CN116059334A - 禽霍乱多价亚单位疫苗、多联疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

禽霍乱多价亚单位疫苗、多联疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116059334A
CN116059334A CN202211127998.2A CN202211127998A CN116059334A CN 116059334 A CN116059334 A CN 116059334A CN 202211127998 A CN202211127998 A CN 202211127998A CN 116059334 A CN116059334 A CN 116059334A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plpe
protein
vaccine
avian
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211127998.2A
Other languages
English (en)
Inventor
马景霞
朱杰
王楠
杨灵芝
李香云
杨平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Binzhou Wohua Biotech Engineering Co ltd
Original Assignee
Shandong Binzhou Wohua Biotech Engineering Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Binzhou Wohua Biotech Engineering Co ltd filed Critical Shandong Binzhou Wohua Biotech Engineering Co ltd
Priority to CN202211127998.2A priority Critical patent/CN116059334A/zh
Publication of CN116059334A publication Critical patent/CN116059334A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了一种禽霍乱多价亚单位疫苗、多联疫苗及其应用。本发明中禽霍乱多价亚单位疫苗包括L1‑plpE蛋白、L3‑plpE蛋白以及兽医学上可接受的佐剂；其中，L1‑plpE蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.3；L3‑plpE蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。此外，本发明还提供了多联疫苗，本发明提供的禽霍乱多价亚单位疫苗和多联疫苗均具有良好的安全性，且对禽多杀性巴氏杆菌A：L1型和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型禽霍乱具有良好的保护效果。

Description

禽霍乱多价亚单位疫苗、多联疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于家禽疫苗制备技术领域，具体涉及一种禽霍乱多价亚单位疫苗、多联疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
多杀性巴氏杆菌是一种能引起多种动物发病的革兰阴性细菌，在禽类中引起的疾病被称为禽霍乱或禽巴氏杆菌病。多杀性巴氏杆菌根据荚膜成分的不同可分为A、B、D、E、F五种血清型，根据脂多糖基因的不同可分为L1-L8八种基因型，在我国引起禽霍乱的血清型主要为A：L1型，其次为A：L3型。
禽霍乱是由禽多杀性巴氏杆菌引起的家禽及野生鸟类的接触性烈性传染性疾病，该病在我国多地均有报道，且一旦发病，常引起重大的经济损失。目前，预防禽霍乱的主要措施是使用疫苗。目前市场上主要存在全细胞灭活疫苗和弱毒活疫苗两种：全细胞灭活疫苗无交叉保护效果，要达到对同型菌株较好的保护效果，需加入大量的灭活细菌，因革兰阴性菌中固有的内毒素成分，疫苗注射后会引起过度的炎症反应，常引起免疫动物出现免后应激以及疫苗注射部位吸收不良的情况，影响养殖效益；使用弱毒活疫苗存在毒力返强的风险，常不被养殖户接受。目前国内在售的疫苗全部为针对A：L1型的，无法针对禽多杀性巴氏杆菌A：L3型进行免疫。而在实际养殖过程中，禽多杀性巴氏杆菌A：L3型也是一种常见的容易引起禽霍乱的病菌，为了在对禽多杀性巴氏杆菌A：L1型进行免疫的同时也能对禽多杀性巴氏杆菌A：L3型进行免疫，我公司特地开发了一种可有效预防禽多杀性巴氏杆菌A：L1型和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型的禽霍乱多价亚单位疫苗。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种禽霍乱多价亚单位疫苗、多联疫苗的制备方法及其应用。
一种禽霍乱多价亚单位疫苗，所述禽霍乱多价亚单位疫苗包括L1-plpE蛋白、L3-plpE蛋白以及兽医学上可接受的佐剂；其中，所述L1-plpE蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.3；所述L3-plpE蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
优选地，所述L1-plpE蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；所述L3-plpE蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
