KR101322228B1 - 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 백신 - Google Patents
넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 백신 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101322228B1 KR101322228B1 KR1020120047698A KR20120047698A KR101322228B1 KR 101322228 B1 KR101322228 B1 KR 101322228B1 KR 1020120047698 A KR1020120047698 A KR 1020120047698A KR 20120047698 A KR20120047698 A KR 20120047698A KR 101322228 B1 KR101322228 B1 KR 101322228B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- vaccine
- virus
- flounder
- vhs2010
- vhs
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 83
- 241000269979 Paralichthys olivaceus Species 0.000 title claims description 12
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 4
- 208000001449 Viral Hemorrhagic Septicemia Diseases 0.000 title abstract description 52
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 99
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 241000269978 Pleuronectiformes Species 0.000 claims abstract 5
- 241000269908 Platichthys flesus Species 0.000 claims description 43
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 32
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 31
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 12
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 11
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 claims description 11
- 241000269980 Pleuronectidae Species 0.000 claims description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 abstract description 3
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 6
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GXCDLJXPZVCHBX-UHFFFAOYSA-N 3-methylpent-1-yn-3-yl carbamate Chemical compound CCC(C)(C#C)OC(N)=O GXCDLJXPZVCHBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 5
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 5
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 5
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 5
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 241000701372 Iridovirus Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000711825 Viral hemorrhagic septicemia virus Species 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 210000002816 gill Anatomy 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 206010060954 Abdominal Hernia Diseases 0.000 description 1
- 206010000060 Abdominal distension Diseases 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000004172 Cathepsin L Human genes 0.000 description 1
- 108090000624 Cathepsin L Proteins 0.000 description 1
- ULBXWWGWDPVHAO-UHFFFAOYSA-N Chlorbufam Chemical compound C#CC(C)OC(=O)NC1=CC=CC(Cl)=C1 ULBXWWGWDPVHAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000148627 Hirame novirhabdovirus Species 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001082065 Homo sapiens Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100027355 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000008791 Lysozyme C Human genes 0.000 description 1
- 108050000633 Lysozyme C Proteins 0.000 description 1
- 241000191938 Micrococcus luteus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241001112535 Novirhabdovirus Species 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 description 1
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000007938 immune gene expression Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000000091 immunopotentiator Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical class OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 229940126583 recombinant protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/38—Antigens from snakes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 불활성화된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 FP-VHS2010-01(KCTC 12153BP) 항원을 포함하는 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 불활성화 백신에 관한 것으로서, 본 발명의 백신은 넙치에서 발생하는 바이러스성 출혈성 패혈증을 효과적으로 예방할 수 있으므로, 넙치의 양식 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 백신에 관한 것이다.
바이러스성 출혈성 패혈증(Viral Hemorrhagic Septicemia, VHS)은 아이트베드(Egtved)병이라 불리며, 전세계적으로 담수 및 해수 어류에 발생하여 대량 폐사를 유발하는 질병이다. 우리나라의 경우, 2001년 넙치에서 처음 보고된 이후로, 경북 및 제주 지역에서 꾸준히 확인되고 있으며, 수온이 낮아지는 늦가을부터 봄철에 걸쳐 작은 치어 뿐만 아니라 큰 어체에도 폐사를 일으켜 양식업계에 큰 손실을 끼치고 있다. 바이러스성 출혈성 패혈증은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)의 감염에 의해 발생하며, 감염된 넙치 등의 어류는 몸 색깔이 검어지고 복부 팽만과 탈장 등의 증상을 보이며, 빠르면 1주일, 늦을 경우 한달 후에 폐사하는 경향을 보이고 있어 양식어장 관리에 세심한 주의가 요구되고 있다.
바이러스성 출혈성 패혈증(VHS)의 원인바이러스는 단일가닥의 RNA 바이러스로 라브도비리데(Rhabdoviridae)과(科) 노비라브도바이러스(Novirhabdovirus)속의 외막을 가진 바이러스이다. 50~70×180~240 nm의 크기이며 바이러스 입자의 모형은 전형적인 라브도바이러스의 형태인 탄환형으로, 한쪽은 둥글며 다른 한쪽은 편평하다. 학계에서는 담수에서 분리된 VHSV의 당단백질 유전자 염기서열을 기초로 유전형으로 구분하고, 이들 유전형은 지리적 분리 유래에 따라 아메리카 타입(American type; Genogroup Ⅰ), 영국제도 타입(British Isles type; Genogroup Ⅱ), 유럽 타입(European type; Genogroup Ⅲ)의 3가지의 유전형적 구분이 일반화되어 있다. 중화항체 시험에 의거해 3개의 혈청형으로 나누고 있는데 이들 혈청형 사이에는 교차반응이 일어난다. 우리나라에서 분리된 유전형은 유전형(Genogroup) Ⅰ에 속하는 북미지역과 일본에서 분리되는 바이러스와 유사하다고 밝혀져 있다. 또한 넙치에서 분리된 VHSV는 담수어에서 분리된 그 바이러스와 유전학적인 구분은 있지만 혈청학적인 구분은 되지 않는다.
바이러스성 출혈성 패혈증은 수산동물 질병 관리법 제 2조의 수산동물전염병으로 15℃이하의 저수온기에 넙치의 폐사를 일으키는 바이러스성질병으로 폐사율이 높고 전염성이 강하기 때문에 종묘에서 검출되는 경우에는 방류를 금지하고 다른 지역으로의 이동을 제한하여 관리하고 있는 질병이다.
바이러스성 출혈성 패혈증은 일단 발병하면 빠른 속도로 전염되기 때문에, 질병의 예방이 매우 중요하지만, 사육환경 및 사육관리의 개선만으로는 질병 발생을 억제하는데 한계가 있다. 따라서 보다 근본적인 예방 대책으로서 백신의 개발이 시급한 실정이다.
현재까지 세균으로 인한 질병을 예방하기 위한 백신은 많이 개발되어 있으나, Pharmaq사의 전염성 췌장 궤양증 바이러스(IPNV)에 대한 백신과 Norvartis animal health사의 전염성 조혈기괴사증의 예방을 위한 DNA 백신인 Apex-IHN, 일본에서 이리도바이러스의 불활화백신 등을 제외하면, 어류 바이러스로 인한 질병을 예방하기 위해 상용화된 백신은 거의 없으며 국내에서도 품목허가가 된 바이러스 백신은 일본에서 수입한 이리도 바이러스 불활화 백신 1종이다. 또한, 바이러스성 출혈성 패혈증의 백신은 출혈성 패혈증 바이러스의 구조와 항원단백질에 대한 연구, 이들 기초 연구를 바탕으로 불활화 백신, 단백질 재조합 백신, 약독화 백신, DNA 백신 등에 대한 연구가 수행되고 있으나, 아직까지 안정성 및 효능이 확보된 백신은 개발된 바 없다. 이는 어류 바이러스 백신의 제조를 위한 적절한 후보 바이러스의 탐색, 백신의 효과적인 제조 및 안정성 확보 등이 매우 어려움을 보여준다.
