CN111187721A - grx 5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株及其构建方法和应用 - Google Patents

grx 5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种grx 5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株及其构建方法和应用。该虫株缺失了新孢子虫谷氧还蛋白5(grx5)基因，其中缺失的grx5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。由于缺失了grx5基因，因此，该虫株具有繁殖能力和毒力显著下降的特点，接种小鼠后能够有效预防动物的新孢子虫的再感染，具有成为新孢子虫病弱毒疫苗的潜力。

Description

grx 5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株及其构建方法和应用
技术领域
本发明是关于基因工程领域，特别是关于一种grx 5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株及其构建方法和应用。
背景技术
新孢子虫是一种寄生于多种动物有核细胞的专性细胞内寄生原虫，新孢子虫病在世界范围内广泛流行。对牛和犬的危害尤为严重，主要造成孕畜流产、死胎以及新生幼畜的神经系统功能障碍，新孢子虫感染是引起奶牛流产的重要原因之一。尽管新孢子虫病严重威胁动物健康，给畜牧业生产造成巨大的经济损失，但尚没有有效的疫苗或药物用于新孢子虫感染的预防或者治疗。因此，构建新孢子虫弱毒虫株，对研发新孢子虫病弱毒疫苗具有重要应用价值。
谷氧还蛋白5(glutaredoxin，grx5)是生物中普遍存在的重要的氧化还原酶，它与硫氧还蛋白家族一同维持着有机体内氧化还原的平衡。谷氧还蛋白以GSH作为直接电子供体，调节细胞含巯基蛋白的氧化还原状态，grx系统作为一种细胞内氧化还原态势的重要调节系统，在细胞信号转导过程中发挥重要作用。新孢子虫对氧化还原失衡十分敏感，但对它的各种氧化还原调节剂的研究还比较少。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种grx 5(glutaredoxin5，谷氧还蛋白5)基因缺失的新孢子虫弱毒虫株，该虫株具有繁殖能力和毒力显著下降的特点，用该虫株免疫小鼠能有效抵抗新孢子虫的攻击，有作为新孢子虫弱毒疫苗的潜力。
为实现上述目的，本发明提供了一种grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株(Δgrx5)，所述新孢子虫弱毒虫株中缺失的grx5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法，包括以下步骤：Nc1虫株(Neospora caninum 1)的准备：该Nc1虫株是具有grx5基因的新孢子虫野生株，所述grx5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；质粒构建：通过PCR扩增、多片段连接获得构建所述新孢子虫弱毒虫株所需要的两个质粒，分别是pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒和grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒；以及弱毒虫株的获得：利用同源重组的方法，将所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒和所述grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒片段电转到所述Nc1虫株中，经过药物乙胺嘧啶筛选、单克隆筛选和PCR鉴定获得上述grx 5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株。
在本发明的一实施方式中，所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒是以pSAG1-Cas9-NcU6-sggra17为模板，将gra17靶点特异的gRNA替换为基因grx5靶点特异的gRNA所得到的。
在本发明的一实施方式中，所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒为CRISPR/Cas9系统的CRISPR质粒，具体制备方法如下：利用ToxoDB里的EuPaGDT库，设计针对基因grx5(SEQID NO.1)靶点特异的gRNA(即，grx5基因敲除的打靶位点)，根据所设计的基因grx5靶点特异的gRNA(即，打靶位点)序列设计引物，分别扩增出Cas9片段、新孢子虫U6启动子、T载体片段，在U6启动子下游引物以及T载体骨架的上游引物加入所述基因grx5靶点特异的gRNA；其中，扩增Cas9片段、NcU6启动子、T载体片段的引物如下：Cas9F：ATACGACTCACTATAGGGCG(SEQID NO.2)，Cas9 R：AGCTCCACCGCGGTGGCGGC(SEQ ID NO.3)，NcU6 F：GCCGCCACCGCGGTGGAGCT(SEQ ID NO.4)，NcU6 R：CAAGCATCACCAGGGAGATTAAACAACAATGTCCCTTTGG(SEQ ID NO.5)，T载体F：AATCTCCCTGGTGATGCTTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.6)，T载体R：CGCCCTATAGTGAGTCGTAT(SEQ ID NO.7)。