一种用于表达L1-plpE蛋白的重组载体，所述重组载体包含如权利要求1所述的L1-plpE蛋白的编码基因。
优选地，所述L1-plpE蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
一种用于表达L3-plpE蛋白的重组载体，所述重组载体包含如权利要求1所述的L3-plpE蛋白的编码基因。
优选地，所述L3-plpE蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
优选地，所述佐剂包括油佐剂、铝胶佐剂、水佐剂、细胞因子佐剂。
优选地，所述佐剂为油佐剂。
一种宿主细胞，由用于表达L1-plpE蛋白的重组载体和用于表达L3-plpE蛋白的重组载体转化受体细胞而得。
一种多联疫苗，所述多联疫苗包括L1-plpE蛋白、L3-plpE蛋白以及兽医学上可接受的佐剂，还包括一种或者多种病原体抗原。
优选地，所述病原体抗原包括新城疫病毒抗原、禽流感病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原、传染性法氏囊病毒抗原、减蛋综合征病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、禽腺病毒抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、鸡传染性贫血病毒抗原、鸡传染喉气管炎病毒抗原、滑液囊支原体抗原、鸡毒支原体抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原或沙门菌抗原。
上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗禽多杀性巴氏杆菌A：L1型和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型禽霍乱的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供的禽霍乱多价亚单位疫苗对A：L1型禽多杀性巴氏杆菌和A：L3型禽多杀性巴氏杆菌均有保护效果，当疫苗中重组蛋白L1-plpE的组分含量和重组蛋白L3-plpE的组分含量均达到25μg/mL时，可完全保护A：L1型禽多杀性巴氏杆菌和A：L3型菌株禽多杀性巴氏杆菌致死剂量下的攻毒；此外，本发明提供的禽多杀性巴氏杆菌、新城疫Lasota二联灭活疫苗对禽多杀性巴氏杆菌A：L1型菌株和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型菌株也具备良好的保护能力，当禽多杀性巴氏杆菌、新城疫Lasota二联灭活疫苗中重组蛋白L1-plpE的组分含量和重组蛋白L3-plpE的组分含量均达到25μg/mL时，对禽多杀性巴氏杆菌A：L1型菌株和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型菌株也能达到100%保护；
而且，本申请制备的禽霍乱多价亚单位疫苗中重组蛋白L1-plpE和重组蛋白L3-plpE之间不仅无免疫干扰，而且相对于只具有单一重组蛋白L1-plpE或者重组蛋白L2-plpE作为抗原的疫苗具有更好的抗体产生能力，而本申请制备的多联疫苗中新城疫Lasota抗原对于重组蛋白L1-plpE或者重组蛋白L2-plpE的抗体水平也无不良影响，一针免疫即能够同时预防两种疾病。
此外，本发明还提供了该疫苗的制备方法，本发明通过基因工程手段对蛋白抗原进行大肠杆菌外源高效表达，提纯出纯度高、内毒素含量低的蛋白抗原，本申请制备的重组蛋白L1-plpE的纯度为70%，重组蛋白L3-plpE的纯度为62%，而通过对得到的重组蛋白L1-plpE溶液和重组蛋白L3-plpE溶液中的内毒素检测发现，重组蛋白L1-plpE溶液和重组蛋白L3-plpE溶液中的内毒素含量均在25-250EU/mL之间，相较于传统的层析方法，该方法操作简便，成本显著降低，适用于规模化生产。
此外，本申请在构建重组蛋白时，采用的是全长基因表达，该种方式保留了该蛋白完整的线性化抗原表位，且其蛋白结构与天然蛋白的结构更相似，除线性化抗原表位外，更有可能提供该蛋白抗原的结构表位，从而在免疫后产生的抗体更易与天然的细菌蛋白结合，从而杀灭细菌。
附图说明
图1为plpE基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；图中，M：DL2000 DNA Maker、1：阴性对照，2：禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因扩增产物，3 ：禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因扩增产物；
图2为BL21-L1-plpE与BL21-L3-plpE诱导表达鉴定SDS-PAGE图；图中，M：蛋白maker，1：诱导后的BL21-L1-plpE菌体上清，2 ：BL21-L1-plpE沉淀物重悬液，3：诱导后的BL21-L3-plpE菌体上清，4：BL21-L3-plpE沉淀物重悬液；
图3为诱导后的空质粒菌以及未诱导的重组表达菌株BL21-L1-plpE和BL21-L3-plpE的SDS-PAGE鉴定图；图中，M：蛋白maker，1: 诱导后的空质粒菌，2：未诱导的重组表达菌株——步骤2.1中得到的重组表达菌株BL21-L1-plpE，3：未诱导的重组表达菌株——步骤2.1中得到的重组表达菌株BL21-L3-plpE；
图4为重组蛋白L1-plpE溶液和重组蛋白L3-plpE溶液的SDS-PAGE鉴定图；图中，M：蛋白maker，1：步骤3.1中得到的重组蛋白L1-plpE溶液，2：步骤3.1中得到的重组蛋白L3-plpE溶液。
