CN104822700A - 新孢子虫属的突变株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及其中蛋白NcMIC3的功能和/或蛋白NcMIC1的功能被消除的新孢子虫属物种(Neospora spp)突变株，以及其在药物组合物中或在疫苗组合物中的用途。

Description

新孢子虫属的突变株及其用途
本发明涉及新孢子虫属物种(Neospora spp)突变株、其在药物组合物中的用途和其在疫苗组合物中的用途。
犬新孢子虫(Neospora caninum)是对新孢子虫病负有责任的细胞内寄生虫。它属于顶复门(Apicomplexa)，该门集合了大量的主要为细胞内的寄生虫。这些寄生虫对诸如新孢子虫病、弓形体病、疟疾、球虫病和隐孢子虫病的疾病负有责任。它们共同具有以多个步骤侵入宿主细胞的特殊过程，从而导致形成寄生泡，在所述寄生泡中寄生虫进行发育。
犬新孢子虫的生活史具有两个不同的阶段：在中间宿主例如小鼠、绵羊和牛中的无性阶段，其导致速殖子的产生和随后包含慢殖子的包囊的产生；和在终宿主(主要是狗)中的有性阶段，其导致包含子孢子的卵囊的产生，所述卵囊被排到粪便中。
动物的新孢子虫病在农业养殖领域中和尤其是在牛养殖中提出了重大的经济问题，在牛养殖中该疾病造成小牛增重减少、生育力下降、产乳减少，但尤其被认为是流产的主要原因之一。因此，每年在世界上，在牛存栏数中3至4千万例流产由犬新孢子虫造成。与鼠弓形体(Toxoplasma gondii)相反，该寄生虫的母-胎传播和胎儿的先天性感染不仅在妊娠过程中在初次感染的情况下发生，而且还在在妊娠之前在被慢性感染的母牛中发生。
牛的污染可以按照两条完全不同的途径来进行：
●通过水平污染，即通过摄入被由终宿主排出的卵囊所污染的食物。在妊娠的情况下，流产的风险因此为80％。
●通过垂直污染，即寄生虫从母亲至其小牛的母-胎传播。在妊娠之前被感染的母牛在随后的妊娠过程中可以要么再次流产，要么生出健康的小牛，要么最经常地将寄生虫传播给其小牛。该小牛将会被犬新孢子虫感染，并且如果它是雌性的，那么她从而将会具有高的将寄生虫传播给其后代的风险，同时具有流产的可能性。
这些后果非常显然地对于养殖业具有重大的经济影响。因此，新孢子虫病对关于在加利福尼亚的120万头奶牛的35M€的损失(Dubey,J.Am.Vet.Med.Assoc.,1999年4月15日,214(8):1160-3)、对关于在荷兰的160万头母牛的19M€的损失(Bartels等人,Vet.Parasitol.,2006年4月15日,137(1-2):17-27)和对关于在瑞士的70万头母牛的10M€(等人,Prev.Vet.Med.,2006年12月18日,77(3-4):230-53)的损失负有责任。
疫苗的开发是用于对抗新孢子虫病的主要目标。数种用于制造针对新孢子虫病的疫苗的策略目前处于研究之中：
●基于通过辐射、通过热等进行灭活的寄生虫的疫苗：这些疫苗产生保护性免疫应答，但通常需要存在佐剂和还有多次追加疫苗接种。目前，唯一的针对牛的新孢子虫病的疫苗在某些地理区域中和尤其在美国销售。它是由Intervet公司销售的疫苗该疫苗由犬新孢子虫的经灭活的速殖子和一种特殊的佐剂(Havlogene)构成。疫苗的效力(大约50％)被认为是部分的。此外，该疫苗的施用方式需要在疫苗接种的头一年期间以几周的间隔注射两次，然后在随后的年份注射一至两次。
●基于经减毒的活寄生虫的疫苗：这些株系通常要么在体外通过在诱变剂存在或不存在下在宿主细胞中培养的寄生虫的连续传代来获得，要么通过自然界中分离出毒力较弱的株系来获得，要么通过其他方法例如辐射来获得。这些疫苗通常是非常有效的但具有在分子方面未得到表征的主要缺点，并且总是让人担心回复至强毒形式。已经从以无症状方式被感染的小牛中分离出了数种分离物，例如Nc-Nowra(Miller等人,Aust.Vet.J.,2002年10月,80(10):620-5)和Nc-Spain-1H(Regidor-Cerrillo等人,Parasitology,2008年12月,135(14):1651-9)。这些减毒株的疫苗潜力正处在评价过程中。
●重组疫苗：已经在小鼠中的疫苗接种实验之中评价了表达犬新孢子虫的抗原NcSRS2的痘苗病毒(Nishikawa等人,Parasitol.Res.,2000年11月,86(11):934-9；Nishikawa等人,Vaccine,2001年1月8日,19(11-12):1381-90)，并且已经证明了其在小鼠中诱导保护性免疫应答的能力。更近来，将流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的菌株用于表达犬新孢子虫的各种不同抗原(Ramamoorthy等人,Int.J.Parasitol.,2007年11月,37(13):1531-8；和Ramamoorthy等人,Int JParasitol.,2007年11月,37(13):1521-9)。表达蛋白NcMIC1或蛋白NcGRA6的菌株有效地保护了小鼠免于犬新孢子虫感染，但提出了在牛中使用致病菌株的问题。
●由能够诱导保护性免疫应答的源自寄生虫的蛋白质组成的亚单位疫苗。这些疫苗通常不仅需要存在佐剂而且还需要存在多次追加疫苗接种，并且在经疫苗接种的个体中诱导的免疫应答方面通常不太有效。已用各种不同的抗原性蛋白质进行了数个疫苗接种试验。因此，给小鼠接种蛋白NcSRS2阻断了母-胎传播(Haldorson等人,Int.J.Parasitol.,2005年11月,35(13):1407-15)，并且与弗氏佐剂相联合地诱导了近似于由接种活的犬新孢子虫速殖子所诱导的免疫应答的免疫应答(Staska等人,Infect.Immun.,2005年3月,73(3):1321-9)。还在小鼠中用蛋白NcMIC1或NcMIC3进行了疫苗接种试验，并且证明了在感染性攻击后防止了脑感染(Cannas等人,J.Parasitol.,2003年2月,89(1):44-50；Allaedine等人,J.Parasitol.,2005年6月,91(3):657-65)。也证明了，用蛋白Nc-AMA1进行免疫接种的小鼠的抗体显著地减少了犬新孢子虫的细胞感染。
尽管在牛饲养中的严重的经济后果，但目前还没有任何有效、安全且使用简单的疫苗销售或处于开发阶段。因此，对于提供同时是针对新孢子虫病有效的、易于使用的和具有优异的无害性的疫苗存在着真正需要。
令人惊奇地，发明人发现，在犬新孢子虫的株系中，单独的蛋白NcMIC3的功能的消除或者NcMIC3和NcMIC1这两种蛋白质的功能的消除导致这样的突变株，其具有感染和免疫原特性，从而赋予哺乳动物以针对新孢子虫病的有害效应的疫苗保护。
因此，本发明的目标在于新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC3的功能和/或蛋白NcMIC1的功能被消除。
因此，本发明的目标还在于新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC3的功能被消除，尤其是通过基因ncmic3表达的抑制，和/或蛋白NcMIC1的功能被消除，尤其是通过基因ncmic1表达的抑制。
因此，本发明的目标在于新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC3的功能被消除。
因此，本发明的目标在于新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC1的功能被消除。
因此，本发明的目标在于新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC3的功能和任选地蛋白NcMIC1的功能被消除。
因此，本发明的目标在于新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC3的功能被消除，尤其是通过基因ncmic3表达的抑制，和任选地，蛋白NcMIC1的功能被消除，尤其是通过基因ncmic1表达的抑制。
蛋白质是细胞活性的效应子。蛋白质功能的消除可以产生自其生物合成的缺乏或其非功能性。该功能障碍的起源可能与在编码该蛋白质的基因的转录期间、在其翻译期间或甚至在该蛋白质的成熟过程期间(翻译后修饰)突然发生的扰乱有关。基因的缺失还说明了没有蛋白质可以被合成。
蛋白NcMIC1和NcMIC3是微线体(顶复门动物的分泌细胞器)的蛋白质，所述微线体在对宿主细胞的识别和粘附中发挥中心作用。在犬新孢子虫中，蛋白NcMIC1是由包含4个外显子的基因ncmic1所编码的具有460个氨基酸的蛋白质。NcMIC1的多肽序列包含具有20个氨基酸的信号肽，随后为串联的两个重复区域(48个氨基酸和44个氨基酸)(Keller等人,Infect Immun.2002年6月,70(6):3187-98)。
犬新孢子虫的蛋白NcMIC3由包含单个外显子的基因ncmic3所编码。该蛋白质具有362个氨基酸。
发明人已构建出了称为Neo ncmic1-3KO的犬新孢子虫突变株，其中蛋白NcMIC1的功能和蛋白NcMIC3的功能被消除；突变株Neoncmic3KO，其中仅蛋白NcMIC3的功能被消除；和突变株Neo ncmic1KO，其中仅蛋白NcMIC1的功能被消除。这三种犬新孢子虫突变株是通过毒力基因的靶向和受控的缺失或者通过毒力蛋白的功能的靶向和受控的消除而获得的犬新孢子虫的减毒活株系的首个实例。
在本发明中，“蛋白NcMIC1的功能被消除”是指要么蛋白NcMIC1的表达不存在，要么表达出了非功能性的蛋白NcMIC1，例如表达出了不具有蛋白NcMIC1的功能且与蛋白NcMIC1具有一定的氨基酸序列同一性的蛋白质。
“蛋白NcMIC3的功能被消除”是指要么NcMIC3的表达不存在，要么表达出了非功能性的蛋白NcMIC3，例如不具有蛋白NcMIC3的功能且与蛋白NcMIC3具有一定的氨基酸序列同一性的蛋白质。
蛋白NcMIC1或蛋白NcMIC3的表达的不存在可以产生自：整个基因ncmic1或ncmic3或者其编码区的缺失；或者在基因ncmic1或ncmic3的编码区中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入，其导致蛋白质的表达不存在或者表达出了与蛋白NcMIC1或NcMIC3具有很小的氨基酸序列同一性的蛋白质；或者基因ncmic1或ncmic3的启动子区或者顺式或反式调控区的功能障碍；或者一个或多个能够与所述启动子区结合的转录因子的功能障碍；或者信使RNA的翻译的功能障碍；或者本领域技术人员熟知的一些外遗传修饰。因此，“基因ncmic1或ncmic3表达的抑制”是指所有的扰乱基因ncmic1或ncmic3转录成信使RNA的机制，或者所有的扰乱信使RNA翻译成蛋白NcMIC1或NcMIC3的机制，这两个步骤对于功能性的蛋白NcMIC1或NcMIC3的合成来说是必需的。
非功能性的蛋白NcMIC1或非功能性的蛋白NcMIC3是不具有识别宿主细胞的能力或者不允许寄生虫粘附至所述宿主细胞的蛋白质。非功能性的蛋白质可以产生自在基因ncmic1或ncmic3的编码区中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入。在该特定场合下，编码区的核酸的修饰不阻断蛋白质(其可以任选地保留一定的与蛋白NcMIC1或蛋白NcMIC3的氨基酸序列同一性)的表达机制，但改变了在蛋白质翻译期间的相应的mRNA的阅读框。蛋白NcMIC3或蛋白NcMIC1的非功能性还可以是无效的或不足的翻译后修饰(即糖基化、异戊二烯化、磷酸化、硫酸化、酰胺化、乙酰化、烷基化等)的结果，所述翻译后修饰允许其确保其功能。
蛋白NcMIC3或蛋白NcMIC1的功能还可以间接地被消除，尤其是通过改变或消除一种或多种与蛋白NcMIC3或蛋白NcMIC1结合从而形成功能性复合物的其他蛋白质(尤其是其他粘附素)的表达。这样的复合物的破坏导致蛋白NcMIC3或蛋白NcMIC1的功能的丧失。
在一个特别的实施方案中，本发明涉及新孢子虫属突变株，其中仅蛋白NcMIC3的功能被消除。
发明人已发现，在犬新孢子虫中单独的蛋白NcMIC3的功能的消除使得能够显著地降低该寄生虫的体内毒力。然而，在犬新孢子虫中蛋白NcMIC3的功能和蛋白NcMIC1的功能的双重消除更进一步地加强了寄生虫毒力的减弱。
在一个特别的实施方案中，本发明涉及新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC3的功能和蛋白NcMIC1的功能被消除。
在一个特别的实施方案中，本发明涉及新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC3的功能和蛋白NcMIC1的功能通过ncmic3和ncmic1这两个基因的表达的抑制而同时被消除。
新孢子虫属物种突变株的蛋白NcMIC3的功能可以通过下列方式来消除：
-在基因ncmic3的核苷酸序列中或在调节蛋白NcMIC3表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入，或者
-由于基因ncmic3的转录而得到的信使RNA的去稳定化，或者
-基因ncmic3的信使RNA的翻译的抑制或调节蛋白NcMIC3表达的核苷酸序列的抑制。
新孢子虫属物种突变株的蛋白NcMIC1的功能可以通过下列方式来消除：
-在基因ncmic1的核苷酸序列中或在调节蛋白NcMIC1表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入，或者
-由于基因ncmic1的转录而得到的信使RNA的去稳定化，或者
-基因ncmic1的信使RNA的翻译的抑制或调节蛋白NcMIC1表达的核苷酸序列的抑制。
“一个或多个核苷酸的突变”是指核苷酸序列的一个或多个核苷酸被一个或多个在野生序列中不存在的核苷酸置换、交换或替代。“野生序列”意指在寄生虫的野生株中以天然状态存在的核苷酸序列。野生序列按照定义没有任何通过基因工程的人工干预。在本发明中，犬新孢子虫的参考野生株为株系NC1。
“一个或多个核苷酸的缺失”是指消除核苷酸序列的一个或多个核苷酸。
“一个或多个核苷酸的插入”是指在核苷酸序列中增加、添加或整合一个或多个核苷酸。
一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入可以发生在相应基因的一个或多个外显子之内并因此修饰所述基因的编码区，或者发生在一个或多个内含子之内并修饰所涉及的内含子的剪接位点。因此，剪接位点的该修饰改变了mRNA的阅读框并导致翻译出新的蛋白质，其氨基酸序列不同于所谓野生的蛋白质的序列。
“信使RNA的去稳定化”是指其半衰期(即其间信使RNA可用于允许其翻译成蛋白质的时间段)减少。信使RNA的稳定化是由顺式元件(处于基因的编码序列侧翼的5’和3’UTR序列)和反式元件(尤其是能够与顺式元件结合的蛋白质)来确保的。信使RNA的半衰期可以响应于各种各样的刺激例如环境因素、生长因子或激素而变化。顺式元件的核苷酸序列的通过基因工程在体外进行的修饰能够改变信使RNA的半衰期。
“基因的信使RNA的翻译的抑制”是指阻断信使RNA翻译成相应于其的蛋白质。在该特定场合下，基因的信使RNA存在于细胞中，而相应于其的蛋白质则不存在。基因的信使RNA的翻译的抑制可以产生自翻译机的元件(尤其是，核糖体，核糖体RNA(rRNA)或转移RNA(tRNA)，或者氨酰tRNA合成酶)的功能障碍。
在一个特别的实施方案中，本发明涉及新孢子虫属物种突变株，其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过在基因ncmic3的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除，或者