在本发明的一实施方式中，所述grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒的制备方法如下所示：分别扩增grx5-5′UTR(5'同源臂)、grx5-3′UTR(3'同源臂)、DHFR及pUC19载体，利用多片段无缝连接试剂盒对grx5-5′UTR、grx5-3′UTR、DHFR及pUC19载体四个片段进行连接，构建质粒，然后扩增grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板备用；其中，扩增上述grx5-5′UTR、grx5-3′UTR、DHFR及pUC19载体四个片段的引物如下：grx5-5′UTR F：GAATCTCATCAGGATGCAGC(SEQ ID NO.8)，grx5-5′UTR R：GATGCGGATCCAGCAGAATA(SEQ IDNO.9)，grx5-3′UTR F：ACCCGCTTTCTCGTCTTCTA(SEQ ID NO.10)，grx5-3′UTR R：TTCATCGACGCATGAAGGCC(SEQ ID NO.11)，DHFR F：TATTCTGCTGGATCCGCATCCTAGCATGTCATTCGATTTT(SEQ ID NO.12)，DHFR R:TAGAAGACGAGAAAGCGGGTACTAGTGGATCGATCCCCCG(SEQ IDNO.13)，pUC19载体F:GGCCTTCATGCGTCGATGAACCTAGGGCTAGCTCTAGAAC(SEQ ID NO.14)，pUC19载体R：GCTGCATCCTGATGAGATTCGCCGTCGTTTTACAACGTCG(SEQ ID NO.15)。
在本发明的一实施方式中，所述PCR鉴定过程中使用了如下两组引物：鉴定5’同源重组(5’→3’)：F：GACTGCGAGATGTACCTGCA(SEQ ID NO.16)，R：ACTGCGAACAGCAGCAAGAT(SEQID NO.17)；鉴定3’同源重组(5’→3’)：F：CAGATGTGCGTGTATCCACT(SEQ ID NO.18)，R：CTGACAAAGGGAATGCGGTG(SEQ ID NO.19)。
在本发明的一实施方式中，所述单克隆筛选过程中使用了如下四组引物对单克隆进行鉴定：PCR1引物，鉴定5’同源重组(5’→3’)：F：GACTGCGAGATGTACCTGCA(SEQ IDNO.20)，R：ACTGCGAACAGCAGCAAGAT(SEQ ID NO.21)，PCR2引物，鉴定3’同源重组(5’→3’)：F：CAGATGTGCGTGTATCCACT(SEQ ID NO.22)，R：CTGACAAAGGGAATGCGGTG(SEQ ID NO.23)，PCR3引物,鉴定grx5基因的引物(5’→3’)：F：GCGAGGGCAGTTGGGATA(SEQ ID NO.24)，R：CTAACAAAGGGTAGGTGGG(SEQ ID NO.25)，PCR4引物，鉴定grx5基因的引物(5’→3’)：F：TACTCCCGCTCGTTGC(SEQ ID NO.26)，R：TCCTCGTCCGTGTTGG(SEQ ID NO.27)。
本发明还提供了上述grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法在研制新孢子虫弱毒疫苗中的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所提供的grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株(Δgrx5)由于缺失了grx5基因，因此，繁殖能力和毒力显著下降；通过噬斑实验表明grx5基因的缺失显著抑制新孢子虫的入侵和繁殖；并且在接种小鼠后，结果发现，△grx5虫株对小鼠的致病性显著下降，并且在接种小鼠后能够有效预防动物的新孢子虫的再感染，从而△grx5虫株具有成为新孢子虫病弱毒疫苗的潜力。
附图说明
图1是根据本发明一实施方式的pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒的构建图；
图2是根据本发明一实施方式的grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒构建图；
图3是根据本发明一实施方式的谷氧还蛋白5基因的敲除示意图；
图4是根据本发明一实施方式的Δgrx5虫株的PCR鉴定条带图；
图5是根据本发明一实施方式的Δgrx5虫株在体外的噬斑实验图；
图6A-6C是根据本发明一实施方式的Δgrx5虫株在小鼠体内的毒力试验统计图；
图7是根据本发明一实施方式的Δgrx5虫株的免疫保护实验。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
本发明所涉及到的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下通过实施例1-2对新孢子虫Δgrx5虫株的构建、以及新孢子虫△grx5虫株的用途进行具体描述。
实施例1：新孢子虫Δgrx5虫株的构建
(1)基础虫株Nc1：Nc1虫株是具有谷氧还蛋白5基因的野生株，所述谷氧含蛋白5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(2)pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒的构建：pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒为CRISPR/Cas9系统的CRISPR质粒。该质粒以pSAG1-Cas9-NcU6-sggra17为模板，将gra17靶点特异的gRNA替换为基因grx5靶点特异的gRNA，具体步骤如下：