具体实施方式
以下实例列出了本发明的优选实施方案，但是，应理解，提供这些实施例是为了说明，而不是限制本发明的总体范围。本发明所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。
一、禽多杀性巴氏杆菌L1-plpE和L3-plpE基因重组质粒的构建
1.1 引物设计
根据禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因序列（GenBank: GU108958.1）和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因序列（GenBank: EF219456.1），使用SignalP进行基因信号肽预测，分别选取去除信号肽的序列作为预表达的基因片段；
按照预表达的基因片段，利用Primer5.0软件设计一对通用引物，使得禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因、禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因的上下游5’端分别引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点及保护性碱基，便于后续用于扩增禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因的序列，预期基因序列禽多杀性巴氏杆菌A：L1型的plpE基因序列为951bp，禽多杀性巴氏杆菌A：L3型的plpE基因序列为948bp。引物序列见表1，上游引物（plpE-F）为SEQ ID NO.5，下游引物（plpE-R）为SEQ ID NO.6，上下游引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
表1 引物序列
基因 上游引物（plpE-F） 下游引物（plpE-R）
plpE <![CDATA[CG<u>GGATCC</u>tgtagcggtggtggcggt]]> <![CDATA[CCG<u>CTCGAG</u>TTATTGTGCTTGGTGACTTT]]>
1.2 禽多杀性巴氏杆菌基因组DNA的提取
分别将禽多杀性巴氏杆菌A：L1型C48-1株（购自中国兽医药品监察所，编号CVCC44801）和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型P-1662株（购自中国兽医药品监察所，编号CVCC413）菌种划线接种于改良马丁琼脂平板，37℃培养24h，而后，分别刮取少量菌苔用试剂盒分别提取禽多杀性巴氏杆菌A：L1型C48-1株的基因组DNA和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型P-1662株的基因组DNA。
1.3plpE基因PCR扩增
将步骤1.2中提取的禽多杀性巴氏杆菌A：L1型C48-1株的基因组DNA和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型P-1662株的基因组DNA分别利用PCR进行扩增，分别得到禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因扩增产物和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因扩增产物。
其中，PCR反应体系为：2×buffer 25μL、高保真酶1μL、dNTP 1μL、plpE-F（20μM） 1μL、plpE-R（20μM）1μL、模板基因组（即步骤1.2中提取的禽多杀性巴氏杆菌A：L1型C48-1株的基因组DNA和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型P-1662株的基因组DNA） 2μL，而后超纯水补至50μL。
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。而后，禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因扩增产物和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因扩增产物均使用1%凝胶进行电泳检测，检测结果如图1所示。
1.4重组载体的构建（即L1-plpE基因重组质粒和L3-plpE基因重组质粒的构建）
将步骤1.3中得到的PCR产物（即禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因扩增产物和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因扩增产物）分别使用胶回收试剂盒进行胶回收，得到禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因。
取禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因以及pET-28a-sumo质粒载体（购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，本申请中pET-28a-sumo质粒载体为一种具体的基础表达载体），而后分别利用40μL酶切体系对其进行酶切，而后将三种酶切产物分别进行胶回收，得禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因片段、禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因片段和pET-28a-sμMo质粒载体片段。其中，40μL酶切体系如下：待双酶切物33μL、BamHⅠ 1.5μL、XhoⅠ 1.5μL、10×K buffer 4μL；酶切条件为：37℃酶切3h，得酶切产物，其中，待双酶切物是指PCR产物、pET-28a-sumo质粒载体，PCR产物是指禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因扩增产物和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因扩增产物。
