KR102082600B1 - Plga를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 조성물 - Google Patents

Plga를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 백신 조성물은 넙치에서 발생하는 바이러스성 출혈성 패혈증을 효과적으로 예방할 수 있으므로, 넙치의 양식 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 침지 및 경구 투여를 통해서도 주사 기반 백신과 유사한 효과를 나타내기 때문에 성어 뿐 아니라 치어에서도 간편한 방법으로 바이러스성 출혈성 패혈증을 예방 및 치료할 수 있다.

Description

PLGA를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 조성물{Vaccine Composition for Viral Hemorrhagic Septicemia Using PLGA}
본 발명은 PLGA를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 조성물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)는 바이러스성 출혈성 패혈증(VHS) 질병의 원인 병원체이다. VHS는 유럽, 미국 및 동남 아시아 전역의 담수 및 해양 어류 70종 이상에 질병을 일으킨다. 우리나라는 2001년 처음 발생한 이후 빈번한 발생으로 엄청난 경제적 손실을 입었다.
바이러스성 출혈성 패혈증은 늦은 겨울부터 봄철에 주로 발생하며, 수온이 8-15℃에서 넙치의 모든 연령군(치어부터 성어)에서 50-70%의 사망률을 초래한다. 감염된 어류는 체색흑화, 복수, 빈혈 및 간과 비장의 종대를 일으킨다. 일단 넙치가 바이러스에 감염되어 질병 증상을 보이기 시작하면 생존 가능성이 매우 낮아 1-2주 이내에 사망한다.
백신접종은 경제적, 환경적 관점에서 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 가장 효과적인 예방법이다. 불활화백신, 약독화 생백신, 원핵 및 진핵 발현 시스템의 재조합 백신 및 DNA 기반 백신을 포함하여 30년 이상 다양한 면역 전략이 시도되었다. 이 모든 면역 전략 중에서 DNA 백신은 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 가장 유망한 백신 접종 전략임이 입증되었다. 그러나 한국을 비롯한 대부분의 국가에서 식용 어류에 DNA 백신을 사용하는 것에 대한 법적 제한이 있기 때문에 DNA 백신을 사용할 수는 없다. 그러므로 강력하고 오래 지속되는 면역 반응을 이끌어 낼 수 있을 뿐만 아니라 양식에 적합한 것으로 입증된 경험적 배합에 기반한 백신의 개발이 필수적이다.
주사면역은 크기가 작은 어류에 스트레스를 유발하여 주사 스트레스만으로도 어체를 사망에 이르게 할 수 있으므로 15 cm 이하의 넙치에는 적용하기 어렵다. 또한 개체별로 주사해야하므로 노동력이 많이 들며 백신 접종을 위한 추가 비용이 필요하다. 따라서, 주사면역법의 한계를 극복하기 위해 어체에 스트레스를 주지 않는 점막(침지/구강) 경로로 백신 전달 경로를 대체 할 필요성이 제기되었다. 침지/경구 경로에 의한 백신 전달은 어류에 스트레스를 유발하지 않고 매우 작은 크기의 어류에 적용이 가능하나 주사백신에 의하여 효능면에서 아주 낮다.
포르말린 불활화 항원은 경구 경로를 통해 전달될 때 생체 내 환경에서 분해되거나, 침지 경로를 통해 투여될 때 면역 세포에 도달하지 못하여 숙주 어류에서 면역 유발에 실패하게 된다. 따라서 불활화 VHSV 항원을 환경(생체 내 및 외부 환경 모두)의 분해로부터 보호할 수 있을 뿐만 아니라 면역계를 유도하기 위해 효율적으로 숙주 면역 기관으로 전달할 수 있는 전달 시스템이 필요하다. 나노 캡슐화는 캡슐화된 항원을 지속적으로 또는 펄스로 방출함으로써 반복 투여 및 다량의 항원투여가 필요한 침지/경구 경로에 의한 백신 전달의 단점을 보완하여, 장기간의 보호를 보장하는 방법이다.
나노 캡슐화에 사용되는 여러 가지 고분자 중 합성 고분자인 PLGA(Poly(D, L-lactic-co-glycolic acid))는 우수한 조직 적합성, 생분해성, 비분해성 등의 이유로 포유류 및 생물 의학 연구에서 백신 전달에 광범위하게 사용된다. PLGA는 인간에게 안전한 사용을 위한(Food and Drug Administration)의 승인을 받은 물질이다. 또한, PLGA 나노 입자는 포유 동물의 항원 제시 세포(APC) 및 수지상 세포에 의해 생체 내에서 흡수되어 항원 제시 효능을 여러 배로 증가시킨다.
본 발명자들은 어류에서의 VHSV 감염 방어에 효과적인 백신을 개발하기 위해 노력하였다. 그 결과, PLGA 나노입자를 사용하여 불활화된 VHSV를 캡슐화하여 제조한 백신이 넙치에서 VHSV에 대한 높은 방어 효과를 보임을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바이러스성 출혈성 패혈증 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)의 불활화 균체를 PLGA(Poly(D, L-lactic-co-glycolic acid))로 캡슐화한 나노구(nanosphere)를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 어류에서의 VHSV 감염 방어에 효과적인 백신을 개발하기 위해 노력하였다. 그 결과, PLGA 나노입자를 사용하여 불활화된 VHSV를 캡슐화하여 제조한 백신이 넙치에서 VHSV에 대한 높은 방어 효과를 보임을 규명하였다.
본 명세서에서 용어 '바이러스성 출혈성 패혈증(Viral hemorrhagic septicemia, VHS)'은 유럽, 미국 및 동남 아시아 전역의 담수 및 해양 어류 70종 이상에 큰 피해를 주고 있는 바이러스 질병이다. 우리나라에서는 2001년 처음 발생한 이후 빈번한 발생으로 엄청난 경제적 손실을 입히고 있다. 늦은 겨울부터 봄철에 주로 발생하며, 수온이 8-15℃에서 넙치의 모든 연령군(치어부터 성어)에서 50-70%의 높은 사망률을 보인다.
