载体在pMD19T‑Simple载体TA克隆位点插入含有鸡痘病毒的早晚期启动子LP2EP2启动下的DADV2fiber2基因、P11启动子启动下的lacz基因，以及用于同源重组的鸡痘病毒的基因组复制非必须片段LTYB、RTYB。所述转移载体的构建方法，包括如下步骤：构建质粒pMD‑TYB；构建质粒pMD22；构建质粒pMD22‑lacz；构建中间载体pMD22‑TYB‑lacz；构建转移载体pMD22‑TYB‑lacz‑DFB2；对所得转移载体pMD22‑TYB‑lacz‑DFB2进行效果验证。本发明构建的重组鸡痘病毒转移载体为研制高效的表达鸭2型腺病毒的重组鸡痘病毒基因工程活载体疫苗奠定基础。

Description

一种表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体 及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及一种表达鸭2型腺病毒(DADV2)fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用。

背景技术

鸭2型腺病毒(Duck Adenovirus 2)属于腺病毒科禽腺病毒属，是直径为70-90nm的线状双股DNA病毒，呈二十面体对称，其核心蛋白形成直径60-65nm的髓芯包裹在衣壳内，衣壳由252个壳粒组成，其中有240个为六邻体，12个则是五邻体基底，每个基底结合着2根纤维突起，这两个纤维突起为纤维蛋白，分别由fiber1和fiber2两个基因编码。纤维蛋白长度与病毒的抗原性有关，带有腺病毒型和亚属特异性抗原决定簇，是刺激宿主产生抗体的主要蛋白。其中fiber2可以诱导机体产生主要的型特异性中和抗体，对病毒的增殖、组装或扩散某个阶段是必要的，缺少fiber2将不能产生病毒粒子(Pablo Guardado-Calvo，Antonio L.Llamas-Saiz，Gavin C.Fox，Patrick Langlois and Mark J.VanRaaiji.Structure of the C-terminal head domain of the fowl adenovirus type1long fiber.[J]GenVirol，2007.88:2407-2416)。

鸭2型腺病毒病1977年首次在法国番鸭发生，由J.F.Bouquet等在番鸭种分离出来(J.F.Bouquet a,Y.Moreau,J.B.McFerran&T.J.Connor，1982.Isolation andcharacterisation of an adenovirus isolated from muscovy ducks,AvianPathology,11:2,301-307)。鸭2型腺病毒主要能引起15-35天龄番鸭发病死亡，感染鸭只表现为精神萎靡、沉郁、消瘦、软脚、拉黄白色黏液稀粪，肝脏肿大苍白弥漫性黄白色针尖样坏死灶，胰腺白色坏死点的，脾脏肿大充血，肾脏肿大充血成黄色条索状。近年来在广东、浙江、福建等地番鸭、樱桃谷鸭养殖场频频爆发直接导致发病死亡率可高达10％-30％不等，给我国养鸭业造成较大的经济损失。

针对鸭2型腺病毒的疾病防治，目前并没有合适、有效的疫苗能对其进行免疫预防。有公司自家生产的组织灭活苗，虽然有一定的效果，但是使用组织苗只能作为一种应急的措施，并不能长期使用；也有公司采用细胞培养生产灭活疫苗，但效果也不佳；若是使用减毒疫苗，则会带来其他疾病的威胁，这就使得新型疫苗的研制尤为重要。因此需要开发更加有效的针对鸭2型腺病毒的疫苗。

足见，现有技术还有待完善。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用，为研制高效的表达鸭2型腺病毒的重组鸡痘病毒基因工程活载体疫苗奠定基础。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒(rFPV DADV2 fiber2)转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2，所述载体在pMD19T-Simple载体TA克隆位点插入含有鸡痘病毒的早晚期启动子LP2EP2启动下的DADV2 fiber2基因、P11启动子启动下的lacz基因，以及用于同源重组的鸡痘病毒的基因组复制非必须片段LTYB、RTYB，载体序列如SEQ ID NO：1所示。

一种表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒(rFPV DADV2 fiber2)转移载体的构建方法，该转移载体的构建流程图见图1所示，

具体包括步骤如下：

(1)构建含同源重组臂基因质粒pMD-TYB：以购自本公司大华农生物科技公司的鹌鹑化弱毒株(CVCC AV1003)鸡痘病毒疫苗所抽提的核酸作为为模板，使用引物设计软件premier5.0根据GenBank上FPV毒株(GenBank:AF198100.1)的序列设计引物LTYB-F/R、RTYB-F/R(见表1)分别扩增左右同源臂序列，先将扩增的左同源臂序列(SEQ ID NO：2)TA克隆至pMD19T-Simple载体，为质粒pMD-LTYB，再将扩增的右同源臂序列(SEQ ID NO：3)插入到NotI和EcoRI位点间，得到含有左右同源重组臂的质粒pMD-TYB；

(2)构建质粒pMD22：合成含鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2、P11启动子的多克隆位点序列(SEQ ID NO：4)，并通过TA克隆至pMD19T-Simple载体中，形成质粒pMD22；

(3)构建质粒pMD22-lacz：以质粒pSV-β-Galactosidase Control Vector为模板，设计引物lacz-F/R(见表1)扩增lacz序列，序列如SEQ ID NO：5所示，使用infusion酶插入(2)中所得质粒pMD22的XhoI位点，形成质粒pMD22-lacz；

(4)构建中间载体pMD22-TYB-lacz：将(3)中所得质粒pMD22-lacz、(1)中所得质粒pMD-TYB用NotI酶切连接，形成含有左右同源臂、鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2的多克隆位点、P11启动下lacz基因的中间转移载体pMD22-TYB-lacz；

(5)构建转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2：以本公司某鸭场分离得到的鸭2型腺病毒为模板(应用宏基因组学鉴定国内第一株鸭2型腺病毒，中国预防兽医学报，2015，37：903-907)，以D-FB2-F/D-FB2-R为引物(序列见表1)，扩增得到DADV2 fiber2基因(SEQ IDNO：6)；将扩增产物DADV2 fiber2基因插入(4)中所得质粒pMD22-TYB-lacz的SmaI位点，形成含鸭2型腺病毒fiber2基因的转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2(SEQ ID NO：1)；

(6)对(5)中所得转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2进行效果验证。

进一步的，运用上述重组载体或上述方法构建的表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体在制备FPV载体疫苗中的应用。

