CN1190127A - 新孢子虫减毒活疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了病原性的原生动物寄生虫新孢子虫的减毒活培养物,以及由此制备的抗新孢子虫病活疫苗,它可用于预防哺乳动物的临床疾病和流产。

Description

新孢子虫减毒活疫苗
本发明涉及致病原生动物新孢子虫(Neospora)的减毒株以及抗新孢子虫病(neosporosis)的活疫苗，所述疫苗是由减毒株制备得到的，它可用于预防哺乳动物的临床疾病和流产。
新孢子虫是动物的致病性原生动物寄生虫，近来人们已认识到它是哺乳动物流产、新生儿死亡、先天感染和脑疾病的主要致病原。Dubeyand Lindsay，1993，Parasitology Today，9：452-458。犬新孢子虫(N.caninum)感染狗，并先天性地感染幼犬，经常导致瘫痪。已从自然感染的幼犬中分离到犬新孢子虫的tachyzoite。Lindsay andDubey，1989，J.Parasitol.75：163-165。新孢子虫是致使奶牛流产的主要原因，在山羊、绵羊和马中也报道了与新孢子虫相关的疾病的例子，即新孢子虫病。
尽管犬新孢子虫在表面上与病原体即鼠弓形体(Toxoplasmagondii)相似，但从抗原和超微结构上仍可以将犬新孢子虫和鼠弓形体互相区分开。Dubey and Lindsay，1993，文献同上。而且，从流产的牛胎儿脑中分离新孢子虫样的原生动物寄生虫，接着在体外培养，显示出它在抗原和超微结构上与鼠弓形体和Hammondia hammondi都有所不同，而与犬新孢子虫最相似。Conrad等，1993，Parasitology106：239-249。另外，对核的小亚单位核糖体RNA基因的分析表明在分离自牛和狗的新孢子虫之间没有核苷酸的差异，但它们与鼠弓形体相比显示出一致的差异。Marsh等.，1995，J.Parasitol.81：530-535。
牛流产和先天疾病的新孢子虫牛分离物的病原学作用已被证实。Barr等.，1994，J.Vet.Diag.Invest.6：207-215。使用被犬新孢子虫感染的近交BALB/c小鼠已开发出中枢神经系统新孢子虫病的啮齿动物模型。Lindsay等.，1995，J.Parasitol.81：313-315。另外，Cole等.，1995，J.Parasitol，81：730-732和Long等.，1996，J.Parasitol.82：608-611分别描述了研究怀孕的远系繁殖和近交小鼠中犬新孢子虫穿过胎盘传染的模型。而且，与自然获得的新孢子虫诱导的牛流产很相似的实验性的犬新孢子虫矮小山羊模型已被阐明。Lindsay等.，1995，Am.J.Vet.Res 56：1176-1180。
WO9525541公开了牛新孢子虫的生物学纯培养物，检测抗新孢子虫抗体和新孢子虫特异性核酸的方法以及含有牛新孢子虫抗原和载体以用作疫苗的组合物。然而，WO9525541未教导新孢子虫的减毒活培养物，或者由此制备的能够在接种动物中激发保护性免疫应答的活疫苗。
第一方面，本发明提供了得自新孢子虫种病原亲本株的一株的细胞培养物，该细胞与亲本株的那些细胞相比表现出减弱的病原性，但是当作为活疫苗施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。
第二方面，本发明提供了保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗，它含有免疫有效量的得自新孢子虫种病原亲本株的一株的活细胞和兽医学可接受的载体，该细胞与亲本株的那些细胞相比表现出减弱的病原性，但是当作为活疫苗施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。本发明的疫苗也可以进一步含有一种或多种其他成分，包括例如佐剂。本发明的疫苗可以施用给对新孢子虫引起的感染和疾病敏感的任何哺乳动物种，包括但不限于狗、奶牛、山羊、绵羊和马。
第三方面，本发明提供了由新孢子虫的病原株制备减毒细胞培养物的方法，该培养物用于保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗中，所述方法包括修饰得自新孢子虫种病原亲本株的细胞；选择并克隆繁殖一个或多个与亲本株细胞相比表现出减弱的病原性的经修饰细胞；并选择和克隆繁殖一个或多个当在活疫苗中被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答的减毒细胞。
第四方面，本发明提供了保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗的制备方法，所述方法包括修饰得自新孢子虫种病原亲本株的细胞；选择并克隆繁殖那些与亲本株细胞相比表现出减弱的病原性但是当在活疫苗中被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答的经修饰细胞；并以适于作为活疫苗施用给哺乳动物的形式将免疫有效量的减毒细胞与兽医学可接受的载体相组合。
第五方面，本发明提供了给哺乳动物接种以抗新孢子虫病的方法，所述方法包括给哺乳动物施用免疫有效量的疫苗，该疫苗含有得自新孢子虫种病原亲本株的一株的活细胞和兽医学可接受的载体，所述细胞与那些亲本株细胞相比表现出减弱的病原性，但是当作为活疫苗施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。
第六方面，本发明提供了联合疫苗，它含有：免疫有效量的得自新孢子虫种病原亲本株的一株的活细胞，该细胞与那些亲本株细胞相比表现出减弱的病原性，但是当作为活疫苗施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答；一种或多种可激发保护哺乳动物抗病或病原状态的免疫应答的其他抗原；和兽医学可接受的载体。联合疫苗可进一步含有一种或多种其他成分，包括例如佐剂。
本申请人已发现新孢子虫种的病原株的细胞可以被减毒，所得减毒细胞当作为活疫苗施用时可以激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。本发明因此提供了得自新孢子虫种病原亲本株的一株的细胞培养物，该细胞与那些亲本株细胞相比表现出减弱的病原性，但当它作为活疫苗被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。
本发明进一步提供了在疫苗中使用的新孢子虫种减毒细胞培养物的制备方法，所述疫苗可保护哺乳动物以抗新孢子虫病，所述方法包括修饰得自新孢子虫种病原亲本株的细胞，例如，通过严格连续传代或者暴露于诱变剂或者使用重组DNA技术的基因工程；选择并克隆繁殖一个或多个与亲本株细胞相比表现出减弱的病原性的经修饰细胞；并选择和克隆繁殖一个或多个当在活疫苗中被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答的减毒细胞。
本文所用术语“新孢子虫病”是指哺乳动物由新孢子虫种或株引起的感染，或是指与哺乳动物被新孢子虫感染相关的任何临床症状，状况，事件或病理学。
本文所用术语“减毒的”描述了与减毒细胞、培养物或株所来源的新孢子虫亲本株相比，体外或体内的感染性或毒力表现出可测降低的新孢子虫细胞、培养物或株。毒力的降低包含任何毒力标志的任何可测的降低，包括体外或体内的感染性，或者包含与感染相关的任何临床症状或状况的严重性或进展速率的任何降低。
术语“亲本株”指的是当施用于哺乳动物时，与通过一次或多次体内或体外传代和/或一个或多个减毒步骤由其得到的减毒株相比，表现出相对高水平病原性的新孢子虫株。
本发明进一步包含新孢子虫株细胞疫苗的制备和使用，所述新孢子虫株得自对特殊的哺乳动物种无致病性的株或种，但该细胞被化学或遗传方法修饰过，从而在该哺乳动物种的成员中都能激发保护性的免疫应答。
本发明的活的减毒细胞在作为活疫苗被施用一次或多次后，能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。“保护性免疫应答”的定义是任何免疫反应，或者是抗体或者是细胞介导的免疫力，或者两者都有，它们出现在哺乳动物中或者防止或者可检测地降低随后的感染，或者消除或者可检测地降低严重性，或者可检测地延缓与新孢子虫病相关的一种或多种临床症状或状况进展的速率。术语“免疫有效量”是指当施用给哺乳动物时可激发保护性免疫应答的疫苗或抗原的量或剂量。新孢子虫减毒株的制备