바이러스성 출혈성 패혈증의 원인 바이러스(VHSV)는 음성 단일가닥 RNA 바이러스로 랍도바이러스(rhabdovirus)과에 속한다. VHSV는 어린 치어기뿐 아니라 출하 시기의 큰 성어에서도 폐사를 일으키며 감염어는 체색흑화, 복막과 복강 내의 투명 복수액 저류, 간 울혈, 비장 비대, 신장종대, 간, 신장, 비장 및 골격근에 괴사와 아가미 새엽의 비후, 간농축, 골격근 혈구 축적 등의 내부증상이 나타나며, 피부 상피층 또는 아가미 내피 세포를 통해 바이러스가 어체로 침입하여 혈류를 타고 신장, 비장의 조혈 형성조직 등 내부장기로 빠르게 이동하는 것으로 보고되어있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여로 바이러스성 출혈성 패혈증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여로 바이러스성 출혈성 패혈증에 의해 이미 유발된 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "백신"이란 감염 질환을 예방하기 위한 면역을 위하여 쓰이는 항원을 의미한다. 백신에 의해 자극을 받으면 개체 내의 면역 시스템이 작동하여 항체를 생성하게 되고, 그 감수성을 유지하다가 재감염이 일어나는 경우, 빠른 시간 내에 항체를 효과적으로 생성함으로써 질환을 극복할 수 있게 된다.
본 발명의 백신 조성물이 적용되는 어류는 바람직하게는 넙치과 어류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 넙치일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서 본 발명의 백신을 넙치에 침지, 경구 투여 또는 이의 조합으로 투여한 경우, 주사 백신과 유사한 수준의 상대 생존율(RPS)을 나타내고, IgM, IgT, pIgR, MHC-II 및 IFN-γ 등 면역 관련 유전자의 발현을 유도하며, 전신 면역 반응 및 점막 면역 반응 모두를 자극하여 바이러스 공격으로부터 우수한 방어력을 보임을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 백신 조성물은 침지 또는 경구 투여용 백신 조성물이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 백신 조성물은 어류에 투여되어, 아래 수학식 I로 산출되는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 상대생존율(RPS)이 50 내지 85%, 50 내지 80%, 50 내지 75%, 55 내지 85%, 55 내지 80%, 55 내지 75%, 60 내지 85% 또는 60 내지 80%, 예를 들어, 60 내지 75%를 나타낸다.
[수학식 I]
상대 생존율(RPS, %) = {1-(백신 접종 군 사망률/% 대조구 사망률 %)} × 100.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 불활화 균체를 PLGA로 캡슐화한 나노구(nanosphere)의 직경은 100 내지 600 nm, 100 내지 550 nm, 100 내지 500 nm, 150 내지 600 nm, 150 내지 550 nm, 150 내지 500 nm, 200 내지 600 nm, 200 내지 550 nm, 200 내지 500 nm, 250 내지 600 nm, 250 내지 550 nm, 250 내지 500 nm, 300 내지 600 nm, 300 내지 550 nm, 300 내지 500 nm, 350 내지 600 nm, 350 내지 550 nm, 350 내지 500 nm, 400 내지 600 nm, 400 내지 550 nm, 400 내지 500 nm, 450 내지 600 nm 또는 450 내지 550 nm이고, 예를 들어, 450 내지 500 nm일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 추가로 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레이트를 포함한다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다.
비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 어주번트(adjuvant)를 포함할 수 있다. 어주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용 가능한 어주번트는 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 백신 조성물의 투여량은 바람직하게는 0.01 mL/미 내지 1 mL/미의 범위이나, 개체의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)를 불활화시키는 단계; 및 불활화된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 PLGA(Poly(D, L-lactic-co-glycolic acid))로 캡슐화시키는 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 불활화는 바이러스에 포르말린을 처리하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 캡슐화 단계는 상기 불활화된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 유기용매에 녹인 PLGA와 혼합하고, 비이온성 계면활성제를 첨가하여 1차 균질화하는 단계; 및 PVA(poly vinyl alcohol) 용액을 첨가하여 2차 균질화하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 유기용매는 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 아세톤(acetone), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 및 염소계 용매(chlorinated solvents)로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상일 수 있고, 예를 들어, 디클로로메탄(dicholoromethane)일 수 있다.
상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제, 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르계 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제 및 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜계 비이온성 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상일 수 있다. 예를 들어 상기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제는 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80 및 트윈 85로 이루어진 군에서 선택된 1 이상, 바람직하게는 트윈 80일 수 있다. 또한, 상기 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제로서 스판 20, 스판 40, 스판 60, 스판 80 및 스판 85로 이루어진 군에서 선택된 1 이상, 바람직하게는 스판 80일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 2차 균질화 단계는 상기 유기용매를 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 바람직하게는 2차 균질화 단계의 결과물을 교반하여 유기용매를 증발시킴으로써 제거할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 백신 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
상기 투여는 침지 및 경구 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방식으로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 침지 및 경구 투여의 조합으로 투여될 수 있다.
상기 어류는 바람직하게는 넙치과 어류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 넙치일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 넙치에서 발생하는 바이러스성 출혈성 패혈증을 효과적으로 예방할 수 있으므로, 넙치의 양식 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 침지 및 경구 투여를 통해서도 주사 기반 백신과 유사한 효과를 나타내기 때문에 성어 뿐 아니라 치어에서도 간편한 방법으로 바이러스성 출혈성 패혈증을 예방 및 치료할 수 있다.
도 1은 불활화 항원의 PLGA 캡슐화 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 백신 실험 설계에 대한 모식도이다.
도 3은 Zetasizer S-90 Malvern 기기를 이용하여 동적 광산란(DLS)에 의한 PLGA 나노 입자(PNP)의 빈 입자 크기 분포를 분석한 결과이다.
도 4는 IV-를 포함한 PLGA 나노구(PNPs-IV)의 투과 전자 현미경 사진으로 450-500 nm의 평균 입도 범위를 갖는 부드럽고 구형인 나노구를 보여준다.
도 5는 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/구강) 및 넙치의 NVC 대조구 그룹의 누적 사망률 및 상대 생존율(RPS) 분석을 보여주는 Kaplan-Meier 곡선(n = 30, 각 그룹 당 15마리의 물고기)이다.
백신 투여 후 독성이 있는 VHSV(106 TCID50/마리)로 공격하였고, Naive 그룹은 바이러스를 감염시키지 않았다. 백신을 투여하지 않고 바이러스로 공격한 대조구에 비해 백신 접종 군에서 유의하게 높은(p-값 = 0.0019) 생존율을 나타내었다.
도 6은 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 신장 조직 총 RNA 50 ng에 포함된 VHSV의 절대 카피 수를 나타낸다.
백신 투여 후 독성이 있는 VHSV(106 TCID50/마리)로 공격감염하였고, 백신 투여 후 공격감염 전(pre challenge), 바이러스 공격감염 24시간 후(24 hpc), 48시간 후(48 hpc), 96시간 후(96 hpc)의 VHSV의 절대 카피 수를 점으로 표시하였다.