而后将禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因片段和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因片段分别与pET-28a-sumo质粒载体片段用T4连接酶进行16℃过夜连接，得禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因过夜连接产物和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因过夜连接产物；其中，禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因片段与pET-28a-sumo质粒载体片段的摩尔质量比为3:1；禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因片段与pET-28a-sumo质粒载体片段的摩尔质量比为3:1。
而后，取5μL禽多杀性巴氏杆菌A：L1型plpE基因过夜连接产物和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型plpE基因过夜连接产物分别加入到50μL DH5α感受态细胞（购自生工生物工程(上海)股份有限公司）中进行轻弹混匀，并分别在冰上放置30min，42℃热激60s，冰浴2min；而后加入500μL LB培养基，37℃摇床培养1h后，而后分别取100μL菌液加入到含50ug/mL卡那霉素的LB琼脂培养基中，37℃过夜培养，得pET-L1-plpE目标菌落和pET-L3-plpE目标菌落。
1.5 L1-plpE基因重组质粒和L3-plpE基因重组质粒的鉴定
分别挑取2-3个pET-L1-plpE目标菌落和pET-L3-plpE目标菌落，并转接到含对应抗生素的培养基中，当菌液变浑浊后，使用扩增目的基因的引物即上下游引物，进行菌液PCR鉴定，鉴定阳性的菌液，取0.5mL送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。经测序鉴定序列正确的重组质粒分别命名为pET-L1-plpE重组质粒和pET-L3-plpE重组质粒。
二、禽多杀性巴氏杆菌L1-plpE和L3-plpE蛋白表达菌株的构建
2.1 重组质粒转化入BL21（DE3）菌株
分别取步骤1.5）中测序鉴定序列正确的pET-L1-plpE重组质粒和pET-L3-plpE重组质粒，将其转化入BL21（DE3）菌株（购自生工生物工程(上海)股份有限公司），转化方法与步骤1.4）方法一致，分别得到重组表达菌株BL21-L1-plpE和重组表达菌株BL21-L3-plpE。
2.2 阳性表达菌株的鉴定
PCR鉴定：分别挑取步骤2.1中制备的重组表达菌株BL21-L1-plpE的菌落和重组表达菌株BL21-L3-plpE的菌落，而后摇菌，而后分别进行菌液PCR鉴定，PCR反应体系、反应程序与步骤1.3）中方法一致，菌液PCR鉴定与步骤1.5中方法相同。
诱导表达鉴定：取步骤2.2中PCR鉴定阳性的BL21-L1-plpE菌液和BL21-L3-plpE菌液，分别转接到200mL含50ug/mL卡那霉素的LB培养基中，当菌液生长至OD600为 0.4-0.6时，分别加入终浓度0.1mM IPTG溶液，37℃诱导4-6h，而后分别离心收集菌体，得诱导后的BL21-L1-plpE表达菌株和BL21-L3-plpE表达菌株。而后，分别使用20mL 纯化水重悬诱导后的BL21-L1-plpE菌体和诱导后的BL21-L3-plpE菌体，而后分别超声波裂解后12000rpm离心30min，而后分别取出诱导后的BL21-L1-plpE菌体的全部上清和沉淀物以及诱导后的BL21-L3-plpE菌体全部上清和沉淀物，而后将诱导后的BL21-L1-plpE菌体的沉淀物和诱导后的BL21-L3-plpE菌体的沉淀物再分别用20mL纯化水重悬，得BL21-L1-plpE沉淀物重悬液和BL21-L3-plpE沉淀物重悬液。
而后分别取诱导后的BL21-L1-plpE菌体上清和BL21-L1-plpE沉淀物重悬液以及诱导后的BL21-L3-plpE菌体上清和BL21-L3-plpE沉淀物重悬液各40μL，分别加入到10μL 5×SDS Loading Buffer中，分别混匀后于沸水中煮沸5-10min，而后分别进行SDS-PAGE电泳测试。SDS-PAGE电泳测试结果如图2所示。
从图2中可以看出，诱导后的BL21-L1-plpE表达菌株和BL21-L3-plpE表达菌株均在50kda附近出现条带，与预期蛋白大小基本一致，且表达产物均在裂解后的上清中，表明均为可溶性表达。
此外，本申请还对空质粒菌进行了诱导表达，其诱导表达方式同步骤2.2中阳性表达菌株的诱导表达方式相同，而后，又进一步对未诱导的重组表达菌株（也就是步骤2.1中得到的重组表达菌株BL21-L1-plpE和重组表达菌株BL21-L3-plpE）及诱导后的空质粒菌均进行了SDS-PAGE电泳测试，测试结果如图3所示，从图3中可以看出未诱导的重组表达菌株及诱导后的空质粒菌均未出现目的条带。
三、重组蛋白L1-plpE和L3-plpE的纯化
3.1重组蛋白L1-plpE和L3-plpE的纯化