运用上述载体或上述方法所构建的载体制备针对鸭2型腺病毒的FPV载体疫苗的方法，包括步骤：将上述验证过的重组载体pMD22-TYB-lacz-DFB2接种于铺满单层的CEF细胞上，于37℃，5％CO2培养箱孵育2h后继续进行蓝白斑筛选纯化，如此反复进行十代左右的纯化，直至所有病变出现的空斑均为蓝斑，则纯化完成；将纯化好的病毒液再接种于CEF细胞上传十代左右，收集每代病毒液，用其生产得抗鸭2型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体疫苗。

本发明有益效果：

本发明将DADV2 fiber2基因重组到鸡痘病毒(FPV)中，构建了表达DADV2fiber2基因重组鸡痘病毒转移载体。构建的载体含有鸡痘病毒的早晚期启动子LP2EP2启动下的DADV2 fiber2基因、P11启动子启动下的lacz基因，以及用于同源重组的鸡痘病毒的基因组复制非必须区片段LTYB、RLYB。

本发明中转移载体中用于诱导表达外源基因DADV2 fiber2基因和筛选目的基因的启动子都是痘病毒自身的启动子，在构建转移载体过程中，先将含有左右同源臂、鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2的多克隆位点、P11启动下lacz基因的中间转移载体pMD22-TYB-lacz构建好，将DADV2 fiber2基因插入到pMD22-TYB-lacz过程中应用了infusion酶无缝连接方法，提高了构建效率，也避免了基因插入载体中因酶切位点有冲突的情况。

FPV作为表达载体，是继痘苗病毒之后的一种具有广阔应用前景的表达载体，具有其独特的优越性，是当今分子生物学领域的研究热点之一。研究表明，FPV载体疫苗显示出常规疫苗无可比拟的优势。首先，它克服了常规活疫苗易散毒、毒力返强等弊端；其次，真实地再现外源基因编码蛋白的抗原性，进而全方位地激发免疫应答反应；第三，递呈免疫源的单一性类似于亚单位疫苗，但不需要佐剂；最后，免疫接种与自然感染动物可以应用特异性诊断试剂进行鉴别。本发明构建的重组鸡痘病毒转移载体为研制高效的表达鸭2型腺病毒的重组鸡痘病毒基因工程活载体疫苗奠定基础。

附图说明

图1为表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体的构建流程图。

图2为LTYB、RTYB PCR扩增图；1：LTYB；2：DL2000；3：RTYB。

图3为含鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2启动子及P11启动子的多克隆位点序列MCS示意图。

图4为pMD22XhoI酶切图；1：DL10000；2：质粒pMD22；3：pMD22酶切。

图5为lacz基因扩增图；1：lacz；2：DL5000。

图6为质粒pMD22-lacz XbaI、PstI酶切鉴定图；1：质粒pMD22-lacz；2：DL10000；3：pMD22-lacz XbaI、PstI酶切。

图7为质粒pMD22-TYB-lacz酶切鉴定图；1：pMD22-TYB-lacz质粒；2：pMD22-TYB-lacz质粒SmaI酶切3：DL10000。

图8为DADV2 fiber2的PCR扩增图；1：DADV2 fiber2；2：阴性对照；3：DL2000。

图9质粒pMD22-TYB-lacz-G转染72h后荧光显微镜相关图。(a)：正常CEF细胞；(b)：pMD22-TYB-lacz-G转染正常CEF细胞；(c)：pMD22-TYB-lacz-G转染鸡痘病毒CEF细胞；(d)：感染鸡痘病毒CEF细胞。

图10为rFPV DADV2 fiber2的PCR鉴定图；1-2：rFPV DADV2 fiber2纯化第3、5代挑取蓝色克隆斑抽提的核酸；3：阳性；4：阴性；5：DL2000。

具体实施方式

为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。

实施例1

1.材料

1.1 病毒毒株和细胞

鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株(CVCCAV1003)购自本公司大华农生物科技公司，鸭2型腺病毒由本公司某鸭场病料分离得到(应用宏基因组学鉴定国内第一株鸭2型腺病毒，中国预防兽医学报，2015，37：903-907)，鸡胚成纤维细胞用温氏公司的SPF鸡胚制备。

1.2 质粒和菌种

质粒pMD19T-Simple、pGuide-it-ZsGreen1、感受态JM109购自宝生物公司，质粒pSV-β-Galactosidase Control Vector购自Promega公司，含鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2、P11启动子的多克隆位点序列的质粒pMD22为苏州省心生物技术公司合成。

1.3 主要试剂

高保真酶PrimeSTAR、限制性内切酶XhoI、SmaI、NotI、PstI、EcoRI、infusion试剂盒、IPTG、X-gal、购自TAKARA公司，T4连接酶购自NEB公司，DNA回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自OMEGA公司，质粒中提试剂盒购自life公司，DNA抽提试剂盒购自Axygen公司，胎牛血清(FCS)和DMEM培养基购自Thermo公司，转染试剂购自life公司、荧光显微镜为Leica公司。

2.方法：

表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2的构建流程见图1。

3.具体步骤：

3.1 制备鸡胚成纤维细胞：①将选好的两枚9-10日龄的发育良好的SPF鸡胚用5％的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘；②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头、四肢和内脏；③再用PH7.2的PBS冲洗两次；④用手术剪剪成小块(2-3mm)，用PH7.2的PBS冲洗两次；⑤约加20ml 0.25％胰酶溶液，37℃消化15min，期间每5min轻摇一次；⑥消化结束，将细胞消化混合液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中过滤；⑦将过滤液2000rpm离心5min，弃去上清液，将细胞用100ml含10％FCS的DMEM培养基溶解；⑧用六孔板每个孔接种2ml，37℃，5％CO2培养箱培养16小时。

3.2 鸡痘病毒液准备：待CEF细胞长至80％左右时，加入200ul用DMEM基础培养基稀释至10⁵EID50/ml的鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株，37℃，5％CO₂培养2h，六孔板每孔加入2ml含2％FCS的DMEM培养基培养72h左右，收获病毒，反复冻融三次，盲传10代，收集每代病毒液。

3.3 构建含同源重组臂基因质粒pMD-TYB

使用引物设计软件premier5.0根据GenBank上FPV毒株(GenBank:AF198100.1)的序列设计引物LTYB-F/R、RTYB-F/R(序列见表1)扩增左右重组同源臂LTYB、RTYB，引物送上海生工合成。