도 7a는 VHSV에 대한 특이 항체의 백분율 저해(PI)를 혈청 샘플에 대하여 항-VHSV-G MAb를 사용하여 경쟁적 ELISA로 분석한 결과이다.
PNP-IV(침지/침지), PNP-IV(침지/경구), NVC 대조구 및 Naive 어류 혈청에서 VHSV 항원에 결합하는 항-VHSV 항체의 백분율 저해로 표시하였다. 2차 백신투여(booster vaccine) 48시간 후(48hpv), 백신 투여 후 공격감염 전(prechallenge), 바이러스 공격감염 24시간 후(24 hpc), 48시간 후(48 hpc), 96시간 후(96 hpc).
양방향 분산 분석(two-way ANOVA)을 수행하여 같은 그룹 내에서 날짜의 경과에 따른 차이, 다른 백신 그룹간의 차이 및 상호 작용 효과를 p-값으로 통계적 유의성을 평가하였고(p <0.05)일 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다. Duncan 다중 범위 테스트의 결과는 NVC그룹은 소문자(w-z), PNPs-IV(침지/침지)그룹은 소문자(a-e), PNPs-IV(침지/구강) 그룹은 대문자(A-E)로 통계적 차이를 표시하고, 각각의 시간대별 그룹간의 차이는 t-테스트를 실시하였고 통계적 차이는 별표 *로 표시하였다.
도 7b는 VHSV에 대한 특이 항체의 백분율 저해(PI)를 피부 점액 샘플에 대하여 항-VHSV-G MAb를 사용하여 경쟁적 ELISA로 분석한 결과이다.
도 7c는 VHSV에 대한 특이 항체의 백분율 저해(PI)를 장내 점액 샘플에 대하여 항-VHSV-G MAb를 사용하여 경쟁적 ELISA로 분석한 결과이다.
도 8a는 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구) 및 NVC 대조구의 넙치의 신장 조직에서 IgM 유전자의 발현을 분석한 결과이다. 각각의 실험구와 naive 대조구와의 유전자의 발현 수준을 상대적 발현량의 차이로 비교하였다.
1차 백신투여 48시간 후(48 hpv), 2차 백신투여 48시간 후(48 hpbv), 백신 투여 후 공격감염 전(pre challenge), 바이러스 공격감염 24시간 후(24 hpc), 48시간 후(48 hpc), 96시간 후(96 hpc). 양방향 분산 분석(two-way ANOVA)을 수행하여 같은 그룹 내에서 날짜의 경과에 따른 차이, 다른 백신 그룹간의 차이 및 상호 작용 효과를 p-값으로 통계적 유의성을 평가하였고(p <0.05)일 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다. Duncan 다중 범위 테스트의 결과는 NVC그룹은 소문자(w-z), PNPs-IV(침지/침지)그룹은 소문자(a-e), PNPs-IV(침지/구강) 그룹은 대문자(A-E)로 통계적 차이를 표시하였다. 각각의 시간대별 그룹간의 차이는 t-테스트를 실시하였고 통계적 차이는 유의적 차이가 있는 경우는 ‘* ’, 유의적 차이가 없는 경우는 ‘ns’로 표시하였다.
도 8b는 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구) 및 NVC 대조구의 넙치의 신장 조직에서 IgT 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 8c는 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구) 및 NVC 대조구의 넙치의 신장 조직에서 pIgR 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 8d는 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구) 및 NVC 대조구의 넙치의 신장 조직에서 MHC I 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 8e는 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구) 및 NVC 대조구의 넙치의 신장 조직에서 MHC II 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 8f는 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구) 및 NVC 대조구의 넙치의 신장 조직에서 TLR 7 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 8g는 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구) 및 NVC 대조구의 넙치의 신장 조직에서 IgM 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 8h는 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구) 및 NVC 대조구의 넙치의 신장 조직에서 IFN-γ Mx 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 8i는 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구) 및 NVC 대조구의 넙치의 신장 조직에서 Caspase 3 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 9a는 넙치의 피부 조직에서 IgM 유전자의 발현을 분석한 결과이다. PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구) 및 NVC 대조구의 각각의 실험구와 naive 대조구와의 유전자의 발현 수준을 상대적 발현량의 차이로 비교하였다.
2차 백신투여 48시간 후(48 hpbv), 백신 투여 후 공격감염 전(pre challenge), 바이러스 공격감염 24시간 후(24 hpc), 48시간 후(48 hpc), 96시간 후(96 hpc). 양방향 분산 분석(two-way ANOVA)을 수행하여 같은 그룹 내에서 날짜의 경과에 따른 차이, 다른 백신 그룹간의 차이 및 상호 작용 효과를 p-값으로 통계적 유의성을 평가하였고(p <0.05)일 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다. Duncan 다중 범위 테스트의 결과는 NVC그룹은 소문자(w-z), PNPs-IV(침지/침지)그룹은 소문자(a-e), PNPs-IV(침지/구강) 그룹은 대문자(A-E)로 통계적 차이를 표시하였다. 각각의 시간대별 그룹간의 차이는 t-테스트를 실시하였고 통계적 차이는 유의적 차이가 있는 경우는 ‘* ’로 표시하였다.
도 9b는 넙치의 피부 조직에서 IgT 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 9c는 넙치의 피부 조직에서 pIgR 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 9d는 넙치의 피부 조직에서 MHC I 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 9e는 넙치의 피부 조직에서 MHC II 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 9f는 넙치의 피부 조직에서 TLR 7 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 9g는 넙치의 피부 조직에서 IFN-γ Mx 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 9h는 넙치의 피부 조직에서 Caspase 3 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10a는 넙치의 장 조직에서 IgM 유전자의 발현을 분석한 결과이다. PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구) 및 NVC 대조구의 넙치의 장 조직에서 면역 유전자의 상대적 발현 분석하였다. 각각의 실험구와 naive 대조구와의 유전자의 발현 수준을 상대적 발현량의 차이로 비교하였다.
2차 백신투여 48시간 후(48 hpbv), 백신 투여 후 공격감염 전(pre challenge), 바이러스 공격감염 24시간 후(24 hpc), 48시간 후(48 hpc), 96시간 후(96 hpc). 양방향 분산 분석(two-way ANOVA)을 수행하여 같은 그룹 내에서 날짜의 경과에 따른 차이, 다른 백신 그룹간의 차이 및 상호 작용 효과를 p-값으로 통계적 유의성을 평가하였고 (p <0.05)일 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다.