이에 본 발명자들은 국내에서 발생한 바이러스성 출혈성 패혈증을 분석하여 백신 후보주를 선발하고, 상기 후보주를 이용하여 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증을 예방하기 위한 최적의 백신을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 불활성화 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 백신을 이용한 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 불활성화된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 FP-VHS2010-01 항원(KCTC 12153BP)을 포함하는 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 불활성화 백신을 제공한다.
본 발명은 상기 백신을 넙치에 투여하는 것을 포함하는, 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 백신은 넙치에서 발생하는 바이러스성 출혈성 패혈증을 효과적으로 예방할 수 있으므로, 넙치의 양식 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 내지 1d은 실시예 1에서 분리된 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01의 당단백질 염기서열을 종래 알려진 VHS 바이러스인 NCBI AY167587 (NBCI), FP-VHS2005-01(2005년 제주 분리), FP-VHS2010-02(2010년 포항 분리) 및 FP-VHS2011-01(2011년 제주 분리)의 당단백질 염기서열과 비교한 것이다.
도 2는 실시예 1에서 분리된 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을 다양한 농도로 다양한 크기의 넙치에 접종한 후 누적폐사율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1에서 분리된 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을 넙치에 접종한 후, 신장 조직 내 면역 유전자의 발현율을 확인한 결과이다. A는 조건 트리(condition tree)를, B는 산점도(scatter plot)를, C는 스캔 이미지를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에서 분리된 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01의 구조 단백질을 다클론 항체를 이용하여 (a) SDS-PAGE 및 (b) 웨스턴 블롯으로 분석한 사진이다. 각 도면에서 레인 M은 마커를, 레인 1은 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을 로딩한 것이다.
도 5는 실시예 1에서 분리된 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을 EPC 세포주에 접종한 후 다양한 온도에서 배양한 세포의 사진이다. A는 정상세포를, B 내지 D는 바이러스 접종 후 3일간 각각 15℃, 20℃, 및 25℃에서 배양한 세포를 나타낸다.
도 6은 실시예 1에서 분리된 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을 EPC 세포주에 접종한 후, 각각 배양 플라스크(125cm2; A) 및 롤러 배양병(850cm2; B)에서 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 각각 포르마린(A) 및 열(B)로 불활성화된 VHS 백신을 접종한 EPC 세포주를 2일간 배양한 후의 사진이다.
도 8은 백신 처리 방법 및 백신 처리시 넙치의 사육 수온에 따른 면역관련 유전자의 발현율 변화를 나타낸 사진이다. A는 고온 실험군을, B는 저온 실험군을, C는 대조군을 나타낸 것이며, A 및 B에서 레인 1 및 2는 백신침지군이고, 레인 3 및 4는 백신주사군이며, C에서 레인 1 및 2는 음성 대조군이고, 레인 3 및 4는 PBS 투여군이다.
도 9는 백신 처리 방법 및 백신 처리시 넙치의 사육 수온에 따른 공격 실험 후의 넙치의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 백신 처리 후 공격실험을 실시할 경우의 평균 누적 폐사율(A), 라이소자임 활성(B), 및 VHSV에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 백신 투여 후 넙치의 각 장기 조직을 H&E 염색으로 살펴본 사진이다.
도 2는 실시예 1에서 분리된 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을 다양한 농도로 다양한 크기의 넙치에 접종한 후 누적폐사율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1에서 분리된 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을 넙치에 접종한 후, 신장 조직 내 면역 유전자의 발현율을 확인한 결과이다. A는 조건 트리(condition tree)를, B는 산점도(scatter plot)를, C는 스캔 이미지를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에서 분리된 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01의 구조 단백질을 다클론 항체를 이용하여 (a) SDS-PAGE 및 (b) 웨스턴 블롯으로 분석한 사진이다. 각 도면에서 레인 M은 마커를, 레인 1은 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을 로딩한 것이다.
도 5는 실시예 1에서 분리된 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을 EPC 세포주에 접종한 후 다양한 온도에서 배양한 세포의 사진이다. A는 정상세포를, B 내지 D는 바이러스 접종 후 3일간 각각 15℃, 20℃, 및 25℃에서 배양한 세포를 나타낸다.
도 6은 실시예 1에서 분리된 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을 EPC 세포주에 접종한 후, 각각 배양 플라스크(125cm2; A) 및 롤러 배양병(850cm2; B)에서 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 각각 포르마린(A) 및 열(B)로 불활성화된 VHS 백신을 접종한 EPC 세포주를 2일간 배양한 후의 사진이다.
도 8은 백신 처리 방법 및 백신 처리시 넙치의 사육 수온에 따른 면역관련 유전자의 발현율 변화를 나타낸 사진이다. A는 고온 실험군을, B는 저온 실험군을, C는 대조군을 나타낸 것이며, A 및 B에서 레인 1 및 2는 백신침지군이고, 레인 3 및 4는 백신주사군이며, C에서 레인 1 및 2는 음성 대조군이고, 레인 3 및 4는 PBS 투여군이다.
도 9는 백신 처리 방법 및 백신 처리시 넙치의 사육 수온에 따른 공격 실험 후의 넙치의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 백신 처리 후 공격실험을 실시할 경우의 평균 누적 폐사율(A), 라이소자임 활성(B), 및 VHSV에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 백신 투여 후 넙치의 각 장기 조직을 H&E 염색으로 살펴본 사진이다.
본 발명은 불활성화된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 FP-VHS2010-01(KCTC 12153BP) 항원을 포함하는 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 불활성화 백신을 제공한다.
본 발명의 백신에 사용되는 바이러스성 출혈성 패혈증(VHS) 바이러스 FP-VHS2010-01은 거제의 양식장에서 넙치의 대량폐사를 일으킨 원인 바이러스로 분리된 균주로서, 종래 알려진 VHS 바이러스(GenBank에 등록된 AY 167587; 2005년 제주에서 분리된 FP-VHS2005-01; 2010년 포항에서 분리된 FP-VHS2010-02; 및 2011년 제주에서 분리된 FP-VHS2011-01)와 다른 균주임이 확인되었다(도 1a 내지 1d 참조).