用上述合成引物以购自本公司大华农生物科技公司的鹌鹑化弱毒株(CVCCAV1003)鸡痘病毒疫苗抽提的FPV基因组为模板分别PCR扩增LTYB(1627bp)、RTYB(1523bp)，扩增序列分别如SEQ ID NO：2何SEQ ID NO：3所示，PCR扩增结果见图2，编号1为LTYB，片段长度为1627bp，编号3为RTYB，长度为1523bp。先将LTYB序列TA克隆到pMD19T-Simple载体上，得质粒pMD-LTYB，再将RTYB序列用插入到pMD-LTYB载体的NotI和EcoRI位点上，得质粒pMD-TYB。

PCR扩增LTYB、RTYB的扩增体系为(25ul)：

扩增程序：

3.4 根据鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2、P11启动子序列，再选取合适的酶切位点(NotI、SmaI、XbaI、PstI等)设计合成含鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2启动子及P11启动子的多克隆位点序列MCS，如SEQ ID NO：4所示，其结构如图3，将该MCS序列TA克隆到pMD19T-Simple载体中，得质粒pMD22。该过程中需合成的物质均由苏州省心生物技术有限公司合成，其用XhoI酶切鉴定图如图4所示。

3.5 质粒pMD22-lacz的构建：以质粒pSV-β-Galactosidase Control Vector为模板，设计引物lacz-F/R(序列见表1)扩增得到lacz序列(SEQ ID NO：5)，使用infusion酶将扩增得到的lacz序列(SEQ ID NO：5)插入质粒pMD22的XhoI位点，形成质粒pMD22-lacz；lacz基因扩增结果见图5，扩增片段为3070bp，质粒pMD22-lacz用XbaI、PstI酶切鉴定结果如图6所示。

扩增lacz序列的扩增体系为(25ul)：

扩增程序：

3.6 质粒pMD22-TYB-lacz的构建：将质粒pMD22-lacz、pMD-TYB用NotI酶切连接，筛选正确插入方向的阳性克隆，即为质粒pMD22-TYB-lacz，用SmaI酶切鉴定结果如图7所示。

3.7 转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2的构建：根据DADV2CH-GD-12-2014株(GenBank:KR135164.1)fiber2基因序列设计引物D-FB2-F、D-FB2-R(序列见表1)，以本公司某鸭场分离得到的鸭二型腺病毒为模板(应用宏基因组学鉴定国内第一株鸭2型腺病毒，中国预防兽医学报，2015，37：903-907)用高保真酶PrimeSTAR扩增fiber2基因片段，扩增产物序列如SEQ ID NO：6所示，结果如图8所示，用infusion方法将扩增产物插入到质粒pMD22-TYB-lacz的SmaI位点，为质粒pMD22-TYB-lacz-DFB2(SEQ ID NO：1)。

扩增fiber2基因序列扩增体系为(25ul)：

扩增程序：

表1 引物序列表

实施例2

对实施例1中的转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2进行效果验证

1.质粒pMD22-TYB-lacz中合成的含鸡痘病毒早晚期启动子诱导表达效果验证

根据购自TAKARA公司质粒pGuide-it-ZsGreen1中绿色荧光基团ZsGreen序列设计引物pGREEN-F、pGREEN-R(见表1)扩增ZsGreen基因，扩增片段大小696bp(SEQ ID NO：7)，用infusion方法将其插入质粒pMD22-TYB-lacz SmaI位点，获得质粒pMD22-TYB-lacz-G；按照life公司质粒中抽试剂盒(PureLink HiPure PlasmidMidiprep Kit)说明书抽提转移质粒pMD22-TYB-lacz-G，制备CEF细胞，当细胞长至单层时，接种鹌鹑化弱毒株(CVCCAV1003)鸡痘病毒疫苗(已传10代)，37℃，5％CO2培养箱孵育2h，再按照life公司Lipofectamine 2000说明书转染pMD22-TYB-lacz-G质粒，72h左右收集病毒液，反复冻融三次72h后在荧光显微镜下观察结果，同时转染正常CEF细胞作对比；并设正常细胞、单独感染了鸡痘疫苗病毒的CEF细胞做对照，结果如图9所示，只在转染了质粒pMD22-TYB-lacz-G的转染了鸡痘病毒的CEF细胞可见绿色荧光蛋白，表明重组载体中的启动子可被鸡痘病毒识别，并诱导重组载体中的目的基因进行重组表达。

2.表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒鉴定

按照life公司质粒中抽试剂盒(PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit)说明书抽提抽提实施例1中转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2，制备CEF细胞，当细胞长至单层时，接种鹌鹑化弱毒株(CVCC AV1003)鸡痘病毒疫苗(已传10代)，37℃，5％CO2培养箱孵育2h，按照life公司Lipofectamine 2000说明书转染pMD22-TYB-lacz-DFB2质粒，于37℃，5％培养箱中培养，72h左右收集病毒液，反复冻融三次；用X-GAL进行蓝白斑筛选，挑取蓝斑，将其进行10^-1至10^-3倍数稀释，接种于CEF细胞上，37℃，5％CO2培养箱孵育2h后，铺上含1％低熔点琼脂的DMEM培养基，待细胞出现病变后，再铺上含有浓度为250ug/ml的X-GAL、1％低熔点琼脂的DMEM培养基进行蓝白斑筛选，待出现蓝斑后挑取蓝斑，放置DMEM培养基中，反复冻融三次后，按照AXYGEN抽提病毒DNA试剂盒说明进行抽提核酸，用D-FB2-F、D-FB2-R引物进行PCR鉴定，结果如图10所示，可扩增1443bp长度的片段，说明转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2中的fiber2基因已在鸡痘病毒中进行重组表达。

实施例3 抗鸭2型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体疫苗制备

利用实施例1的载体制备抗鸭2型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体疫苗，具体操作为：

(1)按照life公司质粒中抽试剂盒(PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit)说明书抽提实施例1中转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2，制备CEF细胞(鸡胚成纤维细胞)，当细胞长至单层时，接种鹌鹑化弱毒株(CVCCAV1003)鸡痘病毒疫苗(已传10代)，37℃，5％CO2培养箱孵育2h，按照life公司Lipofectamine 2000说明书转染pMD22-TYB-lacz-DFB2质粒，72h左右收集病毒液，反复冻融三次；将上述病毒液进行10-1至10-3倍数稀释，接种于CEF细胞上，37℃，5％CO2培养箱孵育，并用X-GAL进行蓝白斑筛选，待出现蓝斑后挑取蓝斑，放置DMEM培养基中，进行反复冻融后，按照AXYGEN抽提病毒DNA试剂盒说明进行抽提核酸，用D-FB2-F、D-FB2-R引物进行PCR鉴定，结果如图10所示，可扩增1443bp的片段，说明转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2已在鸡痘病毒中进行重组。