既然本发明基于以下发现，即新孢子虫病原株的细胞可以被减毒，所得减毒细胞当作为活疫苗被施用时可激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答，那么本发明的实施不局限于任何特殊的减毒方法。相反，通过本领域已知的任何技术或方法，包括但不限于严格连续传代，或暴露于诱变剂，或通过使用重组DNA技术的基因工程，或一些它们的组合都可进行新孢子虫病原株细胞的减毒。
通过将新孢子虫病原株细胞在易感的宿主细胞中重复地体外传代以进行严格连续传代直至充分减毒。传代可在特殊的环境条件下进行以选择减毒细胞。例如，传代可以在低于欲接种的哺乳动物的体温的温度下进行，以选择新孢子虫的温度-敏感型株，该株在疫苗中施与哺乳动物时不会生长，或仅以降低的速率生长。
如本技术领域中所述，将新孢子虫细胞暴露于化学诱变剂或射线中都可进行诱变。对本发明实施有用的化学诱变剂的一个非局限性例子是N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)(Sigma)，下文实施例1中描述了它的使用。辐射可从紫外线或电离辐射中选择。
对诱变剂的暴露程度，即化学诱变剂的浓度或辐射的水平以及暴露时间的长短优选的量可导致产生一个或多个新孢子虫的活细胞，该细胞表现出病原性水平的减弱，但当它作为活疫苗施用给哺乳动物时可以激发抗新孢子虫病的免疫应答。使用标准技术可凭经验确定诱变剂所用的适当参数。
根据本技术领域已知的技术，使用重组DNA技术也可使新孢子虫的病原株减毒，本发明欲包含这种经修饰的病原株以及由此制备的疫苗。可用于实施本发明的重组DNA技术的非局限性例子包括基因置换或基因剔除以使一个或多个基因失去作用，从而得到病原性减弱的株。可以使之失去作用的基因包括例如，必需的代谢基因，或编码毒力因子的基因，或编码在调制哺乳动物宿主的免疫应答中起作用的表面抗原的基因。
在新孢子虫基因组中可用于定向破坏的必需的代谢基因的非局限性例子是二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶(DHFR-TS)基因。Titus等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：10267-10271描述了剔除DHFR-TS基因以产生安全的利什曼原虫属(Leishmania)活疫苗，该文章并入作参考。通过破坏新孢子虫的DHFR-TS基因，产生了需要胸腺嘧啶脱氧核苷以持续生长的营养缺陷型突变体，它表现出减弱的病原性，  当作为活疫苗被施用时，能激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。
现有技术中已知基因置换或基因剔除的重组DNA技术，但不局限于那些利用同源重组的技术。例如新孢子虫病原株的细胞可以被如质粒的载体转化或转染，所述载体含有同源的核苷酸序列，它天然地侧翼于或位于新孢子虫株的例如必需的代谢基因中，优选单拷贝基因。在同源核苷酸序列之间或当中，载体可进一步含有与病原株之核苷酸序列相对应、但最终缺损的核苷酸序列，例如，与病原株序列相比其序列有一个或多个核苷酸“非-沉默”地改变或缺失。用载体转化病原株细胞后，缺损的基因序列整合到新孢子虫基因组中，它也可取代原始的或“野生型”序列。因此，经转化的细胞中定向的基因失去了功能，接着在转化细胞中筛选病原性减弱的那些细胞，再在病原性减弱的转化细胞中筛选出当作为活疫苗施用时可以激发哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答的那些细胞。
为了有助于转化子的筛选，载体可以经基因工程改造以进一步含有报道基因产物或其他选择性标记的编码序列。在本发明中有用的报道基因是现有技术中熟知的，包括例如编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)的基因或编码荧光素酶的基因。报道基因的另一个非局限性例子是编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶的序列，它可被插入载体中，通过底物，如红色的-β-D-吡喃半乳糖苷转化成有色产物来检测酶解活性，从而用于证实转化子。Seeber和Boothroyd，1996，Gene，169：39-45使用此报道酶以检测鼠弓形体的转化子，此文章被并入本文作参考。
编码在本发明中有用的选择性标记的编码序列也是现有技术中已知的，包括那些编码赋予抗生素抗性或抗代谢产物抗性的基因产物的序列或提供营养缺陷型需求的序列。这种序列的例子包括那些赋予潮霉素，新霉素或腐草霉素抗性的序列。Messina等.，1995，Gene，165：213-217提供了在不同病原体中使用的抗生素抗性标记的例子，该文献描述了在鼠弓形体中使用腐草霉素的抗性标记以构建稳定的转化子，该文献已并入本文作参考。
报道基因产物或选择性标记的任何编码序列应优选与调节元件编码序列有效相联以插入载体中。本文所用的“调节元件”包括但不限于本领域已知的用于驱动和/或调节表达的可诱导和不可诱导的启动子、增强子、操纵子和其他元件。而且如本文所用的DNA编码序列与一个或多个调节元件“有效地相联”，其中调节元件可有效调节和允许DNA编码序列的转录和/或相对应的mRNA的翻译。例如，在新孢子虫细胞中表达选择性标记ble的载体可通过在ble开放阅读框(ORF)的侧翼联结新孢子虫或密切相关的Apicomplexa，弓形体的基因调节区来构建。不同的单拷贝新孢子虫或弓形体基因的5’侧翼区可被用来表达ble。单拷贝弓形体基因的例子是：(i)SAG1，编码主要的tachyzoite表面抗原p30(Burg等.，1988，J.Immunol.141：3584-3591)，(ii)GRA1，编码可分泌的蛋白质p23(Cesbron-Delauw等.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.86：7537-7541)；和(iii)GRA2，编码可分泌的蛋白质p28(Mercier等.，1993，Mol.Biochem.Parasitol.59：71-82)。单拷贝的新孢子虫基因的例子包括：(1)弓形体SAG1，GRA1和GRA2基因的同系物，例如以公开的弓形体序列为基础，使用标准的PCR法可鉴定之；(ii)编码犬新孢子虫tachyzoite主要细胞表面蛋白质NC-p43的基因(Hemphill，1996，Infect.Immun.64：4279-4287)；和(iii)编码免疫决定族17-，29-，30-和37kDa外泌/可分泌的蛋白质的基因(Bierkas等.，1994，Clin.Diag.Lab.Immun，1：214-221)。SAG1基因的3’侧翼区可用于提供聚腺苷酸化序列。用于插入5’启动子、ble基因和3’聚腺苷酸化序列的载体骨架可以是任何标准的，可商购的质粒，如pBLUESCRIPTTM(Stratagene)。
一旦适当的载体构建完毕，可将之用于转化或转染一个或多个新孢子虫亲本株的细胞。可按照现有技术将载体导入细胞中，包括但不限于电穿孔法，微注射法，病毒转染法，脂质体-介导的转染，微粒轰击法等等。
一旦载体被导入新孢子虫细胞，被导入的编码序列在宿主细胞基因组中的存在、整合和维持，或导入序列在宿主细胞中游离都可通过标准技术确证和监测，所述技术包括但不限于Sounthern杂交分析；PCR分析，包括逆转录酶-PCR(RT-PCR)；对预期蛋白质产物的免疫学或比色试验；检测标记物基因功能的存在或缺失，如新的营养缺陷型的出现；或检测病原性的减弱。
特别适用于病原性原生动物的载体构建，转化，转化子的选择，宿主细胞表达等的例子描述于下列文献中，它们都被并入本文作参考：Seeber and Boothroyd，1996，上文；Titus等.，1995，上文；Messina等.，1995，Gene，165：213-217；Sibley等.，1994，Prol.Natl.Acad.SciUSA，91；5508-5512；Donald and Roos，1994，Mol，Biochem.Parasitol.，63：243-253；Kim等，1993，Science，262：911-914；Ryan等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：8609-8613；Soldati andBoothroyd，1993，Science，260：349-352；Eid and Sollner-Webb，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：2118-2121；LeBoWitz等.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：9736-9740；Lee and Van der Ploeg，1990，Science，250：1583-1586；Asbroek等.，1990，Nature，348：174-175；Cruzand Beverley，1990，Nature，348：171-173；以及Laban等，Nature，343：572-574。