상기 백신에 사용되는 균주인 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01은 넙치에 2×107TCID50/마리, 2×106TCID50/마리 및 2×105TCID50/마리의 농도로 주사되는 경우, 주사 6일째 50% 이상의 폐사율을 나타내고, 주사 2주째에는 90-100%의 폐사율을 나타내며, 이러한 폐사율은 넙치의 크기가 작을수록, 그리고 바이러스의 농도가 높을수록 증가한다. 또한, 상기 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01은 넙치에 감염시 감염되지 않은 넙치에 비해 면역 유전자를 3 내지 13배 이상 증가시킨다. 이는 상기 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01이 병원성이 매우 높은 바이러스임을 보여준다.
본 발명에 따른 백신은 당업계에 통상적으로 알려진 제조 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 방법은 백신 균주의 배양, 바이러스 균주의 분리, 바이러스의 불활성화, 및 농축 및 희석 등의 과정을 포함한다.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 상기 VHSV 백신은 최적의 조건 중 하나로서 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을 18~22℃, 바람직하게는 20℃의 온도에서 배양함으로써 수득될 수 있다. 상기 온도 조건은 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01의 최대 증식을 유도하여 본 발명의 백신 내에 항원을 증대시키는데 유리하다. 상기 바이러스의 배양을 위한 세포주로는 EPC 세포주가 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 당업계에 알려진 통상적인 세포주, 예를 들어 BF-2, RTG-2, FHM, CHSE-214 등이 사용될 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 백신은 최적의 조건 중 하나로서 상기 배양된 VHS 바이러스를 열을 이용하여 불활성화시킴으로써, 바람직하게는 50-70℃의 온도하에서 2 내지 5일간 둠으로써, 수득될 수 있다. 본 발명의 백신은 포르마린을 이용하여 VHS 바이러스를 불활성화시켜 제조될 수도 있으나, 포르마린 불활성화는 사용된 포르마린을 제거하는 추가의 공정이 필요하며 상기 불활성화된 바이러스가 세포 재배양시 독성을 나타내므로, 열을 이용하여 불활성화시키는 것이 바람직하다(도 7 참조).
한편, 본 발명의 백신은 넙치의 크기가 13~17cm일 경우 주사에 의해 접종되는 것이 바람직하다. 백신 접종 방법으로 침지법이 알려져 있으나, 침지법의 경우 면역관련 유전자의 발현 증가 및 폐사율 면에서 주사법에 비해 낮은 효율을 나타낸다. 또한, 본 발명의 백신은 처리시 저온(예를 들어 10 내지 14℃)에 비해 고온(예를 들어 18 내지 22℃)에서 접종하는 것이 유리하다. 저온에서 처리하는 경우 면역관련 유전자의 발현 증가 및 폐사율 면에서 고온에서 처리하는 경우에 비해 낮은 효율을 나타낸다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 백신은 고온/주사법에 의해 접종될 수 있다.
본 발명에 따른 불활성화 백신은 면역증강제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역증강제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 안정화제 또는 첨가제로서, 당류나 아미노산류, 광물유, 식물유, 백반, 인산알루미늄, 벤토나이트, 실리카, 무라밀디펩티드(muramyl dipeptide) 유도체, 사이모신, 인터류킨 등이 사용될 수도 있다.
본 발명에 따른 백신은 적당한 용적의, 예를 들어 약 10~500 ㎖ 부피의 바이알에 백신액을 분주한 다음, 밀봉하여 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 백신을 넙치에 투여하는 것을 포함하는, 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 방법을 제공한다. 상기 넙치는 감염의 위험성이 있는 넙치 등의 어류를 포함하다.
본 발명의 불활성화 백신을 이용하여 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증을 예방하는 방법은 본 발명의 백신을 복강내 투여 등을 이용하여 넙치에 투여하는 단계를 포함한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
VHSV
백신
후보주
선발
2010년 거제지역 넙치 양식장을 대상으로 PCR 방법 및 세포배양에 의해 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)를 검사하였다. 검사결과, 2개의 양식장에서 총 5마리의 넙치에서 5종의 VHSV가 발견되었다. 상기 5종의 VHSV에 대해 병원성 예비실험을 통해 가장 병원성이 높은 균주를 VHSV 백신을 위한 후보주로 선발하고, 이를 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01으로 명명하였다. 상기 균주를 2012년 2월 19일에 한국생명공학연구원 생물자원센터에 KCTC 12153BP로 기탁하였다.
실시예
2:
VHS
바이러스
FP
-
VHS2010
-01의 당단백질 염기서열 분석
상기 실시예 1에서 선발한 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01의 당단백질 염기서열을 분석하고, 이를 종래 알려진 VHS 바이러스(GenBank에 등록된 AY 167587; 2005년 제주에서 분리된 FP-VHS2005-01; 2010년 포항에서 분리된 FP-VHS2010-02; 및 2011년 제주에서 분리된 FP-VHS2011-01)와 비교하였다.