Duncan 다중 범위 테스트의 결과는 NVC 그룹은 소문자(w-z), PNPs-IV(침지/침지)그룹은 소문자(a-e), PNPs-IV(침지/구강) 그룹은 대문자(A-E)로 통계적 차이를 표시하였다. 각각의 시간대별 그룹간의 차이는 t-테스트를 실시하였고 통계적 차이는 유의적 차이가 있는 경우는 ‘* ’로 표시하였다.
도 10b는 넙치의 장 조직에서 IgT 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10c는 넙치의 장 조직에서 pIgR 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10d는 넙치의 장 조직에서 MHC I 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10e는 넙치의 장 조직에서 MHC II 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10f는 넙치의 장 조직에서 TLR 7 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10g는 넙치의 장 조직에서 IFN-γ Mx 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10h는 넙치의 장 조직에서 Caspase 3 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 거쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%"는 별도의 언급이 없는 한 고체/고체는(중량/중량) %, 고체/액체는(중량/부피) %, 그리고 액체/액체는(부피/부피) %이다.
실시예 1. PLGA 나노입자(NP)내 포르말린 불활화 항원의 캡슐화
1.1. 실험동물
지역 부화장에서 양식된 넙치(Paralichthys olivaceus)의 치어를 50 ppm 포르말린으로 약욕한 후 자외선 처리 된 호기성 해수를 제공한 옥내 사육 시설에 순응시키면서 펠렛사료를 하루에 두 차례 먹였다. 백신 접종 전 3주간 매일 체중의 3%의 사료를 급이하면서 유수식으로 사육하였다. 수온과 pH는 각각 19-20℃와 8-8.5로 유지하였다. 무작위로 채집한 10마리의 아가미와 피부에서 기생충이 없음을 확인하였고, 비장과 신장에서 세균이 분리되지 않는 것을 BHI 배지로 확인하였다. 또한, VHSV가 감염되지 않은 것은 PCR(nested polymerase chain reaction)을 통해 확인하였다.
1.2. 바이러스 배양 및 바이러스 항원의 제조 - 포르말린 불활화
VHSV(F1Wa05 균주)는 10%(v/v) fetal bovine serum(FBS), 100 IU/mL 페니실린 G(Gibco, Invitrogen, USA) 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(Gibco, Invitrogen, USA)을 첨가한 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM)(Gibco, Invitrogen, USA)에서 15℃로 유지시킨 FHM 상피세포주에서 배양하였다. FHM 상피세포주에 바이러스 농도 0.01의 감염 다중도(m.o.i)를 접종하였다. 세포변성효과(cytopathic effect: CPE)가 뚜렷하게 나타났을 때 바이러스 배양액과 세포를 수확했다. 세포 파편을 제거하기 위해 세포 배양 상등액을 4℃에서 30분간 5,000 x g으로 원심 분리하고, 분주하여 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
108 TCID50/mL의 역가를 갖는 바이러스 230 mL에 0.3% 포르말린을 첨가하고 4℃에서 24시간 동안 교반하여 불활화시켰다. 불활화 여부는 FHM 세포에 재접종하여 확인하였다. 'IV'로 명명된 불활화 바이러스는 4℃에서 2시간 동안 30,000 rpm으로 원심분리하여 농축하였다. 농축한 IV 항원은 면역에 사용하기 위해 분주하였고, 멸균 증류수에 부유시켜 나노캡슐화할 때까지 4℃에 보관하였다.
1.3. PLGA 나노입자(NP)내 포르말린 불활화 항원의 캡슐화
IV(inactivated vaccine: 불활화 백신) 항원을 함유하는 PLGA NPs는 Delgado et al.에 의해 기술된 이중 에멀젼-용매 증발 기술을 변형하여 만들었다. 1 ml의 항원(W1)과 500 mg의 PLGA(L:G = 50:50, MW 30-60 KDa) Aldrich, USA)를 녹인 10 ㎖의 dichloromethane(시그마-알드리치, 미국)에 100 μL의 Span-80을 넣고 2분간 호모게나이즈한 후 2분간 부드럽게 볼텍싱하여 water-in-oil primary emulsion(W1/O)을 만들었다. 이것에 50 ml의 PVA(poly vinyl alcohol) 용액(5% w/v)를 넣어 water-in-oil-in-water(W1/O/W2)을 만들었다. W1/O/W2을 5분간 호모게나이즈하여 나노구를 만들었다. 만들어진 에멀젼은 25℃에서 하룻밤 마그네틱스터러로 돌려 유기용매(dichloromethane)를 증발시켰다. PLGA로 캡슐화된 IV 나노구(PNPs-IV)는 5,000 xg에서 30분 동안 4℃에서 원심 분리하여 회수한 후 증류수로 3회 세척(5,000 xg, 10분, 4℃에서 원심 분리)하였다. 분리된 최종 생성물은 4℃에서 보관하였다.
PNPs-IV 나노구의 TEM 분석 결과(도 3), PLGA NP에 불활화 바이러스가 양성 캡슐화 되었으며 규칙적이고 균일한 크기의 구형인 나노구가 얻어졌다. 즉 바이러스성 항원이 적대적인 환경 조건에서 안정적으로 유지될 뿐만 아니라 면역 유도를 위해 도움이 되는 PNP-IV 나노구가 형성된 것을 확인하였다.
1.4. 나노구(Nanospheres) 특성 분석
빈 PLGA 나노파티클(IV 항원을 넣지 않음)는 Zetasizer S-90 Malvern 기기(Malvern, UK)를 사용하여 나노파티클의 크기와 크기의 분포를 측정하였다. PNPs-IV 나노구의 형태와 크기 분포는 투과 전자 현미경(TEM)(Hitachi, Japan)에 의해 평가하였다.
양성 캡슐화와 함께, 생리학적 매개 변수, 특히 NP의 크기, 입자의 제타 전위 또는 전하 및 항원과의 착화 효율은 효율적인 유전자 전달을 위한 매우 중요한 속성이다. 캡슐화된 항원 투여량, 그것의 방출 및 숙주의 세포 및 조직과의 생체 적합성을 보다 잘 제어하기 위해서는 NP의 크기가 매우 중요하다. NP는 나노 크기(100 nm 이하의 직경)로 간주되지만 충분한 약물 부하가 필요한 약물 전달 분야에서는 100 nm에서 500 nm 사이의 크기가 허용된다. 본 연구에서 블랭크 PNP의 평균 입경은 206.3 nm(도 3)이었고 반면에 평균 나노구(PNPs-IV) 크기는 TEM 이미지(도 4)에서 측정했을 때 약 450-500 nm였다. Kanchan et al과 Rauta et al에 의한 이전의 연구들은 대식세포에 의해 200-600 nm 범위의 항원으로 로딩된 PLGA NP가 효과적으로 포획되었다고 보고했다. 현재의 NP 크기는 바이러스 면역 항원을 숙주 면역 세포에 용이하게 전달하는데 도움이 될 수 있는 보고된 크기 범위 내에 있다.