(2)将上述挑取的鉴定为阳性的蓝斑继续接种于铺满单层的CEF细胞上，于37℃，5％CO2培养箱孵育2h后继续进行蓝白斑筛选纯化，如此反复进行十代左右的纯化，直至所有病变出现的空斑均为蓝斑，则纯化完成；将纯化好的病毒液再接种于CEF细胞上传十代左右，收集每代病毒液，每三代左右使用X-gal染色空斑计数进行一次病毒滴度检测，经检测rFPV-DADV2 fiber2重组病毒传至第十代时病毒滴度为1.2*10⁶PFU/ml，同时用检测引物D-FB2-F/R进行检测也为阳性,该病毒液可用于生产抗鸭2型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体疫苗。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

<110> 广东温氏食品集团股份有限公司

<120> 一种表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用

<160> 7

<210> 1

<211> 10589

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt agaactcggt acgcgcggat 420

cttccagaga ttacaacggc atgactaccg agtatagata aagatttaga aatcatttct 480

aagaaattta gatactgatg tatacaagta taactaatag cgagtaattt attttgttct 540

atagcttcat tatatttttt taaagcagat acaagttgtg tatttagagc gtcgttaaag 600

taaacagtat ttccttctac atttaatgaa ctcaataaca tatttcccga aggtaataat 660

cttgaccaag ggaaaataga atattcacgg tataagaaac atacagaata accattttct 720

attaactttt caacagaaat agctcctctc atacccgtac taaaattctc taaaaatctg 780

actggttttt tttctaaaga tactctagtc cctccagatg tgactaaagc tacacgcctg 840

tttttctctt tttgtaattt tacccaatta ttaatgttag tagtcgtgtc cattttttta 900

atataagaat ttatattagg ttaatttata agaaaccaat actttaaatc tctaattcgt 960

tgttctaaac aacagttatg gtttcttaaa ttgttgattc atgataatat tatcgtaata 1020

attctattat tgaaatatct agtctcgttt ttgagataaa tattacgaat aaagcatatt 1080

catatcaaag caacattagc tttacattta agttgtacta cgcatacgca cgaagtacct 1140

attcttatat attcccagga aggcattcca tttttaataa ctatagagtt aacaaaagaa 1200

tgagacgtag aacaataaga ggaccaaaat cgtgtatcta ttcctaaaca gccactaata 1260

gccggatatt ccttacactt ggtttcgaat aggtactgat agtaaacttg tttattatgt 1320

actatttgat ccaatagttc tagtttatta cctctgtgat caaagactgt agttttgtta 1380

gcgacccatg tagaactact ttcacaagat aagtatattc cttcactggt attacctaca 1440

gacaataatt catctatgct tcgtttacca cgatgttcta tattcggagt acgagtacta 1500

aaaacaactt tagatgtatc taatttatcg tttataagat aaggattagt aaattggagt 1560

aacgatccct tgcatactat acctaataca catataaaga ttagccttct aaaattacag 1620

gggtgcgtat ggtatgccat tcttatttat atatgaactt actaattaag taatagaata 1680

tgtctcagta ataattgacg gtacactgta gtatttgatt ccactagtaa acacataaat 1740

tccttaccat tatgtttatt atccactaat agttctctaa taaaaaatgt agagttttgt 1800

aacggaattg ttacaggact tttatgaatt accgattcca tttcgctaat gggtttacca 1860

ccgggaccgg cccaaaacat tctcgctgac gaacctttcc taccacaccc tacacatatt 1920

aagctagtag tatttatatc ttcaggcagt ctagtaatat taacgtaggt acaatcttcg 1980

cgtgttacag gacagcattc tcgcacaccg tcggaatttt ttcttgcgtt ttccggaaga 2040

tatccttcta ggtctagaag cggccgcctg cagcctgccc ggttattatt atttttgaca 2100

ccagaccaac tggtaatggt agcgaccggc gctcagctgg aattccgccg atactgacgg 2160

gctccaggag tcgtcgccac caatccccat atggaaaccg tcgatattca gccatgtgcc 2220

ttcttccgcg tgcagcagat ggcgatggct ggtttccatc agttgctgtt gactgtagcg 2280

gctgatgttg aactggaagt cgccgcgcca ctggtgtggg ccataattca attcgcgcgt 2340

cccgcagcgc agaccgtttt cgctcgggaa gacgtacggg gtatacatgt ctgacaatgg 2400

cagatcccag cggtcaaaac aggcggcagt aaggcggtcg ggatagtttt cttgcggccc 2460

taatccgagc cagtttaccc gctctgctac ctgcgccagc tggcagttca ggccaatccg 2520

cgccggatgc ggtgtatcgc tcgccacttc aacatcaacg gtaatcgcca tttgaccact 2580

accatcaatc cggtaggttt tccggctgat aaataaggtt ttcccctgat gctgccacgc 2640

gtgagcggtc gtaatcagca ccgcatcagc aagtgtatct gccgtgcact gcaacaacgc 2700

tgcttcggcc tggtaatggc ccgccgcctt ccagcgttcg acccaggcgt tagggtcaat 2760

gcgggtcgct tcacttacgc caatgtcgtt atccagcggt gcacgggtga actgatcgcg 2820

cagcggcgtc agcagttgtt ttttatcgcc aatccacatc tgtgaaagaa agcctgactg 2880

gcggttaaat tgccaacgct tattacccag ctcgatgcaa aaatccattt cgctggtggt 2940

cagatgcggg atggcgtggg acgcggcggg gagcgtcaca ctgaggtttt ccgccagacg 3000

ccactgctgc caggcgctga tgtgcccggc ttctgaccat gcggtcgcgt tcggttgcac 3060

tacgcgtact gtgagccaga gttgcccggc gctctccggc tgcggtagtt caggcagttc 3120

aatcaactgt ttaccttgtg gagcgacatc cagaggcact tcaccgcttg ccagcggctt 3180

accatccagc gccaccatcc agtgcaggag ctcgttatcg ctatgacgga acaggtattc 3240

gctggtcact tcgatggttt gcccggataa acggaactgg aaaaactgct gctggtgttt 3300

tgcttccgtc agcgctggat gcggcgtgcg gtcggcaaag accagaccgt tcatacagaa 3360

ctggcgatcg ttcggcgtat cgccaaaatc accgccgtaa gccgaccacg ggttgccgtt 3420

ttcatcatat ttaatcagcg actgatccac ccagtcccag acgaagccgc cctgtaaacg 3480

gggatactga cgaaacgcct gccagtattt agcgaaaccg ccaagactgt tacccatcgc 3540

gtgggcgtat tcgcaaagga tcagcgggcg cgtctctcca ggtagcgaaa gccatttttt 3600

gatggaccat ttcggcacag ccgggaaggg ctggtcttca tccacgcgcg cgtacatcgg 3660

gcaaataata tcggtggccg tggtgtcggc tccgccgcct tcatactgca ccgggcggga 3720

aggatcgaca gatttgatcc agcgatacag cgcgtcgtga ttagcgccgt ggcctgattc 3780

attccccagc gaccagatga tcacactcgg gtgattacga tcgcgctgca ccattcgcgt 3840

tacgcgttcg ctcatcgccg gtagccagcg cggatcatcg gtcagacgat tcattggcac 3900

catgccgtgg gtttcaatat tggcttcatc caccacatac aggccgtagc ggtcgcacag 3960

cgtgtaccac agcggatggt tcggataatg cgaacagcgc acggcgttaa agttgttctg 4020

cttcatcagc aggatatcct gcaccatcgt ctgctcatcc atgacctgac catgcagagg 4080

atgatgctcg tgacggttaa cgcctcgaat cagcaacggc ttgccgttca gcagcagcag 4140

accattttca atccgcacct cgcggaaacc gacatcgcag gcttctgctt caatcagcgt 4200

gccgtcggcg gtgtgcagtt caaccaccgc acgatagaga ttcgggattt cggcgctcca 4260

cagtttcggg ttttcgacgt tcagacgtag tgtgacgcga tcggcataac caccacgctc 4320

atcgataatt tcaccgccga aaggcgcggt gccgctggcg acctgcgttt caccctgcca 4380

taaagaaact gttacccgta ggtagtcacg caactcgccg cacatctgaa cttcagcctc 4440

cagtacagcg cggctgaaat catcattaaa gcgagtggca acatggaaat cgctgatttg 4500

tgtagtcggt ttatgcagca acgagacgtc acggaaaatg ccgctcatcc gccacatatc 4560

ctgatcttcc agataactgc cgtcactcca gcgcagcacc atcaccgcga ggcggttttc 4620

tccggcgcgt aaaaatgcgc tcaggtcaaa ttcagacggc aaacgactgt cctggccgta 4680

accgacccag cgcccgttgc accacagatg aaacgccgag ttaacgccat caaaaataat 4740

tcgcgtctgg ccttcctgta gccagctttc atcaacatta aatgtgagcg agtaacaacc 4800

cgtcggattc tccgtgggaa caaacggcgg attgaccgta atgggatagg tcacgttggt 4860

gtagatgggc gcatcgtaac cgtgcatctg ccagtttgag gggacgacga cagtatcggc 4920

ctcaggaaga tcgcactcca gccagctttc cggcaccgct tctggtgccg gaaaccaggc 4980

aaagcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc 5040

ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac 5100

gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggga tccctcgagg aattcattta 5160

tagcatagaa aaaaacaaaa tgaaattcta ctatattttt acatacatat attctaaata 5220

tgaaagtggt gattgtgact agcgtagcat cgcttctaga ataaaaatta attaattatg 5280

gatctaatta acatttgatg ggttgctaac gtacgaaaat ggaattggac caattgtaat 5340

atcaccagtt gtgccttgtt tgtacagata gtacgaagat tgatctatct tattaagttc 5400

tattgtaaaa gttaattgtg gtgatgtggg gcttcctgat acttgggcta tggagaatct 5460

tgatacgtaa tcatacacat tctttaggtt ccctgtgcct attggaactc ctgatgtgtt 5520

taccccacta tagttataca gaataaagtc atgttctgaa acattgctga catcaaaatt 5580

tttgtatgct ggtgtgatgc atgccttaac gactgcggtt tcctctggct tataactgtt 5640

gttggtacag tgggaaaaat tgacggtgtt ttcattacct atgtctcgac ataaccagaa 5700

tgtgaatact ggttgaatag tcgcgaagcg ttgatctaca gcatgtgatg catcctcagc 5760

gctcaccttc agtgttatat atcctgaaga cacattgttt gagcatacga tcttggcata 5820

gtatgcgcac ggaaacgtaa cagaccctgc tccgcagcac acttgggctt gtgtcttctg 5880

aagtgtgtca gatccactcg taaagacata ggttgagtat gagcttgtga ggtgtagggt 5940

attgtcagtg acggccaggc ttcctgggtc caccttgagg tcgaggcctc cgttgtctag 6000

tgttatgcac gatgtgggga tgatgttgat gcctaactct ttctctcctt gaggattagt 6060

tctaacggag agtgattgat cgatatcaat atccagtcct ttgccagggt cgattgtaag 6120

tggcccgctt tcactaacga gtactgttag gccttcgtcg ctgactatca acgcatcatc 6180

atcaattttt acatctaatc cgttgttact gtgtagtgca ccatcggggt ttagtcgtac 6240

accgagagtc atctgtgaat ttggttgcat tgatgttatt gacatggttt ctgtatcata 6300

ggctataccc actccttcat ctgacacttc gatagggcca cgtggatctg gttttacaga 6360

taaacctgtg aactcgtctt cttcaagacc gtctcctaga gctaaactga gtccagcggg 6420

cgactcatct agaggcccgt ttgggtcgat tttaacgcct agtttgccac ttgtcacagc 6480

tagcgaatca tcgtacagta ggctgaggct gttaccaacg gttcttatcg ggtcggatgt 6540

tcttacgtta agatacccgt tgtcatcata cagtggtccg gtgacaaacg gaggatttat 6600

cgggttggca ctcgaagctt gctcccagaa cggatatgtt aggtcgattg tcgcagaagc 6660

agatgcctga atcttcgcac gctttgtgaa tccttcacca ttgtctgatc tgttggtccg 6720

tttcatgggc atttattatc gataattaca attcaatttt aggatacaga tctatttata 6780

tgccaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagagtcg acctaggcgg ccgctatgaa ttccttctgg 6840

acacgatatc tatcctacta agtatgtatg gtatttattt atcaattaat ctgcgtatgt 6900

agtaactact acagcgtttc taagatcatc atgtcctaca attttatttc tttgacgtcg 6960

tgtttatatc attttctgtt ttgggataat aattttctct aatataaaat tatatattaa 7020

ttctttttct atattgaagt gatttaatta aagaaaatat gtaatcttta tctaattagg 7080

tttttcctta tctaataata gaactgtata cctggtgatc ttcctacttg atttacgtga 7140

cctaatataa ttatttagat atttacctgt ttttcgcata aatataattc ctaaaaatat 7200

tattattaag atattaatat ctattatcca tgataatata tagagaaaca ttatattaat 7260

cgccaatcga atatgaataa catacatagt aataataaag atagcagtta atggcaaact 7320

aatattattc atgataactg ctataaaaga agataatata gcaagatata ttgaagtgtc 7380

tatcatatct tattttatgg ataaaccttt aacggcaact tctaagttac ttattttttg 7440

gtttattaaa ctattggttt tttcgtactt ttcttccaat ttttttgtat ttttctttaa 7500

ttttaatatc tcattatcat gaatgtcgta tagtatttta cttataccct cagagaagaa 7560

gccgcttcgt atctgatctt cattatcaga acctttttta agcctcgtgc aataggagtt 7620

agaaagatag gagttaagta tcttggaaaa attaagtgca atactaggaa aaacccaaca 7680

gataatatga ggcacgagat cgatatgcac atatgttcct acaagttcgt atttataggc 7740

actatttgat gctaatccga tttctaaaac ggctttatta tagataccgt ttttatagtt 7800

caatgttttt atgagttttt tagatgactc tagtctacac cactgcctaa agttcttatt 7860

tccaagatca catattttag tagcatttat atatccgttg tattttaaca tgattacttc 7920

tatgttcgca tagttgataa agcaaaagtt ctcatctata tgtttaacgg tgttaggtac 7980

aaactccata ttgtaatact ttcattcaga atagtattgt ttttacattt tttattataa 8040

ggaaaaaact ggtttattca ttttctttta accatgcata cacaatttac aggaactgat 8100

acatgtttag tcattacagc attattttca ccaagataca ttattttttt aatttctgtg 8160

accgtagaac agtaagattc ccatcttgac tcatcaatgc ccttacaagg agatgtagaa 8220

ttagggaatc ccatgcagct aatcatttga atgtattgtg tgtatccatc tcctttctca 8280

gaatatctgc ccaaaaattc tattttactg acaccagttc cattaacaat cgtcgaacgg 8340

caggcgtgca aacttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 8400

gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 8460

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cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 8580

tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 8640

agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 8700

aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 8760

gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 8820

tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 8880

cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 8940

ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 9000

cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 9060

atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 9120

agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 9180

gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 9240

gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 9300

tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 9360

agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 9420

gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 9480

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tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 9900

ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 9960

cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 10020

agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 10080

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acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 10260

acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 10320

agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 10380

aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 10440

gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa atgggggttc cgcgcacatt 10500

tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa 10560

aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 10589

<210> 2

<211> 1645

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acaacggcat gactaccgag tatagataaa gatttagaaa tcatttctaa gaaatttaga 60

tactgatgta tacaagtata actaatagcg agtaatttat tttgttctat agcttcatta 120

tattttttta aagcagatac aagttgtgta tttagagcgt cgttaaagta aacagtattt 180

ccttctacat ttaatgaact caataacata tttcccgaag gtaataatct tgaccaaggg 240

aaaatagaat attcacggta taagaaacat acagaataac cattttctat taacttttca 300

acagaaatag ctcctctcat acccgtacta aaattctcta aaaatctgac tggttttttt 360

tctaaagata ctctagtccc tccagatgtg actaaagcta cacgcctgtt tttctctttt 420

tgtaatttta cccaattatt aatgttagta gtcgtgtcca tttttttaat ataagaattt 480

atattaggtt aatttataag aaaccaatac tttaaatctc taattcgttg ttctaaacaa 540

cagttatggt ttcttaaatt gttgattcat gataatatta tcgtaataat tctattattg 600

aaatatctag tctcgttttt gagataaata ttacgaataa agcatattca tatcaaagca 660

acattagctt tacatttaag ttgtactacg catacgcacg aagtacctat tcttatatat 720

tcccaggaag gcattccatt tttaataact atagagttaa caaaagaatg agacgtagaa 780

caataagagg accaaaatcg tgtatctatt cctaaacagc cactaatagc cggatattcc 840

ttacacttgg tttcgaatag gtactgatag taaacttgtt tattatgtac tatttgatcc 900

aatagttcta gtttattacc tctgtgatca aagactgtag ttttgttagc gacccatgta 960

gaactacttt cacaagataa gtatattcct tcactggtat tacctacaga caataattca 1020

tctatgcttc gtttaccacg atgttctata ttcggagtac gagtactaaa aacaacttta 1080

gatgtatcta atttatcgtt tataagataa ggattagtaa attggagtaa cgatcccttg 1140

catactatac ctaatacaca tataaagatt agccttctaa aattacaggg gtgcgtatgg 1200

tatgccattc ttatttatat atgaacttac taattaagta atagaatatg tctcagtaat 1260

aattgacggt acactgtagt atttgattcc actagtaaac acataaattc cttaccatta 1320

tgtttattat ccactaatag ttctctaata aaaaatgtag agttttgtaa cggaattgtt 1380

acaggacttt tatgaattac cgattccatt tcgctaatgg gtttaccacc gggaccggcc 1440

caaaacattc tcgctgacga acctttccta ccacacccta cacatattaa gctagtagta 1500

tttatatctt caggcagtct agtaatatta acgtaggtac aatcttcgcg tgttacagga 1560

cagcattctc gcacaccgtc ggaatttttt cttgcgtttt ccggaagata tccttctagg 1620

tctagaagcg gccgctatga attca 1645

<210> 3

<211> 1523

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatgcggccg ctatgaattc cttctggaca cgatatctat cctactaagt atgtatggta 60

tttatttatc aattaatctg cgtatgtagt aactactaca gcgtttctaa gatcatcatg 120

tcctacaatt ttatttcttt gacgtcgtgt ttatatcatt ttctgttttg ggataataat 180

tttctctaat ataaaattat atattaattc tttttctata ttgaagtgat ttaattaaag 240

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taatatatag agaaacatta tattaatcgc caatcgaata tgaataacat acatagtaat 480

aataaagata gcagttaatg gcaaactaat attattcatg ataactgcta taaaagaaga 540

taatatagca agatatattg aagtgtctat catatcttat tttatggata aacctttaac 600

ggcaacttct aagttactta ttttttggtt tattaaacta ttggtttttt cgtacttttc 660

ttccaatttt tttgtatttt tctttaattt taatatctca ttatcatgaa tgtcgtatag 720

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ttttttaagc ctcgtgcaat aggagttaga aagataggag ttaagtatct tggaaaaatt 840

aagtgcaata ctaggaaaaa cccaacagat aatatgaggc acgagatcga tatgcacata 900

tgttcctaca agttcgtatt tataggcact atttgatgct aatccgattt ctaaaacggc 960

tttattatag ataccgtttt tatagttcaa tgtttttatg agttttttag atgactctag 1020

tctacaccac tgcctaaagt tcttatttcc aagatcacat attttagtag catttatata 1080

tccgttgtat tttaacatga ttacttctat gttcgcatag ttgataaagc aaaagttctc 1140

atctatatgt ttaacggtgt taggtacaaa ctccatattg taatactttc attcagaata 1200

gtattgtttt tacatttttt attataagga aaaaactggt ttattcattt tcttttaacc 1260

atgcatacac aatttacagg aactgataca tgtttagtca ttacagcatt attttcacca 1320

agatacatta tttttttaat ttctgtgacc gtagaacagt aagattccca tcttgactca 1380

tcaatgccct tacaaggaga tgtagaatta gggaatccca tgcagctaat catttgaatg 1440

tattgtgtgt atccatctcc tttctcagaa tatctgccca aaaattctat tttactgaca 1500

ccagttccat taacgaattc agt 1523

<210> 4

<211> 260

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcggccgcct aggtcgactc tttttttttt tttttttttt ggcatataaa tagatctgta 60

tcctaaaatt gaattgtaat tatcgataat aaatgcccgg gatccataat taattaattt 120

ttattctaga ctagaagcga tgctacgcta gtcacaatca ccactttcat atttagaata 180

tatgtatgta aaaatatagt agaatttcat tttgtttttt tctatgctat aaatgaattc 240

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 120

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agaagcggtg ccggaaagct ggctggagtg cgatcttcct gaggccgata ctgtcgtcgt 240

cccctcaaac tggcagatgc acggttacga tgcgcccatc tacaccaacg tgacctatcc 300

cattacggtc aatccgccgt ttgttcccac ggagaatccg acgggttgtt actcgctcac 360

atttaatgtt gatgaaagct ggctacagga aggccagacg cgaattattt ttgatggcgt 420

taactcggcg tttcatctgt ggtgcaacgg gcgctgggtc ggttacggcc aggacagtcg 480

tttgccgtct gaatttgacc tgagcgcatt tttacgcgcc ggagaaaacc gcctcgcggt 540

gatggtgctg cgctggagtg acggcagtta tctggaagat caggatatgt ggcggatgag 600

cggcattttc cgtgacgtct cgttgctgca taaaccgact acacaaatca gcgatttcca 660

tgttgccact cgctttaatg atgatttcag ccgcgctgta ctggaggctg aagttcagat 720

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ggtcgccagc ggcaccgcgc ctttcggcgg tgaaattatc gatgagcgtg gtggttatgc 840

cgatcgcgtc acactacgtc tgaacgtcga aaacccgaaa ctgtggagcg ccgaaatccc 900

gaatctctat cgtgcggtgg ttgaactgca caccgccgac ggcacgctga ttgaagcaga 960

agcctgcgat gtcggtttcc gcgaggtgcg gattgaaaat ggtctgctgc tgctgaacgg 1020

caagccgttg ctgattcgag gcgttaaccg tcacgagcat catcctctgc atggtcaggt 1080

catggatgag cagacgatgg tgcaggatat cctgctgatg aagcagaaca actttaacgc 1140

cgtgcgctgt tcgcattatc cgaaccatcc gctgtggtac acgctgtgcg accgctacgg 1200

cctgtatgtg gtggatgaag ccaatattga aacccacggc atggtgccaa tgaatcgtct 1260

gaccgatgat ccgcgctggc taccggcgat gagcgaacgc gtaacgcgaa tggtgcagcg 1320

cgatcgtaat cacccgagtg tgatcatctg gtcgctgggg aatgaatcag gccacggcgc 1380

taatcacgac gcgctgtatc gctggatcaa atctgtcgat ccttcccgcc cggtgcagta 1440

tgaaggcggc ggagccgaca ccacggccac cgatattatt tgcccgatgt acgcgcgcgt 1500

ggatgaagac cagcccttcc cggctgtgcc gaaatggtcc atcaaaaaat ggctttcgct 1560

acctggagag acgcgcccgc tgatcctttg cgaatacgcc cacgcgatgg gtaacagtct 1620

tggcggtttc gctaaatact ggcaggcgtt tcgtcagtat ccccgtttac agggcggctt 1680

cgtctgggac tgggtggatc agtcgctgat taaatatgat gaaaacggca acccgtggtc 1740

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gaaaacctta tttatcagcc ggaaaaccta ccggattgat ggtagtggtc aaatggcgat 2580

taccgttgat gttgaagtgg cgagcgatac accgcatccg gcgcggattg gcctgaactg 2640

ccagctggcg caggtagcag agcgggtaaa ctggctcgga ttagggccgc aagaaaacta 2700

tcccgaccgc cttactgccg cctgttttga ccgctgggat ctgccattgt cagacatgta 2760

taccccgtac gtcttcccga gcgaaaacgg tctgcgctgc gggacgcgcg aattgaatta 2820

tggcccacac cagtggcgcg gcgacttcca gttcaacatc agccgctaca gtcaacagca 2880

actgatggaa accagccatc gccatctgct gcacgcggaa gaaggcacat ggctgaatat 2940

cgacggtttc catatgggga ttggtggcga cgactcctgg agcccgtcag tatcggcgga 3000

attccagctg agcgccggtc gctaccatta ccagttggtc tggtgtcaaa aataataata 3060

accgggcagg 3070

<210> 6

<211> 1443

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaaacgga ccaacagatc agacaatggt gaaggattca caaagcgtgc gaagattcag 60

gcatctgctt ctgcgacaat cgacctaaca tatccgttct gggagcaagc ttcgagtgcc 120

aacccgataa atcctccgtt tgtcaccgga ccactgtatg atgacaacgg gtatcttaac 180

gtaagaacat ccgacccgat aagaaccgtt ggtaacagcc tcagcctact gtacgatgat 240

tcgctagctg tgacaagtgg caaactaggc gttaaaatcg acccaaacgg gcctctagat 300

gagtcgcccg ctggactcag tttagctcta ggagacggtc ttgaagaaga cgagttcaca 360

ggtttatctg taaaaccaga tccacgtggc cctatcgaag tgtcagatga aggagtgggt 420

atagcctatg atacagaaac catgtcaata acatcaatgc aaccaaattc acagatgact 480

ctcggtgtac gactaaaccc cgatggtgca ctacacagta acaacggatt agatgtaaaa 540

attgatgatg atgcgttgat agtcagcgac gaaggcctaa cagtactcgt tagtgaaagc 600

gggccactta caatcgaccc tggcaaagga ctggatattg atatcgatca atcactctcc 660

gttagaacta atcctcaagg agagaaagag ttaggcatca acatcatccc cacatcgtgc 720

ataacactag acaacggagg cctcgacctc aaggtggacc caggaagcct ggccgtcact 780

gacaataccc tacacctcac aagctcatac tcaacctatg tctttacgag tggatctgac 840

acacttcaga agacacaagc ccaagtgtgc tgcggagcag ggtctgttac gtttccgtgc 900

gcatactatg ccaagatcgt atgctcaaac aatgtgtctt caggatatat aacactgaag 960

gtgagcgctg aggatgcatc acatgctgta gatcaacgct tcgcgactat tcaaccagta 1020

ttcacattct ggttatgtcg agacataggt aatgaaaaca ccgtcaattt ttcccactgt 1080

accaacaaca gttataagcc agaggaaacc gcagtcgtta aggcatgcat cacaccagca 1140

tacaaaaatt ttgatgtcag caatgtttca gaacatgact ttattctgta taactatagt 1200

ggggtaaaca catcaggagt tccaataggc acagggaacc taaagaatgt gtatgattac 1260

gtatcaagat tctccatagc ccaagtatca ggaagcccca catcaccaca attaactttt 1320

acaatagaac ttaataagat agatcaatct tcgtactatc tgtacaaaca aggcacaact 1380

ggtgatatta caattggtcc aattccattt tcgtacgtta gcaacccatc aaatgttaat 1440

tag 1443

<210> 7

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggcccagt ccaagcacgg cctgaccaag gagatgacca tgaagtaccg catggagggc 60

tgcgtggacg gccacaagtt cgtgatcacc ggcgagggca tcggctaccc cttcaagggc 120

aagcaggcca tcaacctgtg cgtggtggag ggcggcccct tgcccttcgc cgaggacatc 180

ttgtccgccg ccttcatgta cggcaaccgc gtgttcaccg agtaccccca ggacatcgtc 240

gactacttca agaactcctg ccccgccggc tacacctggg accgctcctt cctgttcgag 300

gacggcgccg tgtgcatctg caacgccgac atcaccgtga gcgtggagga gaactgcatg 360

taccacgagt ccaagttcta cggcgtgaac ttccccgccg acggccccgt gatgaagaag 420

atgaccgaca actgggagcc ctcctgcgag aagatcatcc ccgtgcccaa gcagggcatc 480

ttgaagggcg acgtgagcat gtacctgctg ctgaaggacg gtggccgctt gcgctgccag 540

ttcgacaccg tgtacaaggc caagtccgtg ccccgcaaga tgcccgactg gcacttcatc 600

cagcacaagc tgacccgcga ggaccgcagc gacgccaaga accagaagtg gcacctgacc 660

gagcacgcca tcgcctccgg ctccgccttg ccctga 696

Claims (4)

1.一种表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体，所述载体在pMD19T-Simple载体TA克隆位点插入含有鸡痘病毒的早晚期启动子LP2EP2启动下的DADV2fiber2基因、P11启动子启动下的lacz基因，以及用于同源重组的鸡痘病毒的基因组复制非必须片段LTYB、RTYB，载体序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)构建含同源重组臂基因质粒pMD-TYB：以鸡痘病毒的核酸作为为模板，使用引物LTYB-F/R、RTYB-F/R分别扩增左右同源臂序列，先将扩增的左同源臂序列TA克隆至pMD19T-Simple载体，得到质粒pMD-LTYB，再将扩增的右同源臂序列插入到NotI和EcoRI位点间，得到含有左右同源重组臂的质粒pMD-TYB；

(2)构建质粒pMD22：合成含鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2、P11启动子的多克隆位点序列，并通过TA克隆至pMD19T-Simple载体中，形成质粒pMD22；

(3)构建质粒pMD22-lacz：以质粒pSV-β-Galactosidase Control Vector为模板，使用引物lacz-F/R扩增lacz序列，使用infusion酶将扩增产物插入(2)中所得质粒pMD22的XhoI位点，形成质粒pMD22-lacz；

(4)构建中间载体pMD22-TYB-lacz：将(3)中所得质粒pMD22-lacz、(1)中所得质粒pMD-TYB用NotI酶切连接，形成含有左右同源臂、鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2的多克隆位点、P11启动下lacz基因的中间转移载体pMD22-TYB-lacz；

(5)构建转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2：以鸭2型腺病毒为模板，以D-FB2-F/D-FB2-R为引物，扩增得到DADV2 fiber2基因；将扩增产物DADV2fiber2基因插入(4)中所得质粒pMD22-TYB-lacz的SmaI位点，形成含鸭2型腺病毒fiber2基因的转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2；

(6)对(5)中所得转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2进行效果验证。

3.根据权利要求1所述表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体在制备FPV载体疫苗中的应用。

4.一种抗鸭2型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体的FPV载体疫苗的制备方法，包括步骤：

将权利要求1所述的重组鸡痘病毒转移载体接种于铺满单层的CEF细胞上，于37℃，5％CO₂培养箱孵育2h后继续进行蓝白斑筛选纯化，如此反复进行十代的纯化，直至所有病变出现的空斑均为蓝斑，则纯化完成；将纯化好的病毒液再接种于CEF细胞上进行传十代，收集病毒液，用其生产得抗鸭2型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体疫苗。

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