基于L1-plpE蛋白和L3-plpE蛋白对盐离子浓度敏感的特性，优化纯化方法，具体方法如下：
分别取步骤2.2中37℃诱导4-6h后得到的诱导表达后的BL21-L1-plpE菌液和BL21-L3-plpE菌液各500mL，并分别离心收集菌体，而后分别重悬于50mL 纯化水中，而后分别超声波裂解后12000rpm离心10min，而后分别取出全部上清，然后加入0.8%（M/V）的氯化钠，此时蛋白溶液变浑浊，L1-plpE蛋白与L3-plpE蛋白均发生沉淀，而后分别12000rpm离心10min，分别取出全部沉淀，而后分别用纯化水溶解，即得初步纯化蛋白液（即L1-plpE初步纯化蛋白液、L3-plpE初步纯化蛋白液）。
而后再分别向初步纯化蛋白溶液（即L1-plpE初步纯化蛋白液、L3-plpE初步纯化蛋白液）中，各分别加入1%（V/V）的曲拉通X-114，分别充分混匀后置于4℃静置2h，而后将其回温至30℃，而后分别12000rpm离心10min，收集上清液，如此重复三次，得二次纯化蛋白液（即L1-plpE二次纯化蛋白液、L3-plpE二次纯化蛋白液），而后将二次纯化蛋白液（即L1-plpE二次纯化蛋白液、L3-plpE二次纯化蛋白液）分别用0.22μm滤器过滤除菌，得重组蛋白L1-plpE溶液和重组蛋白L3-plpE溶液。
3.2 重组蛋白L1-plpE和L3-plpE的定量
将步骤3.1中得到的重组蛋白L1-plpE溶液和重组蛋白L3-plpE溶液分别进行SDS-PAGE检测，利用TanonGIS软件分析重组蛋白的纯度，分析结果如图4所示，从图4可知：重组蛋白L1-plpE(即L1-plpE蛋白)的纯度为70%，重组蛋白L3-plpE(即L3-plpE蛋白)的纯度为62%，纯度均在60%以上。
此外，本申请还利用BCA试剂盒测定蛋白浓度，重组蛋白L1-plpE二次纯化蛋白液的浓度为1.5mg/mL，重组蛋白L3-plpE二次纯化蛋白液的浓度为2.4mg/mL。经分析可知，重组蛋白L1-plpE溶液中的L1-plpE蛋白浓度为1.05mg/mL，重组蛋白L3-plpE溶液中的L3-plpE蛋白浓度为1.49mg/mL。
3.3 重组蛋白L1-plpE和L3-plpE的内毒素测定
分别取步骤3.1中得到的重组蛋白L1-plpE溶液和重组蛋白L3-plpE溶液，使用内毒素检测试剂盒（凝胶法）测定其内毒素，内毒素含量在25-250EU/mL之间。
四、禽霍乱多价亚单位疫苗的制备及效果检验
4.1禽霍乱多价亚单位疫苗的制备
将重组蛋白L1-plpE溶液、重组蛋白L3-plpE溶液、吐温-80以及PBS缓冲液按照体积比为(1-10): (1-10)：(1-6.5):（20-30）的比例进行混合制备水相，而后再将水相与进口白油按(1-2): (2-4)体积比混合乳化制成不同抗原含量的禽霍乱多价亚单位疫苗。另外，为了对比禽霍乱二价亚单位疫苗与只具有单一重组蛋白L1-plpE或者重组蛋白L2-plpE作为抗原的疫苗在免疫上的差别，本申请还特地制备了疫苗1-4，疫苗1-4用于为禽霍乱二价亚单位疫苗即疫苗5-6形成对比，疫苗1-6中不同抗原组分见表2。
表2不同疫苗中抗原组分及其含量
4.2禽霍乱多价亚单位疫苗的检验
4.2.1 安全性检验
取4周龄SPF鸡70羽，分为7组，10羽/组，利用步骤四中制备的禽霍乱多价亚单位疫苗1～6分别给六组SPF鸡进行注射作为免疫组，另一组SPF鸡作为对照组。免疫组各组SPF鸡颈部均皮下注射疫苗1.0mL/羽，连续观察14日。结果显示：疫苗1～6免疫的SPF鸡观察14日均未见不良反应，精神状态良好，采食、饮水正常，无死亡情况。14日后解剖，注射部位可见部分疫苗残留，但未见硬结、脓肿和溃烂等不良反应。证明本申请制备的禽霍乱多价亚单位疫苗对SPF鸡具有良好的安全性。
4.2.2 效力检验
4.2.2.1 攻毒保护检验
取4周龄SPF鸡10羽，分为10组，10羽/组，用于免疫实施例4制备的禽霍乱多价亚单位疫苗。第1组免疫疫苗1，第2组免疫疫苗2，第3组免疫疫苗3，第4组免疫疫苗4，第5~6组免疫疫苗5，第7~8组免疫疫苗6，第9~10组为对照组不免疫。各免疫组均采用颈部皮下途径接种0.5mL疫苗，免后21天进行攻毒。第1、2、5、7、9组，腿部肌肉注射A：L1型禽多杀性巴氏杆菌C48-1株，10CFU/羽；第3、4、6、8、10组，腿部肌肉注射A：L3型禽多杀性巴氏杆菌P-1662株，5×109CFU/羽。攻毒后连续观察14日，统计动物的发病死亡情况，攻毒保护结果见表4。结果显示，针对A：L1型禽多杀性巴氏杆菌C48-1菌株，疫苗1、5、6均能提供100%保护，疫苗2可提供60%的保护；针对A：L3型禽多杀性巴氏杆菌P-1662菌株，疫苗3、5、6均能提供100%保护，疫苗4可提供50%的保护。
因此，本发明提供的禽霍乱多价亚单位疫苗对A：L1型禽多杀性巴氏杆菌和A：L3型禽多杀性巴氏杆菌均有保护效果，尤其是疫苗5、6可完全保护A：L1型禽多杀性巴氏杆菌和A：L3型菌株禽多杀性巴氏杆菌致死剂量下的攻毒，且疫苗6在抗原含量为有效抗原含量的1/2的情况下，仍可完全保护A：L1型禽多杀性巴氏杆菌和A：L3型菌株禽多杀性巴氏杆菌致死剂量下的攻毒。
表3禽霍乱多价亚单位疫苗攻毒保护结果
4.2.2.2 抗体检验
取4.2.2.1中第1、2、3、4、5、7、9组动物，在免疫后21天，全部进行翅静脉采血，分离血清，以备抗体水平测定。
抗体水平测定使用间接ELISA方法，具体来说，就是取3.2中制备的重组蛋白L1-plpE溶液和重组蛋白L3-plpE溶液，以5μg/孔L1-plpE蛋白或L3-plpE蛋白包被酶标板，采用5%牛血清白蛋白封闭液，4℃封闭过夜，待检血清100倍稀释后按100μL/孔加入到酶标板中，37℃孵育1h，以兔抗鸡IgG-HRP为二抗，通过TMB底物显示，检测OD450值；第1、2、5、7、9组动物血清，使用L1-plpE蛋白包被酶标板，测定血清中抗L1-plpE蛋白抗体的水平。第3、4、5、7、9组动物血清，使用L3-plpE蛋白包被酶标板，测定血清中抗L3-plpE蛋白抗体的水平，结果如表4所示。