실시예 2. 상대생존율(RPS) 및 바이러스 mRNA 복사 수 분석
2.1. 백신접종을 위한 백신 준비
일차 및 부스터 침지 면역화를 위해 준비된 PNPs-IV 나노구는 백신 접종 전에 20 ml의 증류수에 현탁시켰다. 경구 부스터 백신 접종을 위해, PNPs-IV 나노구를 사료무게의 5%(w/w)의 hydroxypropyl methylcellulose와 섞어 상업용 사료펠렛과 섞은 후 50℃에서 1시간 건조시켰다. 물에서 백신의 침출을 최소화하기 위해 2% HPMC(사료의 w/w) 및 1.6% TEC(triethylcitrate as plasticizer, v/w of feed)(Sigma-Aldrich, USA)를 스프레이하고 37℃에서 1 시간 동안 건조시켰다.
2.2. 면역을 위한 실험설계
넙치 치어(12.5 ± 1.5 g)를 각 그룹 당 60 마리씩 무작위로 네 그룹으로 나누어, 500 L FRP 수조에 넣고 20℃에서 유지하면서 사육하였다. 그룹은 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구(비백신 감염그룹), 나머지 60 마리는 아무런 처리를 하지 않은 naive 그룹으로 명명하였다.
1차 면역을 위하여 PNPs-IV(침지/침지) 및 PNPs-IV(침지/경구) 그룹의 어류를 모두 플라스틱 용기로 옮기고 산소를 공급하면서 2시간 동안 PNP-IV 백신 용액 20 mL를 넣은 물 2 L에 담그고 침지 후 원래의 사육수조로 다시 옮겼다.
2차 면역(부스터 면역)은 1차 면역 14일 후(300 degree days 후)에 실시하였고, PNPs-IV(침지/침지) 군은 1차 면역과 동일한 방법으로 면역하였다. PNPs-IV(침지/구강) 군에는 PNPs-IV 나노구를 포함한 사료를 1일 2회 투여하였고, 총 2일 동안 투여하였다.
2.3. 공격감염
공격감염을 위해 PNPs-IV(침지/침지), PNPs-IV(침지/경구), NV 대조구 및 Naive 그룹의 4개 실험 그룹에서 각각 15마리를 저온실험 시설(15℃)로 옮기고 UV 처리된 25 L의 해수를 함유한 플라스틱 수조로 옮겼다.
백신 그룹의 어류에는 백신 균주를 100 μL(106 TCID50/마리)를 복강으로 주사하였고, Naive 그룹에게는 바이러스를 접종하지 않았다. 감염 후 20일 동안 매일 VHS의 사망률 및 증상을 관찰하였다. 사망한 어류를 채집하여 VHSV에 특이적인 사망을 조사했다. 상대 생존율(RPS)는 아래의 공식으로 계산하였다.
상대 생존율(RPS, %) = {1-(백신 접종 군 사망률 %/대조구 사망률 %)} × 100.
2.4. 상대 생존율(RPS) 분석
공격감염 연구(도 5) 결과는 1차 면역과 2차 부스팅 면역을 모두 침지로 면역한 그룹(PNPs-IV, 침지/침지)이 60% RPS를 나타내는 반면, 1차 면역은 침지로, 2차 부스팅은 경구로 면역했을 때(PNPs-IV, 침지/경구) RPS는 73.3%였다. 나노 캡슐화된 백신의 RPS는 스쿠알렌 애쥬번트-IV 백신(58-73% RPS)을 주사한 이전 연구와 유사한데, 현재까지는 주사백신이 효능이 가장 좋은 방법이므로 침지와 경구의 방법으로 주사백신과 유사한 RPS를 얻을 수 있는 것은 매우 고무적인 결과이다. 본 발명은 숙주의 면역 유도를 위한 항원으로서 불활화한 바이러스 항원을 캡슐화한 PNP가 경구 또는 침지 경로를 통해 성공적으로 전달 될 수 있으며 주사 백신의 유망한 대안이 될 수 있음을 시사한다.
백신을 접종한 후 VHSV로 공격하면(도 6)로 신장에서의 바이러스 mRNA가 백신을 하지 않은 것에 비해 10-100배 적어 백신이 효과적으로 바이러스의 증식을 억제하였음을 알 수 있다.
실시예 3. 경쟁적 ELISA에 의한 항체가 분석
3.1. 혈청, 피부 및 장 점액 수집
혈액은 꼬리 미병부에서 채혈하여 일반적인 방법으로 2,000g에서 15분간 4℃에서 원심분리하고 -20℃에 보관하였다.
피부점액은 CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구와 무처리 대조구에서 취하였다. 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF, Sigma-Aldrich, USA)를 포함한 멸균 PBS 200 μL를 넣은 지퍼락 비닐 봉지에 넙치를 넣고 피부 표면을 가볍게 문질러 피부 점액 샘플을 수집했다. zip-lock bag에서 모은 점액을 microcentrifuge tube로 옮겼다. 이후 1분간 볼텍스한 후 2,000g에서 15분간 4℃에서 원심분리하고 -20℃에 보관하였다.
소화관 점액의 수집을 위해, 어류를 무균적으로 해부하고 장을 절제 하였다. 소화관 점액을 수집하기 전에 모든 장내 내용물을 조심스럽게 제거하여 오염을 방지했다. 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF, Sigma-Aldrich, USA)를 포함한 멸균 PBS 200 μL가 든 에펜돌프 튜브에 장의 3조각(앞부분, 중간부분, 뒷부분) 넣고 핀셋으로 부드럽게 눌러 장내 점액을 용출시켰다. 이후 1분간 볼텍스한 후 2,000g에서 15분간 4℃에서 원심분리하고 -20℃에 보관하였다.
3.2. 경쟁적 ELISA
실험어의 혈청, 피부 점액 및 장 점액에서의 특정 항체(항-VHSV Ig) 정량은 이전에 Kole et al에 의해 보고된 방법에 따라 3가지 competitive enzyme-linked immunosorbent assays(c-ELISA)를 수행하였다.
