BR112015010364B1 - Vacinas atenuadas de mannheimia haemolytica e métodos de produção e uso - Google Patents

Abstract

VACINAS ATENUADAS DE MANNHEIMIA HAEMOLYTICA E MÉTODOS DE PRODUÇÃO E USO. A presente invenção fornece cepas atenuadas de M. haemolitica que eliciam uma resposta imunológica em um animal contra M. haemolitica , composições que compreendem as referidas cepas, métodos de vacinação contra M. haemolitica , e kits para uso com tais métodos e composições. A invenção proporciona ainda vacinas multivalentes que proporcionam imunidade protetora quando administrada em uma quantidade eficaz para animais susceptíveis a "febre do embarque" ou a doença respiratória bovina.

Description

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[0001] Este pedido reivindica a prioridade ao pedido de patente provisório norte-americano US 61/723,979, depositado em 8 de novembro de 2012, e aqui incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção se refere, de uma forma geral, a vacinas bacterianas atenuadas, particularmente, aquelas que fornecem proteção ampla, segura e eficaz para animais de produção contra infecções / doenças causadas por bactérias gram-negativas, incluindo Mannheimia (Pasteurella) haemolytica. A invenção se refere ainda a métodos de produzir as bactérias atenuadas e métodos PCR para a diferenciação entre os sorotipos de M. haemolitica Al e A6, in vivo.

[0003] A invenção se refere em conformidade com composições imunogênicas ou vacina compreendendo a bactéria da invenção; por exemplo, bactérias atenuadas vivas. A bactéria também pode ser inativada nas composições, mas pode ser vantajoso que as bactérias sejam bactérias atenuadas vivas de M. haemolytica, quer isoladamente, ou em combinação com outras bactérias, tais como Haemophilus Somnus e / ou Pasteurella multocida. A invenção se refere, por conseguinte, ainda a métodos para a preparação e / ou formulação de tais composições; por exemplo, a cultura ou o cultivo ou a propagação das bactérias sobre ou em um meio adequado, a colheita das bactérias, opcionalmente, inativação de bactérias, e, opcionalmente, a mistura de bactérias com um suporte, excipiente, diluente ou veículo e / ou um adjuvante e / ou estabilizador veterinariamente ou farmaceuticamente aceitável. Assim, a invenção também se refere à utilização das bactérias na formulação de tais composições.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] M. haemolytica, é uma bactéria gram negativa normalmente encontrada no trato respiratório superior de gado saudável, ovelhas e cRNAeiros selvidadens. M. haemolytica desce para os pulmões quando o gado é estressado, tais como o transporte, o desmame, a superlotação, ou infecções virais e provoca broncopneumonia necrosante e fibrinosa, um componente principal do complexo de doença respiratória bovina (BRDC). Perdas econômicas devido a BRDC na América do Norte é > $ 1 bilhão por ano (Bowland e Shewen, 2000). M. haemolytica é a bactéria mais comummente isolada a partir dos pulmões de bovinos afetados com BRDC. M. haemolytica sorotipo Al é responsável por aproximadamente 60% de febre do transporte, enquanto que os sorotipos A6 e A2 conta para 26% e 7%, respectivamente, (Al-Ghamdi et al, 2000; Purdy et al., 1997). Ambos M. haemolytica Al e A6 contam para > do que 85% dos casos de BRDC envolvendo patógenos bacterianos.

[0005] As vacinas atualmente disponíveis no mercado contra infecções por M. haemolytica são apenas para moderadamente proteção contra a febre de transporte de bovinos de corte, mas, geralmente, ineficazes contra pneumonia do bezerro leiteiro neonatal (Virtala et al., 1996, Rice et al., 2007). A principal causa de pneumonia bacteriana grave em gado de confinamento e leiteiro neonatal é a M. haemolytica sorotipo Al seguido pelo sorotipo A6 (Schreuer et ai, 2000, Rice et al., 2007).

[0006] A avaliação experimental de todas as vacinas de M. haemolytica Al comerciais utilizadas em confinamento mostrou apenas uma proteção parcial em 50% dos estudos (Perino e Hunsaker, 1997). Além disso, uma proteção cruzada contra os sorotipos M. haemolytica (ou A6 ou A2) tem sido difícil de conseguir utilizando preparações de vacinas convencionais (Purdy et al, 1993; Sabri et al, 2000). Portanto, uma vacina eficaz contra M. haemolytica de sorotipos Al e A6 poderia melhorar significativamente a produção de cRNAe bovina / leiteira.

[0007] Imunidade eficaz contra M. haemolytica é multifacetada. Os anticorpos neutralizantes contra a exotoxina A de leucotoxina (lktA) e antígenos de superfície são necessários para a imunidade protetora contra M. haemolytica (Shewen e Wilkie, 1988). Devido à maquinaria genética complexa envolvida no controle da expressão de uma variedade de fatores de virulência da M. haemolytica, os antígenos de superfície específicos que são importantes na estimulação da imunidade não foram claramente determinados (Lawrence et al, 2010). No entanto, proteínas da membrana externa de M. haemolytica (OMPs) têm sido implicadas na estimulação da imunidade contra antígenos de superfície (Confer et al, 2003, Morton et al, 1995; Potter et al., 1999).

[0008] Imunização intranasal de gado tem sido perseguido por um tempo usando o herpesvírus bovino-1 (BoHV- 1), vírus sincicial respiratório bovino (BRSV) e vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR) (Ellis et al, 2007; Muylkens et al, 2007). Comercialmente disponível pela Pfizer, INFORCE 3, quando administrado por via intranasal reivindica evitar BRSV e também ajuda na prevenção da doença respiratória causada pelo IBR e vírus parainfluenza bovino tipo 3 (PI3).

[0009] Em um estudo experimental, quando uma M. haemolytica deficiente de leucotoxina modificada viva foi administrada por via intranasal em bezerros desmamados em confinamento, resultou em redução da colonização nasofaríngea com tipo selvidadem de M. haemolytica em comparação com bezerros de controle não-vacinados (Frank et al., 2003). Embora a vacinação intranasal e M. haemolytica deficiente de leucotoxina sejam conhecidas, os invençãores estão cientes de que nenhuma vacina de M. haemolytica combina com sucesso estes conceitos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] Um objetivo da presente invenção consiste em proporcionar vacinas eficazes compreendendo M. haemolytica atenuadas de sorotipos Al & A6. Em relação a um M. haemolytica Al sorotipo ou A6 parental, as cepas atenuadas podem ter modificações genômicas, incluindo deleções, substituições e adições, e cuja presença (ou ausência) está associado com a virulência reduzida. Em uma concretização, uma M. haemolytica tipo selvidadem (sorotipo Al D153) pode ser modificada para conter uma deleção parcial do gene da leucotoxina CA (lktCA) local genômico, resultando em uma bactéria atenuada, que segrega uma forma truncada, não citotóxica da proteína lktA. As vacinas idealmente fornecem imunidade protetora segura, eficaz e ampla.