구체적으로, 상기 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01에 감염된 넙치의 신장 및 비장의 조직을 호모게나이저로 분쇄한 뒤 트리졸(trizol)을 이용하여 총 RNA(total RNA)를 분리하였다. 상기 분리된 총 RNA으로부터 cDNA를 합성한 후, 상기 cDNA를 주형(template)으로 하고 하기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
- VHSG-exp-F: 5'-GGATCCATGGAATGGAATACTTTTTCCTTGGTG-3' (서열번호 1);
- VHSG-exp-R: 5'-AAGCTTGACCGTCTGACTTCTGGAGAA-3' (서열번호 2)
RT-PCR은 1X PCR 완충액(20 mM Tris-hydrochloride(pH 8.4), 50 mM KCl 및 1.5 mM MgCl2), 200 uM dNTP(Bioneer, Korea), 0.2 uM 프라미머 및 2U Taq DNA 중합효소(Bioneer, Korea) 및 50 ng의 주형 cDNA를 혼합한 후, 94℃, 5분 반응 후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30회 반응시킨 다음 72℃에서 7분간 반응시켜 수행하였다. 상기 증폭된 PCR 생성물을 1X TAE(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) 완충액 상에서 1.5% 아가로스 겔에 로딩한 후, 100 V에서 15분간 전기영동하여 크기를 확인하였다. 상기 PCR 산물을 겔로부터 분리한 후 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 DNA를 pGEM-T easy 벡터(Promega, pGEM-T easy vector system, USA)에 삽입한 후, 상기 플라스미드를 JM109(Takara, Japan) 컴피턴트 세포에 열충격에 의해 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 세포를 2%(w/v) X-gal 40 ㎕, 20%(w/v) IPTG 용액 7 ㎕, 암피실린 50 ㎍/㎖이 포함된 LB 배지에 도말하여 37℃에서 18시간 배양한 후 PCR 산물 유전자가 삽입된 백색 콜로니를 선택하였다. 상기 콜로니를 50 ㎍/㎖ 암피실린(Sigma, USA)이 첨가된 LB 배지(Yeasy extract 5 g/ℓ, pancreatic digest of casein 10 g/ℓ, sodium chloride 10 g/ℓ, Difco；Miller)에서 대량 배양한 후 원심분리한 후, 플라스미드를 얻어 제한효소(EcoRI)로 절단하여 삽입된 DNA의 유무와 크기를 확인하였다. 정확한 크기를 갖는 DNA의 염기서열을 분석한 후, 2005년 제주에서 분리된 VHS 바이러스 및 2011년 제주에서 분리된 VHS 바이러스의 당단백질 염기서열과 비교하였다. 상기 비교 결과를 도 1a 내지 1d에 나타내었다. 비교 결과, VHS 바이러스 FP-VHS2010-01의 당단백질은 종래 알려진 VHS 바이러스(GenBank에 등록된 AY 167587; 2005년 제주에서 분리된 FP-VHS2005-01; 2010년 포항에서 분리된 FP-VHS2010-02; 및 2011년 제주에서 분리된 FP-VHS2011-01)와 98 내지 99%의 상동성을 나타내는 새로운 균주임이 확인되었다.
실시예
3:
VHS
바이러스
FP
-
VHS2010
-01의 병원성 분석
상기 실시예 1에서 선발한 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01의 병원성을 살펴보기 위하여, 20℃에 적응시킨 EPC 세포주(ATCC No; CRL-2872)를 25cm2 배양 플라스크에 계대배양한 다음 12시간 후 TCID 107/ml의 바이러스 용액 200μL를 접종(배지 5 mL)하여 배양하였다. 이후 하기와 같이 특성을 분석하였다.
<3-1> 바이러스 농도에 따른 병원성 실험
상기 배양한 바이러스 FP-VHS2010-01을 원심분리한 후 108 TCID50/ml로 희석하여 2×107TCID50/마리, 2×106TCID50/마리의 농도가 되도록 각각 10마리의 넙치에 복강주사법으로 인위 감염 후, 10-12℃에서 2주간 누적폐사율을 조사하였다. 상기 실험 결과, 전 실험군에서 주사 6일째 넙치의 50% 이상이 폐사하였고, 주사 2주째에는 넙치의 90-100%가 폐사하였다.
<3-2> 바이러스 농도 및 넙치 크기에 따른 병원성 실험
20g, 45g, 100g 및 200g의 특별한 이상 증상을 나타내지 않는 건강한 넙치를 각각 10마리씩 준비한 다음, 상기 실시예 <3-1>에서와 동일한 방법으로 VHS 바이러스 FP-VHS2010-1을 복강내로 인위 감염시킨 후 10-12℃에서 17일간 누적폐사율을 조사하였다. 20g 실험군에는 2×105TCID50/마리 및 1×104TCID50/마리의 농도로 주사하였고, 45g 실험군에는 4×105TCID50/마리 및 2.5×104TCID50/마리의 농도로 주사하였고, 100g 실험군에는 1×106TCID50/마리의 농도로 주사하였으며, 200g 실험군에는 2×106TCID50/마리의 농도로 주사하였다.
실험 결과, 20g 실험군(2×10TCID50 5/마리)은 1주에 50% 폐사율 및 2주에 80% 폐사율을 나타내었고, 45g 실험구(4×105TCID50/마리)은 1주에 20% 폐사율 및 2주에 60% 폐사율을 나타내었으며, 100g 실험군(1×106TCID50/마리)은 1주에 0% 폐사율 및 2주에 30% 폐사율을 나타내었고, 200g 실험군(2×106TCID50/마리)은 1주에 0% 폐사율 및 2주에 14% 폐사율을 나타내었다(도 2 참조). 상기 결과는 어체의 크기가 작을수록 바이러스의 병원성이 높음을 보여준다.
한편, 바이러스의 농도를 달리하여 실험한, 20g 실험군(1×104TCID50/마리)은 1주에 20% 폐사율 및 2주에 50% 폐사율을 나타내었고, 45g 실험군(2.5×104TCID50/마리)은 1주에 0% 및 2주에 20%의 폐사율을 나타내어, 바이러스의 농도가 높을수록 병원성이 높음을 알 수 있었다(도 2 참조).
<3-3>
VHS
바이러스 감염에 따른 넙치의 면역 유전자 발현율 변화 확인
실시예 1의 VHS 바이러스의 감염으로 인한 넙치의 면역 유전자 발현율 변화를 살펴보기 위하여, DNA 칩 마이크로어레이(자체 제작)을 이용하여 상기 바이러스가 감염된 넙치의 신장 조직에서의 면역 유전자의 발현 양상을 시간별로 확인하였다. 구체적으로, 12℃에서 10 cm의 넙치의 복강에 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을 접종한 후 1일 및 3일째 신장과 비장의 면역 유전자의 발현량을 대조군(정상 소견의 넙치의 신장과 비장의 면역 유전자의 발현량)과 비교하였다.
도 3의 결과로부터 바이러스 감염 1일과 3일 후에 CD83, VHSV 유도 단백질 6, CD9, 카텝신(cathepsin) L 프리프로단백질(preproprotein), 인터페론 유도성 단백질 56, 리소자임 C 전구체, IFI56 등의 발현량이 대조구에 비해 3배 내지 13배 이상 증가하는 발현 양상을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 VHS 바이러스 FP-VHS2010-1이 여러 면역 유전자의 발현을 증가시키는 고병원성 바이러스임을 보여준다.
실시예
4: 바이러스 백신 후보주의 구조 단백질 분석
상기 실시예 1에서 선발된 바이러스 균주 FP-VHS2010-01의 구조 단백질을 분석하기 위하여, 하기와 같이 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 수행하였다.