96-well ELISA 플레이트(Nunc, 덴마크)에서 코팅 완충액(탄산염-중탄산염 완충액, pH 9.6)으로 희석한 VHSV(108 TCID50/mL) 100 μL를 4℃에서 하룻밤 배양했다. 플레이트를 5분 동안 3회 세척 완충액(PBS-T, 0.05 % tween20, PBS pH 7.4)으로 3회 세척하고 300 μL 블로킹 완충액(PBS-T 중 3% 소 혈청 알부민(BSA) 용액)으로 차단하고 추가로 25℃에서 1시간, 플레이트를 5분 동안 3회 세척 완충액으로 다시 세척하였다.
상이한 시점에서 모든 실험 그룹으로부터 샘플링한 100 ㎕의 혈청(PBS-T에 녹인 1% BSA로 200배 희석), 피부 점액 및 장 점액을 1시간 동안 실온에서 ELISA 쉐이커에서 배양하였다. 이어서, VHSV-G 유전자에 대한 단클론항체(AB Frontier, Korea) 희석액(PBS-T에 녹인 1% BSA로 200배 희석)을 100μL 씩 각 웰에 첨가하고 4℃에서 밤새 반응시켰다.
MAb에 대한 흡광도를 판독하기 위해 각 플레이트의 3-well에 100μL의 MAb 200배 희석액만을 첨가했다. 플레이트를 다음 날에 세척 완충액으로 3회 세척하고 25℃에서 PBS-T으로 2,000배 희석한 2차 항체(Goat anti-mice HRP conjugate, Thermo Fisher Scientific, USA) 100 μL와 1시간 동안 항온 배양 하였다. 플레이트를 PBS-T으로 5회 완전히 세정하고, 기질 O-페닐렌 디아민 테트라 하이드로 클로라이드(OPD) 용액을 각 well에 첨가하였다. 플레이트를 어두운 곳에서 25℃에서 20분 동안 배양하였다. 그 후, 2N H2SO4 50 ㎕로 반응을 멈추고 VERSA max 마이크로 플레이트 판독기(Perkin Elmer, USA)를 사용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 다음의 식에 의해 유도된 억제 백분율로서 나타내었다.
PI = 100-(시험 혈청의 평균 OD492) × 100) /(MAbs의 평균 OD492)
3.3. 통계 분석
상이한 시점에서 모든 실험군으로부터 수집된 상이한 조직 샘플에서 혈청 및 점액 샘플에서의 VHSV-특이 항체가 및 유전자 발현을 위해 생성된 데이터를 통계 패키지 SPSS 버전 22(SPSS Inc., USA)를 사용하여 통계적으로 분석하였다. 각 데이터 세트는 그룹 내(시간 단위, 그룹 단위) 사이의 통계적 유의성을 결정하고 상호 작용 효과를 평가하기 위해 양방향 분산 분석(two-way ANOVA)을 받았다. 사후 분석은 Duncan의 multiple range test와 unpaired t-test를 사용하여 서로 다른 시점에서의 항체가 및 유전자 발현의 유의한 차이를 측정하였다. 비교는 5% 확률 수준에서 이루어졌으며 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의하다고 간주되었다. 결과는 평균 ± 표준 오차로 나타내었다.
3.4. 경쟁적 ELISA 결과 분석
RPS 분석 외에도 혈청, 피부 점액 및 장 점액에서 항-VHSV 항체를 검출하기 위해 세 가지 cELISA 세트를 사용했으며 각 cELISA에 대해 VHSV에 대한 억제율(PI) 활성을 계산했다(도 7). 본 결과는 1 차 면역 후 최소 역가로부터 시작하여 PNP 백신 접종된 군의 혈청 내 항체 역가가 증가하는 경향을 보였으며(p <0.05), 이후 부스터 투여 후 역가가 유의하게 증가하였다(p <0.05). 비 접종 대조 어류에서의 반응은 매우 낮았다. 이는 불활화된 바이러스 항원에 반응하여 백신처리된 넙치에서 항-VHSV 면역 글로불린(Ig)의 점진적 생산과 관련이 있으며, 체액 면역이 활성화되었음을 알 수 있다. 공격감염 후, 항-VHSV 억제율은 48 hpc 및 96 hpc에서 NVC 대조구를 포함한 모든 그룹에서 증가했으나, 백신 접종군의 억제율은 80% 이상, 백신 비접종군은 40%로 백신접종군의 억제율이 현저하게 높았다(p<0.05).
캡슐화된 백신은 전신적인(혈청 항체) 면역 반응을 유도할 뿐만 아니라(도 7a) PNPs-IV의 점막 부위(전달 경로 특이성), 피부(도 7b) 및 장(도 7c)에서 국소적으로 면역 반응을 유도할 수 있었다. 그 결과는 항원 자극 후 48시간에 PNP-IV(침지/침지) 백신의 피부 점액에서 항체 활성이 가장 많이 증가한 것으로 나타났다. 이것은 침지백신이 skin associated lymphoid tissue(SALT)를 활성화시키는 것으로 설명 될 수 있는데, 이 SALT는 백신 접종 후 피부 점액에서 항체 역가를 증가시킨다.
또한, 모든 실험 시점에서 백신처리를 하지 않은 어류를 포함한 모든 실험 어류군에서 피부 점액의 항체(항-VHSV)가 높았는데 이는 어류의 피부 점액이 선천적인 항균성을 가지므로 백신을 하지 않은 정상적인 상황에서도 미생물의 부착과 진입을 회피하는데 쓰여질 수 있는 가능성을 나타낸다. 마찬가지로, PNPs-IV(침지/경구) 군에서 경구나노 백신 접종으로 장내 항원 림프절 조직(GALT)이 유도되었는데 이는 항-VHSV 항체 역가가 40% 이상 증가하는 결과로 나타났다. 혈청, 피부 및 장 점액에서 특이적인 항체 반응 분석으로부터, 전신 면역 반응만이 유도되는 주사 백신과는 달리, 구강 내 또는 침지 경로에 의한 백신의 투여는 전신 면역 반응 및 점막 면역 반응 모두를 자극하여 바이러스 공격으로부터 더 폭넓은 방어력을 제공할 수 있을 것으로 생각된다.
실시예 4. 면역 관련 유전자의 발현
4.1. 신장, 피부 및 장 조직 수집
신장은 두신을 취하여 바로 -80℃에 보관하였다. 피부는 상기 3.1의 방법과 같이 피부점액을 채취한 후 킴와이프로 물기를 제거한 후 근육으로부터 피부를 벗겨 바로 -80℃에 보관하였다. 장은 상기 3.1의 방법과 같이 장을 3등분 한 후 각각으로부터 일부를 잘라내어 -80℃에 보관하였다.
4.2. RNA 분리 및 cDNA 합성
제조 회사의 프로토콜에 따라 RNAiso Plus(Takara Bio Inc, Japan)를 사용하여 신장, 장 및 피부 조직으로부터 총 RNA를 추출하고 NanoDropTM 1000 분광 광도계(Thermo Fisher Scientific, USA)로 RNA의 양을 측정하였다. 잔류 게놈 DNA는 RNase-free DNase I(Takara Bio Inc, Japan)을 사용하여 제거하였다. ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo, Japan)를 사용하여 올리고-dT 프라이머와 ReverTra Ace 역전사 효소를 사용하여 10 μL 반응 부피로 총 RNA(1μg)를 first-strand cDNA로 역전사시켰다. 생성된 cDNA는 -20℃에서 보관하였다.
4.3. 실험 시료에서 면역 유전자의 정량적 발현 분석
면역 관련 유전자에 대한 유전자 특이적 프라이머는 NCBI 데이터베이스의 이용 가능한 서열에 기초한 Primer3Plus를 사용하여 디자인하였다(표 1). 넙치 β-액틴을 하우스 키핑 유전자로 선택하고 유전자 발현에 사용된 모든 프라이머를 표 1에 열거하였다. 유전자 발현 분석을 위해, ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(Bioneer, 한국)에서 SYBR Green AccuPower® PCR PreMix(Bioneer)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 각 유전자의 상대적인 정량화를 위해, 실험군과 비 실험군의 신장, 피부 및 장 조직으로부터 합성 된 cDNA를 주형으로 사용하였다. 반응은 94℃에서 10분간의 초기 변성, 20초 변성(94℃), 어닐링(온도는 표 1에 주어진다) 및 스캐닝을 35 사이클 수행 한 20㎕의 최종 반응 부피에서(2회 반복) 수행하였다. 임계주기(Ct) 값은 Bioneer ExicyclerTM 96 Real-Time PCR 시스템의 자동설정을 사용하여 결정되었다. 면역 반응의 상대적인 정량화는 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 평가하였고, 바이러스 mRNA는 정량화하였다.
Target gene GenBank acc. no Product length 정방향 프라이머(5'-3') 역방향 프라이머(5'-3') Ta
VHSV N JF792424 138 ATCTGGAGGCAAAGTGCAAG CCATGAGGTTGTCGTTGTTG 62
β-actin HQ386788 131 CCTCTTCCAGCCTTCATTC TGGTTCCTCCAGATAGCAC 56
IgM AB052744 115 GCCTCCTTCTTCTGCTCTG CCTCAGTGGATGTTGTGATT 56
IgT KX174302 150 TAATTGTTCAGTAACTCATGCCG GATTGAAGTGTTCCTATGCGTCT 56
pIgR HM536144 478 AAGGAGGAGGACTCTGGGTG TGGTGATGGGTCTGGATGG 58
MHC I AB126921 148 TCTCCCTCCTCTCCAGTCAGC GCTCATCTGGAAGGTCCCGTCAT 58
MHC II AY848955 107 GTCGTCAGGCTTCACTCTGT TCTCTTTGCCAGCTCACTTT 56
IFN-γ AB435093 126 CTACAAGCGGCGATATGATG GGAGGTTCTGGATGGTTTTG 64
Mx AB110446 159 TCACTGGATTTCCCAACCTC TGTCACTCAAACTGCTGCTG 62
TLR7 HQ845984 97 CCTGGGAAATCTGGAAGAAC TTTGAGGGAGGAGAAACTGC 62
C3 AB021653 233 CTGCGCACATTCCTGAGTTA TACTGCTGGACCATCTGCTG 58
Caspase3 JQ394697 115 ACATCATGACACGGGTGAAC TCCTTCGTCAGCATTGACAC 58
4.4. 면역 관련 유전자의 발현 분석
백신 투여 후, 공격감염 후에 신장, 피부, 장에서의 면역유전자의 발현을 분석하여 백신이 유도하는 면역반응을 알아내고자 하였다. cELISA에 의한 특이 항체의 검출결과와 일치하는 결과로 면역 글로불린(IG) 즉, IgM(도 4a) 및 IGT(도 8b)와 그 수용체 중합체 IGR(pIgR)의(도 8c) 유전자 발현이 증가하였다. 면역글로불린은 바이러스 병원체에 대한 적응면역과 관련하여 백신 효능 평가를 위한 주요 파라미터이며 구체적인 체액성 면역 반응의 지표로 간주된다. Ig 반응 이전에 어류 적응 면역 반응은 항원 제시 세포(APC)에 존재하는 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 마커에 의한 항원 제시에 의하여 B- 및 T-림프구의 활성화가 일어난다. 또한, MHC I(도 8d) 및 MHC II(도 8e)가 면역한 이후와 공격감염 이후에 백신한 그룹에서 유의적으로 증가한 것을 보였다.
또한, 본 발명은 바이러스성 백신 유효성의 중요한 표지자인 IFN-γ와 Mx 유전자의 발현 동역학을 연구하였다. IFN-γ(도 8g)와 Mx(도 8h) 유전자는 모두 나노 백신으로 백신투여 후 유의성있는 상승을 보였다. 발현 수준은 백신 접종된 어류에서 접종 후 정점에 달했고 신속하고 일시적인 항바이러스 기작을 반영 하여 궁극적으로 백신 접종군에서 숙주의 생존을 가져왔다. IFN 매개 면역 반응과는 별도로 PRR 매개 숙주 방어는 항원의 조기 발견과 다른 다운 스트림 항 바이러스 경로 유도에 중요하다. 다른 TLR중 TLR 7은 바이러스 항원인식을 담당한다. nanovaccinated 백신 접종 후 현저하게 높은 TLR7(도 8f)의 발현이 보였는데 이 항원이 성공적으로 면역반응을 유도한 것을 알 수 있다. 또한 apoptosis의 최종 실행자인 caspase3 유전자의 발현은 두 백신 그룹에서 바이러스 공격 후 48시간 후 백신그룹이 비백신그룹보다 현저하게 높은 발현을 나타내었다(도 8i).
피부와 장의 면역유전자 발현은 PNPs-IV(침지/침지) 및 PNPs-IV(침지/경구)그룹에서 피부(도 9) 및 장(도 10)에서 대부분의 면역 유전자가 현저하게 높은 발현을 나타내는 것으로 보아 PNPs-IV 면역 전략은 점막 면역 반응의 자극에 매우 효과적이라는 것을 알 수 있었다.