[0011] Outro objetivo da descrição é fornecer vacinas multivalentes, que compreende a M. haemolytica atenuada em combinação com outras bactérias, incluindo P. multocida, M. haemolytica sorotipo A6, e Histophilus somni (H. Somni). Assim, a invenção abrange uma forma avirulenta-4 modificado da vacina, in vivo útil contra a doença respiratória dos bovinos.

[0012] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar métodos para o tratamento e profilaxia de infecção de doença respiratória bovina, compreendendo as etapas de administrar quantidades eficazes de vacinas da invenção para os bovinos susceptíveis.

[0013] Em uma concretização, as vacinas atenuadas compreende ainda um adjuvante. O adjuvante pode ser qualquer substância que aumenta e / ou intensifica a resposta imunológica induzida, em comparação com a vacina atenuada sozinha. Os adjuvantes das mucosas, incluindo quitosanos e seus derivados, são, particularmente, úteis para as vacinas atenuadas orais descritas.

[0014] A invenção proporciona ainda métodos para a indução de uma resposta imunológica (ou imunogênica) ou resposta protetora contra M. haemolytica, bem como métodos para a prevenção ou o tratamento de M. haemolytica, ou estado de doença (s) causada por M. haemolytica, compreendendo a administração de bactérias vivas atenuadas ou uma composição que compreende as bactérias atenuadas para animais com necessidade da mesma.

[0015] Além disso, a invenção proporciona métodos e reidadentes para PCR úteis para o diagnóstico e / ou discriminar entre sorotipos de M. haemolytica Al e A6. Análise da sequência por genômica comparativa, descrita abaixo, revela genes Al- e A6-específicos, que fornecem a base para os métodos e reidadentes fornecidos na presente descrição.

[0016] Os kits que compreendem, pelo menos, a cepa atenuada de M. haemolytica e instruções para a utilização também são fornecidos.

[0017] Estas e outras concretizações são reveladas ou são óbvias a partir de e abrangidas pela seguinte descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0018] Uma divulgação completa e suficiente da presente invenção, incluindo o seu melhor modo de realização para um técnico versado no assunto, é definido em mais detalhes na parte restante deste relatório descritivo, incluindo referência às figuras anexas, em que:

[0019] A FIG. 1 apresenta o esquema usado para produzir o plasmídeo pCT109GA189AlktCA-Kan (Plasmídeo de substituição). O produto final para a fabricação da vacina incorporou um sítio de ligação ao ribossoma de consenso (AGGAGG, rbs) a montante do códon de iniciação que substituiu rbs IktC e aumentou a expressão de leucotoxóide. O gene lktA nativo, deletado na cepa de vacina, usa um rbs forte (AGGAGA). Para este produto, iniciador lktRBSr foi utilizado em vez de iniciador lktCAdelr. O site consenso está sublinhado;

[0020] A FIG. 2 ilustra a integração do plasmídeo de substituição no genoma bacteriano;

[0021] A FIG. 3 representa a resolução / excisão do plasmídeo de substituição, deixando para trás apenas a sequência AlktCA desejado, estavelmente integrada no genoma bacteriano, e que codifica a proteína truncada lktA;

[0022] A FIG. 4A mostra uma eletroforese em gel de agarose de produtos de PCR do operon de M. haemolytica LktCABD mostrando LktCA truncada (pista 2) e LktCA de tipo selvidadem (pista 3);

[0023] A FIG. 4B mostra a Análise de transferência ocidental de lktA truncadas expressas por M. haemolytica D153A-1-PKL, cepa vacinal. Linhas: 1- marcador; 2- 5 l de sobrenadante de cultura contendo lktA truncada (* = 27 kDa, M. haemolytica D153A-1-PKL); 3- 5 de sobrenadante de cultura contendo lktA do tipo selvidadem (* = 102 kDa, M. haemolytica D153 cepa-mãe);

[0024] A FIG. 5 é um diagrama de Venn representando os genes únicos e sobrepostos presentes em cinco isolados de M. haemolytica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0025] A presente invenção se refere a uma vacina ou composição de M. haemolytica que pode compreender uma cepa atenuada de M. haemolytica e um veículo, transportador, excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável ou que provoca, induz ou estimula uma resposta em um animal.

[0026] A fim de desenvolver uma vacina eficaz intranasal contra a M. haemolytica que protege contra os sorogrupos bovinos A1 / A6, invençãores utilizaram M. haemolytica tendo um gene lktA parcialmente deletado. Esta bactéria não causa citólise, mas é capaz de induzir anticorpos neutralizantes. Antes da presente descrição, não se sabia se a administração intranasal (ou administração através de qualquer via) provocariam em bovinos uma resposta imunológica protetora.

[0027] Embora existam métodos sorológicos para distinguir M. haemolytica Al e A6, estes métodos não são sempre confiáveis e desenvolver anti-soros fortes contra A6 é particularmente difícil. Para superar este problema, ambos os genomas sequenciados dos invençãores Al e A6, realizaram uma análise comparativa do genoma e desenvolveu um método quantitativo de reação de cadeia de polimerase em tempo real (RT-QPCR) para distinguir entre domínio Al e A6 isolados e para controlar a combinação de vacina intranasal (H. haemolytica, M. somnus, e P. multocida).

[0028] Assim, uma concretização desta invenção proporciona métodos de RT-QPCR úteis, que permitam, pelo menos, as seguintes atividades: a) identificação de isolados de campo de M. haemolytica Al e A6 rápida e visualizar um grande número de colônias; b) monotoramento da vacinação / colonização de Al e A6 em cavidades nasais; c) eliminação da necessidade para o desenvolvimento de anti-soros de elevado título; e d) desenvolvimento de kits de teste de diagnóstico automatizados rápidos.

[0029] A presente invenção proporciona ainda as cepas atenuadas de M. haemolytica tendo uma deleção em pelo menos um gene de virulência. Em uma concretização, a deleção é dentro do LktCA, um locus que codifica uma enzima acilase (LktC) e leucotoxina A (lktA), a citotoxina chefe. Esta deleção pode ser amplificada por reação em cadeia da polimerase (PCR) e a secreção de um lktA truncada pode ser detectada em um Western blot para determinar se a bactéria é do tipo selvidadem ou mutantee.

[0030] Deleção da sequência genômica (s) a partir de bactérias virulentas parentais para produzir bactérias mutantees atenuadas virulentas é realizado através de nova e não óbvia atividade inventiva. Tais bactérias mutantes, também aqui referido como microorganismos vivos modificados (MLM) são úteis para a produção de composições imunogênicas e vacinas que têm um alto grau de imunogenicidade e uma baixa (ou inexistente) grau de patogenicidade.

[0031] Estes mutantes são também úteis como vetores que podem ser úteis para a expressão in vitro de produtos de expressão, bem como para a reprodução ou replicação de sequências de nucleotídeos (por exemplo, a replicação de DNA), e para produtos de expressão in vivo.