-蛋白NcMIC1的功能通过在基因ncmic1的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除。
在一个更特别的实施方案中，本发明涉及新孢子虫属物种突变株，其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过在基因ncmic3的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除，和任选地，
-蛋白NcMIC1的功能通过在基因ncmic1的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除。
这样的在基因ncmic3或基因ncmic1的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入可以导致蛋白NcMIC3或NcMIC1的表达不存在，或者导致产生与蛋白NcMIC3或NcMIC1具有或没有一定的氨基酸序列同一性的非功能性的蛋白质。
更特别地，本发明涉及新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC3的功能和蛋白NcMIC1的功能通过在基因ncmic3和ncmic1的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入而同时被消除。
在另一个特别的实施方案中，本发明涉及新孢子虫属物种突变株，其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过基因ncmic3或其启动子区的全部或部分缺失来消除，或者
-蛋白NcMIC1的功能通过基因ncmic1或其启动子区的全部或部分缺失来消除。
在另一个更特别的实施方案中，本发明涉及新孢子虫属物种突变株，其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过基因ncmic3或其启动子区的全部或部分缺失来消除，和任选地，
-蛋白NcMIC1的功能通过基因ncmic1或其启动子区的全部或部分缺失来消除。
“基因的缺失”是指消除整个基因，即内含子和外显子，或者消除基因的整个编码区，即仅外显子。“启动子区”是指位于经转录但不翻译的5’UTR区上游的核苷酸序列，其充当基因表达的调控盒。
更特别地，本发明涉及新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC3的功能通过基因ncmic3或其启动子区的全部或部分缺失来消除，和蛋白NcMIC1的功能通过基因ncmic1或其启动子区的全部或部分缺失来消除。
在另一个特别的实施方案中，本发明涉及新孢子虫属物种突变株，其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过在调节蛋白NcMIC3表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除，或者
-蛋白NcMIC1的功能通过在调节蛋白NcMIC1表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除。
在另一个更特别的实施方案中，本发明涉及新孢子虫属物种突变株，其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过在调节蛋白NcMIC3表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除，和任选地，
-蛋白NcMIC1的功能通过在调节蛋白NcMIC1表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除。
更特别地，本发明涉及新孢子虫属物种突变株，其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过在调节蛋白NcMIC3表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除，和
-蛋白NcMIC1的功能通过在调节蛋白NcMIC1表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除。
在一个特别的实施方案中，根据本发明的新孢子虫属物种突变株为犬新孢子虫的突变株。
本发明的目标还在于提供药物组合物，该药物组合物包含其中蛋白NcMIC3的功能和/或蛋白NcMIC1的功能被消除的新孢子虫属突变株。
本发明的目标还在于提供药物组合物，该药物组合物包含其中蛋白NcMIC3的功能和任选地蛋白NcMIC1的功能被消除的新孢子虫属突变株。
所述药物组合物包含上面所描述的突变株和药学上可接受的载体。
更特别地，这样的药物组合物以102至109个新孢子虫属物种突变株的速殖子的单位剂量进行施用。
更特别地，这样的药物组合物以102至109个株系Neo ncmic1-3KO的速殖子的单位剂量进行施用。
更加特别地，这样的药物组合物以103至108个，尤其是104至107个，尤其是105至106个株系Neo ncmic1-3KO的速殖子的单位剂量进行施用。
更加特别地，这样的药物组合物以102至108个，尤其是102至107个，尤其是102至106个，尤其是102至105个，尤其是102至104个，尤其是102至103个株系Neo ncmic1-3KO的速殖子的单位剂量进行施用。
更加特别地，这样的药物组合物以102、103、104、105、106、107、108或109个株系Neo ncmic1-3KO的速殖子的单位剂量进行施用。
在一个更特别的实施方案中，首次施用之后可以是可能的以后的追加施用，按照前面所指出的单位剂量。
此外，本发明的目标在于提供疫苗组合物，其包含根据本发明的新孢子虫属物种突变株和药学上可接受的载体。
这样的药物组合物或疫苗组合物可以通过肠胃外途径(静脉内、皮下、真皮内、肌内和腹膜内)或通过肠途径进行施用。
在这样的药物组合物或疫苗组合物中所包含的药学上可接受的载体的选择可以按照基于本领域技术人员的知识所考虑的施用方式来进行。
这样的药物组合物或疫苗组合物可以用于在伴侣动物例如狗和马以及农用动物例如绵羊、山羊、牛、猪、骆驼科动物和鹿科动物中治疗初次感染的、重激活的或再感染的新孢子虫病。
更特别地，这样的药物组合物或疫苗组合物可以用于在伴侣动物例如狗和马以及农用动物例如绵羊、山羊、牛、猪、骆驼科动物和鹿科动物中治疗初次感染的、重激活的或再感染的新孢子虫病，和尤其是用于防止寄生虫的母-胎传播以便减少流产数目以及母亲至其后代的垂直污染的风险。
更加特别地，这样的药物组合物或疫苗组合物可以用于在伴侣动物例如狗和马以及农用动物例如绵羊、山羊、牛、猪、骆驼科动物和鹿科动物中治疗初次感染的、重激活的或再感染的新孢子虫病，和尤其是用于防止寄生虫的母-胎传播以便减少流产数目以及在妊娠过程中(即急性感染)和在妊娠之前(即慢性感染)的感染的情况下母亲至其后代的垂直污染的风险。
本发明还涉及体外诊断方法，其使得能够区别用突变株Neoncmic1KO、Neo ncmic3KO、Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种的动物与被犬新孢子虫野生株天然地感染的动物。这些称为DIVA(Differentiating Infected from Vaccinated Animal：区别被感染的动物与经疫苗接种的动物)的诊断测试越来越多地被管理机构所要求，尤其是为了药物警戒性和流行病学研究，以及为了鉴定出在经疫苗接种的动物中突然发生的流产的可能原因。
本发明还涉及体外鉴别诊断方法，其用于区分用本发明的组合物进行疫苗接种的哺乳动物与未经疫苗接种的哺乳动物，所述方法包括下述步骤：
在所述哺乳动物的生物学样品中，
-测定抗-NcMIC1和/或抗-NcMIC3和/或抗-DHFR和/或抗-CAT-GFP抗体的浓度，和/或
-测定抗原NcMIC1和/或NcMIC3和/或DHFR和/或CAT-GFP的浓度，
-测定基因ncmic1、ncmic3、dhfr和/或cat-gfp的表达水平，和/或
-测定基因ncmic1、ncmic3、dhfr和/或cat-gfp的存在或不存在。
本发明还涉及体外鉴别诊断方法，其用于区分用本发明的组合物进行疫苗接种的哺乳动物与未经疫苗接种的哺乳动物，所述方法包括下列步骤：
在所述哺乳动物的生物学样品中，
i)测定抗-NcMIC1和/或抗-NcMIC3和/或抗-DHFR和/或抗-CAT-GFP抗体的浓度，
和/或
测定抗原NcMIC1和/或NcMIC3和/或DHFR和/或CAT-GFP的浓度，
ii)测定基因ncmic1、ncmic3、dhfr和/或cat-gfp的表达水平，
和/或
测定基因ncmic1、ncmic3、dhfr和/或cat-gfp的存在或不存在。
根据一个特别的实施方案，本发明的方法可以在选自下列的生物学样品上实施：血液和血清，以及某些组织和器官例如胎盘、脑、肌肉等。
犬新孢子虫野生株在其基因组中具有基因ncmic1和ncmic3并且表达蛋白NcMIC1和NcMIC3。
根据本发明所定义的犬新孢子虫突变株分别具有：
-基因ncmic1和选择基因dhfr，对于突变株Neo ncmic3KO；在该突变株的基因组中通过同源重组插入选择基因dhfr以代替基因ncmic3。突变株Neo ncmic3KO表达蛋白NcMIC1和DHFR而不表达蛋白NcMIC3。
-基因ncmic3和选择基因cat-gfp，对于突变株Neo ncmic1KO；在该突变株的基因组中通过同源重组插入选择基因cat-gfp以代替基因ncmic1。突变株Neo ncmic1KO表达蛋白NcMIC3和CAT-GFP而不表达蛋白NcMIC1。
-选择基因dhfr和cat-gfp，对于突变株Neo ncmic1-3KO；在该突变株的基因组中通过同源重组插入选择基因dhfr和cat-gfp以分别代替基因ncmic3和基因ncmic1。突变株Neo ncmic1-3KO表达蛋白DHFR和CAT-GFP而不表达蛋白NcMIC1和NcMIC3。
用本发明的突变株进行疫苗接种的动物与被犬新孢子虫野生株感染的动物之间的诊断可以是间接的并且基于抗体的检测和鉴定，或者是直接的并且基于用免疫学技术或分子技术来进行的感染因子的检测。
本发明还涉及用于在生物学样品(其尤其选自源自哺乳动物的血液和血清)中检示抗-NcMIC1抗体和/或抗-NcMIC3抗体和/或抗-DHFR抗体和/或抗-CAT-GFP抗体的方法，所述方法包括下列步骤：
-通过与参考生物学样品进行比较，通过免疫复合物的体外形成来测定在事先从哺乳动物中获取的生物学样品中存在的至少一种抗体的存在，所述免疫复合物由与抗-NcMIC1抗体结合的蛋白NcMIC1或者与抗-NcMIC3抗体结合的蛋白NcMIC3或者与抗-DHFR抗体结合的蛋白DHFR或者与抗-CAT-GFP抗体结合的蛋白CAT-GFP构成。
“免疫复合物”意指抗原与特异地针对该抗原的抗体之间的物理相互作用。在本发明中，该相互作用在体外在蛋白NcMIC1、NcMIC3、DHFR、CAT-GFP与特异地针对这些蛋白质中每一个的抗体之间发生。
“抗体的检测和鉴定”是指检测对于所研究的并且存在于个体血清中的抗原特异的抗体。抗体的检测通过传统的间接ELISA技术或者竞争性ELISA技术来进行。
间接ELISA技术基于在使用固定在固相支持物上的抗原。将待诊断的个体的血清放置在支持物上以产生在经固定的抗原与可能存在于待诊断的个体的血清中的抗体之间的相互作用。在洗涤之后，通过使用经标记的二抗(其特异地识别经缀合的抗物种抗体)来检示抗原-抗体相互作用。检示出针对蛋白DHFR和/或CAT-GFP的抗体使得能够表明先前用突变株对该个体进行了接种。相反地，检示出针对蛋白NcMIC1和NcMIC3的抗体表明该个体以前被犬新孢子虫野生株污染。
竞争性ELISA基于可能存在于待诊断的个体的血清中的抗体与存在于检测血清中的抗体之间的竞争。将抗原固定在固相支持物上。将待诊断的个体的血清和竞争血清放置在支持物上。检测抗体的特异性结合通过使用合适的且经标记的抗物种缀合物来检示。在待诊断的个体的血清中抗体的可能存在产生与存在于检测血清中的抗体的竞争，并且导致揭示减小。使用蛋白DHFR和/或CAT-GFP的间接ELISA使得能够表明给动物接种了本发明的突变株。使用蛋白NcMIC1和NcMIC3的间接ELISA使得能够表明动物被犬新孢子虫野生株污染。
本发明还涉及用于在生物学样品(其尤其选自源自哺乳动物的血液和血清，以及某些组织和器官例如胎盘、脑、肌肉等)中检示抗原NcMIC1和/或抗原NcMIC3和/或抗原DHFR和/或抗原CAT-GFP的方法，所述方法包括下列步骤：
-通过与参考生物学样品进行比较，通过免疫复合物的体外形成来测定在事先从哺乳动物中获取的生物学样品中至少一种抗原的存在，所述免疫复合物由与抗-NcMIC1抗体结合的蛋白NcMIC1或者与抗-NcMIC3抗体结合的蛋白NcMIC3或者与抗-DHFR抗体结合的蛋白DHFR或者与抗-CAT-GFP抗体结合的蛋白CAT-GFP构成。
在一个更特别的实施方案中，本发明涉及用于检示抗原NcMIC1和/或NcMIC3和/或DHFR和/或CAT-GFP，以及抗-NcMIC1和/或抗-NcMIC3和/或抗-DHFR和/或抗-CAT-GFP抗体的方法。
“用免疫学技术来进行的感染因子的检测”意指所有使得能够检测犬新孢子虫野生株的特异的抗原性蛋白质(即蛋白NcMIC1和NcMIC3)和本发明突变株的特异的蛋白质(即蛋白DHFR和/或CAT-GFP)的技术。
抗原性蛋白质的检测可以产生自本领域技术人员所熟知的免疫组织化学、免疫转移、具有抗原捕获的免疫酶方法(ELISA)、免疫层析法或蛋白质组学的实验。这些试验可以从各种不同的生物学样品开始来进行。
“免疫组织化学”是指通过使用特异地针对抗原且经标记的抗体来检测在经固定的组织中的抗原。使用对于蛋白DHFR和/或CAT-GFP特异的抗体的免疫组织化学使得能够表明给动物接种了本发明的突变株。使用对于蛋白NcMIC1和NcMIC3特异的抗体的免疫组织化学使得能够表明动物被犬新孢子虫野生株污染。
“免疫转移”是指在通过凝胶电泳分开样品的蛋白质并且用特异地针对抗原且经标记的抗体进行揭示后检测在生物学样品中的抗原。使用对于蛋白DHFR和/或CAT-GFP特异的抗体的免疫转移使得能够表明给动物接种了突变株。使用对于蛋白NcMIC1和NcMIC3特异的抗体的免疫转移使得能够表明动物被野生株污染。
“具有抗原捕获的免疫酶方法(ELISA)”意指通过使用特异地针对抗原且固定在固相平板上的捕获抗体来检测抗原(“夹心”类型的间接ELISA)。存在于样品中的抗原被特异性抗体捕获，然后通过经标记的二抗来揭示其存在。使用对于蛋白DHFR和/或CAT-GFP特异的抗体的ELISA使得能够表明给动物接种了本发明的突变株。使用对于蛋白NcMIC1和NcMIC3特异的抗体的ELISA使得能够表明动物被犬新孢子虫野生株污染。
“免疫层析法”意指用于基于经由亲和层析法(其中使用经标记且固定在层析柱上的对于抗原特异的抗体)的样品的纯化来检测抗原的方法。使用对于蛋白DHFR和/或CAT-GFP特异的抗体的免疫层析法使得能够表明给动物接种了本发明的突变株。使用对于蛋白NcMIC1和NcMIC3特异的抗体的免疫层析法使得能够表明动物被犬新孢子虫野生株污染。
“用分子技术来进行的感染因子的检测”意指本领域技术人员熟知用于鉴定对于野生株和突变株特异的核苷酸序列的存在的分子生物学技术，尤其是通过聚合物链式扩增反应(PCR)、实时PCR，通过经由可以与PCR方法相结合的限制性片段长度多态性(RFLP)来进行的诊断，或者通过借助于核酸探针来进行的诊断。
在一个特别的实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49或其互补序列。
      