①利用ToxoDB里的EuPaGDT库，设计针对谷氧还蛋白5基因敲除的打靶位点，根据所设计的靶点序列设计引物分别扩增出Cas9片段(1号片段)、新孢子虫U6启动子(2号片段)、T载体片段(3号片段)，在U6启动子下游引物以及T载体骨架的上游引物加入grx5特异性的gRNA，质粒图谱见图1。
1号片段引物(5’→3’)：
F：ATACGACTCACTATAGGGCG(SEQ ID NO.2)
R：AGCTCCACCGCGGTGGCGGC(SEQ ID NO.3)
2号片段扩增引物(5’→3’)：
F：GCCGCCACCGCGGTGGAGCT(SEQ ID NO.4)
R：CAAGCATCACCAGGGAGATTAAACAACAATGTCCCTTTGG(SEQ ID NO.5)
3号片段扩增引物(5’→3’)：
F：AATCTCCCTGGTGATGCTTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.6)
R：CGCCCTATAGTGAGTCGTAT(SEQ ID NO.7)
PCR反应体系：
Figure BDA0002371243220000061
扩增程序为：
Figure BDA0002371243220000062
Figure BDA0002371243220000071
将含有目的条带的凝胶切下，放入EP管中，称重。采用凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。得到目的片段，利用Vazyme公司的多片段无缝连接试剂盒(ClonExpressTMMultiSOne Step Cloning Kit)对三个片段进行连接，37℃，30min。
连接体系为：
Figure BDA0002371243220000072
连接产物加入DH5α感受态细胞，轻柔混匀，冰水浴30min；42℃90s，冰水浴5min；随后加600μL液体培养基，200rpm培养2h(37℃)后，将菌液涂于氨苄(Amp)抗性的固体培养基上；37℃培养12h，PCR及测序鉴定。获得pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒，利用TRANSGEN公司的质粒提取试剂盒(Hipure Plasmid MaxiPrep Kit)对pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5进行质粒提取，测定浓度，备用。
(3)grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板的制备
该质粒的构建是利用Vazyme公司的多片段无缝连接试剂盒将基因grx5的5’同源臂、3’同源臂和DHFR药物筛选标记进行连接所得，质粒图谱见图2，具体操作步骤如下所示：
①在ToxoDB网站上输入拟敲除基因grx5的Gene ID，确定该基因所在的locus，通过该基因所在的基因组序列确定它的5’同源臂(grx5-5'UTR)和3’同源臂(grx5-3'UTR)；
②按照多片段无缝连接试剂盒说明书中所介绍的方法设计5’同源臂(4号片段)，3’同源臂(5号片段)，DHFR(6号片段)，pUC19载体(7号片段)四个片段的引物：
4号片段引物(5’→3’)：
F：GAATCTCATCAGGATGCAGC(SEQ ID NO.8)
R：GATGCGGATCCAGCAGAATA(SEQ ID NO.9)
5号片段扩增引物(5’→3’)：
F：ACCCGCTTTCTCGTCTTCTA(SEQ ID NO.10)
R：TTCATCGACGCATGAAGGCC(SEQ ID NO.11)
6号片段扩增引物(5’→3’)：
F：TATTCTGCTGGATCCGCATCCTAGCATGTCATTCGATTTT(SEQ ID NO.12)
R：TAGAAGACGAGAAAGCGGGTACTAGTGGATCGATCCCCCG(SEQ ID NO.13)
7号片段扩增引物(5’→3’)：
F：GGCCTTCATGCGTCGATGAACCTAGGGCTAGCTCTAGAAC(SEQ ID NO.14)
R：GCTGCATCCTGATGAGATTCGCCGTCGTTTTACAACGTCG(SEQ ID NO.15)
②用Vazyme公司的高保真酶分别从新孢子虫Nc1基因组DNA序列中扩增获得5’同源臂和3’同源臂片段，从带DHFR的质粒中扩增获得DHFR片段，分别对上述目的片段进行回收。
④根据回收产物的浓度配制如下反应体系：利用Vazyme公司的多片段无缝连接试剂盒(ClonExpressTMMultiS One Step Cloning Kit)对三个片段进行连接，37℃连接30min。
连接体系为：
Figure BDA0002371243220000091
连接产物转化入DH5α感受态细胞，将菌液涂于氨苄(Amp)抗性的固体培养基上，37℃培养12h，PCR及测序鉴定，获得grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板的质粒。
⑤将上一步鉴定疑似正确的质粒送生物公司测序，利用M13正向和反向引物进行测序分析，比对测序结果正确即可认为grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR质粒构建成功，将鉴定正确的菌液进行质粒提取，利用4号片段引物作为上游引物，7号片段引物作为下游引物，以PCR扩增的方法得到大量同源片段，得到的PCR产物加入1mL100％无水乙醇(提前置-20℃预冷)，-20℃放置20min，4℃离心，转速为14000rpm，时间为12min，DNA形成白色沉淀，弃去乙醇，加入1mL75％乙醇(提前置-20℃中预冷)，14000rpm离心10min，弃去乙醇后再次离心。最后用电转缓冲液溶解DNA。
(4)新孢子虫基因缺失虫株△grx5::DHFR的获得
①收取速殖子：所使用的Nc1母源虫株为实验室培养保存。利用含有1％NCS的DMEM培养Vero细胞，待其铺满细胞瓶后，接入新孢子虫速殖子，期间每隔24h换液，当在显微镜下观察到Nc1形成大量纳虫空泡(占视野的80-90％)则可以收集电转。利用细胞刮破碎贴壁的细胞，紧接着使用带有1ml注射器针头的注射器吸取破碎的细胞悬液并吹打细胞瓶壁，反复吸取、吹打三次后，利用8μm的滤器过滤细胞悬液，2000rpm离心8min，弃上清，沉淀即为纯化后的速殖子。
②电转：用600μL Cytomix重悬步骤(2)pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒和步骤(3)grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板片段，同时加入纯化后的速殖子；混匀后，转移到干净的电击杯中，在电压2050V，电容25F，电阻∞条件下电击转染。电转后将含有新孢子虫的液体转移到Vero细胞中培养。37℃培养24h后换成含有乙胺嘧啶的培养基。
③重组鉴定：待60-80％转染后的虫体逸出宿主细胞后，将细胞破碎使虫体从宿主细胞中释放虫体；取1000μl左右虫体悬液加入到新鲜的宿主细胞中(T25)，连续药筛三至五代，药筛稳定后，对混合虫株的DNA进行PCR鉴定，鉴定引物有两对，如下：
鉴定5’同源重组(5’→3’)：
F：GACTGCGAGATGTACCTGCA(SEQ ID NO.16)
R：ACTGCGAACAGCAGCAAGAT(SEQ ID NO.17)
鉴定3’同源重组(5’→3’)：
F：CAGATGTGCGTGTATCCACT(SEQ ID NO.18)
R：CTGACAAAGGGAATGCGGTG(SEQ ID NO.19)
④单克隆筛选：
重组鉴定正确后进行单克隆的筛选，方法如下：在含有乙胺嘧啶培养基中培养混合虫株，培养混合虫株的同时在96孔板中培养HFF细胞，尽量使HFF细胞与新孢子虫同时达到最佳状态。收集新孢子虫，在电子显微镜下计数，第一排每孔加入200个新孢子虫，用有限稀释法稀释。37℃培养箱培养7天，挑选单个噬斑转到铺好Vero细胞的12孔板上。电子显微镜观察到新孢子虫在HFF中形成多个噬斑，视野内可见大量纳虫空泡，则用1L枪头刮下，取1/3提基因组进行单克隆鉴定。
⑤单克隆鉴定：
设计4对单克隆PCR鉴定的引物：
PCR1引物，鉴定5’同源重组(5’→3’)：
F：GACTGCGAGATGTACCTGCA(SEQ ID NO.20)
R：ACTGCGAACAGCAGCAAGAT(SEQ ID NO.21)
PCR2引物，鉴定3’同源重组(5’→3’)：
F：CAGATGTGCGTGTATCCACT(SEQ ID NO.22)
R：CTGACAAAGGGAATGCGGTG(SEQ ID NO.23)
PCR3引物,鉴定grx5基因的引物(5’→3’)：
F：GCGAGGGCAGTTGGGATA(SEQ ID NO.24)
R：CTAACAAAGGGTAGGTGGG(SEQ ID NO.25)
PCR4引物,鉴定grx5基因的引物(5’→3’)：
F：TACTCCCGCTCGTTGC(SEQ ID NO.26)
R：TCCTCGTCCGTGTTGG(SEQ ID NO.27)
检测同源臂整合效率以及基因敲除效率如图3所示，PCR1扩增到目的条带说明grx5的5’同源臂成功整合入新孢子虫基因组中，PCR2扩增到目的条带说明grx5的3’同源臂成功整合入新孢子虫基因组中，PCR3和PCR4目的条带是检测敲除基因grx5是否还存在在基因组中，若对照组Nc1有PCR3和PCR4条带，而转染实验组无PCR3和PCR4条带，则说明grx5被成功敲除。若PCR1和PCR2有特异性目的条带而PCR3和PCR4无目的条带，如图4所示，说明该单克隆虫株为基因敲除虫株△grx5::DHFR；将确定为△grx5::DHFR的虫株从24孔板中传入T25培养瓶扩大培养；对T25扩大培养后的基因敲除虫株再次进行PCR1，PCR2，PCR3和PCR4鉴定，鉴定的PCR反应体系和程序如下，若鉴定结果与之前一致，则可在扩大后进行冻存。
PCR反应体系：
Figure BDA0002371243220000121
Figure BDA0002371243220000131
扩增程序为：
Figure BDA0002371243220000132
实施例2：新孢子虫△grx5虫株的用途
(1)△grx5虫株的体外生长实验
噬斑实验主要用于评价新孢子虫在细胞内的整体生长情况，噬斑面积可直接反映虫体的生长能力。将HFFs细胞铺满12孔细胞培养板，分别收集△grx5和Nc1虫株的速殖子，然后将300个速殖子接种到HFF细胞，培养7d；4％多聚甲醛室温固定30min，PBS洗涤，利用结晶紫进行染色，室温染色20min后，利用PBS洗去残留的结晶紫，统计噬斑面积大小。结果显示△grx5和Nc1虫株在HFF细胞中形成的噬斑的面积有显著差异(p>0.05)，△grx5虫株形成的噬斑面积明显少于Nc1虫株，见图5，表明grx5的缺失显著抑制新孢子虫的生长。
(2)不同剂量△grx5虫株的小鼠毒力试验
将6×106，1×107，2×107个△grx5和Nc1的虫株速殖子腹腔接种6周龄雌性BALB/c小鼠，每一组感染5只小鼠，观察并统计30天内小鼠的存活情况，如图6A-6C。从实验结果可以看出，接种△grx5虫株的各组小鼠30天均无死亡，存活率100％；接种野生株的三个组小鼠的存活率率分别为40％、0％和0％。表明与野生型新孢子虫相比，grx5基因缺失虫株对小鼠的致病性显著降低，有成为基因工程疫苗的潜力。
(3)△grx5虫株对小鼠保护力