[0032] Engenharia das mutações de deleção proporciona sequências de nucleotídeos e de genes novas e não óbvias, bem como produtos de genes novos e não óbvios codificados pelas sequências de nucleotídeos e de genes. Tais produtos gênicos fornecem antígenos e imunogênios, epítopos e são úteis como produtos de genes isolados. Tais produtos de genes isolados, bem como os seus epítopos, também são úteis para gerar anticorpos, que são úteis em aplicações de diagnóstico.

[0033] Tais produtos de genes, que podem fornecer ou gerar epítopos ou antígenos ou imunogênios também são úteis para as composições imunogênicas ou imunológicas, bem como vacinas.

[0034] Em um aspecto, a invenção proporciona bactérias que contêm uma mutação atenuante em uma sequência de nucleotídeos ou de um gene, em que as mutações modifica, reduz ou suprime a expressão e / ou a atividade biológica de um polipepitídeo ou proteína codificada por um gene, resultando em virulência atenuada da bactéria. Em uma concretização particular, a mutação é uma deleção em enquadramento resultando na secreção de uma bactéria de leucotoxina truncada. Em uma concretização particular, a leucotoxina truncada migra a cerca de 27 kD em gel típico de SDS.

[0035] Atenuação reduz ou suprime a patogenicidade das bactérias e a gravidade dos sinais clínicos ou lesões, diminui a taxa de crescimento das bactérias e impede a morte das bactérias.

[0036] Em particular, a presente invenção abrange as cepas M. haemolytica atenuadas e as vacinas compreendendo os mesmos, que provocam uma resposta imunogénica em um animal, em particular as cepas de M. haemolytica atenuadas que provocam, induza ou estimule uma resposta em um bovino.

[0037] Em particular, cepas M. haemolytica atenuadas de interesse têm mutações nos genes, em relação ao tipo selvidadem cepa progenitora virulenta, que estão associadas com a virulência. Reconhece-se que, para além das cepas com mutações descritas, cepas atenuadas possuindo qualquer número de mutações nos genes de virulência descritos podem ser utilizados na prática da presente invenção.

[0038] Em um outro aspecto, as novas cepas atenuadaa de M. haemolytica são formuladas em vacina segura e eficaz contra as infecções por M. haemolytica que causam doenças por M. haemolytica.

[0039] Em uma concretização, as vacinas de M. haemolytica ainda compreendem um adjuvante. Em uma concretização particular, o adjuvante é um adjuvante de mucosa, tal como quitosano, quitosano metilado, trimetilada quitosano, ou seus derivados ou suas combinações.

[0040] Tal como aqui definido, o termo "gene" será usado no sentido lato, e deverá englobar ambas as sequências codificantes e não codificantes (isto é, a montante e a jusante as sequências reguladoras, promotores, 573 'UTR, intrões e exões). Sempre que se destina referência à única sequência de codificação de um gene, "sequência de codificação de gene" ou o termo "CDS" são utilizados indistintamente ao longo desta descrição.

[0041] Por "antigênio" ou "imunogênio" significa uma substância que induz uma resposta imunológica específica de um animal hospedeiro. O antígeno pode compreender um organismo inteiro, morto, atenuado ou ao vivo; uma subunidade ou parte de um organismo; um vector recombinante contendo uma inserção com propriedades imunogênicas; uma parte ou fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imunológica contra a apresentação a um animal hospedeiro; um polipepitídeo, um epitopo, um hapteno, ou qualquer combinação dos mesmos. Alternativamente, o imunogênio ou antígeno pode compreender uma toxina ou antitoxina.

[0042] Os termos "proteína", "peptídeo", "polipepitídeo" e "fragmento de poliptido" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a polímeros de resíduos de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, que pode compreender os aminoácidos modificados ou análogos de aminoácidos, e que pode ser interrompido por outros aminoácidos de porções químicas. Os termos englobam também um polímero de intervenção; por exemplo a formação de ligação dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente bioativo ou rotulidadem.

[0043] O termo "polipepitídeo imunogênico ou antigênico", tal como aqui utilizado inclui polipepitídeos que são imunologicamente ativo no sentido de que, uma vez administrada ao hospedeiro, que é capaz de evocar uma resposta imunológica humoral do e / ou tipo celular dirigida contra a proteína. De preferência, o fragmento de proteína é tal que tem substancialmente a mesma actividade imunológica como a proteína total. Assim, um fragmento de proteína de acordo com a invenção compreende, ou consiste essencialmente de, ou consiste de pelo menos um epitopo ou determinante antigénico. Uma proteína "imunogênica" ou polipepitídeo, tal como aqui utilizado, inclui a sequência de comprimento completo da proteína, seus análogos ou fragmentos imunogênicos destes. Por "fragmento imunogênico" entenda-se um fragmento de uma proteína que inclui um ou mais epítopos e assim induz a resposta imunológica descrita acima. Tais fragmentos podem ser identificados utilizando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopos, bem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Mapeamento de Epítopos Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados por, por exemplo, sintetizando concorrentemente um grande número de peptídeos em suportes sólidos, os peptídeos correspondentes a porções da molécula de proteína, e fazendo reagir os peptídeos com anticorpos, enquanto os peptídeos ainda ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas no estado da técnica e descritos em, por exemplo, no documento US. 4,708,871; Geysen et al, 1984; Geysen et al, 1986. De modo semelhante, os epítopos conformacionais são prontamente identificados por determinação da conformação espacial de aminoácidos, tais como por, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Mapeamento de Epítopos protocolos, supra. Métodos aplicáveis especificamente para as proteínas de T. parva estão completamente descritos em PCT/US2004/022605 aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[0044] Como aqui discutido, a invenção engloba fragmentos e variantes do polipepitídeo antigênico ativo. Assim, o termo "polipeptídeo imunogênico ou antigênico" contempla ainda a deleções, adições e substituições para a sequência, desde que as funções de polipepitídeo para produzir uma resposta imunológica, tal como aqui definida. O termo "variação conservativa" designa a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente semelhante, ou a substituição de um nucleótido em uma sequência de ácido nucleico de tal modo que o resíduo de aminoácidos codificada não mudar ou se um outro resíduo biologicamente semelhante. A este respeito, substituições particularmente preferidas serão geralmente de natureza conservativa, isto é, as substituições que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos estão geralmente divididos em quatro famílias: (1) acidic- aspartato e glutamato; (2) básicos lisina, arginina, histidina; (3) não polar-alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares não carregados glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano, e tirosina são por vezes classificadas como aminoácidos aromáticos. Exemplos de variações conservadoras incluem a substituição de um resíduo hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por um outro resíduo hidrofóbico, ou a substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por aspártico ácido, ou glutamina por asparagina, e semelhantes; ou uma substituição conservadora similar de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado que não terá um efeito importante sobre a actividade biológica. Proteínas tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a molécula de referência, mas possuindo substituições menores de aminoácidos que não afetam substancialmente a imunogenicidade da proteína são, portanto, dentro da definição do polipepitídeo de referência. Todos os polipeptidos produzidos por estas modificações estão aqui incluídos. O termo "variação conservadora" também inclui a utilização de um aminoácido substituído no lugar de um aminoácido progenitor não substituído desde que os anticorpos criados para o polipepitídeo substituído também reajam imunologicamente com o polipepitídeo não substituído.