从表4中可以看出，免疫了疫苗1（仅有重组蛋白L1-plpE，且重组蛋白L1-plpE在疫苗1中的组分浓度为50μg/mL）的第一组，动物血清中产生的L1-plpE抗体的OD450为1.045±0.088b；免疫了疫苗3（仅有重组蛋白L3-plpE，且重组蛋白L3-plpE在疫苗3中的组分浓度为50μg/mL）的第三组，动物血清中产生的L3-plpE抗体的OD450为1.158±0.128b；而免疫了疫苗5（有重组蛋白L1-plpE和重组蛋白L3-plpE，且重组蛋白L1-plpE、重组蛋白L3-plpE在疫苗5中的组分浓度均为50μg/mL）的第五组，动物血清中产生的L1-plpE抗体的OD450为1.225±0.107a（大于第一组L1-plpE抗体OD450——1.045±0.088b），第五组动物血清中产生的L3-plpE抗体的OD450的1.359±0.151a （大于第三组L3-plpE抗体OD450——1.158±0.128b）；
同理，免疫了疫苗2（仅有重组蛋白L1-plpE，且重组蛋白L1-plpE在疫苗1中的组分浓度为25μg/mL）的第二组，动物血清中产生的L1-plpE抗体的OD450为0.724±0.152c；免疫了疫苗4（仅有重组蛋白L3-plpE，且重组蛋白L3-plpE在疫苗3中的组分浓度为25μg/mL）的第四组，动物血清中产生的L3-plpE抗体的OD450为0.713±0.208c；而免疫了疫苗6（有重组蛋白L1-plpE和重组蛋白L3-plpE，且重组蛋白L1-plpE、重组蛋白L3-plpE在疫苗5中的组分浓度均为25μg/mL）的第七组，动物血清中产生的L1-plpE抗体的OD450为1.007±0.096b（大于第二组的0.724±0.152c），产生的L3-plpE抗体的OD450为1.019±0.123b（大于第四组的0.713±0.208c）。
综上可知，具有有重组蛋白L1-plpE和重组蛋白L3-plpE的禽霍乱多价疫苗在L1-plpE抗体和L3-plpE抗体的表达水平上要优于同等抗原浓度下只具有重组蛋白L1-plpE或者重组蛋白L3-plpE的疫苗。这说明本申请制备的二价疫苗中重组蛋白L1-plpE蛋白和重组蛋白L3-plpE在免疫表达时，不仅无相互干扰，而且还可以促进彼此的免疫效果。
表4 抗体水平测定结果
（1）数据为平均值±标准差；（2）肩标不同小写字母表示差异显著(P<0．05)，相同字母表示差异不显著（P>0.05)。
五、禽多杀性巴氏杆菌、新城疫Lasota二联灭活疫苗的制备及效果检验
5.1新城疫Lasota株抗原的制备
新城疫Lasota株（购自中国兽医药品监察所，编号 CVCC AV1615）用灭菌生理盐水稀释10000倍，0.1mL/枚接种20枚10日龄SPF鸡胚尿囊腔，用蜡封孔后置37℃孵育，取出96-120h死亡鸡胚及120h活鸡胚，冷却12-18h，取出鸡胚液并混合均匀，测定新城疫抗原的HA和EID50分别为9.5/0.1mL和10-6.6/0.1mL。而后将测定好效价的鸡胚液加入终浓度0.1%的甲醛，充分混合后，37℃灭活16h，得新城疫Lasota株抗原。
5.2禽多杀性巴氏杆菌、新城疫Lasota二联灭活疫苗的制备
利用步骤3.1制备的重组蛋白L1-plpE溶液、重组蛋白L3-plpE溶液以及步骤5.1制备的新城疫Lasota株抗原制备禽多杀性巴氏杆菌、新城疫Lasota二联灭活疫苗，即疫苗7。疫苗7的制备方法，具体为：将重组蛋白L1-plpE溶液、重组蛋白L3-plpE溶液、新城疫Lasota株抗原、吐温-80以及PBS缓冲溶液按照体积比为(1-10): (1-10)：(20-35)：(1-6)：(20-30)的比例进行混合制备水相，而后再将水相与进口白油按（1-2）:（2-4）体积比混合乳化制成禽多杀性巴氏杆菌、新城疫Lasota二联灭活疫苗。
为了验证疫苗7中重组蛋白L1-plpE和重组蛋白L3-plpE对新城疫Lasota抗原免疫的干扰情况，本申请特地制备了疫苗8，疫苗8中不含有步骤3.1制备的重组蛋白L1-plpE溶液和重组蛋白L3-plpE溶液而是仅含有新城疫Lasota株抗原，且疫苗8中新城疫Lasota株抗原与疫苗7中新城疫Lasota株抗原含量相同。疫苗7和疫苗8中不同抗原组分见表5。
表5 疫苗抗原组分及其含量
5.3.1 安全性检验
取4周龄SPF鸡20羽，分为2组，10羽/组，免疫步骤5.2中制备的禽多杀性巴氏杆菌、新城疫Lasota二联灭活疫苗。各组颈部皮下注射疫苗1.0mL/羽，连续观察14日。结果显示上述各疫苗免疫SPF鸡观察14日均未见不良反应，精神状态良好，采食、饮水正常，无死亡情况。14日后解剖，注射部位可见部分疫苗残留，但未见硬结、脓肿和溃烂等不良反应。证明本申请制备的疫苗7和疫苗8对SPF鸡具有良好的安全性。
5.3.2 新城疫效力检验
取4周龄SPF鸡30羽，分为3组，10羽/组。第11组免疫疫苗7、第12组免疫疫苗8，第13组不免疫作为对照组，免疫组免疫步骤5.2制备的疫苗，具体来说就是对该组10羽SPF鸡进行颈部皮下注射步骤5.2中制备的疫苗，0.5mL/羽。免疫后21天，对全部试验鸡分别采血，分离血清，测定新城疫HI效价，结果如表6所示，疫苗7免疫鸡HI抗体效价的算数平均值为8.5±1.0 log2，疫苗8免疫鸡HI抗体效价的算数平均值为8.2±0.5 log2，对照鸡HI抗体效价的算数平均值均≤2log2，符合效力检验标准。而且，根据根据国标可知，当HI抗体检验结果大于等于4log2时，SPF鸡即可得到100%保护，显然，本申请制备的疫苗7免疫鸡的HI抗体效价的算数平均值为8.5±1.0 log2，疫苗8免疫鸡HI抗体效价的算数平均值为8.2±0.5log2，都显著大于4log2，说明本申请制备的疫苗7、8对于SPF鸡具有非常好的免疫效果。本申请制备的疫苗7与疫苗8免疫鸡的HI抗体效价接近，且无显著差异，说明重组蛋白L1-plpE和重组蛋白L3-plpE对新城疫Lasota抗原无免疫干扰。