将30只6周龄雌性BALB/c小鼠分为A、B和C三组，每组10只小鼠，A组腹腔接种2000个△grx5速殖子，B组和C组均腹腔注射PBS；共免疫两次，每次间隔两周，二免后15天，A组和B组小鼠接种1×107个Nc1新孢子虫速殖子，C组不接种虫体。观察并记录小鼠的死亡情况，30天后统计小鼠存活率。结果显示，攻虫30天内，未免疫攻虫小鼠死亡8只，存活率仅为20％，△grx5缺失虫株免疫小鼠死亡1只，存活率为90％，二者差异显著，见图7。说明免疫过△grx5缺失虫株的小鼠获得了抵抗野生株Nc1的能力，有成为基因工程疫苗的潜力。
本发明提供一种可用于预防新孢子虫感染的减毒活疫苗构建和应用，确立了其免疫剂型，摸索了该疫苗的免疫接种程序及接种量。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> grx 5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株及其构建方法和应用
<130> P200004DD1F
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1497
<212> DNA
<213> 新孢子虫谷氧还蛋白5 (grx5 gene of Neospora caninum)
<400> 1
atgagttccc tctccgcaag catcaccagg gagattctcg gctctctggt ggccaaccgc 60
gctcgctgcg ccggcctgcc aaaaccccca tccgggctga acagtcactg gattgtacag 120
cagagaagat cggctctcgg gtcttttcga aggaggtttt ccggcggttc acaccgtcgt 180
tctatcgcag atcaaaaggc agcgtccgaa acgcattgta taccctgcgt tctgaccggc 240
ggtcaagcgg ggtccgagcc cctcgtttcc cgccgatttt tcctcgggaa tttggcagct 300
tcttactccg gaacgaactt ggtttgccgg ggtggtacca ctcttctctt tttgggagcg 360
ccagcgcggt ataatgggac tgtcaccgct gcctcgcagt caacagacgc aggtacggga 420
aaagtaccgc gaataacttc aggaaattta ctcccgctcg ttgcggacct aagatgctga 480
atatatgact ccagttatga gatgcagaca accaagcttt ttgattgctg taaaccactt 540
ccggaaccca gactgttacc ttttcataag ctgtagatgt cgtttcagcg aacgggtgac 600
tatccgtctg gagcaagtca ctggccgtgg gggacctggg cttatatatt gtctgtgtcc 660
cgtcacacag tgacaggtgt tcatttaagt ttgtggctgc gactcgtgtt tgctagcttt 720
tccgagcttt tgaaagaatc cgtaggggtg gcttttggta gataccagcg tagcaatcac 780
agagtaggag gagtccgttc cccggcaccg cttcctgagg gtcattgttg ctggaacctc 840
atacggagtt cggttgtacg ctgttgctcc gttcttgccg acctcgattt ctgggtcaat 900
ttcttccatg gcgtttcgtt actcgaactt ctcttctgtg tcgttgttcg cgcttgtgat 960
gtctcacctc agccgaccgc ccagccaaca cggacgagga agaggtaagt tccgcatgcg 1020
cttggaagga aggagttttt acgtagcggc agtcgttttc atctcgcctg tcggcctccg 1080
gtgtgcatgc cgcgcgatca tttccctgcg tgtgtgctgt ccgtttttta ggacttgagg 1140
aaaaagttag acgacctcgt caagtccacc gccgtcgtac tgttcatgaa aggctctcca 1200
aaagcaccca tgtgtggttt ttccgcgagg gcagttggga tattgaactc cttagacgtc 1260
gatgagtata cgttcgtgaa cattctacag taccctgatg tacgtgcact ggcgaaaaaa 1320
cacttcaact ggcccaccta ccctttgtta gtcgtgggcg gggaagtcgt gggcggggtg 1380
gatattatgg atgaccttaa caaaacaggc gaactgggag aactcatcaa gaaagcactc 1440
aaggagtccg aaggtgcggc ggccggtggc ccagaaggag atcgatcgaa agcctga 1497
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atacgactca ctatagggcg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agctccaccg cggtggcggc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccgccaccg cggtggagct 20