[0045] O termo "epítopo" se refere ao local em um antígeno ou hapteno ao qual as células específicas B e / ou células T respondem. O termo é também utilizado alternadamente com "determinante antigênico" ou "local determinante antigênico". Anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo podem ser identificados em um imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo.

[0046] Uma "resposta imunológica" a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular e / ou mediada por anticorpos à composição ou uma vacina de interesse. Geralmente, uma "resposta imunológica" inclui, mas não se limita a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos, células B, células T auxiliares, e / ou células T citotóxicas, dirigidas especificamente para um antígeno ou antígenos incluído na composição ou vacina de interesse. De preferência, o hospedeiro irá exibir uma resposta terapêutica ou protetora, de modo a que a resistência imunológica a uma nova infecção será aumentada e / ou a gravidade clínica da doença reduzidos. Essa proteção pode ser demonstrada por qualquer uma redução ou a falta de sintomas e / ou sinais de doença clínica normalmente exibidos por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápida e / ou um título viral reduzido no hospedeiro infectado.

[0047] Por "animal" pretende mamíferos, pássaros, e outros semelhantes. Ou animal hospedeiro como aqui utilizado, inclui mamíferos e humanos. O animal pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em equina (por exemplo, cavalo), caninos (por exemplo, cães, lobos, raposas, coiotes, chacais), felinos (por exemplo, leões, tigres, gatos domésticos, gatos selvidadens, outros grandes felinos, e outros felinos incluindo guepardos e lynx), ovinos (por exemplo, ovelhas), bovinos (por exemplo, gado), suína (por exemplo, suínos), aviário (por exemplo, galinha, pato, ganso, de peru, codorniz, faisão, papagaio, passarinhos, falcão, corvo, avestruz, emu e casuar), primata (por exemplo, prosimian, tarsier, macaco, gibbon, macaco), furões, selos, e peixes. O termo "animal" inclui também um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo recém- nascidos, as fases fetais e embrionárias.

[0048] A menos que de outro modo explicado, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um vulgar perito na arte à qual pertence esta divulgação. Os termos singulares "um", "uma", e "o" incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou" destina-se a incluir "e" a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0049] Note-se que nesta divulgação e particularmente nas reivindicações e / ou nos parágrafos, termos tais como "compreende", "composto", "compreendendo" e semelhantes, podem ter o significado que lhe é atribuído na lei de Patentes dos Estados Unidos; por exemplo, eles podem significar "inclui", "inclui", "incluindo", e semelhantes; e que os termos tais como "consistindo essencialmente em e" consiste essencialmente de ter o significado que lhes é atribuído na lei de Patentes dos Estados Unidos, por exemplo, para permitir que elementos não explicitamente recitados, mas excluem elementos que se encontram na técnica anterior ou que afectam uma base ou nova característica da invenção.

[0050] O termo "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" refere-se a NA ou DNA que é de cadeia linear ou ramificada, cadeia simples ou dupla, ou um seu híbrido. O termo também engloba os híbridos de RNA / DNA. Os seguintes são exemplos de polinucleotídeos não limitativo: um gene ou fragmento de gene, exões, intrões, RNAm, RNAt, RNAr, ribozimas, DNAc, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleótido, uracilo, outros açúcares e grupos de ligação, tais como fluororribose e tiolato, e ramos de nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos pode ser adicionalmente modificada após polimerização, tal como por conjugação, com um componente de marcação. Outros tipos de modificações nesta definição são tampas, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo, e introdução de meios para fixar o polinucleotídeo para as proteínas, os iões metálicos, outros componentes de rotulidadem, polinucleotídeos ou suporte sólido. Os polinucleotídeos podem ser obtidas por síntese química ou derivados de um microrganismo.

[0051] O termo "gene" é utilizado amplamente para se referir a qualquer segmento de polinucleotídeo associado a uma função biológica. Assim, os genes incluem intrões e exões como na sequência genómica, ou apenas as sequências de codificação, como no DNAc e / ou as sequências reguladoras necessárias para a sua expressão. Por exemplo, o gene também se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa mRNA ou RNA funcional, ou codifica para uma proteína específica, e que inclui sequências reguladoras.

[0052] Um componente biológico "isolado" (tal como, um ácido nucleico ou proteína ou organela) se refere a um componente que foi substancialmente separado ou purificado a partir de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente, por exemplo, outra cromossómico e extra-cromossómica de DNA e de RNA, proteínas e organelas. Os ácidos nucleicos e proteínas que têm sido "isolado" incluem ácidos nucleicos e de proteínas purificadas por métodos de purificação convencionais. O termo também abrange ácidos nucleicos e proteínas preparadas por tecnologia recombinante, bem como a síntese química.

[0053] O termo "variação conservativa" designa a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente semelhante, ou a substituição de um nucleótido em uma sequência de ácido nucleico de tal modo que o resíduo de aminoácidos codificada não mudar ou se um outro resíduo biologicamente semelhante. A este respeito, substituições particularmente preferidas serão geralmente de natureza conservativa, como descrito acima.

[0054] O termo "recombinante" significa um polinucleotídeo com origem semi-sintética, ou sintética que, ou não ocorre na natureza, ou está ligado a um outro polinucleotídeo em uma disposição não encontrada na natureza.

[0055] "Heterólogo" significa derivado de uma entidade geneticamente distinta do resto da entidade à qual está a ser comparada. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser colocada por meio de técnicas de engenharia genética em um plasmídeo ou vector derivado de uma fonte diferente, e é um polinucleotídeo heterólogo. Um promotor removido da sua sequência de codificação nativa e operativamente ligado a uma sequência de codificação diferente da sequência nativa é um promotor heterólogo.

[0056] Os polinucleotídeos da invenção podem compreender sequências adicionais, tais como sequências de codificação adicionais dentro da mesma unidade de transcrição, elementos de controlo, tais como promotores, locais de ligação ao ribossoma, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, unidades adicionais sob o controlo de transcrição do mesmo ou de um promotor diferente, sequências que permitem a clonidadem, expressão, de recombinação homóloga, e a transformação de uma célula hospedeira, e como tal construção pode ser desejável proporcionar formas de realização da presente invenção. Métodos de utilização e Artigo de Fabricação

[0057] A presente invenção inclui as seguintes concretizações do método. Em uma concretização, um método de vacinação de um animal que compreende a administração de uma composição que compreende uma cepa atenuada de M. haemolytica e um transportador, excipiente ou veículo farmacêutica ou veterinariamente aceitável para um animal é divulgado. Em um aspecto desta concretização, o animal é um bovino.

[0058] O volume de dose das composições para as espécies que são mamíferos, por exemplo, o volume de dose das composições de suínos ou de suínos, com base em antígenos bacterianos, está geralmente entre cerca de 0,1 a cerca de 2,0 ml, entre cerca de 0,1 a cerca de 1,0 ml, e entre cerca de 0,5 ml a cerca de 1,0 ml.

[0059] A eficácia das vacinas pode ser testada cerca de 2 a 4 semanas após a última imunização, desafiando animais, tais como bovinos, com uma cepa virulenta de M. haemolytica. Ambas as cepas homólogas e heterólogas são usados para o desafio para testar a eficácia da vacina. O animal pode ser contestado por I.M. ou injeção S.C., spray, intra-nasal, intra-ocular, intra-traqueal, e / ou por via oral. Amostras de articulações, pulmões, cérebro, e / ou a boca pode ser recolhido antes e após o desafio e pode ser analisada para a presença de anticorpo específico de M. haemolytica.

[0060] As composições que compreendem as cepas bacterianas atenuadas da invenção utilizada nos protocolos prime-boost estão contidos em um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Os protocolos da invenção protegem o animal de M. haemolytica e / ou impedem a progressão da doença em um animal infectado.

[0061] As várias administrações são realizadas, preferencialmente, de 1 a 6 semanas de intervalo. Intervalo de tempo preferido é de 3 a 5 semanas e, otimamente, 4 semanas de acordo com uma concretização, um reforço anual também é visionado. Os animais, porcos, por exemplo, podem ser, pelo menos, de 3 - 4 semanas de idade no momento da primeira administração.

[0062] Deve ser entendido por um técnico versado no assunto que a descrição aqui fornecida é a título de exemplo e a presente invenção não está limitada a eles. A partir da descrição aqui feita e do conhecimento na técnica, o técnico versado no assunto pode determinar o número de administrações, a via de administração, e as doses a utilizar para cada protocolo de injeção, sem qualquer experimentação indevida.

[0063] Outra concretização da invenção é um kit para realização de um método de provocar ou induzir uma resposta imunológica ou de proteção contra o M. haemolytica em um animal compreendendo uma composição imunológica ou de vacina de M. haemolytica atenuada e instruções para realizar o método de entrega de uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune no animal.

[0064] Outra concretização da invenção é um kit para realização de um método de indução de uma resposta imunológica ou de proteção contra o M. haemolytica em um animal compreendendo uma composição ou vacina compreendendo uma cepa M. haemolytica atenuada da invenção, e instruções para realizar o método de entrega em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune no animal.

[0065] Ainda um outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit para vacinação prime-boost, de acordo com a presente invenção, tal como descrito acima. O kit pode compreender pelo menos dois tubos de ensaio: um primeiro frasco contendo uma vacina ou composição para a vacinação primária, de acordo com a presente invenção, e um segundo frasco contendo uma vacina ou composição para o reforço de vacinação, de acordo com a presente invenção. O kit pode conter, vantajosamente, primeiro ou segundo frascos adicionais para-vacinações primos adicionais ou vacinas de reforços adicionais.

[0066] Os idadentes de suporte, veículos ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos dos técnicos versados no assunto. Por exemplo, um transportador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma solução de NaCl a 0,9% (por exemplo, soro fisiológico) ou um tampão de fosfato. Outro transportador, veículo ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável que podem ser utilizados para os métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, poli (L-glutamato) ou polivinilpirrolidona. O transportador, um veículo ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser qualquer composto ou combinação de compostos que facilitem a administração do vector (ou proteína expressa a partir de um vector do invenção, in vitro); vantajosamente, o transportador, veículo ou excipiente pode facilitar a transfecção e / ou melhorar a conservação do vector (ou proteína). As doses e os volumes de dose são aqui discutidos na descrição geral e também pode ser determinada por um especialista na matéria a partir desta divulgação lida em conjunto com o conhecimento na especialidade, sem qualquer experimentação indevida.

[0067] As composições imunológicas e vacinas, de acordo com a invenção podem compreender ou consistir essencialmente de um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes adequados para utilização na prática da presente invenção são (1) polímeros de ácido acrílico ou metacrílico, anidrido maleico e polímeros derivados de alcenilo, (2) sequências imunoestimulantes (ISS), tais como sequências oligodesoxirribonucleótido que possuem uma ou mais unidades CpG não metiladas (Klinman et al., 1996, W098 / 16247), (3) uma emulsão de óleo em água, tal como a emulsão SPT descrita na página 147 de "Vaccine Design, Subunidade e Adjuvante Abordidadem ", publicado pela M. Powell, M. Newman, Pleem um Press 1995, ea emulsão MF59 descritos na página 183 da mesma obra, (4) lipídios catiônicos contendo um sal de amônio quaternário, por exemplo, DDA (5) citoquinas, (6 ) de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, (7) ou saponina (8) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado como referência no presente pedido de patente, ou (9) ou quaisquer combinações suas misturas.

[0068] Em uma concretização, os adjuvantes incluem aqueles que promovem uma melhor absorção através da mucosa gástrica. Alguns exemplos incluem MPL, LTK63, toxinas, micropartículas de PLG e vários outros (Vajdy, M. Imunologia e Biologia Celular (2004) 82, 617-627). Em uma concretização, o adjuvante pode ser um quitosano (Van der Lubben et al 2001;. Patel et al 2005;. Majithiya et al 2008;. Patente US N° 5,980,912).

[0069] Em uma concretização, o adjuvante pode ser bactérias inativadas, um vírus inativado, frações de bactérias inativadas, lipopolissacarídeos bacterianos, toxinas bacterianas, ou derivados. REFERÊNCIAS

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[00104] A invenção será agora adicionalmente descrita por meio dos exemplos não limitativos seguintes.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Produção de M. haemolytica atenuada

[00105] M. haemolytica é um organismo comensal do trato respiratório superior dos vitelos e outros ruminantes. Sob estresse e em animais imunocomprometidos M. haemolytica desce para os pulmões e causa a doença sistêmica grave, resultando em pasteurelose pneumônica ou "febre do embarque". O patógeno pode ser transmitido pelo contato do focinho a focinho. Para atenuar a bactéria, suprimido nucleotídeos dentro do locus LktCA, que codifica uma enzima acilase (LktC) e leucotoxina A (lktA), citotoxina chefe da bactéria. Esta deleção pode ser amplificada por reação em cadeia da polimerase (PCR) e a secreção de um lktA truncada pode ser detectada em um Western blot para determinar se a bactéria é do tipo selvidadem ou mutante. A engenharia genética está resumida nas Figs. 1 - 3. Todos os reidadentes, incluindo o traslado de vetores pCR2.1, pBC SK, PSK e pCT109GA189 ts ori, e a célula hospedeira de E. coli DH11S, são bem conhecidos e acessíveis por técnicos versados no assunto.