引物名称 序列5'→3' 序列编号
ATG Ncmic1 ATGGGCCAGTCGGTGGTTTT SEQ ID NO:35
ATG Ncmic3 ATGCGTGGCGGGGCGTCCGC SEQ ID NO:36
ATG DHFR ATGCAGAAACCGGTGTGTC SEQ ID NO:37
ATG CATGFP ATGCATGAGAAAAAAATCACTG SEQ ID NO:38
stop Ncmic1 TTACAATTCAGATTCACCCG SEQ ID NO:39
stop Ncmic3 TTATCGAGCCGTTCCGCATTTG SEQ ID NO:40
stop DHFR CTAGACAGCCATCTCCATCTG SEQ ID NO:41
stop CATGFP TTAATCGAGCGGGTCCTGGT SEQ ID NO:42
Olig 1 CAGATGGAGATGGCTGTCTAG SEQ ID NO:43
Olig 2 CGCTTTCGTTCTGATTGACA SEQ ID NO:44
Olig 3 AAAACCACCGACTGGCCCAT SEQ ID NO:45
Olig 4 TCCTCTCGTTGTTGGAAGCT SEQ ID NO:46
Olig 5 TAGCACGGGAAAGGATTGAC SEQ ID NO:47
Olig 6 CAAGATCCGCCACAACATC SEQ ID NO:48
ORF CATGFP F3 TTCATCATGCCGTTTGTGAT SEQ ID NO:49
      