包括载体构建，转化，转化子的选择，宿主细胞表达等的基因重组一般技术被进一步描述于Maniatis等.，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y，；Ausubel等.，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates & WileyInterscience，N.Y.；Sambrook等.，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual.2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Innis等(eds)，1995，PCR Strategies，Academic Press，Inc.，San Diego，Ca.；以及Erlich(ed)，1992，PCRTechnology，Oxford University Press，New York，此类文章被并入本文作参考。
减毒步骤之后，从培养物中选择呈现出一种或多种减弱的病原性指示的细胞，有限稀释后克隆繁殖。这种指示的例子包括但不限于体外的新的温度敏感型或新的营养缺陷型的出现，或者与被亲本株感染相比，给哺乳动物施用了减毒株细胞后，毒力指示如感染性或严重性或一种或多种症状或状况的进展速率有所降低。对实施本发明有用的温度敏感型的特殊、非局限性例子是其中减毒株细胞在32℃而不是在37℃生长的株。这种温度敏感型株在32℃时会导致被感染宿主细胞的裂解，从而在宿主细胞单层上出现损伤或噬斑。当在37℃下生长时，减毒株不会充分复制，因此在宿主细胞单层上不会产生噬斑。
可从该属的包括但不限于犬新孢子虫的任何种的任何病原株中得到新孢子虫的减毒株。可从中有效得到减毒株的犬新孢子虫特殊病原株的非局限性例子是存在于被感染的MARC145猴肾细胞中的NC-1株，所述细胞得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 ParklawnDrive，Rockville，MD 20852 USA(ATCC入藏登记号为CRL-12231)。NC-1株还描述于Dubey等.，1988，J.Am.Vet.Med.Assoc.193：1259-63(并入本文作参考文献)。另外，也可使用例如上述文献中所描述的标准分离技术从呈现出新孢子虫病临床症状的受感染动物的组织、器官或体液中得到新孢子虫的病原株。得自犬新孢子虫NC-1株的活的减毒株的非局限性例子是存在于被感染的MARC145猴肾细胞中的NCTS-8，所述细胞得自ATCC(ATCC入藏登记号为CRL-12230)。
根据现有技术中描述的已知技术，通过用新孢子虫株的tachyzoite感染任何可接受的细胞系，优选感染哺乳动物细胞系即可在体外培养新孢子虫的亲本株和减毒株。新孢子虫tachyzoites可在其中被培养的哺乳动物细胞系包括例如人的包皮成纤维细胞(Lindsay等.，1993，Am.J.Vet Res 54：103-106)；牛的心肺主动脉内皮细胞(Marsh等.，1995，见上文)；和牛的单核细胞(Lindsay andDubey，1989，上文)等。例如可在人包皮成纤维细胞Hs68(ATCC入藏登记号CRL-1635)单层上培养犬新孢子虫的tachyzoite(Lindsay等.，1993，见上文)。Bradyzoite也可类似地培养和制备。
可在现有技术描述的几种培养基的任一种中培养哺乳动物细胞培养物，并维持被新孢子虫感染的细胞培养物。例如，可在添加有10％(V/V)热灭活的胎牛血清(FBS)或成年马血清(ES)，2mM L-谷氨酰胺，50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的Dulbecco极限必需培养基(DMEM：Gibco Laboratories，N.Y.)中生长被犬新孢子虫的tachyzoite感染的牛心肺主动脉内皮细胞的固定单层培养物(Conrad等.，1993，见上文)。可以在含有2％(V/V)胎牛血清，1.0mM丙酮酸钠，1×104U/ml青霉素，1×104μg/ml链霉素，5×10-2mM 2-巯基乙醇和0.3mg/ml L-谷氨酰胺的RPMI 1640(Gibco)(维持培养基)中维持人包皮成纤维细胞Hs68的单层。可在只有胎牛血清增至10％(V/V)的同一培养基(生长培养基)中维持被新孢子虫感染的人包皮成纤维细胞Hs68的单层培养物。现有技术中已知具有新营养缺陷型的新孢子虫减毒株需要经适当修饰的培养基以支持生长。
一般在标准组织培养条件下，如37℃和5％CO2维持经新孢子虫感染的哺乳动物细胞的单层培养物。当培养物中70-90％的哺乳动物细胞已被感染时，Tachyzoite一般传代给未被感染的单层培养物，使用标准技术通过显微镜可以测定。通过使用允许tachyzoite保持活力的任何标准技术裂解宿主细胞，并通过例如过滤或者离心收集tachyzoite，可从被感染的哺乳动物细胞培养物中收集到tachyzoite。
疫苗的制备和使用
本发明提供了抗新孢子虫病的疫苗，它含有免疫有效量的得自新孢子虫种病原亲本株的一株的活细胞和兽医学可接受的载体，所述细胞与那些亲本株细胞相比表现出减弱的病原性，但当它作为活疫苗施用给哺乳动物时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。
本发明进一步提供了保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗的制备方法，该方法包括修饰得自新孢子虫种病原亲本株的细胞；选择并克隆繁殖那些与亲本株细胞相比表现出减弱的病原性，但当其在活疫苗中被施用时可激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答的修饰细胞；并以适于作为活疫苗施用给哺乳动物的形式将免疫有效量的减毒细胞与兽医学可接受的载体相组合。
本发明进一步提供了给哺乳动物接种以抗新孢子虫病的方法，所述方法包括给哺乳动物施用免疫有效量的疫苗，该疫苗含有得自新孢子虫种病原亲本株的一株的活细胞和兽医学可接受的载体，所述细胞与那些亲本株细胞相比表现出减弱的病原性，但是当作为活疫苗施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。
本发明的疫苗含有新孢子虫减毒株的活细胞，或作为单个抗原成分，或与一种或多种其他抗原组合，所述其它抗原可激发保护哺乳动物抗与新孢子虫病可能相关或不相关的疾病或病原状态的免疫应答。因此本发明进一步提供了组合疫苗，它含有：免疫有效量的得自新孢子虫种病原亲本株的一株的活细胞，该细胞与那些亲本株细胞相比表现出减弱的病原性，但是当作为活疫苗施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答；一种或多种可激发保护哺乳动物抗病或病原状态的免疫应答的其他抗原；和兽医学可接受的载体。组合疫苗可进一步含有一种或多种其他成分，包括例如佐剂。
疫苗一般经肠胃外途径施用，例如皮下或肌内注射。然而疫苗也可经腹膜内或静脉内注射或通过其他途经施用，包括口服、鼻内、直肠或阴道施药，可根据疫苗施用的位置选择适当的兽医学可接受的载体。疫苗可简单地含有以培养物液体形式存在的减毒细胞，它可直接施予哺乳动物。或者，疫苗也可含有与兽医学或药学可接受的载体组合的减毒细胞，所述载体是根据施药途径及其维持细胞活力的能力从那些现有技术已知的载体中选择出来的。这类载体的非限制性例子包括水、盐水、缓冲的载体等等。适当的其他疫苗载体和添加物对于本领域的技术人员而言是已知的，或者说是显而易见的。例见Remington的Pharmaceutical Science，18th ed.，1990，Mack Publishing(并入本文作参考)。