<4-1> 바이러스 분리 및 정제
바이러스를 분리 및 정제하기 위하여, 대량 배양된 바이러스액의 상징액에 7% 폴리에틸렌 글리콜(PGE-6000) 및 2.3%의 NaCl을 첨가한 다음 4℃에서 교반하면서 하룻밤동안 배양하였다. 상기 배양물을 20,000g에서 40분 동안 원심분리하여 펠렛을 얻고, 이를 소량의 TNE 완충액(0.01M Tris HCl, 0.1M NaCl, 0.001M RDTA)에 재현탁시킨 다음 15% 수크로오스 쿠션(sucrose cushion) 위에 중축하고 4℃, 115,000g에서 1시간 동안 초고속 원심 분리하여 바이러스 펠렛을 얻었다. 이를 TNE 완충용액에 재현탁하여 20, 35 및 50% 수크로오스 불연속 구배 상에서 80,000g로 1.5시간 동안 원심분리하여 20%와 35% 경계지점에 형성된 바이러스 밴드를 회수하였다. 이를 TNE 완충용액에 재현탁한 다음, 115,000g에서 1시간 동안 원심분리하여 바이러스를 정제하였다.
<4-2>
SDS
-
PAGE
FP-VHS2010-01 균주의 항원 단백질체 분석을 위하여 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 분리된 바이러스를 10분간 초음파로 분쇄한 다음, 2× 샘플 버퍼(0.12M Tris-HCl, 4% SDS, 20% glycerol, 5 mM 2-mercaptoethanol)와 1:1로 혼합하고 100℃에서 10분간 끊여서 준비하였다. 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 준비된 시료를 15 ㎕ 로딩하고 100 V에서 1시간 20분 동안 전기영동하였다. 전기영동 끝난 겔을 염료(coomassie brilliant blue R-250)로 염색하고 탈색하여 관찰하였다.
<4-3> 토끼 항체 제작
2주간 안정화한 토끼 2마리에 0주째에 본 발명의 바이러스액을 주사하였다. 4주째, 6주째 및 8주째에 동일한 바이러스액으로 1차 내지 3차 부스트(boost) 주사를 수행하였다. 이후 토끼 혈청 10 mL으로부터 단백질 A 컬럼을 이용하여 IgG를 정제하였다. 이후 항원이 결합된 친화성 컬럼을 이용하여 항원 특이적 항체를 정제하였다. 상기 정제된 항체를 투석 및 농축시켰다. 상기 정제된 항체에 FITC를 결합시키기 위하여, 항체 2 mg을 투석한 다음, FITC와 혼합하여 2시간 동안 교반하였다. 결합되지 않은 자유 FITC를 제거하기 위해 투석을 수행함으로써 FITC 결합된 항체를 수득하였다.
<4-4>
웨스턴
블롯팅
실시예 <4-2>에서 SDS 전기영동한 겔에 니트로셀룰로오소 멤브레인 페이퍼(nitrocelluolse menbrane paper, NC paper, Amersham Biosciences, Germany)를 얹어서 100 V에서 1시간 동안 이전시키고, 상기 NC 페이퍼를 트윈(Tween 20)이 포함된 PBS(T-PBS)로 5회 세척한 다음 1% BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma)로 1시간 동안 블랏킹(blocking)하고 T-PBS로 5회 세척하였다. 상기 실시예 <4-3>에서 제작한 VHSV 항체를 1/10,00로 희석하여 2시간 반응 후 T-PBS로 5회 세척하였다. 2차 항체로는 알칼라인 포스파테이트와 결합된 염소 항-토끼 면역글로불린(Sigma)을 사용하였으며, 이를 1/5,000로 희석하여 1 시간 동안 반응시킨 후 T-PBS로 5회 세척하고, BICP/NBT 포스파타아제 기질(Sigma)을 첨가하여 발색시켜 관찰하였다.
상기 SDS-PAGE 결과를 도 4의 (a)에 나타내었고, 웨스턴 블롯 결과를 도 4의 (b)에 나타내었다. 각 도의 M 레인은 마커를 의미하고, 1 레인은 FP-VHS2010-01을 로딩한 결과이다. 도 4(a)에 나타난 본 발명의 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01의 구조 단백질을 종래 보고된 문헌에 기재된 VHS 바이러스(김수미, 양식넙치, Paralichthys olivaceus에서 발생하는 viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV)감염증에 관한 연구, 부경대학교 대학원 어병학과, 이학박사 학위논문, p.101)와 비교한 결과, 서로 같은 단백질 패턴을 나타내었고 다른 바이러스 HIRRV 등과는 다른 단백질 패턴을 나타내었다. 또한, 도 4(b)의 결과로부터 FP-VHS2010-01 바이러스가 항원-항체 반응에서 항원성이 있음을 확인할 수 있었다.
실시예
5: 백신 제조방법에 따른 효율 분석
실시예 1에서 선발된 VHS 바이러스 FP-VHS2010-01에 대한 최적의 백신을 제조하기 위해, 하기와 같이 백신 제조방법에 따른 효율을 분석하였다.
<5-1> 배양 온도에 따른
VHS
바이러스의 증식 분석
VHS 바이러스 FP-VHS2010-01을, 해산어 유래 VHSV의 증식율이 가장 좋다고 알려진 EPC 세포주에 접종하고 다양한 온도 조건(15℃, 20℃ 및 25℃) 하에서 3일간 배양한 후, 세포의 증식을 분석하였다. 구체적으로, EPC 세포주를 1% 항생제(Gibco) 및 10% FBS(Gibco)가 첨가된 MEM 배지(welgene)에서 단층 배양한 다음, 상기 배양된 EPC 세포주에 VHS 바이러스를 접종하고 실온에서 30분간 흡착시켰다. 이후 5% FBS와 1% 항생제를 첨가한 MEM 배지를 첨가한 다음, 15℃, 20℃ 및 25℃의 온도에서 배양하면서 세포변성 효과(cytopathic effect, CPE)를 역상현미경을 이용하여 관찰하였다. 대조군으로 PBS를 접종한 정상세포를 사용하였다.
상기 실험결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 A는 대조군을, B 내지 D는 바이러스 접종 후 각각 15℃, 20℃ 및 25℃에서 배양한 세포주의 사진이다. 상기 도에서 보는 바와 같이, EPC 세포주는 25℃에서 가장 성장이 빠른데 반해 바이러스의 증식은 20℃에서 가장 높은 세포변성 효과를 나타내었다. 이는 통상적인 세포주 배양 온도와 바이러스 증식 온도가 다르다는 것을 보여준다.