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caagcatcac cagggagatt aaacaacaat gtccctttgg 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aatctccctg gtgatgcttg gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgccctatag tgagtcgtat 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaatctcatc aggatgcagc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatgcggatc cagcagaata 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acccgctttc tcgtcttcta 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttcatcgacg catgaaggcc 20
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tattctgctg gatccgcatc ctagcatgtc attcgatttt 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tagaagacga gaaagcgggt actagtggat cgatcccccg 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggccttcatg cgtcgatgaa cctagggcta gctctagaac 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctgcatcct gatgagattc gccgtcgttt tacaacgtcg 40
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gactgcgaga tgtacctgca 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
actgcgaaca gcagcaagat 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagatgtgcg tgtatccact 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctgacaaagg gaatgcggtg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gactgcgaga tgtacctgca 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
actgcgaaca gcagcaagat 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cagatgtgcg tgtatccact 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctgacaaagg gaatgcggtg 20
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcgagggcag ttgggata 18
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ctaacaaagg gtaggtggg 19
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tactcccgct cgttgc 16
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcctcgtccg tgttgg 16

Claims (8)

1.一种grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株，其特征在于，所述新孢子虫弱毒虫株中缺失的grx5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
Nc1虫株的准备：该Nc1虫株是具有grx5基因的新孢子虫野生株，所述grx5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
质粒构建：通过PCR扩增、多片段连接获得构建所述新孢子虫弱毒虫株所需要的两个质粒，分别是pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒和grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒；以及
弱毒虫株的获得：利用同源重组的方法，将所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒和所述grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒片段电转到所述Nc1虫株中，经过药物筛选、单克隆筛选和PCR鉴定获得权利要求1所述的grx 5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株。
3.如权利要求2所述的grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法，其特征在于，所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒是以pSAG1-Cas9-NcU6-sggra17为模板，将gra17靶点特异的gRNA替换为基因grx5靶点特异的gRNA所得到的。
4.如权利要求3所述的grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法，其特征在于，所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒的具体制备方法如下：
利用gRNA在线设计软件，设计针对基因grx5靶点特异的gRNA，根据所设计的基因grx5靶点特异的gRNA序列设计引物，分别扩增出Cas9片段、新孢子虫U6启动子、T载体片段，在U6启动子下游引物以及T载体骨架的上游引物加入所述基因grx5靶点特异的gRNA；其中，扩增Cas9片段、NcU6启动子、T载体片段的引物如下：
Cas9 F：ATACGACTCACTATAGGGCG(SEQ ID NO.2)
Cas9 R：AGCTCCACCGCGGTGGCGGC(SEQ ID NO.3)
NcU6 F：GCCGCCACCGCGGTGGAGCT(SEQ ID NO.4)
NcU6 R：CAAGCATCACCAGGGAGATTAAACAACAATGTCCCTTTGG(SEQ ID NO.5)
T载体F：AATCTCCCTGGTGATGCTTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.6)
T载体R：CGCCCTATAGTGAGTCGTAT(SEQ ID NO.7)。
5.如权利要求2所述的grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法，其特征在于，所述grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒的制备方法如下所示：分别扩增grx5-5′UTR、grx5-3′UTR、DHFR及pUC19载体，利用多片段无缝连接试剂盒对grx5-5′UTR、grx5-3′UTR、DHFR及pUC19载体四个片段进行连接，构建质粒，然后扩增grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板备用；其中，扩增上述grx5-5′UTR、grx5-3′UTR、DHFR及pUC19载体四个片段的引物如下：
grx5-5′UTR F：GAATCTCATCAGGATGCAGC(SEQ ID NO.8)
grx5-5′UTR R：GATGCGGATCCAGCAGAATA(SEQ ID NO.9)
grx5-3′UTR F：ACCCGCTTTCTCGTCTTCTA(SEQ ID NO.10)
grx5-3′UTR R：TTCATCGACGCATGAAGGCC(SEQ ID NO.11)
DHFR F：TATTCTGCTGGATCCGCATCCTAGCATGTCATTCGATTTT(SEQ ID NO.12)
DHFR R:TAGAAGACGAGAAAGCGGGTACTAGTGGATCGATCCCCCG(SEQ ID NO.13)
pUC19载体F:GGCCTTCATGCGTCGATGAACCTAGGGCTAGCTCTAGAAC(SEQ ID NO.14)
pUC19载体R：GCTGCATCCTGATGAGATTCGCCGTCGTTTTACAACGTCG(SEQ ID NO.15)。
6.如权利要求2所述的grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法，其特征在于，所述PCR鉴定过程中使用了如下两组引物：
鉴定5’同源重组(5’→3’)：
F：GACTGCGAGATGTACCTGCA(SEQ ID NO.16)
R：ACTGCGAACAGCAGCAAGAT(SEQ ID NO.17)
鉴定3’同源重组(5’→3’)：
F：CAGATGTGCGTGTATCCACT(SEQ ID NO.18)
R：CTGACAAAGGGAATGCGGTG(SEQ ID NO.19)。
7.如权利要求2所述的grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法，其特征在于，所述单克隆筛选过程中使用了如下四组引物对单克隆进行鉴定：
PCR1引物，鉴定5’同源重组(5’→3’)：
F：GACTGCGAGATGTACCTGCA(SEQ ID NO.20)
R：ACTGCGAACAGCAGCAAGAT(SEQ ID NO.21)
PCR2引物，鉴定3’同源重组(5’→3’)：
F：CAGATGTGCGTGTATCCACT(SEQ ID NO.22)
R：CTGACAAAGGGAATGCGGTG(SEQ ID NO.23)
PCR3引物,鉴定grx5基因的引物(5’→3’)：
F：GCGAGGGCAGTTGGGATA(SEQ ID NO.24)
R：CTAACAAAGGGTAGGTGGG(SEQ ID NO.25)
PCR4引物，鉴定grx5基因的引物(5’→3’)：
F：TACTCCCGCTCGTTGC(SEQ ID NO.26)
R：TCCTCGTCCGTGTTGG(SEQ ID NO.27)。
8.权利要求2所述的grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法在研制新孢子虫弱毒疫苗中的应用。
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