疫苗可进一步含有一种或多种其他成分，例如，包括例如白介素-1的免疫调节剂，或者另一种免疫增强物质，如兽医学可接受的佐剂。佐剂的非限制性例子包括弗氏完全和不完全佐剂，矿物凝胶，包括例如氢氧化铝和水包油或油包水的制剂。可根据其维持减毒的新孢子虫细胞活力的能力以及细胞在被接种的哺乳动物体内激发保护性免疫应答的能力来选择免疫调节剂。
可作为本发明疫苗中的佐剂的水包油制剂的非限制性例子包括以下乳剂1-3。乳剂1的组成是：(a)ME6201(5％V/V角鲨烯，0.1％V/V维生素E和0.8％V/V吐温TM80分散剂)； (b)Quil A(QA)皂草苷制品(Superfos)(200μg/ml)；和(C)胆固醇(chol.)(100μg/ml)。乳剂2的组成是：(a)ME 6201；和(b)Avridine lipoidal amine(1mg/ml)。乳剂3的组成是ME6210(5％V/V角鲨烯，1.0％V/V维生素E和0.8％V/V吐温TM80分散剂)。
通过常规方法可确定有效剂量，开始时给予低剂量的减毒细胞，然后加大剂量，同时监测效果并系统地改变剂量。当确定每只动物的最适剂量时需考虑多种因素，最先考虑的是种，动物的大小，年龄，动物的一般状况，其他药物的存在，动物被接种的新孢子虫特殊株的毒力等等。考虑其他动物研究的结果之后即可优选出实际的剂量。
根据上述因素也可选择出疫苗的施用方案。可在任何时间给动物接种，包括在生育前片刻或在生育时接种。为了完备的保护，需要补充施用疫苗，或需要加强免疫。确定是否已达到足够的免疫保护的一种方法是在接种后测定动物中血清转变和抗体滴度。因此，依据几种因素，包括例如其他动物中新孢子虫病爆发的时间等，可在欲接种的特殊动物生命中的任一时间施用本发明的疫苗。可将疫苗施予断奶期或更小的动物，或施予更成熟的动物，例如以生育前疫苗形式施用可抵抗与新孢子虫相关的先天疾病或流产。有效的接种仅需要初次接种，或初次接种与一次或多次加强接种相组合。加强接种可在初次接种后的任何时间给予，这取决于例如初次接种后的免疫反应，疾病爆发的严重性，导致疾病爆发的新孢子虫株的毒力，接种动物的健康状况等等。接种时间的选择和加强免疫的次数(如果有的话)优选由兽医根据所有相关因素(有些在上文有述)的分析来决定。
用于疫苗的新孢子虫细胞优选为tachyzoite，但也可由bradyzoite或卵囊或其某些组合来代替。疫苗中减毒细胞的浓度优选范围约为1×103/ml至1×108/ml，更优选约为2×106/ml至2×107/ml。适当的剂量大小在约0.5ml至约1.0ml之间变化。一般对每个剂量而言，施予动物的减毒细胞数目优选约为2×104至2×108；更优选约2×105至2×107；最优选约1×106至1×107。
本发明的疫苗可保护哺乳动物抗由新孢子虫引起的感染或疾病。此疫苗可用于保护怀孕和未怀孕的哺乳动物，包括但不限于牛、绵羊、公山羊、狗和马以抗由新孢子虫病引起的感染、临床疾病或流产。术语“保护”是广义的，它不局限于完全防止由新孢子虫引起的感染，但包括感染性的降低，或由感染引起的疾病或状况严重性的降低，包括一种或多种由感染引起的病理效果或症状的可观察到的减轻，或一种或多种这类病理效果或症状进展速率的可观察到的延缓。本发明的疫苗也是安全的，即它不会导致被接种哺乳动物的疾病或明显的副作用。
下列实施例将进一步阐明而不是限制本发明的组合物和方法。
实施例1：犬新孢子虫温度敏感型株的
建立及在BALB/c小鼠中分析病原性
此研究的目的是建立犬新孢子虫的温度敏感型株(NCTS)，并通过在已知对新孢子虫病高度易感的BALB/c小鼠中分析血清抗体反应，组织包囊和脑损伤的产生以及临床症状的进展来检测这些温度敏感型株的病原性。
材料和方法
按Lindsay和Dubey所述(1989，见上文)，通过有限稀释将犬新孢子虫NC-1株的tachyzoite(Dubey等.，1988，见上文)克隆两次并维持在37℃。在25cm2烧瓶中繁殖tachyzoite并克隆于含有人包皮成纤维细胞Hs68(ATCC入藏登记号CRL-1635)单层的96-孔培养板中(Lindsay等.，1993，见上文)。Hs68细胞预先已在含有2％(V/V)胎牛血清，1.0mM丙酮酸钠，1×104U/ml青霉素， 1×104μg/ml链霉素，5×10-2mM 2-巯基乙醇和0.3mg/ml L-谷氨酰胺的RPMI 1640(维持培养基)中生长。在同一培养基中维持被感染的细胞培养物单层，只是其中胎牛血清增加到10％(V/V)(生长培养基)。分离一个克隆，在实验室中将之命名为NC-1-2C系，但下文简称为NC-1株。
通过暴露于含0.5μM N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(Sigma)的生长培养基中达24小时使NC-1株的tachyzoite诱变，然后在32.5℃下在于维持培养基中的Hs68细胞中培养3mos，再通过有限稀释克隆tachyzoite。最初分离了12个克隆。在32.5℃下，在维持培养基中将克隆维持于连续培养物中的Hs68细胞内达8mos以上，然后选择三个克隆以进一步研究，它们被命名为NCTS-4，NCTS-8和NCTS-12(NCTS＝犬新孢子虫，温度敏感型)。
按下述进行小鼠的血清学试验。使用间接的免疫荧光抗体试验(IFAT)(Dubey等.，1988，见上文)以分析小鼠的血清中抗犬新孢子虫抗体的存在。在免疫接种研究中，在攻击接种前片刻得到小鼠血清，还从在病原性实验中存活的所有小鼠中得到血清。从1∶50开始双倍稀释以检测血清并终点滴定之，tachyzoite被用作抗原。阳性样品出现完全的tachyzoite表面荧光，阴性样品未出现荧光或仅有前面的残余荧光。
按下述测定被犬新孢子虫不同株攻击的小鼠脑损伤的存在。对每只小鼠进行尸检以取出脑，先取一半在10％V/V的中性缓冲的福尔马林溶液中固定以作组织病理学检查。使用常规的组织学技术制备组织切片，用苏木精和伊红染色以在显微镜下检测损伤的存在。
按照Lindsay等.，1995，J.Parasitol.81：313-315所述的标准对苏木精-和伊红-染色的脑组织切片的损伤进行评分。
炎症/坏死的病灶的数目            评分
无病灶                            1
1-5病灶                           2
6-10病灶                          3
＞10病灶                          4  病灶的平均大小                   评分
无                              1
100-200μm                      2
200-500μm                      3
＞500μm                        4损伤的严重程度                   评分
无损伤                          1
轻微                            2
轻度                            3
中度                            4
重度                            5
使用上述列出的三个值可得到平均的损伤评分。正常的未被感染的小鼠脑平均损伤评分为3.0。使用Kruskal-Wallis非参数测验以及无分布的多重对比法评价平均损伤得分。使用Fisher氏精确测验检查每组中带损伤的小鼠数目。以截断值P＜0.05来确定统计学意义。
使用特异于犬新孢子虫的鼠单克隆抗体6G7与亲和素-生物素过氧化物酶复合物(ABC)免疫组化试验相联合检查每只小鼠的脑切片以检测犬新孢子虫时相(Cole等.，1993，J.Vet Diag.Invest.5：574-589)。
将每只小鼠脑的另一半在酸性-胃蛋白酶中消化并用来接种哺乳动物细胞培养物以检测犬新孢子虫组织包囊的存在。为了消化，将小鼠脑的另一半置于3ml Hank平衡盐溶液(HBSS)中，并两次通过具有23孔径针头的注射器。在匀浆中加入3ml酸性-胃蛋白酶溶液(0.52g胃蛋白酶，0.50g NaCl，98.6ml dH2O，1.4ml浓HCl，pH0.8)，并在37℃水浴中保温10分钟。离心除去酸性胃蛋白酶溶液，将代表完整的另一半脑的沉淀物接种于单个25cm2组织培养瓶中，该瓶中含有按上述培养的人包皮成纤维细胞Hs68的单层。30分钟后，除去接种物，洗涤Hs68细胞单层，并在如上所述的新鲜维持培养基中保温，然后检查细胞培养物达30天以检测犬新孢子虫的存在(Lindsay andDubey，1989，见上文)。
按下述测定犬新孢子虫的NC-1和三个选定的NCTS株，即NCTS-4，NCTS-8和NCTS-12的病原性。用HBSS(对照)，或用于HBSS中的犬新孢子虫的NC-1，NCTS-4，NCTS-8或NCTS-12株中任一种的5×105tachyzoite(总体积为0.5至1.2ml)皮下接种BALB/c小鼠(8周龄，雌性)(Harlan Sprague Dawley(HSD))。接种后(PI)42或56天尸检以检查存活小鼠(见表1)。对存活小鼠尸检以收集血清。检查这些小鼠脑的损伤评分和免疫组织学，如上所述将每只脑的一半用于酸性胃蛋白酶消化以测定组织包囊的存在。
表1：用犬新孢子虫的NCTS-4，NCTS-8，NCTS-12或NC-1株的tachyzoite接种BALB/c小鼠的结果
 处理组  小鼠数目 犬新孢子虫株     结果
    1     4  HBSS(对照)     无死亡
    2     5    NCTS-4     无死亡
    3     5    NCTS-4     无死亡
    4     5    NCTS-8     无死亡
    5     5    NCTS-8     无死亡
    6     5    NCTS-12     无死亡
    7     5    NCTS-12     无死亡
    8     5     NC-1 在PI约16天时临床新孢子虫病开始发作；小鼠与1-7组的相比较不活跃；皮毛变硬。在PI34天时，两只小鼠因新孢子虫病而无痛致死；在PI39天时，又一只小鼠死亡。
    9     5     NC-1 临床病征与组8相同；在PI26，30，32和41天时发现有小鼠死亡。
表2：被犬新孢子虫不同株接种的BALB/c小鼠的平均损伤评分
    处理组 有损伤的小鼠数/被检查的数目/存活的数目   平均损伤评分
 1(HBSS-对照)     0/4/4     3.00
  2+3(NCTS-4)     4/10/10a     4.80
  4+5(NCTS-8)     6/10/10a     5.50
  6+7(NCTS-12)     5/10/10a     4.90
  8+9(NC-1)     8/8/3a.b     9.38a.b
a＝与对照(HBSS)显著不同(p＜0.05)
b＝与NCTS-4，NCTS-8和NCTS-12明显不同(p＜0.05)。
表3：小鼠血清相互的抗体滴度
               相互抗体滴度
    处理组   ＜50   800  1,600   3,200   6,400
 1(HBSS-对照)PI42天     2    -     -     -     -
 1(HBSS)PI56天     2    -     -     -     -
 2(NCTS-4)PI42天     -    1     4     -     -
 3(NCTS-4)PI56天     -    -     5     -     -
 4(NCTS-8)PI42天     -    -     3     2     -
 5(NCTS-8)PI56天     -    -     3     2     -
 6(NCTS-12)PI42天     -    -     3     2     -
 7(NCTS-12)PI56天     -    -     4     1     -
 8(NC-1)PI56天     -    -     2     -     -
 9(NC-1)PI56天     -    -     1     -     -
                     结果
仅在被NC-1株接种的BALB/c小鼠中出现临床新孢子虫病和死亡(表1)。受NC-1株感染后，10只BALB/c小鼠只有3只存活。NCTS-4，NCTS-8和NCTS-12株不会引起BLAB/c小鼠的死亡。
平均的损伤评分示于表2。在被NCTS株接种的一些小鼠的脑中发现有损伤，但是当与对照(HBSS)相比，平均的损伤评分没有统计学意义。当将被NC-1株接种的小鼠与被HBSS(对照)或被犬新孢子虫NCTS株中任一种接种的小鼠相比即可发现平均损伤评分和具损伤的小鼠数目的显著差异。
血清抗体滴度示于表3。在所有被NCTS株攻击的小鼠中(30/30)检测到显著的IFAT滴度(≥400)。这表明NCTS株能在免疫功能完全但遗传上易感的动物中刺激B-细胞应答。在受NCTS攻击的小鼠中IFAT滴度与受NC-1攻击的小鼠相等，有些时候甚至比后者更高。
使用如上所述的酸性胃蛋白酶消化技术在检测的任一半脑中都未检测组织包囊。这表明组织包囊如果存在，在被犬新孢子虫NCTS或NC-1株接种的小鼠中数目也很少。
              实施例2：在HSD：LCR远系繁殖的
            小鼠中分析犬新孢子虫NCTS株的病原性
本研究的目的是在HSD：ICR远系繁殖的小鼠中测定犬新孢子虫NCTS株的病原性，所述小鼠有免疫活性，它比近交的BALB/c小鼠对新孢子虫有更强的抗性。
                     材料和方法
该实验中使用HSD：ICR小鼠(4周龄，雌性)。除对照外，给所有HSD：ICR小鼠接种于HBSS中的犬新孢子虫适当株的5×105tachyzoite(总体积为0.5至1.2ml)。给对照小鼠仅接种HBSS。PI56天后处死所有存活的小鼠，收集血清以检测IFAT。按上述收集这些小鼠的脑，先取一半用作损伤评分和免疫组织学分析，每只脑的另一半用于酸性-胃蛋白酶消化以检测组织包囊。
                         结果
在HSD：ICR小鼠中，所测试的犬新孢子虫株，包括NC-1，无一引起死亡(表4)，与未被攻击的对照相比，具损伤的小鼠数目或平均损伤评分也无显著差异(表5)。在组织或ABC-染色的切片中未观察到脑的组织包囊。在细胞培养物中未分离到寄生虫。
表4：用犬新孢子虫NC-1，NCTS-4，NCTS-8或NCTS-12株的tachyzoite接种HSD：ICR小鼠的结果
  处理组   小鼠数目  犬新孢子虫株     结果
    10     5  HBSS(对照)     无死亡
    11     5     NC-1     无死亡
    13     5     NCTS-4     无死亡
    14     5     NCTS-8     无死亡
    15     5     NCTS-12     无死亡
表5：被犬新孢子虫不同株接种的HSD：ICR小鼠的平均损伤评分
    处理组 具有损伤的小鼠数目/检查的数目/存活的数目 平均损伤评分a
 10(HBSS-对照)     0/5/5     3.0
  11(NC-1)     3/5/5     6.0
  13(NCTS-4)     0/5/5     3.0
  14(NCTS-8)     1/5/5     4.0
  15(NCTS-12)     0/5/5     3.0
a＝在处理组之间未观察到显著差异
表6：小鼠血清的相互抗体滴度a
                    相互抗体滴度
    处理组   ＜50   400   800   1,600   3,200     6,400
 10(HBSS-对照)     5    -     -     -     -       -
 11(NC-1)     -    -     -     2     3       -
 13(HCTS-4)     -    1     3     1     -       -
 14(HCTS-8)     1    -     2     1     1       -
 15(HCTS-12)     1    -     3     1     -       -
存活小鼠的抗体滴度示于表6。在被NCTS株攻击的大多数小鼠中(13/15)检测到显著的IFAT滴度(≥400)，这表明这些NCTS株在免疫功能完全但遗传学上具抗性的动物中能够诱导B-细胞应答。
在经组织学、免疫组织学或通过使用酸性-胃蛋白酶消化法检查的脑部分中未检测到组织包囊。这些结果证实了上文实施例1中使用BALB/c小鼠所呈现的结果。