<5-2> 배양 용기 크기에 따른 증식 분석
배양 용기 크기에 따른 증식의 차이를 분석하기 위하여, 바이러스가 포함된 300 mL의 배양액을 배양 플라스크(125cm2; 도 6A) 및 롤러 배양병(roller bottle, 850cm2; 도 6B)에서 각각 배양하였다.
동일한 양(300 mL)을 배양하더라고 면적이 큰 롤러 배양병에서 배양하는 것이 더 높은 농도의 바이러스 배양액을 제조하는데 유리한 것으로 확인되었다.
<5-3> 바이러스 불활성화 방식에 따른 백신의 안정성 검사
백신의 제조를 위한 최적의 불활성화 방식을 확인하기 위하여, 실시예 1에서 선발한 VHS 바이러스를 통상적으로 바이러스 불활성화에 사용되는 방법인 포르마린 불활성화 방법과 열 불활성화 방법을 통해 불활성화한 후, 세포를 재배양하여 안정성을 비교하였다. 구체적으로, 포르마린 불활성화 방법은 냉동된 바이러스 배양액을 해동시켜 원심분리(40,000 rpm, 4℃, 10분)하여 세포 성분을 제거하고, 상층액에 1:4,000(0.4%)의 비율로 포르말린을 처리하여 37℃에서 3일간 반응시켜 수행하였다. 열 불활성화 방법은 세포성분을 제거한 상기 상층액을 60℃에서 3일간 불활성화시켜 수행하였다. 상기 제조된 백신은 4℃에 보관한 상태로 사용하였다.
상기 실험결과를 도 7에 나타내었다. 도 7의 A는 본 발명의 바이러스를 포르마린으로 불활성화한 후 EPC 세포에 접종하여 2일간 배양한 세포의 사진이며, 도 7의 B는 본 발명의 바이러스를 열로 불활성화한 후 EPC 세포에 접종하여 2일간 배양한 세포의 사진이다. 상기 도에서 보는 바와 같이, 포르마린으로 불활성화된 바이러스는 포르말린 독성으로 인한 세포변성을 나타내어 안전성에 있어 문제가 있는 것으로 확인되었고, 또한 포르마린을 제거하는 추가의 과정(불활화된 반응물을 원심분리(X50,000g, 초원심분리, 4℃, 1시간)하여 얻은 펠렛을 FBS가 없는 MEM에 재부유시킨 다음 보존하는 과정)을 추가한다면, 이로 인해 바이러스의 손실 및 경제적 손실이 생기며, 나아가 불활화된 바이러스가 세포 재배양시 독성을 나타내는 문제점이 있다. 이에 반해, 열로 불활성화된 바이러스는 세포 변성이 없어 안전하므로, 제조 후 바로 사용할 수 있으므로 열 불활성화 방법이 본 발명의 백신 제조에 효과적인 것으로 판단되었다.
실시예
6: 백신의 처리방법에 따른 효율 분석
상기 실시예 5에서 열 불활성화 방법에 의해 제조된 백신을 대상으로, 백신의 처리방법 및 처리 온도가 면역능에 미치는 영향을 하기와 같이 분석하였다. 넙치(평균체중 24.6g, 13.4cm)를 20℃에서 사육한 고온 실험군과 12℃에 사육한 저온 실험군으로 나눈 다음, 주사백신(106 TCID50/마리, 복강주사)과 침지백신(106 TCID50/마리, 3분간 침지, 1회 실시)을 처리하였으며, 12℃에서 사육하면서 2주 후 각 실험군별로 20마리씩 VHS 바이러스를 접종하였다. 상기 접종 후 면역관련 유전자의 발현 및 누적폐사율을 조사하였다.
면역관련 유전자(GAPDH, Mx, IFN 및 ISG-15)의 발현량을 하기와 같이 측정하였다. 백신을 투여한지 2주 후의 넙치를 무작위로 선정하여 RNA를 추출하였다. 상기 추출한 RNA를 대상으로, 하기 표 1에 기재된 각 면역관련 유전자용 프라이머 및 조건을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
| 유전자명 | 프라이머 이름 | 염기서열 | 조건 | |
| GAPDH | GAPDH-1U | 5'-ccaggtcgtctccacagact-3' (서열번호: 3) |
94℃, 5분 94℃, 20초 27 사이클 55℃, 30초 72℃, 30초 72℃, 7분 |
|
| GAPDH-1D | 5'-catgagaccagcttgacgaa-3' (서열번호: 4) |
|||
| IFN | IFN-1U | 5'-tacagccaggtgtcaaatgc-3' (서열번호: 5) |
94℃, 5분 94℃, 20초 29 사이클 59℃, 30초 72℃, 30초 72℃, 7분 |
|
| IFN-1D | 5'-tggaatcctcctcaaacagg-3' (서열번호: 6) |
|||
| Mx | floMx-F | 5'-aacagccaaggcaaagattg-3' (서열번호: 7) |
94℃, 5분 94℃, 20초 29 사이클 59℃, 30초 72℃, 30초 72℃, 7분 |
|
| floMx-R | 5'-aatgtccagctcctccttca-3' (서열번호: 8) |
|||
| ISG-15 | ISG-15-F | 5'-ctccatgtaatctgcagcaa-3' (서열번호: 9) |
94℃, 5분 94℃, 20초 26 사이클 57℃, 30초 72℃, 30초 72℃, 7분 |
|
| ISG-15-R | 5'-cagatctagtgcaggtgtga-3' (서열번호: 10) |
RT-PCR 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8의 A는 고온 실험군을, B는 저온 실험군을, C는 대조군(PBS 처리군)을 나타낸다. 또한 A 및 B에서 레인 1 및 2는 백신침지군이며, 레인 3 및 4는 백신주사군이고, C에서 레인 1 및 2는 음성 대조군이고, 레인 3 및 4는 PBS 투여군이다.
상기 결과는 고온 및 저온 처리된 백신을 접종한 실험군에서 대조군에 비해 면역관련 유전자의 발현량이 증가하였음을 보여준다. 특히 고온 처리된 백신을 사용한 실험군에서의 면역관련 유전자의 발현량이 저온 처리된 백신을 사용한 실험군에서의 면역관련 유전자의 발현량에 비해 더 높은 것으로 보아 백신을 고온 처리하는 것이 유리한 것으로 확인되었다.