[00106] Construção da deleção IktCA. pCT109GA189- KanAlktCA e pCT109GA189-KanAlktCA-RBS foram construídos como descrito nas Figs. 1-3. Resumidamente, dois fragmentos de DNA, a montante (1,06 kb, SEQ ID NO: 6) e a jusante (1,29 kb, SEQ ID NO: 7) foram amplificados por PCR a partir de M. haemolytica NADC D153 cepa (FIG.l). As células completas foram usadas como molde usando os conjuntos de iniciadores, IktCAf (SEQ ID NO: 1) / lktCAdelr (SEQ ID NO: 4) e IktCAr (SEQ ID NO: 2) / lktCAdelf (SEQ ID NO: 3). Os produtos de PCR foram fenol-clorofórmio-extraiu-se para inativar a Taq polimerase e, em seguida digerido com Muni antes da ligação. Os produtos de ligação foram amplificados por PCR com o par de iniciadores IktCAf / IktCAr e os produtos foram clonados utilizando um vector disponível comercialmente (PCR2.1, Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

[00107] Um produto contendo uma inserção de aproximadamente 2,3 kb foi seleccionado e sequência apropriada através da supressão foi confirmada por sequenciação de DNA e designado pTAAlktCA. Um cassete de canamicina de pUC4K derivado foi colocado no local Sail de pBC SK (Stratidadene Inc.) para gerar pBCKan. Os 2,3 kb suprimido leucotoxina inserção em pTAAlktCA foi transferida para pBCKan por digestão com EcoRI e a ligação no local EcoRI único de modo a formar pBCKanAlktCA. Este produto foi amplificado por PCR utilizando o par de iniciadores lktCAdelf (SEQ ID NO: 3) e IktRBSr (SEQ ID NO: 5) para substituir o local de ligação ao ribossoma IktC nativa (RBS) com um RBS de consenso (Fig. 1). O produto foi digerido com Muni e ligado sobre si próprio para formar pBCKanAlktCArbs. Sequência adequada adjacente à supressão foi confirmada por sequenciação de DNA. Finalmente, o plasmídeo de esqueleto de ambos pB CKanAlktC A e pBCKanAlktCArbs pBC foi substituída com a origem do plasmídeo sensível à temperatura da replicação do pCT109GA189 (Briggs e Tatum, 2005) por ligação de preparações BssHII-digeridos de cada um para gerar pCT109GA189KanAlktCA e pCT109GA189KanAlktCArbs.

[00108] M. haemolytica eletrocompetentes do sorotipo de células D153 Al (cepa parental virulenta) foram pCT109GA189KanAlktCArbs por métodos anteriormente descritos, exceto o produto de ligação não metilado foi diretamente introduzido nas células competentes. (Briggs e Tatum, 2005) Resumidamente, as células foram feitas crescer por eletrocompetentes a fase logarítmica em 100 ml de caldo Columbia (Difco Laboratories, Detroit, MI) a 37° C com agitação suave. As células foram sedimentadas por centrifugação a 5000 g e lavadas em 100 ml de 272 mM de sacarose, a 0 ° C, e o sedimento foi suspenso em um volume igual de 272 mM de sacarose, a 0 ° C. Após a eletroporação, as células recuperadas durante a noite em 10 ml de caldo Columbia a 30 ° C. Crescimento (50 ) foi espalhada sobre placas de agar de Columbia contendo 50 ug / ml de canamicina, que foram em seguida incubadas 36 horas a 30 ° C. As colónias individuais foram passados para caldo contendo 50 ug / ml de canamicina e incubadas durante a noite a 30 ° C. Crescimento (100 ) foi passada outra vez para placas de agar de Columbia com canamicina, que foram incubadas durante a noite a 39 ° C. As colónias individuais foram passados para agar de soja tripticase (TSA) placas contendo 5% de sangue de cRNAeiro desfibrinado (BA, placas incubadas durante a noite a 39 ° C) e de caldo Columbia sem selecção (incubada durante a noite a 30 ° C). O crescimento em caldo foi riscado para isolamento em placas BA e passou novamente em caldo a 30 ° C. Líticas colônias não-hemo que foram Canamicina-sensível foram detectados em placas BA após 1-3 passidadens sem seleção. Colônias representante de cada plasmídeo cepa receptora e substituição foram selecionados para um estudo mais aprofundado.

[00109] Uma vez que as funções do plasmídeo de origem sensível à temperatura mal em E. coli hospedeiros de clonidadem, estes produtos finais de ligação foram introduzidos directamente em M. haemolytica. Antes passos de clonidadem utilizados E. coli DH1 IS (Life Technologies, Rockville, MD) como o hospedeiro de clonidadem.

[00110] Os mutantees não-hemolíticos foram cultivados em caldo Columbia a 37° C durante 3 horas e colhidas em crescimento logarítmica tardia. Os sobrenadantes foram espalhados em nitrocelulose, juntamente com os sobrenadantes a partir do progenitor de tipo selvidadem e um mutantee isogênica leucotoxina-negativo. Após bloqueio e lavidadem adequada, o blot foi sondado com anticorpo monoclonal anti- leucotoxina 2C9-1E8 (anticorpo neutralizante produzido por NADC, Ames, IA). Produtos do mutantee contendo o sítio de ligação ao ribossoma nativo foram encontrados para expressam baixos níveis da proteína reativa com anticorpo monoclonal, menos do que a produzida pela cepa-mãe de tipo selvidadem. Os produtos que continham o novo sítio de ligação ao ribossoma produziram níveis muito mais elevados de proteína reactiva. Os sobrenadantes de dois produtos que expressam níveis elevados de leucotoxina foram concentradas 15 vezes através de um filtro de 10.000 MW (Centriprep, Amicon). Os concentrados (1,5 l) foram sujeitos a SDS-PIDADE, transferidos para nitrocelulose e sondados com anticorpo 2C9- 1E8. A análise por Western blot indicou uma nova proteína reactiva com anticorpo monoclonal neutralizante anti- leucotoxina a um peso molecular aparente de acordo com o previsto de 27 kDa da proteína produto (lktA truncado). Estes mutantees representativos e controles de um único cruzamento foram analisadas por PCR para demonstrar a ausência de origem sensível a temperatura e uma cassete de resistência à canamicina (Passo G). O mutante M. haemolytica sorotipo Al foi designado como D153AlktCA4-707, que se refere às posições de aminoácidos na LktC e lktA, respectivamente, onde a região eliminada começa e termina. Inserção do gene foi caracterizado através de amplificação por PCR utilizando LktCAf (SEQ ID NO: l) e LktCAr (SEQ ID NO: 2), iniciadores que flanqueiam o local de eliminação. Tal como indicado pela imidadem do gel, a amplificação por PCR produziu os esperados ~ 2,3 kb para LktCA truncado, e ~ 5,0 kb para a bactéria de tipo selvidadem (Fig. 4A). Finalmente, o PCR realizado com os iniciadores (SEQ ID NOs: l e 2) e ts ori flanqueando os genes de resistência a canamicina confirmaram estes elementos não esteja mais presente no mutantee LktCA final para Master Seed (MS). Cinco microlitros do sobrenadante de cultura concentrado foi realizada em um sistema de SDS-PIDADE, transferidas para membrana de PVDF e sondadas com anticorpo de ratinho anti-lktA, anticorpo neutralizante 2C9-1E8 (1: 1000) como anticorpo primário. De cabra anti-IgG de ratinho (1: 4000) acoplado com fosfatase alcalina foi usado como anticorpo secundário e desenvolvido em uma solução contendo substrato NBT / BCIP durante 1-5 minutos (FIG 4B.). A falta de acilase funcional impede a activação do lktA, e, além disso, a deleção N-terminal do lktA que impede a formação de poros em neutrófilos de animais hospedeiros ou macrófagos. Exemplo 2 - Eficácia da M. haemolytica atenuada em bezerros

[00111] Os bezerros foram distribuídos aleatoriamente para um dos três grupos, cada um recebendo 106 ou 10 7 CFU da vacina MH A1 + A6, ou o controle RPMI (diluente). Mannheimia haemolytica liofilizada (MH) sorotipos Al e A6 foram ressuspensas e administrado por via intranasal, 1 mL a cada narina, de nove animais, com idades entre 5-6 semanas. Foram observados os vitelos para consumo de ração e temperatura retal tomadas manhã e à noite, durante 3 dias após a vacinação. Colonização nasal de M. haemolytica Al e A6 após a vacinação foi analisada por RT-QPCR (diferenciados entre M. haemolytica Al e A6 durante o estudo). As vacinas foram semeadas em TSA para exata UFC / ml contar com cada vacina no dia seguinte.

[00112] Desafio. Um stock de glicerol de fresco virulenta MH Al foi cultivado O / N em meio BHI, chapeado (TSA) no dia seguinte e incubadas a 37 ° C. No dia seguinte, as placas foram raspadas e diluiu-se em meio RPMI suplementado com soro bovino fetal inactivado a 2%. O inóculo foi crescido a 37° C / 200 rpm até desejado OD 6 foi conseguida oo, e a cultura foi diluída para o CFU / dose de desafio de diluição desejado e plaqueadas para eem umerar o exacto de UFC / ml no dia seguinte. O inóculo remanescente foi imediatamente diluído e banhado no laboratório. Os bezerros foram desafiados em dia através de administração trans-traqueal de 2,4 x 10 9 CFU em 20 ml de RPMI, perseguido com 60 ml RPMI. Os vitelos foram monitorizados quanto a mudanças de comportamento, incluindo letargia, tosse, corrimento nasal e teve como mostrado na Tabela 3. As temperaturas rectais foram monitorizados para os vitelos com sinais clínicos. Os pulmões foram marcados por lesões pneumônicas e registrados como lesão% em cada lóbulo, e tecido pulmonar também foi coletado para exame histopatológico. Cotonetes foram retirados de lesões pulmonares e traquéia para recuperar o organismo de desafio.

[00113] A Tabela 1 apresenta o horário de estudo. Tabela 1. Estudo da programação

*Os bezerros foram observados para consumo de ração e temperatura retal (manhã / noite) durante 3 dias, após a vacinação. As amostras de cada um dos vitelos foram testadas utilizando células inteiras, Lkt ELISA e RT-QPCR. Tabela 2. Critérios de sinais clínicos

[00114] Resultados. Três dias após o desafio um dos bezerros de controle mostrou sinais graves de pneumonia e foi eutanasiado (36,92% lesões típicas de M. haemolytica). Os restantes oito bezerros foram sacrificados no dia 6 e o seu envolvimento pulmonar por cento é descrito na Tabela 3. Os resultados indicam claramente que a vacina proporciona proteção quando administrada por via intranasal. Tal como indicado na tabela 4 a vacinação intranasal de M. haemolytica A1 / A6 combinação reduziu significativamente (62,0% e 76,7% para 6 log e log grupo 7 respectivamente) as lesões pulmonares quando comparado com simulado. Além disso, a análise histopatológica indicou claramente broncopneumonia necrotizante típica característica de M. haemolytica. Tabela 4.

[00115] As lesões (patologia grave) foram devidas a infecção crônica típica por Mycoplasma bovis.

Exemplo 3 - Desenvolvimento do método RT-QPCR para distinguir entre sorotipos A1 / A6

[00116] A eficácia de colonização intranasal de M. haemolytica A1 / A6 foi seguida durante o curso da experiência através de um novo método de QPCR. Resumidamente, os genomas dos acima descritos sorotipos Al e A6 das bactérias foram comparados contra dois genomas disponíveis Al e A2 no GenBank. A comparação revelou 63 genes específicos para Al (D153) e 42 genes específicos para A6 (D174). Fora destes 105 genes, escolhemos uma família S6 IgA específica metaloendopeptidase (SEQ ID NO: 14) específico para o gene de betaína / cRNAitina / colina transportador família Al e BCCT (SEQ ID NO: 12) específico para a A6, respectivamente, para PCR em tempo real diferencial. Estas sequências de genes foram amplificadas utilizando iniciadores específicos do gene, sequenciados pelo método de Sanger padrão e verificados. Em seguida, nós projetamos tempo real iniciadores de PCR e marcou as sondas com dois corantes diferentes (A 1-5 '6 FAM / ZEN / 3 e A6-5 "Cy5 / 3' IBRQ) dentro de cada gene. Para verificar a eficácia nosso método de ensaio, escolhemos colônias do M. haemolytica a partir de swab nasal obtidos a partir de bezerros mantidos em nossas instalações sete dias após a vacinação. As colônias individuais foram amplificadas por colônia multiplex PCR em tempo real utilizando QuantiTect Probe mastermix PCR kit (Qiidaden) seguindo a instrução do fabricante em uma máquina MX3000P qPCR (Stratidadene). Colônias Al e A6 verificadas por sorotipagem foram usados como controles positivos para tempo real multiplex PCR quantitativo (RT-qPCR). Os valores Ct foram fixados em configuração padrão da máquina e cada colônia verificada por meio de multiplex PCR em tempo real foi confirmada por leucotoxina (lktA) PCR específica. A RT- QPCR resultante de sete dias pós-vacinação indicou uma colonização preferencial de Al ao longo A6 (Tabela 5), o qual foi adicionalmente confirmada por supressão específica do gene de leucotoxina de PCR (Tabela 6). Mas, 14 e 21 dias pós- vacinação indicaram colonização essencialmente exclusiva de Al (Tabelas 7 e 8).

[00117] Tabela 5. Resultados de RT-QPCR para swab nasal a partir de D7 após a vacinação.

Tabela 6. Os resultados da PCR para swab nasal de D7 após a vacinação

Tabela 7. Os resultados da PCR para swab nasal do D14 após a vacinação

Tabela 8. Os resultados da PCR para swab nasal de D21 após a vacinação

vacinas Mannheimia haemolytica Al & A6 seguido por desafio virulento

[00118] Quinze bezerros, 4 semanas de idade e alojados em três canetas diferentes / 5 bezerros por caneta, foram aleatoriamente designados para um dos dois grupos de tratamento. Os vitelos foram vacinados via intranasal.} 'Com os sorotipos Mannheimia haemolytica viva modificada Al e A6 (reconstituído a partir de iyoph.ifeed. Tabela 9), e colonização intranasal de uma! A6 e foi monitorizada por PCR em tempo real. Os bezerros foram finalmente desafiados com vimient M, haemolytica A6 (tipo selvidadem) para determinar a eficácia da vacina. Tabela 9. Grupos de tratamento.

* reais CFU / ml com base na contidadem de placas.

[00119] Vacinação. Culturas liofilizadas de M. haemolytica Al e A6 foram contadas a partir de uma batelada armazenada a 4 ° C. No dia da vacinação, as vacinas foram diluídas em meio RPMI (incolor) para necessários CFU / mL para cada isolado. Do mesmo modo, a vacina simulada (liofilizado em meio RPMI estabilizador) foi diluída em meio RPMI. As vacinas foram semeadas em TSA para determinar a exacta CFU / mL Quantidade de vacina em cada dia seguinte. As vacinas foram misturadas e administradas de 1 ml / narina usando uma seringa de repetição ligado com uma cânula de acordo com a dose na Tabela 9. O grupo de controle foi vacinado em primeiro lugar, seguido do menor para o maior grupo de log. Após a vacinação, as amostras foram recolhidas como descrito na Tabela 10, e foram observados os vitelos para o consumo de ração e temperaturas rectais tomadas de manhã e à noite durante 3 dias após a vacinação. Colonização nasal de M. haemolytica Al e A6 após a vacinação foi analisada por Q- PCR, como descrito acima.

[00120] Cultura de M. haemolytica desafio A6. Um estoque de glicerol fresco de M. haemolytica A6 foi cultivado O / N em meio BHI, chapeado (TSA) no dia seguinte e incubado a 37° C. No dia seguinte, as placas foram raspadas e diluiu- se em meio RPMI suplementado com soro bovino fetal inativado a 2%. O inóculo foi crescido a 37 ° C / 200 rpm até densidade ótica desejada OD60 tenha sido conseguida. A cultura foi diluída para CFU / dose desafio desejado e diluição banhado para eem umerar a exata / ml no dia seguinte CFU. O inoculo foi transportado em gelo e mantido em gelo durante desafio, e administrado trans-traqueal utilizando uma polegada agulha 14G x 1. A dose foi de 1,09 x 10 9 CFU / animal em 20 ml de RPMI, retomado com 60 ml de RPMI. Depois de concluído, o inoculo remanescente foi imediatamente diluição banhada. Os vitelos foram monitorados quanto a mudanças de comportamento, incluindo letargia, tosse, corrimento nasal e e teve como mostrado na Tabela 11. As temperaturas retais foram monitoradas para os vitelos com sinais clínicos. Os pulmões foram marcados por lesões pneumônicas e registrados como lesão% em cada lobo, e os tecidos foram coletadas para exame histopatológico. Cotonetes também foram tomadas a partir de pulmões (lesões) e traqueia para recuperar o organismo do desafio. Tabela 10. Programação de Estudo.

[00121] O consumo de ração (diário) e temperatura retal (duas vezes por dia) foram acompanhados durante 3 dias após a vacinação. Tabela 11. Os sinais clínicos.

[00122] Resultados. Dois dias após o desafio bezerro # 5 e 174 apresentavam sinais graves de pneumonia e foram sacrificados. Bezerro # 7 morreu no dia 3, após o desafio. Os restantes 12 animais foram submetidos a eutanásia no dia 5 e o seu envolvimento% pulmão é descrito na Tabela 4. Os resultados indicam que 80% dos vacinados foram protegidos pelo modificado M. haemolytica de vacina viva de A1 / A6. A partir do grupo 7 log, três (1, 3 e 9) animais foram apresentaram lesões significativamente grandes em comparação aos controles. As grandes lesões poderiam ter sido causadas por uma Mannheimia, micoplasma existente ou infecção viral, que tinha sido exacerbado pelo desafio. No geral, 80% dos vacinados (1, 2, 3, 4, 6, 8, 9 e 10) tiveram significativamente (redução de 89,55%) reduziu lesão pulmonar em relação ao controle e análise histopatológica indicou broncopneumonia necrotizante típica nos animais de controlo. Tabela 12. Grupos dosados.

[00123] A eficácia da colonização intranasal de M. haemolytica A1 / A6 foi seguido durante o curso da experiência por métodps QPCR acima descritos. Resultados para 7 e 15 dias pós-vacinação vacinados indicados teve uma colonização preferencial de Al sobre A6 que foi ainda confirmado por PCR de deleção específica do gene de leucotoxina (Tabelas 13 e 14). Tabela 13. Dia 7 após a Vacinação

[00124] Tendo assim descrito em detalhe concretizações preferidas da presente invenção, é para ser entendido que a invenção definida pelos parágrafos acima não é para ser limitada aos detalhes específicos estabelecidos na descrição acima de como muitas variações evidentes da mesma são possíveis sem se afastarem do espírito ou escopo da presente invenção.

Claims (11)

1. Vacina para indução de uma resposta imunogênica em um animal caracterizada pelo fato de que compreende bactérias contendo uma mutação atenuante de um gene, em que a mutação modifica a expressão e/ou a atividade biológica de um polipeptídeo ou proteína codificada por um gene, resultando em virulência atenuada da bactéria, em que a mutação é uma deleção em enquadramento resultando na secreção de uma bactéria de leucotoxina truncada (LktA), ainda, em que as bactérias são os sorotipos A1 e A6 de Mannheimia haemolytica, ainda, em que a deleção é dentro do locus do gene LktCA que codifica uma enzima acilase (LktC) e leucotoxina A (LktA), ainda, em que a sequência de aminoácidos da forma truncada segregada de LktA consiste na sequência codificada pela SEQ ID NO: 16 ou 17.

2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

3. Vacina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.

4. Vacina, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é bactéria inativada, vírus inativado, frações de bactérias inativas, lipopolissacarídeos bacterianos, toxinas bacterianas ou derivados ou combinações dos mesmos.

5. Vacina, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que compreende ainda bactérias em combinação com M. haemolytica.

6. Vacina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende P. Multocida, e Histophilus somni (H. Somni).

7. Uso de uma vacina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma medicação imunológica adequada para a prevenção de doença respiratória bovina causada por M. Haemolytica.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o animal é um bovino.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o bovino é um bezerro que tem 28 dias ou mais.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a vacina é administrada por via intranasal.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser para proteger os bovinos contra as cepas A1 ou A6 de M.haemolytica.

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