表6 禽多杀性巴氏杆菌、新城疫二联灭活疫苗新城疫部分效力检验结果
注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的算数平均值，标示为X±SD，X代表平均数，SD代表标准差。
5.3.3 禽多杀性巴氏杆菌效力检验
5.3.3.1 攻毒保护检验
取4周龄SPF鸡80羽，分为8组，10羽/组，免疫步骤5.2制备的疫苗7、疫苗8以及步骤4.1制备的疫苗6。其中，第14、15组免疫疫苗7，第16、17组免疫疫苗6，第18、19组免疫疫苗8，第20、21组为对照组不免疫。各免疫组均采用颈部皮下途径接种0.5mL疫苗，免后21天进行攻毒。第14、16、18、20组，腿部肌肉注射A：L1型禽多杀性巴氏杆菌C48-1株，10CFU/羽；第15、17、19、21组，腿部肌肉注射A：L3型禽多杀性巴氏杆菌P-1662株，5×109CFU/羽。攻毒后连续观察14日，统计动物的发病死亡情况，攻毒保护结果见表8。结果显示，针对A：L1型禽多杀性巴氏杆菌菌株和A：L3型禽多杀性巴氏杆菌菌株，本发明步骤5.2中制备的禽多杀性巴氏杆菌、新城疫Lasota二联灭活疫苗均能达到100%保护，新城疫Lasota抗原对本申请中制备的重组蛋白L1-plpE和重组蛋白L3-plpE的免疫原性无不良干扰。
表8禽多杀性巴氏杆菌、新城疫二联灭活疫苗禽多杀性巴氏杆菌部分效力检验结果
5.3.3.2 抗体水平检验
取5.3.3.1中第14、16、18、20组动物，在免疫后21天，全部进行翅静脉采血，分离血清，以备抗体水平测定。
抗体检测方法与5.2.2.2中一致，分别测定第14、16、18、20组针对重组蛋白L1-plpE和重组蛋白L3-plpE的抗体水平，结果如表9所示。从表9中可以看出，利用疫苗7（含有25μg/mL重组蛋白L1-plpE、25μg/mL重组蛋白L3-plpE以及体积百分比为10%的新城疫Lasota抗原）进行免疫后，第16组产生的L1-plpE抗体的OD450为1.106±0.167a，产生的L3-plpE抗体的OD450为1.218±0.113a，而疫苗6（只含有25μg/mL重组蛋白L1-plpE、25μg/mL重组蛋白、不含有L3-plpE体积百分比为10%的新城疫Lasota抗原）进行免疫后，第14组产生的L1-plpE抗体的OD450为1.155±0.108a，产生的L3-plpE抗体的OD450为1.184±0.113a，显然，疫苗7在针对A：L1型禽多杀性巴氏杆菌菌株和A：L3型禽多杀性巴氏杆菌菌株中的免疫抗体产生水平与疫苗6针对A：L1型禽多杀性巴氏杆菌菌株和A：L3型禽多杀性巴氏杆菌菌株中的免疫抗体产生水平是基本持平的，这也间接说明了疫苗7中新城疫Lasota抗原对于对二联疫苗中的重组蛋白L1-plpE和重组蛋白L3-plpE无免疫干扰。
表9抗体水平测定结果
（1）数据为平均值±标准差；（2）肩标不同小写字母表示差异显著(P<0．05)，相同字母表示差异不显著（P>0.05)。
因此，上述结果证明了本发明制备的禽多杀性巴氏杆菌、新城疫二联灭活疫苗安全性、效力良好，且新城疫Lasota抗原与本申请中制备的重组蛋白L1-plpE和重组蛋白L3-plpE之间也无不良免疫干扰，一针免疫即能够同时预防两种疾病，在降低免疫成本的同时，也提高了预防不同疾病的便捷性。

Claims (10)

1.一种禽霍乱多价亚单位疫苗，其特征在于：所述禽霍乱多价亚单位疫苗包括L1-plpE蛋白、L3-plpE蛋白以及兽医学上可接受的佐剂；其中，所述L1-plpE蛋白的氨基酸序列SEQID NO.3；所述L3-plpE蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
2.一种多联疫苗，其特征在于：所述多联疫苗包括如权利要求1所述的L1-plpE蛋白、L3-plpE蛋白以及兽医学上可接受的佐剂，还包括一种或者多种病原体抗原。
3.根据权利要求2所述的多联疫苗，其特征在于：所述病原体抗原包括新城疫病毒抗原、禽流感病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原、传染性法氏囊病毒抗原、减蛋综合征病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、禽腺病毒抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、鸡传染性贫血病毒抗原、鸡传染喉气管炎病毒抗原、滑液囊支原体抗原、鸡毒支原体抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原或沙门菌抗原。
4.根据权利要求1所述的禽霍乱多价亚单位疫苗，其特征在于：所述L1-plpE蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；所述L3-plpE蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.2。
5.一种用于表达L1-plpE蛋白的重组载体，其特征在于：所述重组载体包含如权利要求1所述L1-plpE蛋白的编码基因。
6.根据权利要求5所述的用于表达L1-plpE蛋白的重组载体，其特征在于：所述L1-plpE蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
7.一种用于表达L3-plpE蛋白的重组载体，其特征在于：所述重组载体包含如权利要求1所述的L3-plpE蛋白的编码基因。
8.根据权利要求7所述的用于表达L3-plpE蛋白的重组载体，其特征在于：所述L3-plpE蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
9.一种宿主细胞，其特征在于：由用于表达L1-plpE蛋白的重组载体和用于表达L3-plpE蛋白的重组载体转化受体细胞而得。
10.根据权利要求1所述的疫苗组合物或者权利要求2所述的多联疫苗在制备预防和/或治疗禽多杀性巴氏杆菌A：L1型和禽多杀性巴氏杆菌A：L3型禽霍乱的药物中的应用。
CN202211127998.2A 2022-09-16 2022-09-16 禽霍乱多价亚单位疫苗、多联疫苗及其制备方法和应用 Pending CN116059334A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211127998.2A CN116059334A (zh) 2022-09-16 2022-09-16 禽霍乱多价亚单位疫苗、多联疫苗及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211127998.2A CN116059334A (zh) 2022-09-16 2022-09-16 禽霍乱多价亚单位疫苗、多联疫苗及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116059334A true CN116059334A (zh) 2023-05-05

Family

ID=86177637

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211127998.2A Pending CN116059334A (zh) 2022-09-16 2022-09-16 禽霍乱多价亚单位疫苗、多联疫苗及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116059334A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115772506A (zh) * 2022-12-09 2023-03-10 内蒙古自治区农牧业科学院 一种溶血性曼氏杆菌plpe蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115772506A (zh) * 2022-12-09 2023-03-10 内蒙古自治区农牧业科学院 一种溶血性曼氏杆菌plpe蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104862286B (zh) 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN108653724B (zh) 一种用于预防禽减蛋综合征的疫苗组合物、及其制备方法和应用
WO2021103421A1 (zh) 基因vii型新城疫病毒弱毒株及其应用
CN105985966B (zh) 基因vii型新城疫病毒株、其疫苗组合物、制备方法及应用
CN108653725B (zh) 一种用于预防禽减蛋综合征的疫苗组合物、及其制备方法和应用
CN113943714B (zh) 一种猫杯状病毒毒株及其应用
CN103013895B (zh) 猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活疫苗及制备与应用
CN111233984B (zh) 一种o型口蹄疫病毒样颗粒抗原、及其疫苗组合物、制备方法和应用
CN107432930A (zh) 一种i群4型禽腺病毒dna疫苗及其制备方法和应用
JP6149240B2 (ja) ロタウイルスサブユニットワクチン並びにその製造及び使用方法
CN114149493A (zh) I群4型禽腺病毒fiber-2蛋白抗原及其制备基因工程亚单位疫苗的方法和应用
CN114908029B (zh) 一种ii型草鱼呼肠孤病毒vp6重组乳酸菌的构建和应用
CN116059334A (zh) 禽霍乱多价亚单位疫苗、多联疫苗及其制备方法和应用
CN110540579B (zh) 一种副鸡禽杆菌抗原蛋白、含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物、及其制备方法和应用
WO2015066292A1 (en) Attenuated pasteurella multocidavaccines &amp; methods of making &amp; use thereof
JP7515611B2 (ja) 口蹄疫ウイルス様粒子抗原、及びそのワクチン組成物、調製方法と使用
JP2022513734A (ja) 口蹄疫ウイルス様粒子抗原及びそのワクチン組成物並びに調製方法及び応用
CN110777160A (zh) 一种口蹄疫病毒样颗粒抗原的制备方法及其制备的口蹄疫病毒样颗粒抗原和应用
CN117431200A (zh) 一种在芽孢表面展示新城疫病毒hn蛋白的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用
CN107287168B (zh) 一种新城疫病毒拯救方法及其应用
CN105154377B (zh) 重组鸡白痢沙门菌、制备方法及应用
BR112015010364B1 (pt) Vacinas atenuadas de mannheimia haemolytica e métodos de produção e uso
KR20230081996A (ko) 구제역 바이러스 유사 입자를 생산하기 위한 백신 플랫폼
CN112574958A (zh) 一株h9亚型禽流感病毒分离株及其应用
CN114058634B (zh) 一种鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination