CN110042117A - 弓形虫α淀粉酶基因敲除虫株的构建方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种弓形虫基因敲除虫株的构建方法，该方法敲除了弓形虫α淀粉酶基因，所述α淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述弓形虫基因敲除虫株在α淀粉酶位点具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。该基因敲除虫株具有毒力小，在动物体内繁殖少等优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有成为抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

Description

弓形虫α淀粉酶基因敲除虫株的构建方法及用途
技术领域
本发明涉及一种弓形虫α淀粉酶(简称AMY)基因敲除虫株的构建方法，以及使用该方法构建的α淀粉酶基因缺失虫株的用途，属于生物及基因工程领域。
背景技术
弓形虫是一种能够引起世界性的人畜共患病的原虫，从属于顶复动物门，是一种专性细胞内寄生虫，具有很强的入侵能力，能够感染几乎所有温血动物。据估计，世界上超过三分之一的人口已经暴露在这种寄生虫之下，并已被该虫潜伏感染。在南美和欧洲一些地区，人群和动物的感染率高达80-90％；在中国，感染率一般在10％左右。弓形虫是一种非常重要的机会性致病原虫，在人类中，免疫功能正常的宿主感染后多呈无症状带虫状态，而在免疫功能受损或先天感染者，常存在很大风险，严重时可致死。孕妇感染弓形虫可引起流产、胎儿畸形、死胎，免疫缺陷和免疫抑制病。鉴于其危害的严重性，弓形虫已被列为孕妇常规检查中的一个必检项目。弓形虫能在人、畜和野生动物之间广泛传播，对人类健康和畜牧业生产构成严重威胁，弓形虫感染重要农业动物会产生巨大经济损失，同时能通过食物传播给人类。随着城市犬、猫的数量增多，人们饮食习惯及行为方式的改变，以及有机农业的兴起，目前弓形虫感染率正呈上升的趋势。
因此，弓形虫病的防控对于人类健康和畜牧养殖业的发展均有重要意义。然而，到目前为止，弓形虫病的预防没有良好的疫苗，因而构建具有良好免疫原性和免疫保护力的弓形虫疫苗具有重要价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种弓形虫α淀粉酶基因敲除虫株的构建方法，该虫株由于敲除了α淀粉酶基因，具有毒力小，在动物体内繁殖少等优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有制备抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。
(1)本发明所述弓形虫基因敲除虫株(简称△AMY虫株)的构建：构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgAMY质粒、制备α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR同源模板,共电转至出发虫株ME49，经1uM乙胺嘧啶筛选、PCR鉴定获得弓形虫基因敲除虫株△AMY；
(2)进行了基因敲除虫株△AMY毒力试验：以野生型虫株ME49为对照,腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，1×102个速殖子/小鼠，每组接10只，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明感染△AMY敲除株的小鼠30天内存活率90％。
(3)不同剂量的△AMY虫株对小鼠的毒力试验：腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，1×102，1×103，和1×104个敲除株虫子，每组接10只，对照组接1×102个ME49速殖子/小鼠，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明接种1×102敲除株实验组小鼠30天之内没有死亡，1×103敲除株30天之内小鼠存活率80％，1×104敲除株30天之内小鼠存活率50％，对照组小鼠存活率20％。说明弓形虫AMY基因敲除之后对小鼠的毒力下降明显。
(4)小鼠感染△AMY虫株后的荷虫量试验：对7周龄雌性ICR小鼠腹腔接种1×105个敲除株和野生型虫株速殖子，感染后7天，收取小鼠腹水，进行定量qPCR，分析腹水荷虫量。结果表明接种△AMY敲除虫株小鼠腹水荷虫量显著低于野生型ME49的对照组小鼠腹水荷虫量，说明弓形虫△AMY在小鼠体内无明显繁殖，可以被宿主有效清除。
(5)△AMY虫株对小鼠的免疫保护力：以1×102个速殖子每只小鼠的感染量接种ICR小鼠，每组5只。在第30天后对免疫过的小鼠及空白ICR小鼠(每组10只)分别接种1×103个ME49野生型虫株，观察、记录小鼠死亡情况，统计小鼠30天内的死亡率。结果表明△AMY虫株对小鼠抵抗野生型虫株感染具有良好的保护力，有成为基因工程疫苗的潜力。
附图说明
图1是△AMY的单克隆虫株PCR鉴定结果。
图2是△AMY虫株对小鼠的毒力试验结果。
图3是小鼠感染△AMY虫株后腹水中的荷虫量。
图4是△AMY虫株对小鼠的免疫保护力试验结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：弓形虫△AMY虫株的构建
(1)出发虫株ME49
ME49是具有α淀粉酶基因的球虫目弓形虫科弓形科属的II型虫株，所述α淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgAMY质粒的构建
①用gRNA在线设计网站(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)对目标基因打靶位点进行设计，根据所设计的靶点序列设计gRNA引物：
上游引物gRNA-AMY-F:5’-GTCCCAGGGCATGCTATGGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQID NO：3)
下游引物gRNA-R：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’(SEQ ID NO：4)
②在灭菌PCR管中配制如下反应体系，其中模板DNA：pSAG1-Cas9-TgU6-sgUPRT质粒(购自http://www.addgene.org)：
③PCR反应条件如下：
④PCR结束以后，在PCR反应体系里直接加1μl DpnI，PCR仪里37℃消化30min。
⑤取新的灭菌PCR管，配制如下反应体系：
在PCR仪中，25℃反应15min；
⑥取全部反应产物转化入DH5α(100μl)感受态细胞中，涂LB/Amp平板，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落置于5ml LB/Amp液体培养基中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊；取500μl菌液进行测序分析，测序引物为M13反向引物，若测序结果显示靶点序列已完全被替换，即质粒构建成功，利用Omega公司的去内毒素质粒提取试剂盒(Endo-free PlasmidMini Kit II)对pSAG1-Cas9-TgU6-sgAMY质粒进行提取，并测定浓度、备用。
(3)α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR同源模板的制备
①根据拟敲除基因的Gene ID在ToxoDB上确定该基因所在的locus，通过其所在的基因组序列确定5’同源臂(α-amy-5UTR)和3’同源臂(α-amy-3UTR)；
②根据多片段无缝连接试剂盒说明书中所介绍的方法进行5’同源臂，3’同源臂，DHFR药物筛选标签，pUC19载体无缝连接扩增引物的设计；
③利用设计的引物(表1)用高保真酶(KD plus)分别从弓形虫ME49基因组DNA中扩增获得5’同源臂和3’同源臂片段，从带DHFR的质粒(购自http://www.addgene.org)中扩增获得DHFR片段，利用所设计的特异性引物线性化pUC19载体(购自http://www.addgene.org)，分别对上述目的片段进行回收，并利用NanoDrop2000测定回收产物浓度；
表1.构建p AMY-5UTR::DHFR::AMY-3UTR质粒所使用的引物
④根据回收产物的浓度配制如下反应体系：
充分混匀后，37℃反应30min，冰上放置5min；
⑤将10μl连接产物全部转化入DH5α(100μl)感受态细胞中，涂LB/Amp平板，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落置于含5ml LB/Amp液体培养基的无菌PV玻璃瓶中，37℃/180rpm振荡培养10h至菌液浑浊；分别利用M13正向和反向引物进行测序分析，若测序结果正确即可认为pAMY-5UTR::DHFR::AMY-3UTR质粒构建成功，遂将鉴定正确的菌液进行质粒提取，-20℃保存，该正确质粒含有SEQ ID NO：2所示序列。
⑥利用高保真酶对pα-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR质粒进行PCR扩增，扩增引物为U5α-amy-F上游引物和U3α-amy-R下游引物，对具有SEQ ID NO：2所示序列的目的片段(α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR)进行切胶回收并测定浓度、备用。
(4)弓形虫基因敲除虫株△AMY的获得
①收取步骤(1)所述新鲜的弓形虫速殖子ME49，利用无菌的3μm孔径滤膜过滤除掉宿主细胞碎片，1500rpm离心10min；弃上清，用Cytomix(120mM KCl,0.15mM CaCl2,10mMK2HPO4/KH2PO4,25mM HEPES,2mM EGTA,5mM MgCl2,pH＝7.6)重悬虫体沉淀至虫体量为1×107个速殖子/ml。
②取250-300μl左右的虫体悬液到电转杯中，加入步骤(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgAMY质粒和步骤(3)α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR同源模板，其中质粒和同源模板DNA摩尔比＝5:1，转染DNA的总量为10μg，总体积350μl。
③用移液枪将DNA和ME49虫体混合均匀于4mm电转杯中，并去除气泡；将电转杯置于Bio-Rad电转仪内，设置1500V、25μF、50Ω、4mm电击一次后，再用1550V、25μF、50Ω、4mm连续电击两次。
④在电转杯中立即加入1ml虫体培养液(DMEM+2％FBS+双抗)轻轻冲洗，再将该液体转移至新鲜的宿主细胞上进行培养(T25)，同时设立无DNA的转染对照组，同时进行培养观察。
⑤在60-80％转染后的虫体逸出HFF宿主细胞后，将细胞裂解使虫体从宿主细胞中释放出来；取500-2000μl虫体悬液加入到新鲜的宿主细胞中(T25)，在该培养基中加入1uM乙胺嘧啶筛选；
⑥在乙胺嘧啶作用3天后，可见宿主细胞内出现虫体增殖现象，在50％虫体从宿主细胞内逸出时将细胞裂解使虫体释放，取500-1000μl虫体传到新鲜的宿主细胞中，再进行药物筛选；
⑦在经过三至五代药物筛选后，将虫体置于含有宿主细胞的96孔板中进行单克隆筛选(接4块96孔板)，每孔接种1-3个(计算量)速殖子；剩余虫子可进行基因组DNA的提取(基因组提取方法参照基因组DNA提取试剂盒操作说明进行)，并利用(表2)引物检测同源臂整合效率和基因敲除效率，PCR1有条带说明AMY的5’同源臂整合入弓形虫基因组中，PCR2有条带说明AMY的3’同源臂整合入弓形虫基因组中，PCR3条带检测敲除基因AMY是否还在基因组中，若对照组ME49有PCR3条带，而转染实验组无PCR3条带，则说明AMY被成功敲除。
表2.△AMY的单克隆虫株PCR鉴定引物
⑧在96孔板中培养8-11天后观察是否存在单克隆，利用无菌枪头将含有单克隆的宿主细胞从孔内刮下，加入到含有宿主细胞的24孔板中，继续培养；当24孔板中有70％的宿主细胞被裂解时，即可将孔内的虫子150μl传到新的24孔板中培养，其余的用于DNA提取以鉴定克隆；
⑩利用PCR1，PCR2和PCR3对挑选的单克隆虫株进行检测，若PCR1和PCR2有特异性条带而PCR3无目的带说明该单克隆虫株为基因敲除虫株△AMY；将确定为△AMY的虫株继续扩大培养至T25培养瓶；对T25培养瓶中的基因敲除虫株再次进行PCR1，PCR2和PCR3检测，PCR反应体系如下，若仍为敲除表型即可在扩大后进行冻存。
在灭菌PCR管中配制如下反应体系：
PCR反应条件如下：