“寡核苷酸”意指可以在扩增方法中作为引物或者在检测方法中作为探针进行使用的核酸序列。在本发明中，所述寡核苷酸由能够与基因组DNA分子或与互补DNA杂交的具有至少15个核苷酸、优选地20个核苷酸和优选地少于30个核苷酸的序列组成。“杂交”意指在两个核酸分子之间存在的物理相互作用。该杂交可以牵涉DNA/DNA或RNA/RNA同源双链体，或者DNA/RNA异源双链体。
“核酸”意指通过磷酸二酯键相互连接的一连串核苷酸。核酸分子可以是线性的、环状的、单链的、双链的，特别是双链的。在本发明中按照本领域技术人员所熟知的惯例来描述核酸序列，即通过按照5’至3’的方向进行编号的序列来定义它们。
“互补序列”意指具有可以通过氢键在它们之间相互作用的互补核苷酸的两个核酸序列。在腺嘌呤的对面，总是存在胸腺嘧啶或尿嘧啶(在DNA/RNA异源双链体的情况下)；在胞嘧啶的对面，总是存在鸟嘌呤。作为例子但这并不限制本发明的范围，序列5’ATCG 3’和序列5’CGAT 3’是互补的。
本发明还涉及由选自下列的序列对组成的寡核苷酸对：
-SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:28，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:46，
-SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:39和SEQ IDNO:28，SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:39和SEQ IDNO:46，SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:24，
-SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:35，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:24，
-SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:45和SEQ IDNO:24，
-SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47和SEQ IDNO:24，
-SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:24，
-SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:8，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:6，
-SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:14，
-SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:14，
-SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:36和SEQ IDNO:40，SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:36和SEQ IDNO:14，SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:12，
-SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:14，
-SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:44，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:6，
-SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:14，
-SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:41，SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:6，SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:14，
-SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14，
-SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:43和SEQ IDNO:6，SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:14，
-SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:6，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:14，
-SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:30，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:42，
-SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:38和SEQ IDNO:42，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:24，
-SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:49和SEQ IDNO:42，SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:24，
-SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:42，SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:24，
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:23和SEQ IDNO:42，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24，
-SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:48和SEQ IDNO:42，SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:24，
或者其互补序列。
“寡核苷酸对”意指通过其序列定义的两个核苷酸。
本发明的另一个目标为提供由选自下列的序列三元组组成的寡核苷酸套组：
-SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:36，
-SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:16，
-SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47，
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:48，
或者其互补序列。
对于每一个三元组，前2个SEQ ID相应于引物和第三个相应于探针的序列。
“寡核苷酸套组”意指通过其各自序列定义的三个寡核苷酸的组。
犬新孢子虫野生株在其基因组中具有基因ncmic1和ncmic3。
在生物学样品中ncmic1、ncmic3、dhfr、cat-gfp这四个基因的存在和/或表达水平的分析使得能够确定动物是由于被野生株感染还是由于用在本发明中所描述的三种突变株之一进行疫苗接种而携带了犬新孢子虫株系。目的是能够建立允许在畜群内区分经疫苗接种的动物与未经疫苗接种和/或被感染的动物的鉴别诊断。
本发明还涉及至少一种由选自下列的核酸序列组成的寡核苷酸用于检测来自于犬新孢子虫野生株和/或突变株Neo ncmic1KO和/或Neo ncmic3KO和/或Neo ncmic1-3KO的基因组的基因ncmic1和/或ncmic3和/或dhfr和/或cat-gfp的用途：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或其互补序列。
在一个特别的实施方案中，本发明涉及至少一种由选自下列的序列组成的寡核苷酸作为引物以用于实施来自于犬新孢子虫野生株和/或突变株Neo ncmic3KO的基因组的基因ncmic1的杂交和任选地扩增的用途：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或其互补序列。
在一个更特别的实施方案中，本发明涉及由选自下列的至少一个序列对组成的寡核苷酸作为引物以用于实施来自于犬新孢子虫野生株和/或突变株Neo ncmic3KO的基因组的基因ncmic1的杂交和任选地扩增的用途：SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:24，或其互补序列。
在另一个特别的实施方案中，本发明涉及至少一种由选自下列的序列组成的寡核苷酸作为引物以用于实施来自于犬新孢子虫野生株和/或突变株Neo ncmic1KO的基因组的基因ncmic3的杂交和任选地扩增的用途：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40或其互补序列。
在另一个更特别的实施方案中，本发明涉及由选自下列的至少一个序列对组成的寡核苷酸作为引物以用于实施来自于犬新孢子虫野生株和/或突变株Neo ncmic1KO的基因组的基因ncmic3的杂交和任选地扩增的用途：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:14，或其互补序列。
在另外一个特别的实施方案中，本发明涉及至少一种由选自下列的序列组成的寡核苷酸作为引物以用于实施来自于犬新孢子虫突变株Neo ncmic3KO和/或Neo ncmic1-3KO的基因组的选择基因dhfr的杂交和任选地扩增的用途：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44或其互补序列。
在另外一个更特别的实施方案中，本发明涉及由选自下列的至少一个序列对组成的寡核苷酸作为引物以用于实施来自于犬新孢子虫突变株Neo ncmic3KO和/或Neo ncmic1-3KO的基因组的选择基因dhfr的杂交和任选地扩增的用途：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13，SEQID NO:11和SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:41，SEQID NO:11和SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:6，SEQID NO:5和SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10，SEQID NO:5和SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:44，SEQID NO:5和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:14，SEQ IDNO:37和SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:41，SEQ IDNO:37和SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:6，SEQ IDNO:37和SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:44，SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:14，或其互补序列。
在另外一个特别的实施方案中，本发明涉及至少一种由选自下列的序列组成的寡核苷酸作为引物以用于实施来自于犬新孢子虫突变株Neo ncmic1KO和/或Neo ncmic1-3KO的基因组的选择基因cat-gfp的杂交和任选地扩增的用途：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或其互补序列。
在另外一个更特别的实施方案中，本发明涉及由选自下列的至少一个序列对组成的寡核苷酸作为引物以用于实施来自于犬新孢子虫突变株Neo ncmic1KO和/或Neo ncmic1-3KO的基因组的选择基因cat-gfp的杂交和任选地扩增的用途：SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:24，或其互补序列。
“扩增”意指在DNA序列的混合物中特定DNA序列的浓度增加。DNA扩增技术是本领域技术人员熟知的技术。
本发明还涉及至少一种由选自下列的核酸序列组成的寡核苷酸作为探针以用于实施与来自于犬新孢子虫野生株和/或突变株Neoncmic1KO和/或Neo ncmic3KO和/或Neo ncmic1-3KO的基因组的核酸的杂交的用途：SEQ ID NO:35至42、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48或其互补序列。
本发明还涉及由选自下列的核酸序列组成的寡核苷酸的用途，所述寡核苷酸在一个末端用荧光团进行标记和任选地在另一个末端用猝灭剂进行标记：SEQ ID NO:35至42、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48或其互补序列。
“荧光团”意指在当它们被光源激发时能够发射光的分子。荧光团是本领域技术人员熟知的分子，其中最常使用的是Fam、Tet、Hex、Tamra、德克萨斯红、Cy3、Cy5。该非穷尽的列表的目的在于举例说明荧光团的概念，但在任何情况下均不应当将本发明限制在这些仅有的荧光团的使用。
“猝灭剂”意指这样的化学物种类，其能够通过能量转移、通过电子转移或通过化学机制来使在分子实体中所产生的激发态钝化。猝灭剂是本领域技术人员熟知的分子，其中最常使用的是Dabcyl、Eclipse Dark Quencher、Black Hole Quencher。荧光团也可以充当猝灭剂。为此，嫁接在5’处的荧光团的发射谱不应当与嫁接在3’处的荧光团-猝灭剂的激发谱交叠。该非穷尽的列表的目的在于举例说明猝灭剂的概念，但在任何情况下均不应当将本发明限制在这些仅有的猝灭剂的使用。
在本发明中，所使用的探针可以归属于Taqman技术、FRET(荧光共振能量转移)技术、分子信标或蝎技术或者本领域技术人员所熟知的任何其他实时PCR(或RT-PCR)技术的定义。
本发明还涉及通过从生物学样品开始进行体外扩增来检测犬新孢子虫的方法，所述方法包括下列步骤：
-使上面所定义的寡核苷酸套组与生物学样品或源自所述生物学样品的核酸相接触，这在允许所述寡核苷酸与存在于所述样品中的犬新孢子虫的核酸杂交的条件下进行，
-通过使用所述寡核苷酸作为引物来扩增犬新孢子虫的核酸，
-检测扩增产物，其表征了在样品中犬新孢子虫的存在。
根据一个特别的实施方案，本发明的检测方法可以在选自下列的生物学样品上实施：血液、血清或血浆，以及某些组织和器官例如胎盘、脑、肌肉等。
根据另一个实施方案，在所述检测犬新孢子虫的方法中，通过PCR来扩增犬新孢子虫的核酸。所述PCR可以是定性的、定量的或半定量的。根据是否使用检测探针，称之为实时PCR或传统PCR。
根据另一个更特别的实施方案，在所述检测犬新孢子虫的方法中，通过使用下列中的至少一个来检测扩增产物：具有序列SEQ ID NO:35至42、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48或其互补序列的寡核苷酸，或者任何其他的具有在从已允许目的基因片断进行扩增的引物开始而获得的扩增子序列中所包含的序列的寡核苷酸，其在一个末端用荧光团进行标记和在另一个末端用猝灭剂(作为探针)进行标记。
本发明还涉及用于从生物学样品开始对犬新孢子虫进行扩增的试剂盒，所述试剂盒包含所述寡核苷酸套组或其互补序列之一，和允许犬新孢子虫的核酸进行扩增的工具。
根据一个特别的实施方案，所述扩增试剂盒包含：
-至少一个由具有下列序列的寡核苷酸组成的寡核苷酸套组：
-SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:36，
-SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:16，
-SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47，
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:48，和
-用于扩增犬新孢子虫的核酸的工具，
-任选地，内对照。
“用于扩增核酸的工具”意指dNTPs、Taq聚合酶、盐和缓冲液(其允许实施PCR)。
“内对照”意指与犬新孢子虫的基因组无关的核酸序列(外源DNA)，允许扩增和检测该外源DNA的引物和探针。该内对照被置放在用于用以检测犬新孢子虫的PCR的混合物中，并且证明扩增的良好运行。
下面的附图和实施例旨在更进一步地举例说明本发明。
      图1：该图图解说明了用于获得株系Neo ncmic1-3KO的2个步骤的同源重组。同源重组的第一个步骤允许编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因整合到基因ncmic3的基因座处。用乙胺嘧啶来进行的选择使得能够扩增单突变株Neo ncmic3KO。如此获得的株系Neoncmic3KO用于同源重组的第二个步骤，其允许编码嵌合蛋白“氯霉素乙酰转移酶/绿色荧光蛋白”(CAT-GFP)的基因整合到基因ncmic1的基因座处。然后，用氯霉素来进行的选择使得能够扩增双突变株Neoncmic1-3KO。
      图2-A：该图是质粒pNcMic3KO-DHFR的示意图。该具有11,312个碱基对的质粒包含侧翼为与处于基因ncmic3侧翼的序列同源的区域(5HR-NcMic3和3HR-NcMic3)的选择基因DHFR、氨苄青霉素抗性基因(Amp)以及允许其线性化的限制位点Not I。
      图2-B：该图是质粒pNcMic1KO-CAT-GFP的示意图。该具有10,069个碱基对的质粒包含侧翼为与处于基因ncmic1侧翼的序列同源的区域(3HR-NcMic1和5HR-NcMic1)的选择基因CAT-GFP、氨苄青霉素抗性基因(Amp)以及允许其线性化的限制位点Kpn I。
      图3-A：该图显示了在犬新孢子虫野生株NC1中和在突变株Neoncmic3KO中分别获得的PCR产物的电泳图谱，其中使用表II中的第1、2或3号PCR引物组，其相应于SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:10。
      图3-B：该图显示了在犬新孢子虫野生株NC1中和在突变株Neoncmic3KO中分别获得的PCR产物的电泳图谱，其中使用表II中的第4、5、6或7号PCR引物组，其相应于SEQ ID NO:11至SEQ IDNO:16。
      图4-A：该图图解说明了通过免疫荧光法来进行的在犬新孢子虫野生株NC1中蛋白NcMIC3的检测的分析，其中使用特异地识别蛋白NcMIC3的抗体。在直接光下(图像A)或在荧光下(图像B)显现同一个显微镜视野。
      图4-B：该图图解说明了通过免疫荧光法来进行的在犬新孢子虫突变株Neo ncmic3KO中蛋白NcMIC3的检测的分析，其中使用特异地针对蛋白NcMIC3的抗体。在直接光下(图像A)或在荧光下(图像B)显现同一个显微镜视野。
      图5：该图显示了在犬新孢子虫野生株NC1中、在突变株Neoncmic3KO中和在突变株Neo ncmic1-3KO中分别获得的PCR产物的电泳图谱，其中使用表VII中的第1至12号PCR引物组，其相应于SEQ ID NO:7至16和SEQ ID NO:21至30。
      图6：该图图解说明了通过免疫荧光法来进行的在突变株Neoncmic3KO(图像A和B)和Neo ncmic1-3KO(图像C和D)中蛋白GFP的检测的分析，其中使用蛋白CAT-GFP的荧光特性。在直接光下(上面的图像A和C)或在荧光下(下面的图像B和D)显现同一个显微镜视野。
      图7：该图显示了通过腹膜内途径用107个犬新孢子虫野生株NC1(黑色圆圈)或突变株Neo ncmic3KO(黑色正方形)和Neo ncmic1-3KO(黑色三角形)的速殖子进行感染的雌性Balb/C小鼠的存活百分比(纵坐标)。横坐标轴表示在给小鼠注射速殖子后过去的时间(以天表示)。
      图8：该图显示了在用剂量渐增的突变株ncmic1-3KO进行疫苗接种和于疫苗接种后4个月用致死剂量的犬新孢子虫野生株NC1进行攻击之后，雌性Balb/C小鼠的存活百分比(纵坐标)。在横坐标轴上显示了六个批次的小鼠：
批次i：该批次的雌性Balb/C小鼠通过腹膜内途径用5×106个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行了疫苗接种，然后通过腹膜内途径用2×107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行了攻击。
批次ii：该批次的雌性Balb/C小鼠通过腹膜内途径用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行了疫苗接种，然后通过腹膜内途径用2×107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行了攻击。
批次iii：该批次的雌性Balb/C小鼠通过腹膜内途径用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子的第一剂量，随后在一个月后用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子的第二剂量进行了疫苗接种，然后通过腹膜内途径用2×107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行了攻击。
批次iv：该批次的雌性Balb/C小鼠通过腹膜内途径用5×107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行了疫苗接种，然后通过腹膜内途径用2×107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行了攻击。
批次v：该批次的雌性Balb/C小鼠通过腹膜内途径用108个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行了疫苗接种，然后通过腹膜内途径用2×107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行了攻击。
批次vi：该批次的雌性Balb/C小鼠未用突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种，但是通过腹膜内途径用2×107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行了攻击。
      图9：该图图解说明了在本发明中用于检测在犬新孢子虫野生株和/或突变株Neo ncmic1KO和/或Neo ncmic3KO和/或Neo ncmic1-3KO中ncmic3、dhfr、ncmic1、cat-gfp这四个基因的存在的核酸引物的位置。数字表示在本申请中所定义的引物序列的编号。
      图10：该图显示了为了测定在事先用Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种了30天或未经疫苗接种的小鼠的血清中存在的抗犬新孢子虫IgG抗体的含量而实施的ELISA测试的结果(405nm处的光密度，在纵坐标上)。在横坐标轴上显示了四个批次的小鼠：
批次i：该批次的雌性小鼠用突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行了疫苗接种。
批次ii：该批次的雌性小鼠未进行疫苗接种，并因此对于新孢子虫病来说是免疫上幼稚的。
T+：被犬新孢子虫感染并且在其血清中具有抗犬新孢子虫IgG抗体的小鼠。该小鼠用作阳性对照。
T-：在其血清中不具有抗犬新孢子虫IgG抗体的免疫上幼稚的小鼠。该小鼠用作阴性对照。
      图11：该图显示了为了测定在事先用株系Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种了30天(在该分析中包括12只小鼠)或未经疫苗接种(在该分析中包括2只小鼠)的小鼠的血清中存在的抗犬新孢子虫IgG1抗体(深灰色直方图)和IgG2A抗体(浅灰色直方图)的含量而实施的ELISA测试的结果(405nm处的光密度，在纵坐标上)。在横坐标轴上显示了两个批次的小鼠：
批次i：该批次的雌性小鼠用突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行了疫苗接种。
批次ii：该批次的雌性小鼠未进行疫苗接种，并因此对于新孢子虫病来说是免疫上幼稚的。
      图12-A：该图显示了从J-5至接种后J14(横坐标)，母羊的以摄氏度表示的平均直肠温度(纵坐标)的演变。在该图中显示了四个批次：
批次i(不连续的灰色曲线－灰色圆形)：该批次的母羊未用突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种但已受孕，然后在妊娠中期通过皮下途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击。
批次ii(连续的黑色曲线－黑色正方形)：该批次的母羊通过皮下途径用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子的第一剂量，随后在一个月后用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子的第二剂量进行了疫苗接种。在首次疫苗接种后2个月使母羊受孕，然后在妊娠中期通过皮下途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击。
批次iii(连续的灰色曲线－灰色三角形)：该批次的母羊通过皮下途径用108个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子的剂量进行了疫苗接种。在疫苗接种后2个月使母羊受孕，然后在妊娠中期通过皮下途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击。
批次iv(不连续的黑色曲线–黑色叉号)：该批次的母羊既未用突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种，也未用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击。使它们在与批次(i)、(ii)和(iii)的母羊相同的时间受孕。
      图12-B：该图显示了从J-1至攻击后J9(横坐标)，母羊的以摄氏度表示的平均直肠温度(纵坐标)的演变。在该图中显示了四个批次：
批次i(不连续的灰色曲线－灰色圆形)：该批次的母羊未用突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种但已受孕，然后在妊娠中期通过皮下途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击。
批次ii(连续的黑色曲线－黑色正方形)：该批次的母羊通过皮下途径用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子的第一剂量，随后在一个月后用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子的第二剂量进行了疫苗接种。在首次疫苗接种后2个月使母羊受孕，然后在妊娠中期通过皮下途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击。
批次iii(连续的灰色曲线－灰色三角形)：该批次的母羊通过皮下途径用108个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子的剂量进行了疫苗接种。在疫苗接种后2个月使母羊受孕，然后在妊娠中期通过皮下途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击。
批次iv(不连续的黑色曲线–黑色叉号)：该批次的母羊既未用突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种，也未用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击。使它们在与批次(i)、(ii)和(iii)的母羊相同的时间受孕。
      图13：该图显示了在批次(ii)和(iii)的疫苗接种的那天(J0)时、在批次(ii)的加强的那天(J22)时、在首次疫苗接种后57天(J57)时、在首次疫苗接种后107天(J107)时、在攻击的那天(J0Chal)时、在攻击后29天(J29Chal)时和在攻击后62天(J62Chal)时，从母羊的血清开始来进行的ELISA测试的结果的平均值(405nm处的光密度，在纵坐标上)。该图中在横坐标上显示了四个批次：
批次i：该批次的母羊未用突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种但已受孕，然后在妊娠中期通过皮下途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击。
批次ii：该批次的母羊通过皮下途径用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子的第一剂量，随后在一个月后用107个突变株Neoncmic1-3KO的速殖子的第二剂量进行了疫苗接种。在首次疫苗接种后2个月使母羊受孕，然后在妊娠中期通过皮下途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击。
批次iii：该批次的母羊通过皮下途径用108个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子的剂量进行了疫苗接种。在疫苗接种后2个月使母羊受孕，然后在妊娠中期通过皮下途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击。
批次iv：该批次的母羊既未用突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种，也未用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击。使它们在与批次(i)、(ii)和(iii)的母羊相同的时间受孕。
      图14：该图显示了分别从被犬新孢子虫感染的小鼠的脑开始或从用株系Neo ncmic3KO进行疫苗接种的小鼠的脑开始而获得的PCR产物的电泳图谱，其中使用在表XVI中所定义的第1号(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)、第2号(SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)、第3号(SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:25)或第4号(SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:42)PCR引物组。
实施例
为了制备对于基因ncmic1和ncmic3而言被无效的犬新孢子株系，进行了两个步骤的同源重组。同源重组的第一个步骤允许获得单突变体KO(株系Neo ncmic3KO)。同源重组的第二个步骤在株系Neoncmic3KO中进行以获得双缺失株系(Neo ncmic1-3KO)(图1)。
实施例1：突变株Neo ncmic3KO的构建
在增殖期期间犬新孢子虫的基因组的单倍性使得能够在单次同源重组中使基因无效。
所有所使用的犬新孢子虫株系NC1的速殖子在人成纤维细胞(HFF)中产生，所述人成纤维细胞在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的Dulbecco基本培养基(DMEM)中进行培养。在机械裂解宿主细胞并且于25G注射器中通过3次之后，收获速殖子。
      a)质粒pNcMic3KO-DHFR的构建
质粒pNcMic3KO-DHFR(图2-A)包含选择基因DHFR(二氢叶酸还原酶)，其赋予对于乙胺嘧啶的抗性(Donald等人,PNAS,1993,90(24):11703-11707)。将选择基因DHFR置于鼠弓形体的tgdhfr启动子(tgdhfr启动子)的控制之下以允许该基因在寄生虫中表达。该异源启动子的效力先前已在犬新孢子虫中得到证明。该盒被与处于基因ncmic3侧翼的序列同源的区域(5HR-NcMic3和3HR-NcMic3)围绕。所述选择盒DHFR使得能够用乙胺嘧啶进行选择。
从犬新孢子虫株系NC1的基因组DNA开始通过PCR扩增出了基因ncmic3的5’UTR区。对于所述扩增，引物5HR NCmic3F KpnI和5HR NCmic3R ClaI(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)允许扩增出基因ncmic3的5’UTR区和产生被用于将片段5HR克隆到在质粒pT230DHFR中的选择盒DHFR上游的两个限制位点(在PCR片段的5’处的KpnI和3’处的ClaI)。
从犬新孢子虫株系NC1的基因组DNA开始通过PCR扩增出了基因ncmic3的3’UTR区。对于所述扩增，引物3HR NCmic3F XbaI和3HR NCmic3R NotI(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)允许扩增出基因ncmic3的3’UTR区和产生被用于将片段3HR克隆到在质粒pT2305HR-NcMic3-DHFR中的选择盒DHFR下游的两个限制位点(在PCR片段的5’处的XbaI和3’处的NotI)。引物的序列列出在下面的表I中。
      表I：用于整合基因ncmic3的5’UTR和3’UTR序列的引物的列表。限制位点的序列加有下划线。
      
      b)电穿孔和选择的条件
向悬浮在包含ATP(3mM)和谷胱甘肽(3mM)的电穿孔介质CYTOMIX(Van den Hoff等人,Nucleic Acid Research,6月11日,20(11):2902)中的5×107个犬新孢子虫NC1的速殖子添加50μg经纯化然后用NotI线性化的质粒pNcMic3KO-DHFR，并且在具有4mm间距的杯池中以800μL的体积在仪器BioRad上施行电穿孔(参数：2000V，50欧姆，25μF，具有两次电冲击)。
在电穿孔后，将速殖子放置在处于培养中的HFF细胞单层上。对于突变体的选择，在电穿孔后24小时更换培养基并补充以选择试剂(2μM乙胺嘧啶)。在该培养基中进行三次培养物传代。
在选择16天后，通过在96-孔平板的孔中HFF细胞的限度稀释来克隆具有抗性的寄生虫。在扩增后，寻找由寄生虫引起的裂解斑。将寄生虫移种，并且提取其基因组DNA以用于PCR分析。这些PCR分析应当确认所述转基因的整合，但还应当使得能够区别随机整合了该转基因的寄生虫与其基因ncmic3已通过同源重组而被有效消除的目的寄生虫。
      c)PCR分析
从基因组DNA开始，进行了PCR，以便：
●研究用存在于同源序列上的第1号PCR引物组(HR NCmic3F(SEQ ID NO:5)和HR NCmic3R(SEQ ID NO:6))扩增出的DNA片段的大小。在转基因随机整合的情况下，扩增出具有2163bp和3824bp的两个DNA片段；而在同源重组的情况下，仅扩增出具有3824bp的片段。在野生株的情况下，仅扩增出具有2163bp的片段。
●用第2号PCR引物组(ORF NCmic3F(SEQ ID NO:7)和ORF NCmic3R(SEQ ID NO:8))来证实基因ncmic3的存在/不存在。
●和/或，用第3号PCR引物组(ORF DHFR F(SEQ ID NO:9)和ORF DHFR R(SEQ ID NO:10))来证实盒DHFR的存在/不存在。
引物的序列和源自各种不同PCR的扩增子的大小分别列出在下面的表II和表III中。
      表II：用于用以确证突变株Neo ncmic3KO的构建的各种不同PCR的引物的列表。
      
      表III：用于确证突变株Neo ncmic3KO的构建的各种不同PCR的扩增子的大小(以碱基对表示)。
      
PCR编号 Neo ncmic3KO 犬新孢子虫(NC1)
1 3824 2163
2 - 850
3 504 -
4 - 3127
5 - 3374
6 2890 -
7 3258 -
PCR产物的电泳图谱呈现在在图3-A中。在所研究的克隆之中，某些克隆具有对于DHFR特异的条带(PCR 3)但没有对于ncmic3特异的条带(PCR 2)。对于这些克隆所进行的第1号PCR显现出对于克隆Neo ncmic3KO特异的3824bp的条带。
用新的引物组对这些目的克隆进行了新的PCR分析。这些PCR(所谓的“整合PCR”)使得能够通过使用存在于基因组上在处于基因ncmic3侧翼的序列上游或下游的一个引物和存在于选择盒(基因dhfr)或目的基因(ncmic3)中的第二个引物来确证基因的KO(图3-B)。
在图3-B中，第4和5号PCR使得能够显示在ncmic3的基因座处ncmic3的存在。第4号PCR用引物组Integ NCmic3F(SEQ ID NO:11)和ORF NCmic3R2(SEQ ID NO:12)来进行。第5号PCR用引物组Integ NCmic3R(SEQ ID NO:14)和ORF NCmic3F2(SEQID NO:15)来进行。观察到对于犬新孢子虫野生株NC1存在条带，和对于突变株Neo ncmic3KO这些条带不存在。在图3-B中，第6和7号PCR使得能够显示在ncmic3的基因座处DHFR的存在。第6号PCR用引物组Integ NCmic3(SEQ ID NO:11)和ORF DHFR R2(SEQID NO:13)来进行。第7号PCR用引物组Integ NCmic3R(SEQ IDNO:14)和ORF DHFR F2(SEQ ID NO:16)来进行。注意到对于犬新孢子虫野生株NC1不存在条带，和对于株系Neo ncmic3KO存在条带。应当注意，对于第6号PCR，在大约1000bp处存在非特异的条带。
所有的PCR结果证明，确实已经发生了同源重组，并且突变株Neo ncmic3KO确实已缺失了基因ncmic3。
      d)免疫荧光分析
进行了免疫荧光分析。在免疫荧光分析之前24小时，将5×105个寄生虫放置在包含覆盖有HFF细胞的细胞层的覆盖片的p24的孔中。
将被寄生虫感染的细胞用1X PBS洗涤2次，然后用低聚甲醛(3.7％，在1X PBS中)固定30分钟。在用1X PBS进行3次洗涤后，将细胞用Triton溶液(0.1％，在1X PBS中)进行渗透化5分钟。在用1X PBS进行3次洗涤后，用1X PBS/10％FCS的溶液实施饱和步骤30分钟。然后，将细胞与在PBS/2％FCS的溶液中稀释的一抗一起温育1小时，洗涤3次，随后与在PBS/2％FCS的溶液中稀释的二抗一起温育1小时。在用1X PBS进行2次洗涤后，用Immu-Mount将盖玻片安放在载玻片上，并且在荧光显微镜下进行观察。
所使用的一抗为使得能够检测在寄生虫中蛋白NcMIC3的表达的抗体(一抗：兔的抗-mic3抗体；和商业的二抗：Alexa594，山羊抗兔，Life technologies ref.A-11012)。
对于犬新孢子虫野生株NC1，在寄生虫的顶极处观察到红色荧光，这揭示了蛋白NcMIC3的存在(图4A)，而对于突变株Neo ncmic3KO，在寄生虫的顶极处未观察到荧光，这证明了蛋白NcMIC3的不存在(图4B)。
实施例2：突变株Neo ncmic1KO的构建
      a)质粒pNcMic1KO-CAT-GFP的构建
质粒pNcMic1KO-CAT-GFP(图2-B)包含选择盒CAT-GFP，其编码同时允许对于氯霉素的抗性(CAT)和绿色荧光(GFP：绿色荧光蛋白)的融合蛋白。将所述选择盒CAT-GFP置于鼠弓形体的α-微管蛋白启动子的控制之下以允许该基因在寄生虫中表达。在所述盒的两侧，克隆了与处于基因ncmic1侧翼的序列同源的区域。
从犬新孢子虫株系NC1的基因组DNA开始通过PCR扩增出了基因ncmic1的3’UTR区。对于所述扩增，引物3HR NCmic1F KpnI和3HR NCmic1R HindIII(SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18)允许扩增出基因ncmic1的3’UTR区和产生被用于将片段3HR克隆到在质粒pT230CAT-GFP中的选择盒CAT-GFP上游的两个限制位点(在PCR片段的5’处的KpnI和3’处的HindIII)。
从犬新孢子虫株系NC1的基因组DNA开始通过PCR扩增出了基因ncmic1的5’UTR区。对于所述扩增，引物5HR NCmic1F BamHI和5HR NCmic1R NotI(SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20)允许扩增出基因ncmic1的5’UTR区和产生被用于将片段5HR克隆到在质粒pT2303HRNcMic1CAT-GFP中的选择盒CAT-GFP下游的两个限制位点(在PCR片段的5’处的BamHI和3’处的NotI)。引物的序列列出在下面的表IV中。
      表IV：用于整合基因ncmic1的5’UTR和3’UTR序列的引物的列表。限制位点的序列加有下划线。
      
      b)电穿孔和选择的条件
应当向悬浮在包含ATP(3mM)和谷胱甘肽(3mM)的电穿孔介质CYTOMIX(Van den Hoff等人,Nucleic Acid Research,6月11日,20(11):2902)中的5×107个NC1的速殖子添加50μg经纯化然后用KpnI线性化的质粒pNcMic1KO-CAT-GFP，并且应当在具有4mm间距的杯池中以800μL的体积在仪器BioRad上施行电穿孔(参数：2000V，50欧姆，25μF，具有两次电冲击)。
在电穿孔后，将速殖子放置在处于培养中的HFF细胞单层上。对于突变体的选择，将会在电穿孔后24小时更换培养基并补充以选择试剂(50μM氯霉素)。在该培养基中应当进行三次培养物传代。
在选择15天后，通过在96-孔平板的孔中HFF细胞的限度稀释来克隆具有抗性的寄生虫。在扩增后，寻找由寄生虫引起的裂解斑。将寄生虫移种，并且将会提取其基因组DNA以用于PCR分析。
      c)PCR分析
引物的序列和源自各种不同PCR的扩增子的预期大小分别列出在下面的表V和表VI中。
      表V：用于用以确证突变株Neo ncmic1KO的构建的各种不同PCR的引物的列表。
      
      表VI：用于确证突变株Neo ncmic1KO的构建的各种不同PCR的扩增子的大小(以碱基对表示)。
      
PCR编号 Neo ncmic1KO 犬新孢子虫(NC1)
1 3359 -
2 3421 -
3 - 3746
4 - 3046
5 - 449
6 472 -
实施例3：突变株Neo ncmic1-3KO的构建
      a)质粒pNcMic1KO-CAT-GFP的构建
质粒pNcMic1KO-CAT-GFP的构建描述在实施例2(2a)中。
      b)电穿孔和选择的条件
向悬浮在包含ATP(3mM)和谷胱甘肽(3mM)的电穿孔介质CYTOMIX(Van den Hoff等人,Nucleic Acid Research,6月11日,20(11):2902)中的5×107个Neo ncmic3KO的速殖子添加50μg经纯化然后用KpnI线性化的质粒pNcMic1KO-CAT-GFP，并且在具有4mm间距的杯池中以800μL的体积在仪器BioRad上施行电穿孔(参数：2000V，50欧姆，25μF，具有两次电冲击)。
在电穿孔后，将速殖子放置在处于培养中的HFF细胞单层上。对于突变体的选择，在电穿孔后24小时更换培养基并补充以选择试剂(50μM氯霉素)。在该培养基中进行三次培养物传代。
在选择15天后，通过在96-孔平板的孔中HFF细胞的限度稀释来克隆具有抗性的寄生虫。在扩增后，寻找由寄生虫引起的裂解斑。将寄生虫移种，并且提取其基因组DNA以用于PCR分析。
      c)PCR分析
引物的序列和源自各种不同PCR的扩增子的大小分别列出在下面的表VII和表VIII中。
      表VII：用于用以确证突变株Neo ncmic3KO和Neo ncmic1-3KO的构建的各种不同PCR的引物的列表。
      
      表VIII：用于确证突变株Neo ncmic3KO和Neo ncmic1-3KO的构建的各种不同PCR的扩增子的大小(以碱基对表示)。
      
PCR编号 Neo ncmic1-3KO 犬新孢子虫(NC1) Neo ncmic3KO
1 3359 - -
2 3421 - -
3 - 3746 3746
4 - 3046 3046
5 - 3127 -
6 - 3374 -
7 2890 - 2890
8 3258 - 3258
9 - 449 449
10 472 - -
11 - 850 -
12 504 - 504
在图5中，第1号PCR用引物组Integ NCmic1F(SEQ ID NO:21)和ORF CATGFP R(SEQ ID NO:22)来进行。第2号PCR用引物组ORF CATGFP F(SEQ ID NO:23)和Integ NCmic1R(SEQ ID NO:24)来进行。第3号PCR用引物组Integ NCmic1F(SEQ ID NO:21)和ORF NCmic1R(SEQ ID NO:25)来进行。第4号PCR用引物组Integ NCmic1R(SEQ ID NO:24)和ORF NCmic1F(SEQ ID NO:26)来进行。第5号PCR用引物组Integ NCmic3F(SEQ ID NO:11)和ORF NCmic3R2(SEQ ID NO:12)来进行。第6号PCR用引物组Integ NCmic3R(SEQ ID NO:14)和ORF NCmic3F2(SEQ ID NO:15)来进行。第7号PCR用引物组Integ NCmic3F(SEQ ID NO:11)和ORF DHFR R2(SEQ ID NO:13)来进行。第8号PCR用引物组Integ NCmic3R(SEQ ID NO:14)和ORF DHFR F2(SEQ ID NO:16)来进行。第9号PCR用引物组ORF NCmic1F2(SEQ ID NO:27)和ORF NCmic1R2(SEQ ID NO:28)来进行。第10号PCR用引物组ORF CATGFP F2(SEQ ID NO:29)和ORF CATGFP R2(SEQ IDNO:30)来进行。第11号PCR用引物组ORF NCmic3F(SEQ ID NO:7)和ORF NCmic3R(SEQ ID NO:8)来进行。第12号PCR用引物组ORF DHFR F(SEQ ID NO:9)和ORF DHFR R(SEQ ID NO:10)来进行。
PCR产物的电泳分析显示，株系Neo ncmic1-3KO不再具有基因ncmic1和ncmic3(孔3、4、5、6、9和11，图5)和确实具有基因dhfr和cat-gfp(孔1、2、7、8、10和12，图5)，如此确证了株系Neo ncmic1-3KO的获得。所有的PCR结果证明，确实已经发生了同源重组，并且株系Neo ncmic1-3KO确实已缺失了基因ncmic1和ncmic3。
      d)免疫荧光分析
仅通过直接观察寄生虫的荧光来进行免疫荧光分析(图6)。
在直接光下显现所述两种突变株的寄生虫(图像A和C)。在荧光下显现同一个显微镜视野。仅在插入了盒CAT-GFP之后的突变株Neo ncmic1-3KO中检测到由于重组嵌合蛋白CAT-GFP的表达而引起的绿色荧光(图像D)。相反地，不具有盒CAT-GFP的株系Neoncmic3KO不表达蛋白CAT-GFP并因此不具有荧光(图像B)。
实施例4：蛋白NcMIC3或者蛋白NcMIC1和NcMIC3的失活对于犬新孢子虫的感染特性的影响
通过于在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养的HFF细胞上进行定期传代来维持在实施例1和3中所描述的突变株Neo ncmic3KO和Neo ncmic1-3KO。由于在HFF细胞上的传代降低寄生虫的毒力(Baszler等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol,2000年11月,7(6):893-898；和Bartley等人,Parasitology,2006年10月,133(4):421-32)，因而将在HFF细胞上的传代次数有意识地限制在20次。
一般地，在通过腹膜内途径用107个犬新孢子虫株系NC1的速殖子进行感染后8至11天，60至80％的雌性Balb/C小鼠死亡。
在具有10只雌性Balb/C小鼠的最小批次上通过腹膜内注射107个速殖子/小鼠研究了突变体Neo ncmic3KO和Neo ncmic1-3KO的毒力。在相同条件下在具有10只雌性Balb/C小鼠的批次上通过使用犬新孢子虫株系NC1来实施对照。
图7显示，70％的用107个犬新孢子虫株系NC1的速殖子进行感染的小鼠在感染后11天死亡(黑色圆形)。用突变株Neo ncmic3KO进行感染的小鼠(黑色正方形)呈现出在死亡发生方面的延迟(在感染后9天至17天，小鼠死亡)和寄生虫毒力的显著减弱(在感染后29天，30％的死亡率相对于用野生株时的70％)。此外，在用突变株Neo ncmic1-3KO进行感染的小鼠的情况下(黑色三角形)，在感染后29天观察到100％的存活。
小鼠还用数量渐增的犬新孢子虫株系NC1和突变株Neo ncmic3KO和Neo ncmic1-3KO进行感染。对于引起50％的死亡率所需的剂量(LD50)为：6×106个速殖子，对于犬新孢子虫野生株NC1；和22×106个速殖子，对于株系Neo ncmic3KO。对于株系Neo ncmic1-3KO，LD50大大高于108个速殖子，即为犬新孢子虫野生株NC1的LD50的17倍。事实上，用突变株Neo ncmic1-3KO在该剂量下未观察到任何死亡发生。
实施例5：在致死性新孢子虫病的鼠类模型中株系Neo ncmic1-3KO在预防新孢子虫病方面的效力
通过于在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养的HFF细胞上进行定期传代来维持在实施例3中所描述的突变株Neo ncmic1-3KO。由于在HFF细胞上的传代降低寄生虫的毒力(Baszler等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol,2000年11月,7(6):893-898；和Bartley等人,Parasitology,2006年10月,133(4):421-32)，因而将在HFF细胞上的传代次数有意识地限制在20次。
将雌性Balb/C小鼠分成6个不同的批次：(i)通过腹膜内途径用5×106个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种的批次，(ii)通过腹膜内途径用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种的批次，(iii)通过腹膜内途径用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种并且在首次注射后1个月用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行加强的批次，(iv)通过腹膜内途径用5×107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种的批次，(v)通过腹膜内途径用108个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种的批次，和(vi)未经疫苗接种的对照批次。
在疫苗接种后四个月，通过腹膜内途径用2×107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子对所有小鼠进行攻击。通过于在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养的HFF细胞上进行定期传代来维持犬新孢子虫野生株NC1。由于在HFF细胞上的传代降低寄生虫的毒力(Baszler等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol,2000年11月,7(6):893-898；和Bartley等人,Parasitology,2006年10月,133(4):421-32)，因而将在HFF细胞上的传代次数有意识地限制在20次。用于攻击的剂量对于在经攻击的小鼠中引起100％的死亡率来说是足够的。然后，在一个月的持续时间期间，监测小鼠的存活。
图8显示，批次(i)至(iv)的经疫苗接种的小鼠完全受到保护而免于被强毒的犬新孢子虫野生株NC1再感染，所述强毒的犬新孢子虫野生株NC1在对照批次(vi)的小鼠中引起100％的死亡率，这些对照批次(vi)的小鼠在攻击后第6天全部死亡。用最高剂量的株系Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种的小鼠(批次(v))具有中间的死亡率(50％)。与对照批次(vi)的小鼠相反，该批次的小鼠的死亡发生更早地出现(平均4.5天)。该观察结果可以通过在攻击时由该组小鼠所产生的强烈的炎症反应来解释。
实施例6：在先天性新孢子虫病的鼠类模型中突变株Neo ncmic1-3KO在预防新孢子虫病方面的效力–实验1
通过于在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养的HFF细胞上进行定期传代来维持在实施例3中所描述的突变株Neo ncmic1-3KO。由于在HFF细胞上的传代降低寄生虫的毒力(Baszler等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol,2000年11月,7(6):893-898；和Bartley等人,Parasitology,2006年10月,133(4):421-32)，因而将在HFF细胞上的传代次数有意识地限制在20次。
将雌性OF1小鼠分成2个不同的批次：(i)通过腹膜内途径用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种的批次，(ii)未经疫苗接种的对照批次。
在疫苗接种后两个月，按照“三只雌性小鼠/一只雄性小鼠”将所述小鼠分配给雄鼠(J0)。通过称重来诊断妊娠小鼠，并且使它们在妊娠的第二天经历通过腹膜内途径用2×106个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子来进行的感染性攻击。通过于在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养的HFF细胞上进行定期传代来维持犬新孢子虫野生株NC1。由于在HFF细胞上的传代降低寄生虫的毒力(Baszler等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol,2000年11月,7(6):893-898；和Bartley等人,Parasitology,2006年10月,133(4):421-32)，因而将在HFF细胞上的传代次数有意识地限制在20次。
在产崽前一天，处死雌性小鼠。分离出胎盘和胎儿，并且提取DNA。从犬新孢子虫的基因NC5的区域开始进行嵌套式PCR(Yamage等人,J.Parasitol,1996年4月,82(2):272-9；Baszler等人,J ClinMicrobiol,1999年12月,37(12):4059-64)。对于第一次PCR，使用引物对NC5FA(SEQ ID NO:31)和NC5RA(SEQ ID NO:32)，和对于第二次PCR，使用引物对NC5FB(SEQ ID NO:33)和NC5RB(SEQ ID NO:34)。引物的序列列出在下面的表IX中。
      表IX：用于用以研究在组织中寄生虫犬新孢子虫的存在的PCR的引物的列表。
      
引物名称 序列5'→3' 序列编号 PCR编号
NC5FA CCCAGTGCGTCCAATCCTGTAAC SEQ ID NO:31 第一次
NC5RA CTCGCCAGTCAACCTACGTCTTCT SEQ ID NO:32 第一次
NC5FB TAATCTCCCCCGTCATCAGT SEQ ID NO:33 第二次
NC5RB GGGTGAACCGAGGGAGTTG SEQ ID NO:34 第二次
对于每个胎盘和胎儿，进行三次独立的PCR。当对于至少一次PCR检测到犬新孢子虫时，认为所述胎盘和胎儿是阳性的。结果呈现在下面的表X中。
      表X：在用株系Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种并用野生株NC1进行攻击的小鼠(批次(i))的胎盘和胎儿组织中犬新孢子虫的研究，相比于未经疫苗接种并用野生株NC1进行攻击的对照小鼠(批次(ii))而言。
      
这些结果证明，用减毒突变株Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种大大地减少了寄生虫的母-胎传播，因此确证了株系Neo ncmic1-3KO在内源的先天性新孢子虫病的鼠类模型中防止新孢子虫病的有害效应的效力。
实施例7：突变株Neo ncmic1-3KO在先天性新孢子虫病的绵羊模型中在预防新孢子虫病方面的效力
a)实验的展开
通过于在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养的HFF细胞上进行定期传代来维持在实施例3中所描述的突变株Neo ncmic1-3KO。由于在HFF细胞上的传代降低寄生虫的毒力(Baszler等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol,2000年11月,7(6):893-898；和Bartley等人,Parasitology,2006年10月,133(4):421-32)，因而将在HFF细胞上的传代次数有意识地限制在20次。
将对于犬新孢子虫和对于鼠弓形体来说血清阴性的Romanov母羊分成4个不同的批次：由14只未用突变株Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种并且通过皮下途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击的对照母羊组成的批次(批次i)，由15只通过皮下途径用突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种然后在首次注射后1个月通过皮下途径用107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行加强并且通过皮下途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击的母羊组成的批次(批次ii)，由14只通过皮下途径用108个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种并且通过皮下途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行攻击的母羊组成的批次(批次iii)，和由5只未用突变株Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种并且未用犬新孢子虫野生株NC1进行攻击的对照母羊组成的批次(批次iv)。
在首次疫苗接种后两个月，对母羊进行人工授精。在人工授精后3周，使其返回至公羊。然后，实施回波描记术，并且所述回波描记术使得能够诊断出：在批次(i)中，14只母羊中的14只是妊娠的；在批次(ii)中，15只母羊中的13只是妊娠的；在批次(iii)中，14只母羊中的13只是妊娠的；和在批次(iv)中，5只母羊中的4只是妊娠的。
使批次(i)、(ii)和(iii)的妊娠母羊在妊娠中期经历用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子来进行的感染性攻击。通过于在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养的HFF细胞上进行定期传代来维持犬新孢子虫野生株NC1。由于在HFF细胞上的传代降低寄生虫的毒力(Baszler等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol,2000年11月,7(6):893-898；和Bartley等人,Parasitology,2006年10月,133(4):421-32)，因而将在HFF细胞上的传代次数有意识地限制在20次。
b)免疫接种后和攻击后温度的记录
从疫苗接种前5天至疫苗接种后14天，每日记录母羊的直肠温度。批次(i)、(ii)、(iii)和(iv)的免疫接种后温度的平均值呈现在图12-A中。对照批次(iii)和(iv)的温度保持是生理性的。相反地，对于两个经疫苗接种的批次，观察到热峰值(>39.5℃)。在免疫接种后5天，观察到返回至生理性温度。
在感染前那一天和在随后的天期间，每日记录直肠温度。批次(i)、(ii)、(iii)和(iv)的感染后温度的平均值呈现在图12-B中。对照批次(iv)的温度保持是生理性的。相反地，对于经疫苗接种的批次(i)、(ii)和(iii)，观察到热峰值。对于仅进行感染的对照批次(批次(i))，发热性峰值持续了3天，其中在J3具有40℃的最大值。对于经疫苗接种的批次(ii)和(iii)，发热性峰值从J2起出现，仅持续了两天，并且不太强烈(39.5℃)。
c)体液免疫应答的分析
在免疫接种后和在攻击后，通过经由ELISA评价在批次(i)、(ii)、(iii)和(iv)的母羊的血清中抗犬新孢子虫的特异性IgG的出现的动力学，研究了免疫应答。在免疫接种前(J0)，然后在疫苗接种后J22、J57和J107，和最后在攻击后(J0Chal、J29Chal、J62Chal)，抽取血清。在颈静脉处抽取血液，并且让抽取物在4℃下放置过夜以允许形成血凝块。通过将抽取物在5000g下离心10分钟来回收血清。回收上清液并贮存于-20℃。
为了分析在疫苗接种后所诱导的体液免疫应答，制备了犬新孢子虫的提取物。对于该总寄生虫提取物的制备，将株系NC-1的速殖子进行洗涤，在冰中以60瓦特/秒进行超声处理两次(10分钟)，并且在+4℃下以2000g离心30分钟。回收上清液，并且通过使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准的BCA测定法来测定浓度。将等分试样贮存于-80℃直至使用。
将株系NC1的总寄生虫提取物稀释在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中以获得10μg/mL的最终浓度。然后，用洗涤缓冲液(1X PBS–0.05％Tween 20)洗涤平板三次，随后在37℃下用补充有4％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的1X PBS–0.05％Tween 20溶液饱和1小时30分钟。然后，去除介质。将待检测的血清在1X PBS–0.05％Tween 20溶液中稀释至1/50，并且以两次重复放置在孔中。在37℃下温育一小时和新的一系列洗涤之后，按照100μL/孔放置与碱性磷酸酶相偶联并稀释至1/5000的抗绵羊IgG二抗(Jackson ImmunoResearch713-055_147，驴抗绵羊IgG)。在这之后，将样品在37℃下温育一小时。在新的一系列三次洗涤之后，通过在每个孔中添加100μL的在DEA-HCl缓冲液中的1mg/mL的对硝基苯酚磷酸酯二钠(PnPP)(Sigma)溶液来进行揭示。在环境温度和避光条件下温育20分钟后，借助于平板阅读器(Multiskan MCC340Wallace)来测量405nm处的吸光度。关于稀释至1/50的各种不同批次的母羊的血清的在免疫接种后J0、J22、J57和J107时和在攻击后J0、J29、J62时的ELISA测试的结果的平均值显示在图13中。
在免疫接种后，未经疫苗接种的对照批次(i)和(iv)的母羊没有发展出体液应答。相反地，批次(ii)和(iii)的母羊从J22起发展出了抗新孢子虫病的IgG应答。该IgG应答在批次(ii)的第二次疫苗接种时得到加强。然后，对于(ii)和(iii)这两个批次，它减小。
在攻击后，未经攻击的对照批次(iv)的母羊没有发展出体液应答。相反地，批次(i)、(ii)和(iii)的母羊发展出了抗新孢子虫病的IgG应答。经疫苗接种的批次(ii)和(iii)的体液应答比关于未经疫苗接种的批次(i)的体液应答更快速。
d)流产的研究
在攻击后，每日对母羊进行监测直至产崽，并且记录流产和死产。
在下面的表XV中举例说明了该研究的结果。
      
这些结果证明，用减毒突变株Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种大大地减少了反刍动物(尤其是绵羊)被犬新孢子虫感染的有害效应。
实施例8：在用株系Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种后体液免疫应答的分析
通过于在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养的HFF细胞上进行定期传代来维持在实施例3中所描述的突变株Neo ncmic1-3KO。由于在HFF细胞上的传代降低寄生虫的毒力(Baszler等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol,2000年11月,7(6):893-898；和Bartley等人,Parasitology,2006年10月,133(4):421-32)，因而将在HFF细胞上的传代次数有意识地限制在20次。
将雌性OF1小鼠分成2个不同的批次：(i)通过腹膜内途径用5×107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种的批次，(ii)未经疫苗接种但经攻击的对照批次。
在疫苗接种后一个月，进行颌下血液抽取。将全血在37℃下贮存2小时，然后在5000g下离心10分钟以便保留血清。将血清贮存于-20℃直至使用。
为了分析在疫苗接种后所诱导的体液免疫应答，制备了犬新孢子虫的提取物。对于该总寄生虫提取物的制备，将株系NC-1的速殖子进行洗涤，在冰中以60瓦特/秒进行超声处理两次(10分钟)，并且在+4℃下以2000g离心30分钟。回收上清液，并且通过使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准的BCA测定法来测定浓度。将等分试样贮存于-80℃直至使用。
从用突变株Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种的小鼠和未经疫苗接种的小鼠的血清开始，进行ELISA测试以便表征由突变株Neoncmic1-3KO所诱导的体液免疫应答。
a)对于犬新孢子虫特异的总IgG的研究
将株系NC1的总寄生虫提取物稀释在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中以获得10μg/mL的最终浓度。在这之后，通过在每个孔中放置100μL总犬新孢子虫提取物来将平底96-孔平板于+4℃敏化过夜。然后，用洗涤缓冲液(1X PBS–0.05％Tween 20)洗涤平板三次，随后在37℃下用补充有4％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的1X PBS–0.05％Tween 20溶液饱和1小时30分钟。然后，去除介质。将待检测的血清在1X PBS–0.05％Tween 20溶液中稀释至1/50，并且以两次重复放置在孔中。在37℃下温育一小时和新的一系列洗涤之后，按照100μL/孔放置与碱性磷酸酶相偶联并稀释至1/5000的抗小鼠IgG二抗(Sigma A3562，山羊抗小鼠IgG)。在这之后，将样品在37℃下温育一小时。在新的一系列三次洗涤之后，通过在每个孔中添加100μL的在DEA-HCl缓冲液中的1mg/mL的对硝基苯酚磷酸酯二钠(PnPP)(Sigma)溶液来进行揭示。在环境温度和避光条件下温育20分钟后，借助于平板阅读器(Multiskan MCC340Wallace)来测量405nm处的吸光度。当所获得的吸光度是用源自健康的免疫上幼稚的小鼠血清的阴性对照所获得的吸光度的2.5倍时，认为所述小鼠是经血清转变的(图10)。
与批次(ii)的未经疫苗接种的小鼠相反，批次(i)的经疫苗接种的小鼠全部呈现出血清转变。
b)抗犬新孢子虫IgG的同种型谱
将株系NC-1的总寄生虫提取物稀释在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中以获得10μg/mL的最终浓度。在这之后，通过在每个孔中放置100μL总犬新孢子虫提取物来将平底96-孔平板于+4℃敏化过夜。然后，用洗涤缓冲液(1X PBS–0.05％Tween 20)洗涤平板三次，随后在37℃下用补充有4％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的1X PBS–0.05％Tween 20溶液饱和1小时30分钟。然后，去除介质。将待检测的血清在1X PBS–0.05％Tween 20溶液中稀释至1/100，并且以两次重复放置在孔中。在37℃下温育一小时和新的一系列洗涤之后，放置二抗。按照100μL/孔放置与碱性磷酸酶相偶联并稀释至1/1000的抗-IgG1二抗(BD 557272，大鼠抗小鼠IgG1)和抗-IgG2a二抗(BD 553389，大鼠抗小鼠IgG2a)。在这之后，将样品在37℃下温育一小时。在新的一系列三次洗涤之后，通过在每个孔中添加100μL的在DEA-HCl缓冲液中的1mg/mL的对硝基苯酚磷酸酯二钠(PnPP)(Sigma)溶液来进行揭示。在环境温度和避光条件下温育20分钟后，借助于平板阅读器(Multiskan MCC340Wallace)来测量405nm处的吸光度(图11)。
批次(i)的经疫苗接种的小鼠的抗犬新孢子虫IgG优选地为IgG2A类型的，一种有利于针对犬新孢子虫的保护作用的同种型谱(Long等人,J.Parasitol,1998年4月,84(2):316-20)。
实施例9：在先天性新孢子虫病的鼠类模型中突变株Neo mic1-3KO在预防新孢子虫病方面的效力–实验2
通过于在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养的HFF细胞上进行定期传代来维持在实施例3中所描述的突变株Neo ncmic1-3KO。由于在HFF细胞上的传代降低寄生虫的毒力(Baszler等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol,2000年11月,7(6):893-898；和Bartley等人,Parasitology,2006年10月,133(4):421-32)，因而将在HFF细胞上的传代次数有意识地限制在20次。
将雌性OF1小鼠分成2个不同的批次：(i)具有11只通过腹膜内途径用5×107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种的小鼠的批次，和(ii)具有6只未经疫苗接种的对照小鼠的批次。
在疫苗接种后两个月，按照“三只雌性小鼠/一只雄性小鼠”将所述小鼠分配给雄鼠(J0)。通过称重来诊断批次(i)和(ii)的妊娠小鼠，并且使它们在妊娠的第二天经历通过腹膜内途径用2×106个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子来进行的感染性攻击。通过于在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养的HFF细胞上进行定期传代来维持犬新孢子虫野生株NC1。由于在HFF细胞上的传代降低寄生虫的毒力(Baszler等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol,2000年11月,7(6):893-898；和Bartley等人,Parasitology,2006年10月,133(4):421-32)，因而将在HFF细胞上的传代次数有意识地限制在20次。
在产崽前一天，处死雌性小鼠。分离出胎盘和胎儿，并且提取DNA。从犬新孢子虫的基因NC5的区域开始进行嵌套式PCR(Yamage等人,J.Parasitol,1996年4月,82(2):272-9；Baszler等人,J ClinMicrobiol,1999年12月,37(12):4059-64)。对于第一次PCR，使用引物对NC5FA(SEQ ID NO:31)和NC5RA(SEQ ID NO:32)，和对于第二次PCR，使用引物对NC5FB(SEQ ID NO:33)和NC5RB(SEQ ID NO:34)。引物的序列列出在下面的表XI中。
      表XI：用于用以研究在组织中寄生虫犬新孢子虫的存在的PCR的引物的列表。
      
引物名称 序列5'→3' 序列编号 PCR编号
NC5FA CCCAGTGCGTCCAATCCTGTAAC SEQ ID NO:31 第一次
NC5RA CTCGCCAGTCAACCTACGTCTTCT SEQ ID NO:32 第一次
NC5FB TAATCTCCCCCGTCATCAGT SEQ ID NO:33 第二次
NC5RB GGGTGAACCGAGGGAGTTG SEQ ID NO:34 第二次
对于每个胎盘和胎儿，进行三次独立的PCR。当对于至少一次PCR检测到犬新孢子虫时，认为所述胎盘和胎儿是阳性的。结果呈现在下面的表XII中。
      表XII：在用株系Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种并用野生株NC1进行攻击的小鼠(批次(i))的胎盘和胎儿组织中犬新孢子虫的研究，相比于未经疫苗接种并用野生株NC1进行攻击的对照小鼠(批次(ii))而言。
      
这些结果证明，用减毒突变株Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种大大地减少了寄生虫的母-胎传播，因此确证了株系Neo mic1-3KO在内源的先天性新孢子虫病的鼠类模型中防止新孢子虫病的有害效应的效力。
实施例10：在妊娠前母体被感染之后，在先天性新孢子虫病的鼠类模型中突变株Neo ncmic1-3KO在预防新孢子虫病方面的效力
通过于在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养的HFF细胞上进行定期传代来维持在实施例3中所描述的突变株Neo ncmic1-3KO。由于在HFF细胞上的传代降低寄生虫的毒力(Baszler等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol,2000年11月,7(6):893-898；和Bartley等人,Parasitology,2006年10月,133(4):421-32)，因而将在HFF细胞上的传代次数有意识地限制在20次。
将雌性OF1小鼠分成3个不同的批次：
●批次(i)：由9只通过腹膜内途径用5×106个株系NC-1的速殖子进行感染的小鼠组成的对照批次，
●批次(ii)：由9只通过腹膜内途径用5×106个野生株NC-1的速殖子进行感染然后在58天后通过腹膜内途径用5×107个株系Neoncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种的小鼠组成的批次，
●批次(iii)：由9只通过腹膜内途径用5×107个株系Neoncmic1-3KO的速殖子进行疫苗接种然后在58天后通过腹膜内途径用5×106个野生株NC-1的速殖子进行感染的小鼠组成的批次。
在实验开始后107天，按照“3只雌性小鼠/1只雄性小鼠”将所述小鼠分配给雄鼠。通过称重来诊断妊娠小鼠。
在妊娠的18天时，即理论产崽前一天，处死雌性小鼠。分离出胎儿，并且提取DNA。
从犬新孢子虫的基因NC5的区域开始进行嵌套式PCR(Yamage等人,J.Parasitol,1996年4月,82(2):272-9；Bazler等人,J.Clin.Microbiol,1999年12月,37(12):4059-64)。对于第一次PCR，使用引物对NC5FA(SEQ ID NO:31)和NC5RA(SEQ ID NO:32)，和对于第二次PCR，使用引物对NC5FB(SEQ ID NO:33)和NC5RB(SEQ ID NO:34)。引物的序列列出在下面的表XIII中。
      表XIII：用于用以研究在组织中寄生虫犬新孢子虫的存在的PCR的引物的列表。
      
引物名称 序列5'→3' 序列编号 PCR编号
NC5FA CCCAGTGCGTCCAATCCTGTAAC SEQ ID NO:31 第一次
NC5RA CTCGCCAGTCAACCTACGTCTTCT SEQ ID NO:32 第一次
NC5FB TAATCTCCCCCGTCATCAGT SEQ ID NO:33 第二次
NC5RB GGGTGAACCGAGGGAGTTG SEQ ID NO:34 第二次
对于每个胎儿，进行3次独立的PCR。当对于至少一次PCR检测到犬新孢子虫时，认为所述胎儿是阳性的。结果呈现在下面的表XIV中。
      表XIV：在由在妊娠前被感染的母鼠(批次(i))、在妊娠前被感染然后进行疫苗接种的母鼠(批次(ii))和在妊娠前进行疫苗接种然后被感染的母鼠(批次(iii))所生出的幼鼠的胎盘和胎儿组织中犬新孢子虫的研究。
      
这些结果证明，当母鼠在妊娠前被感染时，用减毒突变株Neoncmic1-3KO进行疫苗接种显著地(χ2检验，p<0.05)减少了寄生虫的母-胎传播，因此确证了株系Neo ncmic1-3KO在先天性新孢子虫病的鼠类模型(母鼠在妊娠前被感染)中防止新孢子虫病的有害效应的预防和治疗效力。
实施例11：使得能够在向小鼠注射后区别疫苗株Neo mic1-3KO与野生株NC1的诊断测试
通过于在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养的HFF细胞上进行定期传代来维持在实施例3中所描述的突变株Neo ncmic1-3KO。由于在HFF细胞上的传代降低寄生虫的毒力(Baszler等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol,2000年11月,7(6):893-898；和Bartley等人,Parasitology,2006年10月,133(4):421-32)，因而将在HFF细胞上的传代次数有意识地限制在20次。
将雌性Balb/c小鼠分成2个不同的批次：
●通过腹膜内途径用5×107个突变株Neo ncmic1-3KO的速殖子进行注射的批次，
●通过腹膜内途径用107个犬新孢子虫野生株NC1的速殖子进行注射的批次。
处死小鼠。然后，取出小鼠的脑，并且借助于Potter在RPMI培养基中进行研磨。然后，将一部分研磨物放置在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中的HFF细胞上。然后，收获寄生虫，并且提取其基因组DNA。
从基因组DNA开始，进行PCR，以便：
●用第1号PCR引物组(ORF NCmic3F(SEQ ID NO:7)和ORF NCmic3R(SEQ ID NO:8))来证实基因ncmic3的存在或不存在，
●用第2号PCR引物组(ORF DHFR F(SEQ ID NO:9)和ORFDHFR R(SEQ ID NO:10))来证实盒DHFR的存在或不存在，
●用第3号PCR引物组(stop Ncmic1(SEQ ID NO:39)和ORFNCmic1R(SEQ ID NO:25))来证实基因ncmic1的存在或不存在，
●用第4号PCR引物组(ORF CATGFP F3(SEQ ID NO:49)和stop CATGFP(SEQ ID NO:42))来证实盒CATGFP的存在或不存在。
引物的序列和源自各种不同PCR的扩增子的大小分别列出在下面的表XVI和XVII中。
      表XVI：用于诊断用株系Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种的小鼠和用犬新孢子虫株系NC-1进行感染的小鼠的引物的列表。
      
      表XVII：从各种不同PCR获得的扩增子的大小(以碱基对表示)，所述PCR允许在用株系Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种的小鼠与用犬新孢子虫株系NC-1进行感染的小鼠之间的鉴别诊断。
      
PCR编号 Neo ncmic1-3KO 犬新孢子虫(NC-1)
1 - 850
2 504 -
3 - 716
4 875 -
从源自经疫苗接种的小鼠的样品开始通过PCR获得的扩增子和从源自用株系NC-1进行攻击的小鼠的样品开始获得的扩增子(图14)与所预期的图谱相一致，并且证明：
●对于源自用突变株Neo ncmic1-3KO进行疫苗接种的小鼠的样品，不存在基因ncmic3和ncmic1并且存在盒DHFR和CATGFP，
●对于源自用犬新孢子虫株系NC-1感染的小鼠的样品，存在基因ncmic3和ncmic1并且不存在盒DHFR和CATGFP。
这些结果确认了区别经疫苗接种的动物与被感染的动物的可能性。

Claims (13)

1.新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC3的功能和任选地蛋白NcMIC1的功能被消除。
2.根据权利要求1的新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC3的功能和蛋白NcMIC1的功能被消除。
3.根据权利要求1或2中任一项的新孢子虫属物种突变株，其中蛋白NcMIC3的功能通过下列方式来消除：
-在基因ncmic3的核苷酸序列中或在调节蛋白NcMIC3表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入，或者
-由于基因ncmic3的转录而得到的信使RNA的去稳定化，或者
-基因ncmic3的信使RNA的翻译的抑制或调节蛋白NcMIC3表达的核苷酸序列的抑制。
4.根据权利要求1至3中任一项的新孢子虫属物种突变株，其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过在基因ncmic3的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除，和任选地，
-蛋白NcMIC1的功能通过在基因ncmic1的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除。
5.根据权利要求4的新孢子虫属物种突变株，其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过在基因ncmic3的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除，和
-蛋白NcMIC1的功能通过在基因ncmic1的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除。
6.根据权利要求4的新孢子虫属物种突变株，其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过基因ncmic3或其启动子区的全部或部分缺失来消除，和任选地，
-蛋白NcMIC1的功能通过基因ncmic1或其启动子区的全部或部分缺失来消除。
7.根据权利要求6的新孢子虫属物种突变株，其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过基因ncmic3或其启动子区的全部或部分缺失来消除，和
-蛋白NcMIC1的功能通过基因ncmic1或其启动子区的全部或部分缺失来消除。
8.根据权利要求1至3中任一项的新孢子虫属物种突变株，
其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过在调节蛋白NcMIC3表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除，和任选地，
-蛋白NcMIC1的功能通过在调节蛋白NcMIC1表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除，
和尤其是，其中：
-蛋白NcMIC3的功能通过在调节蛋白NcMIC3表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除，和
-蛋白NcMIC1的功能通过在调节蛋白NcMIC1表达的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入来消除。
9.根据权利要求1至8中任一项的新孢子虫属物种突变株，所述突变株为犬新孢子虫的突变株。
10.药物组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项的突变株和药学上可接受的载体。
11.根据权利要求10的药物组合物，其以102至109个根据权利要求1至9中任一项所定义的突变株的速殖子的单位剂量进行施用。
12.疫苗组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所定义的突变株和药学上可接受的载体，所述疫苗组合物用于在伴侣动物例如狗和马以及农用动物例如绵羊、山羊、牛、猪、骆驼科动物和鹿科动物中治疗新孢子虫病。
13.体外鉴别诊断方法，其用于区分用根据权利要求10至12所定义的组合物进行疫苗接种的哺乳动物与未经疫苗接种的哺乳动物，所述方法包括下列步骤：
在所述哺乳动物的生物学样品中，
i)测定抗-NcMIC1和/或抗-NcMIC3和/或抗-DHFR和/或抗-CAT-GFP抗体的浓度，
和/或
测定抗原NcMIC1和/或NcMIC3和/或DHFR和/或CAT-GFP的浓度，
ii)测定基因ncmic1、ncmic3、dhfr和/或cat-gfp的表达水平，
和/或
测定基因ncmic1、ncmic3、dhfr和/或cat-gfp的存在或不存在。
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