2개의 다른 점막 표면인 장과 피부 중, 2차 부스터 면역에서 장을 통한 경로가 항원의 흡수 및 점막 관련 림프성 조직(mucosa associated lymphoid tissue(MALT))의 자극을 보다 효율적으로 하는 것으로 여겨진다. 몇몇 연구자들은 나노 캡슐화된 바이러스성 항원의 경구 백신 접종이 전신 면역 기관과 함께 MALT에 긍정적인 영향을 미친다는 유사한 관찰을 보고하고 있다. 또한, 본 발명에서 피부 조직의 면역유전자 발현은 2차 면역(booster 면역) 후가 바이러스로 공격했을 때 보다도 높았는데(IgM, IgT, pIgR, MHC-II, IFN-γ의 높은 전사 수준) 이는 바이러스의 공격을 복강 내 주사로 했기 때문에 복강주사에 의해서는 전신면역이 증가하는 반면 피부의 점막 면역은 상대적으로 낮게 자극되기 때문인 것으로 생각되었다. 이에 반하여 장의 면역 유전자 발현은 2차 면역(booster 면역) 후와 바이러스로 공격했을 때 모두 높게 나타났다.
결론적으로, 불활화 VHSV 항원을 PLGA로 캡슐화한 것은 넙치의 VHS에 대한 보호를 위한 효과적인 백신 전략이다. 본 실험에서 관찰된 높은 RPS 값은 이전의 주사 기반 백신과 유사하여 'IV'의 나노 캡슐화가 항원에 대한 항원 보호를 제공하여 백신 효율을 향상 시킨다는 것을 시사한다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Vaccine Composition for Viral Hemorrhagic Septicemia Using PLGA <130> PN190061 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHSV N Forward Primer <400> 1 atctggaggc aaagtgcaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHSV N Reverse Primer <400> 2 ccatgaggtt gtcgttgttg 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin Forward Primer <400> 3 cctcttccag ccttcattc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin Reverse Primer <400> 4 tggttcctcc agatagcac 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgM Forward Primer <400> 5 gcctccttct tctgctctg 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgM Reverse Primer <400> 6 cctcagtgga tgttgtgatt 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgT Forward Primer <400> 7 taattgttca gtaactcatg ccg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgT Reverse Primer <400> 8 gattgaagtg ttcctatgcg tct 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pIgR Forward Primer <400> 9 aaggaggagg actctgggtg 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pIgR Reverse Primer <400> 10 tggtgatggg tctggatgg 19 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC I Forward Primer <400> 11 tctccctcct ctccagtcag c 21 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC I Reverse Primer <400> 12 gctcatctgg aaggtcccgt cat 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC II Forward Primer <400> 13 gtcgtcaggc ttcactctgt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC II Reverse Primer <400> 14 tctctttgcc agctcacttt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-gamma Forward Primer <400> 15 ctacaagcgg cgatatgatg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-gamma Reverse Primer <400> 16 ggaggttctg gatggttttg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mx Forward Primer <400> 17 tcactggatt tcccaacctc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mx Reverse Primer <400> 18 tgtcactcaa actgctgctg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR7 Forward Primer <400> 19 cctgggaaat ctggaagaac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR7 Reverse Primer <400> 20 tttgagggag gagaaactgc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 Forward Primer <400> 21 ctgcgcacat tcctgagtta 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 Reverse Primer <400> 22 tactgctgga ccatctgctg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 Forward Primer <400> 23 acatcatgac acgggtgaac 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 Reverse Primer <400> 24 tccttcgtca gcattgacac 20

Claims (10)

  1. 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)의 불활화 균체를 PLGA(Poly(D, L-lactic-co-glycolic acid))로 캡슐화한 직경 450 내지 500 nm의 나노구(nanosphere)를 포함하는 넙치과(Paralichthyidae) 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물로서,
    상기 조성물은 1차 면역 침지 투여 및 2차 면역 경구 투여되며,
    상기 1차 면역 침지 투여는 백신 조성물을 물과 1:100의 부피비로 혼합한 용액에 2시간 동안 침지하는 것이고,
    상기 2차 면역 경구 투여는 백신 조성물을 포함한 사료를 1일 2회 투여하고, 총 2일 동안 투여하는 것인,
    바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 사료는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 불활화 균체를 PLGA로 캡슐화한 직경 450 내지 500 nm의 나노구가 사료펠렛에 담지되어 있고, HPMC 및 TEC로 코팅된 것인, 넙치과 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  4. 삭제
  5. 하기의 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 (Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)의 불활화 균체를 PLGA (Poly(D, L-lactic-co-glycolic acid))로 캡슐화한 직경 450 내지 500 nm의 나노구 (nanosphere)를 포함하는 넙치과 (Paralichthyidae) 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제조하는 방법:
    바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 불활화시키는 단계;
    불활화된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 유기용매에 녹인 PLGA와 혼합하는 단계;
    비이온성 계면활성제를 첨가하여 1차 균질화하는 제1차 균질화 단계;
    PVA (poly vinyl alcohol) 용액을 첨가하여 2차 균질화하는 제2차 균질화 단계; 및
    유기용매를 제거하는 단계;
    를 포함하고, 상기 조성물은 1차 면역 침지 투여 및 2차 면역 경구 투여되며,
    상기 1차 면역 침지 투여는 백신 조성물을 물과 1:100의 부피비로 혼합한 용액에 2시간 동안 침지하는 것이고,
    상기 2차 면역 경구 투여는 백신 조성물을 포함한 사료를 1일 2회 투여하고, 총 2일 동안 투여하는 것이다.
  6. 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)의 불활화 균체를 PLGA(Poly(D, L-lactic-co-glycolic acid))로 캡슐화한 직경 450 내지 500 nm의 나노구(nanosphere)를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 물과 1:100의 부피비로 혼합한 용액에 넙치과(Paralichthyidae) 어류를 2시간 동안 침지하는 1차 면역 침지 투여 단계; 및
    바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 불활화 균체를 PLGA로 캡슐화한 직경 450 내지 500 nm의 나노구를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 포함한 사료를 1일 2회 투여하고, 총 2일 동안 투여하는 2차 면역 경구 투여 단계;를 포함하는 넙치과 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 예방 또는 치료 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 사료는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 불활화 균체를 PLGA로 캡슐화한 직경 450 내지 500 nm의 나노구가 사료펠렛에 담지되어 있고, HPMC 및 TEC로 코팅된 것인, 넙치과 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 예방 또는 치료 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 2차 면역 경구 투여 단계는 1차 면역 침지 투여 단계 실시 14일 후에 수행하는 것인, 넙치과 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 예방 또는 치료 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
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