⑩PCR产物鉴定：扩增完成后，取PCR产物10μL，加1μL的10×核酸上样缓冲液混匀，点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，110-120V，电泳30分钟，凝胶成像系统观察，PCR鉴定结果如图1所示，表示△AMY的单克隆虫株构建成功。
实施例2 弓形虫△AMY虫株的用途
2.1基因敲除虫株△AMY稀释注射液
1)稀释注射液配方
2)稀释注射液制作方法
①磁力搅拌器混匀5min。
②0.22um滤器过滤除菌。
2.2△AMY敲除株对小鼠毒力实验
1)使用HFF细胞体外培养弓形虫速殖子，待有30-50％虫体逸出细胞；弃掉原培养瓶中的培养基，用PBS洗去已逸出的虫体和残留的培养基，加入新鲜不含FBS的稀释液。
2)用一次性细胞刮将细胞刮下，5ml注射器反复吹打悬液8-10次，使纳虫泡破裂，虫体逸出，用无菌的3μm孔径滤膜过滤纯化虫体；用细胞计数板对虫体悬液进行计数、稀释。
3)按照100个虫体/小鼠，腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，每组接10只，每天记录小鼠的存活情况，30天后对结果进行统计，结果如图2。从实验结果可以看出，接种△AMY敲除株的小鼠30天内仅有一只小鼠死亡，存活率90％，而接种野生型ME49的小鼠30天内有80％死亡，说明△AMY敲除株的毒力远低于出发虫株。
2.3不同剂量△AMY敲除株对小鼠的毒力
分别向不同组7周龄雌性ICR小鼠，按照每组每只接种1×102，1×103和1×104个敲除株虫子进行腹腔接种，每组各接10只小鼠，对照组小鼠每只接种1×102个野生型ME49，每天记录小鼠的死亡情况，30天之后统计小鼠死亡情况，结果如表3显示，接种野生型ME49的对照组小鼠30天死亡率达80％，接种1×102敲除株实验组小鼠在30天内没有死亡，接种1×103和1×104个敲除株实验组小鼠在30天内分别有80％和50％存活率，说明△AMY敲除之后对小鼠的毒力下降明显。
表3.不同剂量△AMY敲除株对小鼠的毒力实验结果
2.4小鼠腹水中△AMY敲除虫体荷虫量实验
分别向不同组7周龄雌性ICR小鼠，按照每组每只接种1×105个敲除株虫子进行腹腔接种，每组接种3只小鼠，对照组接种等剂量的野生型ME49虫子，感染后7天，对小鼠进行安乐死，腹腔注射5ml生理盐水，混匀，收取小鼠腹水，分别取1/20混匀腹水提取基因组gDNA，基因组提取方法参照基因组DNA提取试剂盒操作说明进行。
将5ml生理盐水注入空白ICR小鼠，然后取出，形成阴性对照液，以102、103、104、105、106、107个弓形虫速殖子ME49分别混匀于2ml阴性对照液，分别取100ul混匀液提取基因组gDNA，基因组提取方法参照基因组DNA提取试剂盒操作说明进行。
进行荷虫量qPCR，qPCR所用引物见表4。
表4.△AMY的荷虫量qPCR引物
在Hard-shell-PCR-Plates 96孔板中配制如下反应体系：
PCR反应条件如下：
qPCR结果如图3所示，接种△AMY敲除虫株小鼠腹水荷虫量显著低于野生型ME49的对照组小鼠腹水荷虫量，说明弓形虫△AMY在小鼠体内无明显繁殖，可以被宿主有效清除。
2.5△AMY敲除株对小鼠保护力实验
以1×102个速殖子每只小鼠的感染量接种ICR小鼠，每组5只。30天后对免疫过的小鼠及未经免疫的对照ICR小鼠(每组10只)分别接种1×103个ME49野生型虫株。观察、记录小鼠死亡情况，30天后统计小鼠死亡率。免疫实验结果如图4，对照组小鼠感染野生型虫株株在30天内仅有20％存活，经△AMY免疫过的小鼠再次感染高剂量野生型虫株30天内仍没有死亡，说明△AMY虫株对小鼠抵抗野生株毒力具有良好的保护力，有成为基因工程疫苗的潜力。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 弓形虫α淀粉酶基因敲除虫株的构建方法及用途
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13900
<212> DNA
<213> 弓形虫(Toxoplasma Gondii)
<400> 1
cgcacacacg cagaccaggc ctcgagacag gcgagctgtt ctttgcactc gatgaagctg 60
cggcgttcaa aaagcacaaa aagaaacaag agcagcagtg tcagtgtgta tttcgttgta 120
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tccaagcgcc agaggtcgca gttgttgatt ttttgagttc gctttcaggc tgtctttccc 780
tgtttcctct tgcacttttt tcgcagatag acatgtgtgt actgctcctt cgtaagaagg 840
tagtttctgc ttcgttttct tcttttcctg tccaccttca attctcttgt tcctttctct 900
tctttgctca gtctcgctct ttgcctcttg cgccttctta ctgtctctgg ccttttcccc 960
tctcccttcc tctctccttt cctctgcgcc tttctctcct cttgtccctt gattttctcg 1020
tctctgcttt ctttctcttt cttcctctct tcatctcttt ctctctctct tgctcgaggg 1080
aggttcttct cccgcagcag tcgactctgc gtcgccacac acttcgacgg agcctttcgt 1140
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cttctctcct gaaagagctc tgtcctcaaa gctagagctg tctgtctctg atgctgggag 1440
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tcttcgagca tctgcaaagg tccatagcgt gtcgttcgcc gcgccacgat gcagcggaga 1680
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acacaagatg ccaagcaccg tttttcagtc caagggtggg ctgccaggct tctttgccgc 2160
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cgtcgtgata ttctttcgag tctatgtctt tccaacctcg tggagtgttt cagtctctct 3000
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tctctaatcc tgttctctct gctctctcct tcttctgttt cgtttctttc ctagatctcc 3300
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cgtcacaggt gcagttgaat cctacaaagg ccggagaaag tccccggcgc ttcgagttga 3480
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acaggcgtaa gtgcaacctg acgctcacat tcacgcagtt tactctgcct gagtctgtct 3660
gtccgtagat gcttcgattg acctccatat catatctgta ttcatatgtc ttgacctcca 3720
tctatcagcc tatatatctg cccatctttg tacatttttg tgtatgtctt tctgtatcag 3780
tcgaaacgtc tgtatgcctt cctacatctc tctattccta atgttattca cttagacctc 3840
attctatctc ttcctaaagc aatgtattat ggacgtgagt ctgttctgcc tagtgtagcc 3900
tcagttgtta tccgcttggt cttgtgtacc ctgatttcgg aaggggaagt tcaagaatgt 3960
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gttgaatttt ctctcgactt ggatttacgc gtttcgtgca atgcctgctg tgaatcaagt 4080
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cttaagcagt ttgcctgact tcatcgttgt tttcttcagt cgagacattt ccgctgtccg 4260
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tatatatata tatatatatg tatatatata tatatatgca tttatgtata catatctaca 4560
tacatatatc tctatatgta tgattacatg cgtagataaa ggtgtgcata aaacgagaga 4620
gatacacgaa gagctgtagg ttagtctagg gagatttgag cacagacaca cacgtatatc 4680
gacatgacac agcatgcatt tatatacata tatacaaatg tgtatatata tatatatgta 4740
tatgtatgta tgtgtaggaa tgtttttata taggtgagta tgctcgttcc actggtgtcg 4800
cttttgactc ttttggaagt tggaggacgg tctttgtttc cttcagagtc ttcgagacgc 4860
tggtggacaa gttggatcac attcgctctc tggtaggtct gtggttaccg ggaccccagc 4920
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ccgcgtctcc cgtttttttt cgtcttcaag gtgtcggctc cagcctcaag ttctctttcg 5100
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gcgacgcctc tgttgggcgt acggcttttc acctgcgagc agctggcgcc tctgctgtga 5220
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gttctgtgca ggtacggcaa agatgcgtct ggcggcatct acttcgaagg cggcggggaa 6660
agtggctggg ggcgaaaatt cagttttcac aaacgcgaag ttcgcgacat gatccttgca 6720
gcggctctct gcttcatcga ggaatatggg taggcgcaag cgtgatggcg gccgctgagg 6780
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gaaggcaaga ggcgaaggaa gggaaggaag agaagaaaga aaaggaagag aagaaagaga 7020
aggaagagag gacgcacgag acagagaaga cagctctcac agggagggcc agggacgcca 7080
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gtctgtccag cagcagccgg taactccgcg tctgtcttct cgagggtctc gggggggtcg 7260
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ggtaaggagt ttctttctcc tcgcttccac gttgtcttcg cgctccatac gcagacgccg 7500
ctctgtctgt gcagatctgt tcccaggaaa accgttctac ctgcatgcac ctgtcgactt 7560
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tatatatata tatatgaatg aatgtatgta aataatatta gtgtgaacga ggatgcatag 7680
gtgaatccgc agacgtcggt ggacattctc acactgtaga gatccgtata cgcaatcgtc 7740
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gtataaacat atatatatat atatatatat gtttatatgg gcatgcggat aatgcgtcgg 11520
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ctgtagttct acgtgggagt gtttttggag gtttcggtct gtttctaaat agcactgatc 13860
gccgcggccc ctgctttcga gagtttttgt gtctactcct 13900
<210> 2
<211> 8343
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
aagcgccaga ggtcgcagtt gttgattttt tgagttcgct ttcaggctgt ctttccctgt 60
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ctgagaagaa aactgaaccg gaaaggagac tcgaaagcca gtttcctttc accacgcacg 540
cgaaagactc actgagactc cgcgccctgc gaagccccca aacacccagg caacactaac 600
ctcagaaaca gctcccccgt ctctccgaaa caaagagagc gctgcctcca aacaagactt 660
ctctcctgaa agagctctgt cctcaaagct agagctgtct gtctctgatg ctgggaggtc 720
tgccgtcgcc ctcaagaccg cgcgttgtct ctggaggtct gggtgagtgt gaagcgtcct 780
tttcggggac gtttgtatcc aaatataagc cgcagagggc acctgcgccg gggtcttttc 840
gttccaccgg gggtctctcg cttttcagga gacgcagaac ttctggaacc aacccgcgca 900
gaagacatcc accaaacggt gttacacaat caccttgtgt gaagttcttg cggaaaacta 960
ctcgttggca ttttttctat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atagaattcc 1020
gacaaaatgg aggtccatac taaccaagat ccacttgacc ctaggatgag aggatcggga 1080
tccatgggtt cagagggcca ggctgtaaat cccgtgagtc gtcctcacaa atcatcaagc 1140
aggtgtcctc agggagactg cctgactgag ttatgctaat tcctttctac tttggcgtgg 1200
tcacgggggc gcgccggatc cttaattaag tctagcatgt cattcgattt tcaccccccg 1260
cgtagttcct gtgtgtcatt cgttgtcgag acaactctgt cccgccccgg tgctgttcca 1320
tatgcgtgac tttcccgcaa ttttttcaga ctttcaggaa agacaggctc cggaacgatc 1380
tcgtccatga ctggtaaatc cacgacaccg caatggcccc cagcacctct atctctcgtg 1440
ccaggggact aacgttgtat gcgtctgcgt cttgtctttt tgcattcgct ttccaaaaaa 1500
gagagccatc cgttcccccg cacattcaac gccgcgagtg cggtttttgt cttttttgag 1560
tggtaggacg cttttcatgc gcgaactacg tggacattaa gttccattct ctttttcgac 1620
agcacgaaac cttgcattca aacccgcccg cggaagatcc gatcttgctg ctgttcgcag 1680
tcccagtagc gtcctgtcgg ccgcgccgtc tctgttggtg ggcagccgct acacctgtta 1740
tctgactgcc gtgcgcgaaa atgacgccat ttttgggaaa atcggggaac ttcattcttt 1800
aaaagtatgc ggaggtttcc tttttcttct gttcgtttct ttttctcggg tttgataacc 1860
gtgttcgatg taagcacttt ccgtctctcc tccgtgcttt gttcgacatc gagaccaggt 1920
gtgcagatcc ttcgcttgtc gatccggaga cgcgtgtctc gtagaacctt ttcattttac 1980
cacacggcag tgcggagcac tgctctgagt gcagcaggga cgggtgaagt ttcgctttag 2040
tagtgcgttt ctgctctacg gggcgttgtc gtgtctggga agatgcagaa accggtgtgt 2100
ctggtcgtcg cgatgacccc caagaggggc atcggcatca acaacggcct cccgtggccc 2160
cacttgacca cagatttcaa acactttcgt cgtgtgacaa aaacgacgcc cgaagaagcc 2220
agtcgcctga acgggtggct tcccaggaaa tttgcaaaga cgggcgactc tggacttccc 2280
tctccatcag tcggcaagag attcaacgcc gttgtcatgg gacggaaaaa ctgggaaagc 2340
atgcctcgaa agtttagacc cctcgtggac agattgaaca tcgtcgtttc ctcttccctc 2400
aaagaagaag acattgcggc ggagaagcct caagctgaag gccagcagcg cgtccgagtc 2460
tgtgcttcac tcccagcagc tctcagcctt ctggaggaag agtacaagga ttctgtcgac 2520
cagatttttg tcgtgggagg agcgggactg tacgaggcag cgctgtctct gggcgttgcc 2580
tctcacctgt acatcacgcg tgtagcccgc gagtttccgt gcgacgtttt cttccctgcg 2640
ttccccggag atgacattct ttcaaacaaa tcaactgctg cgcaggctgc agctcctgcc 2700
gagtctgtgt tcgttccctt ttgtccggag ctcggaagag agaaggacaa tgaagcgacg 2760
tatcgaccca tcttcatttc caagaccttc tcagacaacg gggtacccta cgactccgtg 2820
gttctcgaga agagaaggaa gactgacgac gcagccactg cggaaccgag caacgcaatg 2880
agctccttga cgtccacgag ggagacaact cccgtgcacg ggttgcaggc tccttcttcg 2940
gccgcagcca ttgccccggt gttggcgtgg atggacgaag aagaccggaa aaaacgcgag 3000
caaaaggaac tgattcgggc cgttccgcat gttcacttta gaggccatga agaattccag 3060
taccttgatc tcattgccga cattattaac aatggaagga caatggatga ccgaacgggc 3120
gttggtgtca tctccaaatt cggctgcact atgcgctact cgctggatca ggcctttcca 3180
cttctcacca caaagcgtgt gttctggaaa ggggtcctcg aagagttgct gtggttcatt 3240
cgcggcgaca cgaacgcaaa ccatctttct gagaagggcg tgaagatctg ggacaagaat 3300
gtgacacgcg agttcctcga ttcgcgcaat ctcccccacc gagaggtcgg agacatcggc 3360
ccgggctacg gcttccagtg gagacacttc ggcgcggcat acaaagacat gcacacagac 3420
tacacagggc agggcgtcga ccagctgaag aatgtgatcc agatgctgag aacgaatcca 3480
acagatcgtc gcatgctcat gactgcctgg aatcctgcag cgctggacga aatggcgctg 3540
ccgccttgtc acttgttgtg ccagttctac gtgaacgacc agaaggagct gtcgtgcatc 3600
atgtatcagc ggtcgtgcga tgtcggcctc ggcgtcccct tcaacatcgc ttcctattcg 3660
cttttgacgc tcatggttgc acacgtctgc aacctaaaac ctaaggagtt cattcacttc 3720
atggggaaca cgcatgtcta cacgaaccat gtcgaggctt taaaagagca gctgcggaga 3780
gaaccgagac cgttccccat tgtgaacatc ctcaacaagg aacgcatcaa ggaaatcgac 3840
gatttcaccg ccgaggattt tgaggtcgtg ggctacgtcc cgcacggacg aatccagatg 3900
gagatggctg tctagcggaa atacagaagc tgcccgtctc tcgttttcct ctcttttcgg 3960
agggatcagg gagagtgcct cgggtcggag agagctgacg agggggtgcc agagacccct 4020
gtgtccttta tcgaagaaaa gggatgactc ttcatgtggc atttcacaca gtctcacctc 4080
gccttgtttt ctttttgtca atcagaacga aagcgagttg cgggtgacgc agatgtgcgt 4140
gtatccactc gtgaatgcgt tatcgttctg tatgccgcta gagtgctgga ctgttgctgt 4200
ctgcccacga cagcagacaa ctttccttct atgcacttgc aggatgaatt cctacccagc 4260
tttcttgtac aaagtggtcg tctctagttt ttttgacaga ccgctgacgg aatcagggac 4320
accagcgaca agcgcgacca cgtgtgccag cgcgaggtgg cctacgccca cagcgtgccc 4380
cgcatcacca gcgccatcgg tagcgacgag gatatgcata gatcttaatt aataacttcg 4440
tatagcatac attatacgaa gttataaaat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg 4500
ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc 4560
cagaaagttc ttttcaagtc tccaggagcg ccccgtctca ggcgcagctc tctcgcgtcg 4620
agagtcacac gcgtcgacac agagtggacg caaaaacatg ctgtgcgcgt tcggatctgc 4680
tgcatcgtag agcgatgcga agagtgtaga ggtgaaagag gtctgcgtcg acgcatgcgt 4740
tgaacgagga acgcggtcga aagcacgggc gatctgctcc cgcactcagc gtcgagcatt 4800
cactgacacg catgcactca gtctgagtcg ttgggtgaag caggcgctcc cggcacactt 4860
ccaggatttc caccgctcga gttgcatgct ttcttggtgc cagtcctcga cggggaatcc 4920
tttcgcacag aaaaaccaag ggcagggaga aagaggatct cgagcgaaaa caggggaaaa 4980
cgtgagtggc ttgcagagtc gcgcaagacg ctggcccagc cggagtggct tcctgtcgag 5040
tttctccagc ttctcggctg atgcatcgac ggaaaagggt cgttttccgg ggaaacgaat 5100
catctgtgac atgttccaac attctcggat ctgctgctct tgggtgaggc ccgatttctt 5160
atcgctccgc agtcggagaa tcccgcaacc tccgtaacat ggtgttttcc ttggtgacac 5220
gcgagtcggc agaaaagcga aagagaacac acactgagaa gaacagcaac gtttcactcc 5280
tcttttcgca gcagcgaaca gtcccttcag tcgtttccga tgagtctgaa tccgcagaac 5340
tgttagacca cacatcgact attcgcgtag tatgaacttg ccacaaagaa agttaaggca 5400
catgacgtca gcatctgagt atcaaagtcg tcattatcgc tgtacaaagg atccgtgatc 5460
cacaactgca caactcgaac tgaatcaaca gaggcactag aatacgtagg agaatgaaat 5520
aggagataca agaaaacaaa gttcttcatg ttcctcttgt acaccggcgt aatcatggtc 5580
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 5640
aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 5700
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 5760
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 5820
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 5880
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 5940
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 6000
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 6060
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 6120
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 6180
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 6240
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 6300
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 6360
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 6420
gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 6480
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 6540
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 6600
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 6660
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 6720
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 6780
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 6840
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 6900
agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 6960
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 7020
agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 7080
gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 7140
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 7200
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 7260
atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 7320
tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 7380
cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 7440
cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 7500
atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 7560
aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 7620
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 7680
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccaccta aattgtaagc 7740
gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa 7800
taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt 7860
gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg 7920
cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt 7980
ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga 8040
gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg 8100
ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg 8160
cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa 8220
gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca 8280
aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc 8340
agt 8343
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gtcccagggc atgctatgga gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
aacttgacat ccccatttac 20
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gttgtaaaac gacggccagt aagcgccaga ggtcgcagtt 40
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gatgtcttct gcgcgggttg gttccagaag ttctgcgtc 39
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
gccacaagtt cagcgtgtcc agaaagttct tttcaagtct c 41
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gctatgacca tgattacgcc ggtgtacaag aggaacatga 40

Claims (2)

1.一种弓形虫α淀粉酶基因敲除虫株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)出发虫株是具有α淀粉酶基因的弓形虫虫株，所述α淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示；
(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgAMY质粒的构建：利用软件设计弓形虫α淀粉酶基因的打靶位点，根据所设计的靶点序列设计gRNA上、下游引物，然后以pSAG1-Cas9-TgU6-sgUPRT质粒为模板，利用所设计的引物及Q5点突变试剂盒进行PCR扩增，对扩增产物进行KLD酶连接并转化DH5α感受态细胞，经提取后得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgAMY质粒，其中，上、下游引物序列分别为：
gRNA-AMY-F：5’-GTCCCAGGGCATGCTATGGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’
gRNA-R：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’；
(3)α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR同源模板的制备：以出发虫株的基因组为模板，设计引物，分别扩增α-amy-5UTR和α-amy-3UTR同源臂，以pUC19质粒及含DHFR质粒为模板分别扩增pUC19载体、DHFR药物筛选标签，连接上述4个片段，构建重组质粒pUC19-α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR，该质粒即α淀粉酶基因的敲除质粒，利用α-amy-5UTR-F、α-amy-3UTR-R引物扩增上述基因敲除质粒即获得α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR同源模板，其中，扩增α-amy-5UTR和α-amy-3UTR同源臂所用的上、下游引物序列分别为：
U5α-amy-F：5’-GTTGTAAAACGACGGCCAGTAAGCGCCAGAGGTCGCAGTT-3’
U5α-amy-R：5’-GATGTCTTCTGCGCGGGTTGGTTCCAGAAGTTCTGCGTC-3’
U3α-amy-F：5’-GCCACAAGTTCAGCGTGTCCAGAAAGTTCTTTTCAAGTCTC-3’
U3α-amy-R：5’-GCTATGACCATGATTACGCCGGTGTACAAGAGGAACATGA-3’
(4)弓形虫基因敲除虫株的获得：将步骤(2)中的pSAG1-Cas9-TgU6-sg AMY质粒和步骤(3)中的α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR同源模板共电转至步骤(1)中所述出发虫株，通过1uM乙胺嘧啶筛选，PCR鉴定，获得α淀粉酶基因敲除虫株，所述基因敲除虫株缺失SEQ IDNO：1所示核苷酸序列。
2.弓形虫α淀粉酶基因敲除虫株在制备抗弓形虫基因工程活疫苗中的用途，所述弓形虫α淀粉酶基因敲除虫株是按照权利要求1所述的方法构建的。
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