한편, 누적 폐사율 결과를 도 9에 나타내었다. 상기 도에서 보는 바와 같이, 대조구의 폐사율은 77%인 반면, 고온/백신주사군은 17%, 고온/백신침지군은 71%, 저온/백신주사군은 45%, 저온/백신침지군은 50%의 폐사율을 나타내었다. 상기 결과로부터 저온보다는 고온에서의 처리가 효과적이며 침지보다는 주사방법이 효과적임을 알 수 있었다. 고온/백신주사군의 경우 상대생존율이 78%로 가장 높아 가장 효과적인 것으로 나타났다.
실시예
7: 백신의 효능 평가
VHSV 백신의 효능 변화를 살펴보기 위하여, 상기 백신을 각각 20마리의 넙치(평균체중 41g, 17cm)에 접종하였다. 상기 접종 6주 후에, VHS 바이러스를 105 TCID50/마리(0.1ml/마리)로 주사한 다음, 대조군(PBS 투여)에 대한 폐사율, 라이소자임 활성 및 ELISA에 의한 에드와드균에 대한 응집항체가를 조사하였다.
라이소자임 활성 및 응집항체가는 하기 방법에 의해 수행하였다.
라이소자임
활성 측정
1. 32 mM KH2PO4 0.435g를 3차 증류수 100 ml에 용해시켰다(이하 용액A).
2. 32 mM K2HPO4 0.278g를 3차 증류수 50 ml에 용해시켰다(이하 용액B).
3. 용액A 100 ml와 용액B 25 ml를 혼합하였다(이하 LY용액).
4. 마이크로코커스 리소데익티쿠스(Micrococcus lysodeikticus; Sigma no.M-3370)를 0.0014g를 LY용액 1ml에 녹였다(이하 균액).
5. 96웰 평바닥 플레이트의 웰에 실험 혈청을 50 ㎕씩 3반복하여 분주하고, 여기에 균액을 50 ㎕씩 분주하였다.
7. ELISA 리더를 이용하여 550 nm에서 0분 및 15분에 흡광도를 측정하였다.
8. 식 {(0분 흡광도값)-(15분 흡광도값)}×10000으로 계산하여 활성을 측정하였다.
응집항체가 측정
1. 96웰 둥근바닥 플레이트의 웰에 멀티 피펫을 이용하여 1×PBS를 25 ㎕씩 분주하였다.
2. 실험할 혈청을 첫 번째 열의 웰에만 25 ㎕씩 분주하였다.
3. 멀티피펫을 이용하여 첫 번째 열의 웰에서 11번째 열의 웰까지 25 ㎕씩 단계희석하였다.
4. 멀티피펫을 이용하여 FKC균을 12번째 열부터 첫 번째 열까지 순서대로 25㎕씩 분주하였다.
5. 플레이트 뚜껑을 닫은 후, 안에 내용물이 잘 섞이도록 조심스럽게 흔들어준 다음, 냉장 상태로 하룻밤동안 보관하였다.
상기 실험결과를 도 10에 나타내었다. 도 10A에서 보는 바와 같이, PBS 대조군의 폐사율은 90%인 반면, 바이러스 단독백신의 폐사율은 20%로, 상대생존율은 77%로 좋은 효과를 가졌다. 또한 도 10B 및 10C에서 보는 바와 같이, 라이소자임 활성 및 ELISA는 대조군에 비해 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예
8:
VHSV
백신의 안전성 조사
본 발명의 백신의 안전성을 살펴보기 위하여, 넙치에 VHSV 백신을 투여한 후 여러 가지 장기(간, 비장, 신장, 심장, 위, 아가미)를 H&E 염색한 후, 현미경(×200)을 통해 PBS 투여군과 비교하였다.
구체적으로, 10% BNF에 고정한 각 장기를 48시간 이내에 같은 고정액에 세절하여 재고정시켰다. 24시간 후 6-12시간 동안 흐르는 물에 수세한 후 농도별 알콜(70-100%)로 탈수시켰다. 이후, 자일렌으로 투명화하고 파라핀 침투시켜 파라핀 블록을 만들고 마이크로톰을 이용하여 세절(4 um)한 후 슬라이드에 부착시켰다. 상기 부착된 슬라이드를 50℃에서 하룻밤동안 건조시킨 후 H & E 염색법에 의해 염색시켜 현미경으로 관찰하였다.
상기 실험결과를 도 11에 나타내었다. 도 11은 VHSV 백신 처리 후, 간, 비장, 신장, 심장, 위 및 아가미의 현미경 사진을 보여준다. 상기 도에서 보는 바와 같이, VHSV 백신 투여시 모든 장기에서 정상 소견이 관찰되어 본 발명의 VHSV 백신은 넙치의 안전에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (6)
- 불활성화된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 FP-VHS2010-01(KCTC 12153BP) 항원을 포함하는 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 불활성화 백신.
- 제1항에 있어서, 상기 백신이 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 FP-VHS2010-01을 18~22℃의 온도에서 배양시켜 수득되는 것을 특징으로 하는, 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 불활성화 백신.
- 제1항에 있어서, 상기 백신이 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 FP-VHS2010-01을 열 불활성화(heat inactivation)시키는 것을 특징으로 하는, 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 불활성화 백신.