           实施例3：在免疫抑制的HSD：ICR
         小鼠中分析犬新孢子虫NCTS株的病原性
本研究的第一个目的是在免疫抑制的HSD：ICR小鼠中测定犬新孢子虫NCTS株的病原性。本研究的第二个目的是测定是否在37℃下将犬新孢子虫NCTS株体外传代后会回复突变到有病原性。
                   材料和方法
通过在接种后-7，0和7天肌内施用2mg甲基强的松龙乙酸酯(MPA)(Upjohn-Pharmacia)使HSD：ICR小鼠(4周龄，雌性)受到免疫抑制。见Lindsay and Dubey，1989，J Parasitology75：772-779。
在第0天用于HBSS中的NC-1，NCTS-4，NCTS-8或NCTS-12株中任一种，或被命名为NCTS-4-37，NCTS-8-37或NCTS-12-37的有潜在回复突变的对照中的一种的2×105tachyzoite(总体积为0.5至1.2ml)接种免疫抑制的HSD：ICR小鼠，随后如上所述对小鼠进行血清学，组织学和临床检查。
检查NCTS-4，NCTS-8和NCTS-12克隆回复突变至有病原性的情况方法是在37℃下培养88天(25个细胞培养物传代数)，接着接种到免疫抑制的HSD：ICR小鼠中(潜在的回复突变株被命名为NCTS-4-37，NCTS-8-37，NCTS-12-37)。
                        结果
犬新孢子虫的NC-1，NCTS-4-37和NCTS-12-37株在免疫抑制的HSD：ICR小鼠中导致100％死亡(表7)。NCTS-4，NCTS-8，NCTS-12和NCTS-8-37株针对免疫抑制的HSD：ICR小鼠而言病原性较弱，仅导致0至20％死亡。平均损伤评分示于表8。在PI56天尸检检查的任何小鼠的酸性-胃蛋白酶消化物中都未观察到tachyzoite。
存活小鼠的抗体滴度示于表9。攻击后56天在NCTS-4，-8和-12和NCTS-8-37小鼠中检测到显著的IFAT滴度(≥800)，这表明这些株在免疫抑制但遗传学上有抗性的动物中能刺激B-细胞应答。
表7：用犬新孢子虫的NC-1，NCTS-4，NCTS-8，NCTS-12或其潜在的回复突变株的tachyzoite接种免疫抑制的HSD：ICR小鼠的结果
  处理组 小鼠数目 犬新孢子虫株     结果
    16     5   HBSS(对照)     无死亡
    17     5     NC-1 第20天时3只小鼠死亡或被无痛致死*，在PI22和23天各有一只小鼠死亡
    18     5     NCTS-4     无死亡
    19     5     NCTS-8 在PI20天，一只小鼠被无痛致死*
    20     5     NCTS-12     在PI22天，一只小鼠死亡
    21     5     NCTS-4-37 在PI13，14(2)，16和21天，所有小鼠死亡或被无痛致死*。
    22     5     NCTS-8-37     在PI29天，一只小鼠死亡
    23     5     NCTS-12-37 在PI14天，1只小鼠死亡，4只被无痛致死
*＝出于人道主义原因，将因临床脑炎新孢子虫病而垂死的小鼠无痛致死。
表8：被犬新孢子虫不同株接种的免疫抑制HSD：ICR小鼠的平均损伤评分
    处理组 具损伤的小鼠数目/检查的数目/存活的数目 平均损伤评分
 16(HBSS-对照)     0/5/5     3.0
  17(NC-1)     4/4/0a     9.8a
  18(NCTS-4)     1/5/5     3.6
  19(HCTS-8)     2/5/4     5.2
  20(NCTS-12)     3/5/4     6.2
  21(NCTS-4-37)     3/3/0a     8.7
  22(NCTS-8-37)     5/5/4a     8.2
  23(NCTS-12-37)     4/4/0a     9.5a
a＝与对照(组16)明显不同(P＜0.05)。
表9：小鼠血清的相互抗体滴度a
                     相互抗体滴度
    处理组 ＜50    100    800  1,600   3,200   6,400   12,800
   16(HBSS-对照)   5     -     -     -     -     -     -
    18(NCTS-4)   -     1     1     1     1     1     -
    19(NCTS-8)   -     -     -     2     1     1     -
    20(NCTS-12)   -     -     -     1     2     1     -
    22(NCTS-8-37)   -     -     -     -     1     2     1
a＝所有滴度是在PI56天时测定的。
对于免疫抑制的HSD：ICR小鼠而言，NCTS株比NC-1，NCTS-4-37和NCTS-12-37株的病原性弱。被NCTS-8-37回复突变株接种的小鼠与被NCTS-4-37或NCTS-12-37回复突变株接种以致100％死亡的小鼠相比，呈现出相对高的存活率(4/5)，这表明在37℃连续传代之后，NCTS-8-37回复突变株保留了减弱的病原性。基于被阐明的减弱病原性的保留，如下所述选择犬新孢子虫NCTS-8株作为有优势的候选疫苗并用作进一步研究。
实施例4：给BALB/c小鼠接种以抗犬新孢子虫诱导的脑炎
本研究的第一个目的是确定用犬新孢子虫的活的温度敏感型株接种是否能提供对抗由病原株如犬新孢子虫NC-1株随后攻击引起的疾病的保护作用。本研究的第二个目的是确定用杀死的(冷冻)NCTS-8tachyzoite接种BALB/c小鼠提供给被犬新孢子虫NC1株随后攻击之小鼠的保护作用的水平。
                  材料和方法
用HBSS(对照)(0.5ml)或于HBSS中的NCTS-8株5×105活tachyzoite(0.5ml)或于HBSS中的2×106杀死的(冷冻)tachyzoite(0.5ml)(表10)皮下注射BALB/c小鼠(9周龄，雌性)以接种。用与初次注射相同的材料在PI21天对接种动物加强免疫。加强免疫后14天，通过皮下施用于HBSS中的犬新孢子虫NC-1株1×106tachyzoite或只施用HBSS(对照)(总体积为0.5ml)以攻击小鼠。
如上文所述，使用IFAT检测实验中存活的小鼠的血清以确定抗犬新孢子虫抗体的存在。尸检每只小鼠以取出脑。如上文所述，将一半用于组织病理学和免疫组织学研究，另一半用于酸性-胃蛋白酶消化。如上文所述，通过接种人包皮成纤维细胞Hs68单层培养物以确定冷冻后tachyzoite的活力。
                    结果
初次或加强接种后，所有试验组中无一只小鼠死亡。经NC-1tachyzoite攻击后，被HBSS(对照)接种的10只小鼠中有2只死亡，被杀死的NCTS-8 tachyzoite接种的10只小鼠中有3只死亡。存活小鼠的平均损伤分数示于表11。
存活小鼠的相互抗体滴度示于表12。在经活的NCTS-8 tachyzoite接种又经加强免疫的小鼠中检测到显著的IFAT滴度(≥800)，这证实了上述结果。相反，被杀死的NCTS-8 tachyzoite接种的任何小鼠在攻击前没有显著的IFAT滴度，这表明杀死的tachyzoite在遗传易感的宿主中未能诱导显著的抗体反应。
用两只虚假接种、攻击小鼠(组24，小鼠1号和2号)和一只经杀死的NCTS-8 tachyzoite接种的小鼠(组31，小鼠5号)的经酸性-胃蛋白酶消化的脑组织接种细胞培养物，从中分离犬新孢子虫tachyzoite。在被任何其他小鼠脑组织接种的培养物中都未分离到tachyzoite。
表10：BALB/c小鼠的接种和攻击方案
  处理组   小鼠数目 接种&加强免疫     攻击
    24     5     HBSS     NC-1
    25     5     HBSS     NC-1
    26     5  NCTS-8(活的)     HBSS
    27     5  NCTS-8(活的)     HBSS
    28     5  NCTS-8(活的)     NC-1
    29     5  NCTS-8(活的)     NC-1
    30     5  NCTS-8(死的)     NC-1
    31     5  NCTS-8(死的)     NC-1
表11：被接种，攻击的BALB/c小鼠的平均损伤评分
    处理组 具损伤的小鼠数/检查数/存活数   平均损伤评分
    24+25     8/8/8     9.3
    26+27     1/10/10     3.4a，b
    28+29     1/10/10     3.3a，b
    30+31     6/7/7     7.7
a＝与组24+25有显著不同(p＜0.05)
b＝与组30+31有显著不同(p＜0.05)
表12：攻击前、后小鼠血清的相互抗体滴度
    处理组  攻击前或后                        相互抗体滴度
 ＜50  50  100   400   800   1.600   3,200   6,400
 24+25(HBSS-对照)   前   10   -    -    -     -     -   -
 24+25(HBSS-对照)   后    -   -    -    -    -     1     4   3
 26+27(NCTS-8，活的；HBSS)   前    -   -    -    1    4     4     1 -
 26+27(NCTS-8，活的；HBSS)   后    -   -    - -    3     4     3   -
 28+29(NCTS-8，活的；NC-1)   前    -   -    - -    1     9     -   -
 28+29(NCTS-8，活的；NC-1)   后    -   -    - -    1     8     1   -
 30+31(NCTS-8，死的；NC-1)   前    6   2    2    -    -     -     -   -
 30+31(NCTS-8，死的；NC-1)   后    -   -    -    1    1     2     2   1
被犬新孢子虫NCTS-8株活的tachyzoite接种的小鼠没有死亡，也没有临床疾病症状出现。被NCTS-8株的活的tachyzoite接种、随后又被NC-1株的tachyzoite攻击的小鼠(表11，组28+29)有损伤评分，该分数与被NCTS-8株的活的tachyzoite接种、随后又施用了HBSS的小鼠(表11，组26+27)的评分几乎相同。这表明用NCTS-8株活的tachyzoite接种可提供实质性的保护作用以抗由犬新孢子虫NC-1株感染引起的疾病。用NCTS-8株的死的tachyzoite接种小鼠可提供很少的抗新孢子虫病的保护作用(表11，组30+31)。
实施例5：用低剂量的犬新孢子虫NCTS-8株接种BALB/c小鼠
本研究的目的是测定低剂量的即5×104犬新孢子虫NCTS-8株的tachyzoite是否可以提供抗继后攻击感染的保护作用。
                 材料和方法
用HBSS，或于HBSS中的犬新孢子虫NCTS-8株的5×104tachyzoite(0.5ml)皮下接种BALB/c小鼠(7周龄，雌性)(表13)。tachyzoite的这一剂量是先前实施例中所用量的十分之一。接种后21天用与初次注射相同的材料加强免疫小鼠，加强免疫后14天用犬新孢子虫NC-1株的1×106tachyzoite攻击小鼠。
如上所述，使用IFAT检测实验中存活的小鼠的血清以确定抗犬新孢子虫抗体的存在。尸检每只小鼠以取出脑。如上所述，将一半用于组织病理学和免疫组织学研究，另一半用于酸性-胃蛋白酶消化。
                         结果
用犬新孢子虫NC-1株tachyzoite随后攻击后，一只对照小鼠(仅施用HBSS)死亡。用NC-1株的tachyzoite随后攻击后，被低剂量的犬新孢子虫NCTS-8株tachyzoite接种的小鼠中未见有死亡。仅用HBSS虚假接种的对照小鼠与经低剂量NCTS-8株接种的小鼠相比，平均损伤评分和具损伤的小鼠数目都显著要高(表14)。相互抗体滴度示于表15中。
表13：低剂量接种和攻击BALB/c小鼠的方案
  处理组   小鼠数目     接种&加强免疫     攻击
    32     5         HBSS     NC-1
    36     5  NCTS-8(5×104tachyzoite)     NC-1
表14：小鼠的平均损伤评分
    处理组 具损伤的存活小鼠数目/存活小鼠数目   平均损伤评分
  32(HBSS/NC-1)     4/4     10.25a
  36(NCTS-8/NC-1)     2/5     4.50
a＝与组36有明显不同(P＜0.05)。
表15：攻击接种前小鼠血清中相互抗体滴度
                  相互抗体滴度
    处理组 ＜50  400  800  1,600  3,200  6,400
 32(HBSS)抗-新孢子虫滴度 10    -   -     -    -    -
 36(HCTS-8)抗-新孢子虫滴度 -    3   4     3    -    -
          实施例6：含和不含佐剂的疫苗的效力
此项研究的目的是确定在经修饰的活的新孢子虫疫苗中加入佐剂的作用，以及由此得到的抗新孢子虫病的保护程度。
                         材料和方法
在先的体外结果(数据未示)表明，至少一种经修饰的活的犬新孢子虫株即NCTS-8的tachyzoite当与几种不同水包油制剂中的一种共同保温时，可在体外保留部分活力和感染性。基于这些体外结果，选择三种特殊制剂作为佐剂以作体内评价。
在第0天(初次接种)和接种后21天(加强接种)，仅用HBSS(对照)，或用于HBSS中的犬新孢子虫NCTS-8株5×105tachyzoite，或用于下列三种水包油乳剂之一的犬新孢子虫NCTS-8株的5×105tachyzoite皮下接种(0.2ml)10只15周龄的雌性BALB/c小鼠的各组。
乳剂1的组成是：(a)ME6201(5％V/V角鲨烯，0.1％V/V维生素E和0.8％V/V吐温TM80分散剂)；(b)Quil A皂草苷制品(QA)(Superfos)(200μg/ml)；和(C)胆固醇(chol.)(100μg/ml)。
乳剂2的组成是：(a)ME6201；和(b)Avridine lipoidalamine(1mg/ml)。
乳剂3的组成是ME6201(5％V/V角鲨烯，1.0％V/V维生素E和0.8％V/V吐温TM80分散剂)。
表16：试验有和无佐剂的疫苗制剂的方案
  处理组     疫苗     乳剂
    38     HBSS     无
    39     NCTS-8     无
    40     HBSS     1
    41     NCTS-8     1
    42     HBSS     2
    43     NCTS-8     2
    44     HBSS     3
    45     NCTS-8     3
接种后35天，通过皮下施用于HBSS中的犬新孢子虫NC-1株的1×106 tachyzoite(0.2ml)以攻击所有小鼠。接种后49和63天处死3至5只小鼠的各组以评价疫苗效力。
从第0天开始，基于死亡和皮毛弄皱的外表，不规则的移动、下肢麻痹和全身虚弱来评价疾病。
按下述进行组织病理学分析。在第49天得到肺样品，在10％(V/V)中性缓冲的福尔马林中固定，使用常规的组织学技术将组织切片和染色。将经苏木精和伊红染色的肺切片编码，以不知道处理组的盲试方式给损伤评分。使用下列系统给肺炎损伤评分：0＝无；1＝轻度；2＝中度；3＝显著的；4＝严重的。
                        结果
经含有犬新孢子虫NCTS-8株tachyzoite和佐剂的制剂接种的小鼠相对于仅用HBSS接种的对照小鼠(56％)相比，用犬新孢子虫NC-1株攻击后轻度肺炎的发生率(33％)显著较低(p＜0.01)。接种后9周检查时，经NCTS-8接种的未被攻击的小鼠无一显示出脑炎疾病或寄生虫的任何迹象(数据未显示)，这表明施用NCTS-8不会产生临床疾病。
结果表明，含有减毒的活的新孢子虫tachyzoite和佐剂的制剂用作抗新孢子虫病疫苗至少与不含佐剂的同一制剂一样有效和安全(表17)  。
表17：施用了含或不含佐剂的疫苗、用犬新孢子虫NC-1株攻击后，对小鼠肺组织的组织病理学分析
         处理  处理组的编号 具有肺损伤的小鼠数目/检查的小鼠数目
       对照小鼠(只用HBSS接种)     38     3/5
    40     3/4
    42     2/4
    44     2/5
 用不含佐剂的NCTS-8接种的小鼠     39     0/4
  用含佐剂的NCTS-8接种的小鼠     41     1/4
    43     0/4
    45     3/4
     实施例7：使矮小山羊免受新孢子虫病的保护作用
本研究的目的是确定给矮小山羊接种犬新孢子虫减毒的活株是否可以保护它以抗新孢子虫病。更具体地说，检测了含有犬新孢子虫NCTS-8株活的tachyzoite的疫苗保护矮雌小雌山羊以抗新孢子虫-诱导的流产的能力。
                   材料和方法
将年龄约为2-5岁的矮小雌山羊随机安排到组A-E(表18)。每个非虚假疫苗接种的剂量(组A-C)由所示株的4×106tachyzoite组成。在第0天(初次)和第21天(加强免疫)皮下接种(10ml/剂量)后，在第28和39天，使用LUTALYSETM前列腺素制品(Upjohn-Pharmacia)使雌山羊同步(10mg/山羊，肌内途径)。在第52和56天之间，通过自然交配使雌山羊受孕。用超声确定怀孕的雌山羊，当攻击发生时，雌山羊已怀孕41至55天。
通过颈静脉内注射于无血清维持培养基中的犬新孢子虫NC-1株4×106tachyzoite(0.45ml)以攻击组A-D中的雌山羊。通过超声，攻击后的7天每天量体温和每天肉眼观察两次以监测雌山羊，攻击后每周给雌山羊取一次血。
  表18：怀孕的矮小雌山羊处理组
    组 雌山羊数   疫苗株    佐剂   攻击株
    A     4   NC-1     无     NC-1
    B     5   NCTS-8     无     NC-1
    C     4   NCTS-8   乳剂2a     NC-1
    D     6   假的   乳剂2     NC-1
    E     2   假的     无     无
                       结果
接种了活的犬新孢子虫NC-1株(组A)或活的减毒的犬新孢子虫NCTS-8株(组B，C)的所有山羊在加强免疫后10天血清发生了转变并且有可测的IFAT滴度(表19)。这些数据表明NC-1和NCTS-8对于怀孕的山羊是免疫原性的。组A的GMT比组B和C的高很多，暗示与减毒的NCTS-8株相比，NC-1株宿主中的复制有所增强。
表20阐明含有活的减毒的新孢子虫tachyzoite的疫苗保护矮小雌山羊抗新孢子虫-诱导的流产的能力。被活的NC-1株接种(A)的所有4只雌山羊经NC-1攻击后都流产了(0％保护)。被虚假接种(D)的6只雌山羊中的5只经NC-1攻击后流产(17％保护)。相比之下，被NCTS-8接种(B)的5只雌山羊中仅有2只经NC-1攻击后流产(60％保护)，被含佐剂的NCTS-8接种(C)的4只雌山羊中只有2只经NC-1攻击后流产(50％保护)。
这些结果阐明，通过接种活的，减毒的犬新孢子虫NCTS-8株tachyzoite可实质性地保护怀孕的矮小雌山羊以抗新孢子虫-诱导的流产。这是首次阐明通过接种来自新孢子虫病原株的活的减毒的tachyzoite可保护怀孕的哺乳动物以抗新孢子虫诱导的流产。
表19：加强免疫后10天矮小雌山羊相互抗体滴度的几何平均值(GMT)
    组   相互抗体滴度(GMT)     范围
    A      566     200-6,400
    B      283     100-800
    C      259     100-400
    D     ＜50     ＜50
    E     ＜50     ＜50
表20：矮小山羊中由减毒活疫苗提供的抗由犬新孢子虫诱导的胎儿流产的保护作用
    组     疫苗 流产数/攻击数 保护的百分数
    A     NC-1     4/4     0
    B     NCTS-8     2/5     60
    C  含佐剂的NCTS-8     2/4     50
    D     虚假的     5/6     17
    E     怀孕对照    未攻击     n.a.
                     生物材料的保藏
下列生物材料已于1996年11月6日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD.20852，USA)，它们的入藏登记号是：
1、于MARC145猴肾细胞中的犬新孢子虫NC-1株，ATCC入藏登记号为CRL-12231。
2、于MARC145猴肾细胞中的犬新孢子虫NCTS-8株，ATCC入藏登记为CRL-12230。
上文提到的所有专利，专利申请和文献全部并入本文作参考。
本发明不局限于所述特殊实施方案的范围，该方案只欲阐明本发明单独的方面。功能上等价的组合物和方法也在本发明的范围之内。事实上，根据前述内容，对于微生物学、寄生虫学、免疫学、分子生物学，兽药学和相关领域的技术人员而言，除了本文所示和所描述的那些以外，对本发明的多种修饰是显而易见的，这种修饰意欲包括在所附权利要求的范围之内。

Claims (14)

1.得自新孢子虫(Neospora)种病原亲本株的一株的细胞培养物，该细胞与亲本株的细胞相比表现出减弱的病原性，但当作为活疫苗被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。
2.权利要求1所要求的培养物，其细胞为温度敏感型。
3.权利要求1或2所要求的培养物，其中亲本株的种是犬新孢子虫。
4.权利要求3所要求的培养物，其中犬新孢子虫的亲本株是NC-1，它存在于MARC145猴肾细胞中，ATCC入藏登记号为CRL-12231。
5.权利要求4所要求的培养物，其中减毒的细胞株是NCTS-8，它存在于MARC 145猴肾细胞中，ATCC入藏登记号为CRL-12230。
6.保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗，它含有免疫有效量的来自新孢子虫种病原亲本株的一株的活细胞和兽医学可接受的载体，所述细胞与亲本株的细胞相比表现出减弱的病原性，但当作为活疫苗被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答。
7.权利要求6所要求的疫苗，其中细胞如权利要求2至5中任一个所限定。
8.权利要求6或7所要求的疫苗，进一步含有佐剂。
9.权利要求8所要求的疫苗，其中佐剂是水包油的乳剂。
10.制备新孢子虫种减毒细胞培养物的方法，该培养物用于保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗中，所述方法包括修饰来自新孢子虫种病原亲本株的细胞；选择和克隆繁殖一或多个与亲本株细胞相比表现出减弱的病原性的经修饰细胞；并选择和克隆繁殖一或多个当在活疫苗中被施用时可激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答的减毒细胞。
11.权利要求10所要求的方法，其中细胞如权利要求2至5中任一个所限定。
12.制备保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗的方法，包括修饰来自新孢子虫种病原亲本株的细胞；选择和克隆繁殖那些与亲本株细胞相比表现出减弱的病原性，但当在活疫苗中被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答的修饰细胞；并以适于作为活疫苗给哺乳动物施用的形式将免疫有效量的减毒细胞与兽医学可接受的载体组合。
13.权利要求12所要求的方法，其中细胞如权利要求2至5中任一个所限定。
14.组合疫苗，它含有免疫有效量的来自新孢子虫种病原亲本株的一株的活细胞，该细胞与那些亲本株细胞相比表现出减弱的病原性，但当作为活疫苗被施用时能够激发保护哺乳动物抗新孢子虫病的免疫应答；一种或多种可激发保护哺乳动物抗疾病或病理状态的免疫应答的其他抗原；和兽医学可接受的载体。
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