- 제1항에 있어서, 상기 백신이 주사에 의해 넙치에 투여되는 것을 특징으로 하는, 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 불활성화 백신.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 백신을 어류에 투여하는 것을 포함하는, 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 백신을 어류의 복강에 주사하는 것을 특징으로 하는 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 방법.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120047698A KR101322228B1 (ko) | 2012-05-04 | 2012-05-04 | 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 백신 |
| PCT/KR2013/003811 WO2013165190A1 (ko) | 2012-05-04 | 2013-05-02 | 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 백신 |
| CN201380025053.2A CN104619337B (zh) | 2012-05-04 | 2013-05-02 | 比目鱼的病毒性出血性败血症预防用疫苗 |
| JP2015510189A JP5860569B2 (ja) | 2012-05-04 | 2013-05-02 | ヒラメのウイルス性出血性敗血症予防用ワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120047698A KR101322228B1 (ko) | 2012-05-04 | 2012-05-04 | 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 백신 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101322228B1 true KR101322228B1 (ko) | 2013-10-28 |
Family
ID=49514535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020120047698A KR101322228B1 (ko) | 2012-05-04 | 2012-05-04 | 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 백신 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5860569B2 (ko) |
| KR (1) | KR101322228B1 (ko) |
| CN (1) | CN104619337B (ko) |
| WO (1) | WO2013165190A1 (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150108446A (ko) * | 2014-03-17 | 2015-09-30 | 제주광어주식회사 | 한 개의 뉴크레오타이드 염기 변화를 통한 숙주 비의존성 약독화 바이러스성 출혈패혈증 바이러스 |
| KR20170031378A (ko) | 2015-09-11 | 2017-03-21 | 제주대학교 산학협력단 | 2단계 한외여과를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증 원인바이러스의 농축방법 |
| KR102082600B1 (ko) * | 2019-02-19 | 2020-02-27 | 전남대학교산학협력단 | Plga를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 조성물 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113583968A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-11-02 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 传染性胰脏坏死病疫苗及其病毒在大鳞大麻哈鱼胚胎细胞上扩增的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005112726A (ja) | 2003-10-02 | 2005-04-28 | Meiji Seika Kaisha Ltd | ヒラメのウイルス性出血性敗血症に対するｄｎａワクチン |
| KR20090077303A (ko) * | 2008-01-10 | 2009-07-15 | 전남대학교산학협력단 | 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방방법 및 예방 시스템 |
| JP2010065027A (ja) | 2008-08-12 | 2010-03-25 | Mie Univ | 魚類のウイルス性出血性敗血症に対する不活化ワクチンとその処方 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4695454A (en) * | 1985-04-01 | 1987-09-22 | New York Blood Center, Inc. | Process for preparing hepatitis B surface antigen containing particles in novel forms which are highly immunogenic |
| JPH0720881B2 (ja) * | 1991-05-13 | 1995-03-08 | 中村 徹雄 | Ｎａｎｂ‐２型の肝炎ウイルス由来抗原組成物及びワクチン |
| JP2001161355A (ja) * | 1999-11-25 | 2001-06-19 | Natl Sci Council | ハタ科チャイロマルハタから得られる不死の細胞株およびその応用 |
| DE102005010288A1 (de) * | 2005-03-02 | 2006-09-07 | Riemser Arzneimittel Ag | Pharmazeutisches, oral applizierbares Präparat zur Behandlung von Fischen, Herstellungsverfahren für dieses und seine Verwendung |
-
2012
- 2012-05-04 KR KR1020120047698A patent/KR101322228B1/ko active IP Right Grant
-
2013
- 2013-05-02 WO PCT/KR2013/003811 patent/WO2013165190A1/ko active Application Filing
- 2013-05-02 JP JP2015510189A patent/JP5860569B2/ja active Active
- 2013-05-02 CN CN201380025053.2A patent/CN104619337B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005112726A (ja) | 2003-10-02 | 2005-04-28 | Meiji Seika Kaisha Ltd | ヒラメのウイルス性出血性敗血症に対するｄｎａワクチン |
| KR20090077303A (ko) * | 2008-01-10 | 2009-07-15 | 전남대학교산학협력단 | 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방방법 및 예방 시스템 |
| JP2010065027A (ja) | 2008-08-12 | 2010-03-25 | Mie Univ | 魚類のウイルス性出血性敗血症に対する不活化ワクチンとその処方 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 논문1(Journal of fish pathology, 2011) * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150108446A (ko) * | 2014-03-17 | 2015-09-30 | 제주광어주식회사 | 한 개의 뉴크레오타이드 염기 변화를 통한 숙주 비의존성 약독화 바이러스성 출혈패혈증 바이러스 |
| KR101661277B1 (ko) | 2014-03-17 | 2016-09-30 | 제주광어주식회사 | 한 개의 뉴크레오타이드 염기 변화를 통한 약독화 바이러스성 출혈패혈증 바이러스 |
| KR20170031378A (ko) | 2015-09-11 | 2017-03-21 | 제주대학교 산학협력단 | 2단계 한외여과를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증 원인바이러스의 농축방법 |
| KR102082600B1 (ko) * | 2019-02-19 | 2020-02-27 | 전남대학교산학협력단 | Plga를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104619337B (zh) | 2016-09-14 |
| JP2015521170A (ja) | 2015-07-27 |
| CN104619337A (zh) | 2015-05-13 |
| WO2013165190A1 (ko) | 2013-11-07 |
| JP5860569B2 (ja) | 2016-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6845266B2 (ja) | 多価組換型鳥ヘルペスウイルス及び鳥類を免疫化するためのワクチン | |
| Pitcovski et al. | Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens | |
| AU619812B2 (en) | A recombinant marek's disease virus and a vaccine | |
| He et al. | Prokaryotic expression and purification of grass carp reovirus capsid protein VP7 and its vaccine potential | |
| KR101322228B1 (ko) | 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 백신 | |
| CN109310750B (zh) | 编码传染性喉气管炎病毒和传染性法氏囊病病毒抗原的重组非致病性马立克氏病病毒构建体 | |
| CN113943714A (zh) | 一种猫杯状病毒毒株及其应用 | |
| CN105247043A (zh) | 鳞片脱落疾病(sdd)致病病毒及其衍生物 | |
| EP2982683B1 (en) | Recombinant pasteurella multocida toxin and application thereof | |
| JP7350864B2 (ja) | 異種スパイクタンパク質を有するｈ５２ ｉｂｖワクチン | |
| KR20210022165A (ko) | 조류 레오바이러스 백신 | |
| CN114921422B (zh) | 一种犬源猫细小病毒分离株及其应用 | |
| CN113073083A (zh) | 犬细小病毒弱毒株、及其制备的疫苗组合物和应用 | |
| US20220185848A1 (en) | Recombinant vaccine against marek's disease and newcastle disease | |
| KR102513632B1 (ko) | 구제역 바이러스 유사 입자를 생산하기 위한 백신 플랫폼 | |
| CN116059334A (zh) | 禽霍乱多价亚单位疫苗、多联疫苗及其制备方法和应用 | |
| JPH07322877A (ja) | レオウイルス株２１７７及び該株を含むワクチン | |
| US20070269459A1 (en) | Mutant G Genes of the Trout Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus (Vhsv) and Applications Thereof | |
| CN103589693B (zh) | 一种表达ibdv vp2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重组火鸡疱疹病毒 | |
| US9764017B2 (en) | Potomac horse fever isolates | |
| KR20200061508A (ko) | 약독화된 조류메타뉴모바이러스 주 및 이를 포함하는 백신 조성물 | |
| KR101104911B1 (ko) | 비병원성 전염성낭병 바이러스 및 이의 백신으로서의 용도 | |
| KR102390674B1 (ko) | 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물 | |
| KR101560337B1 (ko) | 신규한 조류메타뉴모바이러스 및 그 백신 | |
| EP3337813B1 (en) | Synthetic btv vp2 fusion protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |