ES2684556T3 - Vacunas de mannheimia haemolytica atenuadas y procedimientos de fabricación y uso - Google Patents

Abstract

Vacuna para provocar una respuesta inmunogénica en un animal, comprendiendo la vacuna bacterias que contienen una mutación atenuante en un gen, en la que la mutación modifica la expresión y/o la actividad biológica de un polipéptido o proteína codificada por el gen, dando lugar a una virulencia atenuada de las bacterias, en la que la mutación es una deleción dentro del marco que da lugar a que las bacterias secreten una leucotoxina (LktA) truncada, en la que además las bacterias son los serotipos A1 y A6 de Mannheimia haemolytica, en la que además la deleción está dentro del locus del gen de LktCA que codifica acilasa (LktC) y leucotoxina A (LktA), en la que además la secuencia de aminoácidos de la forma truncada secretada de LktA consiste en la secuencia codificada por la SEQ ID NO: 16 o 17.

Description

Vacunas de mannheimia haemolytica atenuadas y procedimientos de fabricación y uso

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere en general a vacunas bacterianas atenuadas, en particular las que proporcionan una protección amplia, segura y eficaz a animales de producción contra las infecciones/enfermedades causadas por bacterias gram-negativas, incluyendo Mannheimia (Pasteurella) haemolytica. La invención se refiere además a procedimientos de producción de las bacterias atenuadas y a procedimientos de PCR para diferenciar entre los serotipos A1 y A6 de M. haemolitica, in vivo.

[0002] La presente invención se refiere por tanto a composiciones inmunogénicas o de vacuna que comprenden las bacterias de la invención; por ejemplo, bacterias atenuadas vivas. Las bacterias también podrían inactivarse en las composiciones, pero puede ser ventajoso que las bacterias sean bacterias vivas atenuadas de M. haemolytica, ya sean solas, o en combinación con otras bacterias, tales como Haemophilus Somnus y/o Pasteurella multocida. También se describen en este documento procedimientos para preparar y/o formular tales composiciones; por ejemplo, cultivar o dearrollar o propagar las bacterias sobre o en medio adecuado, recolectar las bacterias, opcionalmente inactivar las bacterias y, opcionalmente, mezclar las bacterias con un portador, excipiente, diluyente o vehículo aceptables veterinaria o farmacéuticamente adecuados, y/o un adyuvante y/o estabilizador. Por lo tanto, también se describe en el presente documento el uso de bacterias en la formulación de tales composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] M. haemolytica es una bacteria gram negativa que se encuentra normalmente en el tracto respiratorio superior de ganado, ovejas y ovejas salvajes sanos. M. haemolytica desciende en los pulmones cuando el ganado experimenta estrés, tal como el transporte, el destete, el hacinamiento, o infecciones virales y provoca bronconeumonía fibrinosa y necrotizante, un componente principal del complejo de la enfermedad respiratoria bovina (BRDC). Las pérdidas económicas debido a la BRDC en Norteamérica es de más de mil millones de dólares al año (Bowland y Shewen, 2000). M. haemolytica es la bacteria más comúnmente aislada de los pulmones de ganado afectado con BRDC. El serotipo A1 de M. haemolytica es responsable de aproximadamente el 60% de la fiebre del transporte, mientras que los serotipos A6 y A2 representan el 26% y el 7%, respectivamente (Al-Ghamdi et al, 2000; Purdy et al., 1997). Tanto A1 como A6 de M. haemolytica representan > 85% de los casos de BRDC que implican patógenos bacterianos.

[0004] Las vacunas disponibles actualmente en el mercado contra las infecciones por M. haemolytica son sólo moderadamente protectoras contra la fiebre de embarque de ganado vacuno, pero generalmente ineficaces contra la neumonía en terneros neonatales lecheros (Virtala et al, 1996; Rice et al, 2007). La causa principal de neumonía bacteriana grave en ganado lechero de engorde y neonatales es M. haemolytica serotipo A1 seguido de serotipo A6 (Schreuer et al., 2000, Rice et al., 2007).

[0005] La evaluación experimental de todas las vacunas comerciales de M. haemolytica A1 utilizadas en ganado de engorde mostró sólo una protección parcial en el 50% de los estudios (Perino y Hunsaker, 1997). Además, la protección cruzada contra los serotipos de M. haemolytica (ya sea A6 o A2) ha sido difícil de lograr con preparaciones de vacuna convencionales (Purdy et al, 1993; Sabri et al, 2000). Por lo tanto, una vacuna eficaz contra serotipos A1 y A6 de M. haemolytica podría mejorar significativamente la producción de leche/carne.

[0006] La inmunidad efectiva contra M. haemolytica es multifacética. Son necesarios anticuerpos neutralizantes contra la leucotoxina exotoxina A (LktA) y antígenos de superficie para la inmunidad protectora contra M. haemolytica (Shewen y Wilkie, 1988). Debido a la maquinaria genética compleja involucrada en el control de la expresión de diversos factores de virulencia de M. haemolytica, los antígenos de superficie específicos que son importantes en la estimulación de la inmunidad no se han determinado claramente (Lawrence et al, 2010). Sin embargo, las proteínas de membrana externa (OMP) de M. haemolytica se han implicado en la estimulación de la inmunidad contra los antígenos de superficie (Confer et al, 2003, Morton et al, 1995; Potter et al., 1999).

[0007] La inmunización intranasal de ganado se ha perseguido durante un tiempo utilizando virus de herpes bovino 1 (BoHV-1), virus respiratorio sincitial bovino (BRSV) y virus de la rinotraqueitis infecciosa bovina (IBR) (Ellis et al, 2007; Muylkens et al., 2007). INFORCE 3 de Pfizer disponible comercialmente cuando se administra por vía intranasal afirma evitar BRSV y también ayuda en la prevención de la enfermedad respiratoria causada por el virus de IBR y parainfluenza bovina de tipo 3 (PI3). En un estudio experimental cuando se administró un mutante de M. haemolytica carente de leucotoxina viva modificada por vía intranasal en terneros de engorde para carne destetados, dio lugar a la reducción de la colonización nasofaríngea con M. haemolytica de tipo natural en comparación con terneros de control no vacunados (Frank et al., 2003). Aunque la vacunación intranasal y M. haemolytica deficiente en leucotoxina son conocidos, los inventores no son conscientes de ninguna vacuna de M.

haemolytica que combine con éxito estos conceptos. WO 99/15670 A1 describe M. haemolytica serotipo A1, atenuada por una deleción en el gen lktA.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0008] La presente invención proporciona una vacuna para provocar una respuesta inmunogénica en un animal, comprendiendo la vacuna bacterias que contienen una mutación atenuante en un gen, en el que la mutación modifica la expresión y/o la actividad biológica de un polipéptido o proteína codificada por el gen, dando como resultado una virulencia atenuada de la bacteria, en la que la mutación es una deleción en marco que da lugar a las bacterias que segregan una leucotoxina truncada (LktA), además en la que las bacterias son Mannheimia haemolytica serotipos A1 y A6, además en la que la deleción está dentro del locus del gen de LktCA que codifica acilasa (LktC) y leucotoxina A (LktA), además en la que la secuencia de aminoácidos de la forma truncada secretada de LktA consiste en la secuencia codificada por la SEQ ID NO: 16 o 17.

[0009] La presente invención también proporciona una vacuna de la invención para su uso en la vacunación de un animal contra las enfermedades causadas por M. haemolytica, en la que la vacuna se administra al menos una vez.

[0010] Un objeto de la presente descripción es proporcionar vacunas eficaces que comprenden M. haemolytica atenuada de serotipos A1 y A6. En relación a una cepa parental de M. haemolytica serotipo A1 o A6, las cepas atenuadas pueden tener modificaciones genómicas, incluyendo deleciones, sustituciones y adiciones, y cuya presencia (o ausencia) está asociada con una virulencia reducida. En una realización, una M. haemolytica de tipo natural (serotipo A1 D153) puede modificarse para contener una deleción parcial de genes del locus genómico de leucotoxina CA (lktCA), dndo lugar a una bacteria atenuada, que secreta una forma truncada, no citotóxica, de la proteína LktA. Las vacunas idealmente proporcionan inmunidad protectora segura, eficaz y amplia.

[0011] Otro objeto de la descripción es proporcionar vacunas multivalentes, que comprenden la M. haemolytica atenuada en combinación con otras bacterias, incluyendo P. multocida, M. haemolytica serotipo A6, y Haemophilus somnus (H. Somni). Por lo tanto, la invención abarca una vacuna de 4 vías no virulenta viva modificada útil contra la enfermedad respiratoria bovina.

[0012] Se describen en el presente documento procedimientos para el tratamiento y la profilaxis de la infección por la enfermedad respiratoria bovina, que comprende las etapas de administrar cantidades eficaces de las vacunas de la invención a los animales bovinos susceptibles.

[0013] En una realización, las vacunas atenuadas comprenden además un adyuvante. El adyuvante puede ser cualquier sustancia que aumenta y/o incrementa la respuesta inmunitaria provocada, en comparación con la vacuna atenuada sola. Los adyuvantes de la mucosa, incluyendo quitosanos y derivados de los mismos, son particularmente útiles para las vacunas atenuadas orales descritas.

[0014] Se describen en el presene documento procedimientos para inducir una respuesta inmunológica (o inmunogénica) o protectora contra M. haemolytica, así como procedimientos para la prevención o tratamiento de M. haemolytica, o estado o estados patológicos causados por M. haemolytica, que comprende administrar las bacterias atenuadas, o una composición que comprende las bacterias atenuadas a los animales en necesidad del mismo.

[0015] Además, la descripción proporciona procedimientos de PCR y reactivos útiles para el diagnóstico y/o discriminar entre los serotipos A 1 y A6 de M. haemolytica. El análisis comparativo de secuencias genómicas, que se describe más adelante, reveló genes específicos de A1 y A6 que proporcionan la base para los procedimientos y reactivos proporcionados en esta descripción.

[0016] También se proporcionan kits que comprenden al menos la cepa de M. haemolytica atenuada e instrucciones de uso.

[0017] Estas y otras realizaciones se describen o son evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y están abarcadas por la misma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0018] Una descripción completa y propicia de la presente invención, incluyendo el mejor modo de la misma, para un experto en la técnica, se expone más particularmente en el resto de la memoria descriptiva, incluyendo la referencia a las figuras adjuntas, en las que: La figura 1 presenta el esquema utilizado para producir el plásmido pCT109GA189ΔlktCA-Kan (plásmido de sustitución). El producto final para la fabricación de vacunas incorporaba un sitio de unión al ribosoma de consenso (AGGAGG, rbs) en dirección 5’ del codón de inicio que sustituyó al rbs pobre en lktC y aumentó la expresión de leucotoxoide. El gen de lktA nativo, eliminado en la cepa de la vacuna, utiliza un rbs fuerte (AGGAGA). Para este producto, se utilizó el cebador lktRBSr en lugar del cebador lktCAdelr. El sitio de consenso está subrayado; la figura 2 ilustra la integración del plásmido de sustitución en el genoma bacteriano;

la figura 3 representa la resolución/escisión del plásmido de sustitución, suprimiendo sólo la secuencia ΔlktCA deseada, integrada de manera estable en el genoma bacteriano, y que codifica la proteína LktA truncada; figura 4A. Electroforesis en gel de agarosa de productos de PCR del operón LktCABD de M. haemolytica que muestran LktCA truncada (carril 2) y LktCA de tipo natural (carril 3); figura 4B. Análisis de transferencia Western de LktA truncada expresada por cepa de vacuna de M. haemolytica D153Δ-1-PKL. Carriles: 1-marcador; 2-5 µl de sobrenadante de cultivo que contiene LktA truncada (* = 27 kDa, M. haemolytica D153Δ-1-PKL); 3-5 µl de sobrenadante de cultivo que contiene LktA de tipo natural (* = 102 kDa, M. haemolytica, cepa parental D153); la figura 5 es un diagrama de Venn que representa los genes únicos y superpuestos presentes en cinco aislados de

M. haemolytica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0019] La presente invención se refiere a una vacuna o composición de M. haemolytica que puede comprender una cepa de M. haemolytica atenuada y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal.

[0020] Con el fin de desarrollar una vacuna de M. haemolytica intranasal eficaz, que protege los animales bovinos contra los serogrupos A1/A6, los inventores utilizaron M. haemolytica que tiene un gen de LktA parcialmente eliminado. Esta bacteria no causa citolisis, pero es capaz de inducir anticuerpos neutralizantes. Antes de la presente descripción, no se sabía si la administración intranasal (o la administración por cualquier vía) provocaría en animales bovinos una respuesta inmunitaria protectora.

[0021] Aunque existen procedimientos serológicos para distinguir M. haemolytica A1 y A6, estos procedimientos no son siempre fiables y desarrollar antisueros fuertes contra A6 es particularmente difícil. Para superar este problema, los inventores secuenciaron ambos genomas de A1 y A6, realizaron un análisis genómico comparativo y desarrollaron un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) para distinguir entre los aislados de campo A1 y A6 y para realizar un seguimiento de nuestra combinación de vacuna intranasal (M. haemolytica, M. somnus y P. multocida).

[0022] De este modo, una realización de esta descripción proporciona procedimientos RT-QPCR útiles, que permiten al menos las siguientes actividades: a) identificación de aislados de campo de M. haemolytica A1 y A6 rápidamente y el cribado de una gran número de colonias; b) seguimiento de la vacunación/colonización de A1 y A6 en las cavidades nasales; c) eliminación de la necesidad de desarrollo de antisueros de título elevado; y d) el desarrollo de kits rápidos y automatizados de pruebas de diagnóstico.

[0023] La presente invención se refiere además a cepas de M. haemolytica atenuadas que tienen una deleción en al menos un gen de virulencia. La supresión se encuentra dentro de LktCA, un locus que codifica una enzima acilasa (LktC) y leucotoxina A (LktA), la citotoxina líder. Esta deleción se puede amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se puede detectar la secreción de una LktA truncada en una transferencia Western para determinar si la bacteria es el mutante o de tipo natural.

[0024] La deleción de la secuencia o secuencias genómicas de bacterias parentales virulentas para producir bacterias mutantes avirulentas atenuadas se logra a través una actividad inventiva nueva y no obvia. Dichas bacterias mutantes, también denominadas aquí como microorganismos vivos modificados (MLM), son útiles para la producción de composiciones inmunogénicas o vacunas que tienen un alto grado de inmunogenicidad y un bajo (o inexistente) grado de patogenicidad.

[0025] Estos mutantes también son útiles como vectores que pueden ser útiles para la expresión in vitro de productos de expresión, así como para la reproducción o replicación de secuencias de nucleótidos (por ejemplo, la replicación del ADN), y para productos de expresión in vivo.

[0026] Ingeniería de las mutaciones de deleción proporciona secuencias de nucleótidos y genes nuevos y no obvios, así como productos génicos nuevos y no obvios codificados por las secuencias de nucleótidos y genes. Dichos productos génicos proporcionan antígenos, inmunógenos y epítopos, y son útiles como productos génicos aislados. Dichos productos génicos aislados, así como epítopos de los mismos, también son útiles para generar anticuerpos, que son útiles en aplicaciones de diagnóstico.

[0027] Dichos productos génicos, que pueden proporcionar o generar epítopos, antígenos o inmunógenos, también son útiles para composiciones inmunogénicas o inmunológicas, así como vacunas.

[0028] En un aspecto, la presente invención se refiere a bacterias que contienen una mutación atenuante en una secuencia de nucleótidos o un gen en el que la mutación modifica, reduce o suprime la expresión y/o la actividad biológica de un polipéptido o proteína codificada por un gen, dando como resultado una virulencia atenuada de la bacteria. La mutación es una deleción en el marco que da lugar a que la bacteria secreta una leucotoxina

truncada. En una realización particular, la leucotoxina truncada migra a aproximadamente 27 kD en un gel de SDS típico.

[0029] La atenuación reduce o suprime la patogenicidad de las bacterias y la gravedad de los signos clínicos o lesiones, disminuye la tasa de crecimiento de las bacterias y evita la muerte de las bacterias.

[0030] En particular, la presente invención abarca vacunas que comprenden cepas de M. haemolytica atenuadas, que provocan una respuesta inmunogénica en un animal, en particular las cepas de M. haemolytica atenuadas que provocan, inducen o estimulan una respuesta en un animal bovino.

[0031] Las cepas particulares de M. haemolytica atenuadas de interés tienen mutaciones en genes, con relación a la cepa parental virulenta de tipo natural, que están asociados con la virulencia. Se reconoce que, además de cepas que tienen las mutaciones descritas, se describen en este documento cepas atenuadas que tengan cualquier número de mutaciones en los genes de virulencia descritos.

[0032] En otro aspecto, las cepas de M. haemolytica atenuadas nuevas se formulan en una vacuna segura, eficaz contra M. haemolytica y las infecciones/enfermedades causadas por M. haemolytica.

[0033] En una realización, las vacunas de M. haemolytica comprenden además un adyuvante. En una realización particular, el adyuvante es un adyuvante de la mucosa, tal como quitosano, quitosano metilado, quitosano trimetilado

o derivados o combinaciones de los mismos.

[0034] Tal como se define en el presente documento, el término "gen" se utilizará en un sentido amplio, y abarca secuencias codificantes y secuencias no codificantes (es decir, secuencias reguladoras en dirección 3’ y 5’, promotores, UTR 5'/3', intrones y exones). Cuando se pretende hacer referencia a solamente una secuencia de codificación de un gen, el término "secuencia codificante del gen" o "CDS" se utilizarán indistintamente en toda esta descripción.

[0035] Por "antígeno" o "inmunógeno" se entiende una sustancia que induce una respuesta inmunitaria específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad

o parte de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmunitaria tras la presentación a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno, o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.

[0036] Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal

o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y que puede estar interrumpido por restos químicos distintos de aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo la formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje o bioactivo.

[0037] El término "polipéptido inmunogénico o antigénico", tal como se usa en el presente documento incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que una vez administrado al huésped, es capaz de evocar una respuesta inmunitaria de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. De este modo, un fragmento de proteína comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", tal como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y de este modo provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Tales fragmentos pueden ser identificados usando cualquier técnica de mapeo de epítopos bien conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse mediante, por ejemplo, la síntesis simultánea de grandes cantidades de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a partes de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están todavía unidos a los soportes. Dichas técnicas se conocen en el estado de la técnica y se describen en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos. No. 4.708.871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. De manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente mediante la determinación de la conformación espacial de aminoácidos, tal como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Los procedimientos especialmente aplicables a las proteínas de T. parva se describen completamente en el documento PCT/US2004/022605 publicada como WO2005/007691A. En el presentre documento se describen fragmentos activos y variantes del polipéptido antigénico. Por lo tanto, el término "polipéptido inmunogénico o antigénico" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones a la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica, tal como se define en este documento. El término "variación

conservativa" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos aspartato y glutamato; (2) básicos -lisina, arginina, histidina; (3) no polares -alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga -glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido, siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.

[0038] El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al cual responden células B y/o células T específicos. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.

[0039] Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta celular y/o inmunitaria mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Por lo general, una "respuesta inmunológica" incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en el composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, de manera que la resistencia a una nueva infección se verá reforzada y/o la gravedad clínica de la enfermedad se verá reducida. Dicha protección se demostrará por una reducción o ausencia de síntomas y/o signos clínicos de la enfermedad normalmente mostrados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral disminuido en el huésped infectado.

[0040] Por "animal" se entiende mamíferos, aves, y similares. Animal o huésped, tal como se utiliza en el presente documento, incluye mamíferos y humanos. El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballos), canino (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos incluyendo guepardos y linces), ovino (por ejemplo, ovejas), bovino (por ejemplo, ganado), porcino (por ejemplo, cerdo), aves (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emu y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsier, mono, gibón, simio), hurones, focas y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo recién nacido, embrionario y etapas fetales.

[0041] A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta descripción. Los términos singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0042] Se observa que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, los términos, tales como "comprende" "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado "incluye", "incluido", "que incluye", y similares. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refieren a ARN o ADN que es lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o un híbrido de los mismos. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de unión, tales como fluororibosa y tiolato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación, con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son los bloqueos, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, y la introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes de marcaje, otros polinucleótidos o soporte sólido. Los polinucleótidos se pueden obtener por síntesis química o derivar de un microorganismo.

[0043] El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o sólo las secuencias codificantes como en ADNc y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Por ejemplo, el gen también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.

[0044] Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico o proteína u orgánulo) se refiere a un componente que se ha separado sustancialmente o purificado de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que se produce el componente de forma natural, por ejemplo, otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y proteínas que se han "aislado" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante procedimientos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante tecnología recombinante, así como la síntesis química.

[0045] El término "variación conservativa" indica la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, tal como se describe anteriormente. El término "recombinante" significa un polinucleótido de origen semisintético o sintético que, o bien no se produce en la naturaleza o está ligado a otro polinucleótido en una disposición no hallada en la naturaleza.

[0046] "Heterólogo" significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad a la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido puede colocarse mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor extraido de su secuencia codificante nativa y unido operativamente a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.

[0047] Los polinucleótidos descritos en este documento pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias codificantes adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control, tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo o un promotor diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homóloga y transformación de una célula huésped, y cualquier constructo, según pueda ser deseable.

Procedimientos de uso y artículo de fabricación

[0048] La presente descripción incluye los procedimientos siguientes. En una realización, se describe un procedimiento de vacunación de un animal que comprende administrar una composición que comprende una cepa de M. haemolytica atenuada y un portadoripiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable a un animal. En un aspecto de esta realización, el animal es un animal bovino.

[0049] El volumen de dosis de composiciones para las especies diana que son mamíferos, por ejemplo, el volumen de dosis de composicionespara cerdos o puercos, basado en antígenos bacterianos, es generalmente de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 2,0 ml, de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1,0 ml, y de entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 1,0 ml.

[0050] La eficacia de las vacunas puede ser analizada aproximadamente de 2 a 4 semanas después de la última inmunización mediante la estimulación de los animales, tales como animales bovino, con una cepa virulenta de M. haemolytica. Ambas cepas homóloga y heteróloga se utilizan para la estimulación para probar la eficacia de la vacuna. El animal puede ser estimulado mediante inyección IM o SC, aerosol, intra-nasal, intra-ocular, por vía intratraqueal, y/o por vía oral. Se pueden recoger muestras de las articulaciones, los pulmones, el cerebro y/o la boca antes y después de la estimulación y se pueden analizar para la presencia de anticuerpo específico de M. haemolytica.

[0051] Las composiciones que comprenden las cepas bacterianas atenuadas de la invención utilizadas en los protocolos de sensibilización-refuerzo están contenidas en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutico o veterinariamente aceptable. Los protocolos de la invención protegen al animal de M. haemolytica y/o previenen la progresión de la enfermedad en un animal infectado.

[0052] Las diversas administraciones se realizan preferiblemente de 1 a 6 semanas de diferencia. El intervalo de tiempo preferido es de 3 a 5 semanas, y óptimamente 4 semanas de acuerdo con una realización. También se prevé un refuerzo anual. Los animales, por ejemplo, cerdos, pueden tener al menos 3-4 semanas de vida en el momento de la primera administración. A partir de la descripción de este documento y el conocimiento en la técnica, el experto puede determinar el número de administraciones, la vía de administración, y las dosis a utilizar para cada protocolo de inyección sin gran experimentación.

[0053] También se describe en el presente documento un kit para llevar a cabo un procedimiento de producir o inducir una respuesta inmunológica o protectora contra M. haemolytica en un animal que comprende una composición inmunológica o vacuna de M. haemolytica atenuada y las instrucciones para realizar el procedimiento de liberación de una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.

[0054] También se describe en el presente documento un kit para realizar un procedimiento de inducir una respuesta inmunológica o protectora contra M. haemolytica en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende una cepa de M. haemolytica atenuada de la invención, y las instrucciones para realizar el procedimiento de liberación en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.

[0055] También se describe en el presente documento un kit para la vacunación de sensibilización-refuerzo de acuerdo con la presente invención tal como se describe anteriormente. El kit puede comprender al menos dos viales: un primer vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación de sensibilización de acuerdo con la presente invención y un segundo vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación de refuerzo según la presente invención. El kit puede contener ventajosamente primeros o segundos viales adicionales para vacunas de sensibilización adicionales o vacunas de refuerzo adicionales.

[0056] Los portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una solución de NaCl (por ejemplo, solución salina) al 0,9% o un tampón fosfato. Otro portador

o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable que se puede utilizar para los procedimientos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que facilitan la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector de la invención in vitro); ventajosamente, el portador, vehículo o excipiente pueden facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína). Las dosis y volúmenes de dosis se describen en el presente documento en la descripción general y también pueden ser determinadas por el experto en la materia a partir de esta descripción en relación con el conocimiento en la técnica, sin gran experimentación.

[0057] Las composiciones inmunológicas y vacunas de acuerdo con la invención pueden comprender uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen uno o más unidades de CpG no metiladas (Klinman et al, 1996; WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", publicado por M. Powell, M . Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de la misma obra, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA (5) citocinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina u (8) otros adyuvantes descritos en cualquier documento citado, o (9) cualquier combinación o mezclas de los mismos.

[0058] En una realización, los adyuvantes incluyen aquellos que promueven una mejor absorción a través de revestimientos de la mucosa. Algunos ejemplos incluyen MPL, LTK63, toxinas, micropartículas de PLG y varios otros (Vajdy, M. Immunology and Cell Biology (2004) 82, 617-627). En una realización, el adyuvante puede ser un quitosano (Van der Lubben et al 2001; Patel et al 2005; Majithiya et al 2008; patente de Estados Unidos Nº de serie 5.980.912).

[0059] En una realización, el adyuvante pueden ser bacterias inactivadas, un virus inactivado, fracciones de bacterias inactivadas, lipopolisacáridos bacterianos, toxinas bacterianas o derivados o

Referencias.

[0060]

Ackermann, M. R, Brogden, K.A. 2000. Response of the ruminant respiratory tract to Mannheimia (Pasteurella) haemolytica. Microbes Infect. 2:1079-1088. Al-Ghamdi, G.M., et al, 2000. Serotyping of Mannheimia (Pasteurella) haemolytica isolates from the upper Midwest United States. J. Vet. Diagn. Invest. 12, 576-578. Bowland, S., Shewen, P., 2000. Bovine respiratory disease: commercial vaccines currently available in Canda. Can. Vet. J. 41, 33-38. Briggs R.E, Tatum F.M. 2005. Generation and molecular characterization of new temperature-sensitive plasmids intended for genetic engineering of Pasteurellaceae. Appl Environ Micobiol 71:7187-7195. Burriel, A.R. 1997. News & Notes: Isolation of Pasteurella haemolytica from Grass, Drinking Water, and Straw Bedding Used by Sheep. Curr. Microbiol. 35: 316-318. Confer, A.W., et al., 2003. Immunogenicity of recombinant Mannheimia haemolytica serotype 1 outer membrane protein PIpE and augmentation of a commercial vaccine. Vaccine 21, 2821-2829. Davies, R.L, et al. 2002. Mosaic structure and molecular evolution of the leukotoxin operon (lktCABD) in Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Mannheimia glucosida, and Pasteurella trehalosi. J Bacteriol. 184(1):266-277.

Davies, R.L, et al. 2001. Sequence diversity and molecular evolution of the leukotoxin (lktA) gene in bovine and ovine strains of Mannheimia (Pasteurella) haemolytica. J Bacteriol. 183(4):1394-1404. Ellis, J., et al., 2007. Response of calves to challenge exposure with virulent bovine respiratory syncytial virus following intranasal administration of vaccines formulated for parenteral administration. J. Am. Vet. Med. Assoc. 230, 233-243. Frank, G.H, et al. 2003. Effect of intranasal exposure to leukotoxin-deficient Mannheimia haemolytica at the time of arrival at the feedyard on subsequent isolation of M. haemolytica from nasal secretions of calves. Am J Vet Res. 64(5):580-585. Gioia, J. et al. 2006. The genome sequence of Mannheimia haemolytica A1: insights into virulence, natural competence, and Pasteurellaceae phylogeny. J Bacteriol. 188(20):7257-7266. Lawrence, P.K., et al., 2010. Three-way comparative genomic analysis of two Mannheimia haemolytica isolates. BMC Genomics. 11:535 (Open access). Morton, R.J., et al., 1995. Vaccination of cattle with outer membrane protein-enriched fractions of Pasteurella haemolytica and resistance against experimental challenge exposure. Am. J. Vet. Res. 56, 875-879. Miller, M. W. 2001. Pasteurellosis, In E. S. Williams and I. K. Barker (ed.), Infectious diseases of wild mammals. Iowa State University. Press, Ames, IA. p. 330-339 Mosier, D. A. 1997. Bacterial pneumonia. Vet. Clin. N. Am. Food Anim. Pract. 13:483-493. Muylkens, B., et al., 2007. Bovine herpesvirus 1 infection and infectious bovine rhinotracheitis. Vet. Res. 38, 181-209. Potter, A.A., et al., 1999. Protective capacity of the Pasteurella haemolytica transferrin-binding proteins TbpA and TbpB in cattle. Microb Pathog 27, 197-206. Perino, L.J., Hunsaker, B.D., 1997. A review of bovine respiratory disease vaccine field efficacy. The Bovine Practitioner 31, 59-66. Purdy, C.W., et al, 1993. Efficacy of Pasteurella haemolytica subunit antigens in a goat model of pasteurellosis. Am.

J. Vet. Res. 54, 1637-1647. Purdy, C.W., et al., 1997. Efficacy of a subcutaneously administered, ultraviolet light-killed Pasteurella multocida A:3containing bacterin against transthoracic challenge exposure in goats. Am. J. Vet. Res. 58, 841-847. Rehmtulla, A. J, Thomson, R.G. 1981. A review of the lesions in shipping fever of cattle. Can. Vet. J. 22:1 Rice, J.A., et al., 2007. Mannheimia haemolytica and bovine respiratory disease. Anim. Health Res. Rev. 8, 117-128. Sabri, M.Y., et al., 2000. Efficacy of an outer membrane protein of Pasteurella haemolytica A2, A7 or A9-enriched vaccine against intratracheal challenge exposure in sheep. Vet. Microbiol. 73, 13-23. Schreuer, D., et al. 2000. Evaluation of the efficacy of a new combined (Pasteurella) Mannheimia haemolytica serotype A1 and A6 vaccine in pre-ruminant calves by virulent challenge. Journal Cattle Practice Vol. 8 No. 1 pág. 912 Shewen, P.E., Wilkie, B.N., 1988. Vaccination of calves with leukotoxic culture supernatant from Pasteurella haemolytica. Can. J. Vet. Res. 52, 30-36. Virtala, A.M., et al., 1996. Epidemiologic and pathologic characteristics of respiratory tract disease in dairy heifers during the first three months of life. J. Am. Vet. Med. Assoc. 208, 2035-2042.

[0061] La invención se describirá ahora adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 -Producción de M. haemolytica atenuada

[0062] M. haemolytica es un organismo comensal del tracto respiratorio superior de los terneros y otros rumiantes. En situaciones de estrés y en animales inmunocomprometidos, M. haemolytica desciende en los pulmones y causa una enfermedad sistémica grave con resultado de pasteurelosis neumónica o "fiebre de embarque". El patógeno puede ser transmitido por contacto de nariz a nariz. Para atenuar la bacteria, hemos suprimido los nucleótidos dentro del locus LktCA, que codifica una enzima acilasa (LktC) y leucotoxina A (LktA), la citotoxina líder de la bacteria. Esta supresión se puede amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se puede detectar la secreción de una LktA truncada en una transferencia Western para determinar si la bacteria es el mutante o de tipo natural. La ingeniería genética se resume en las figuras 1-3. Todos los reactivos, incluido los vectores lanzadera pCR2.1, pBC SK, pSK, y pCT109GA189 ts ori, y la célula huésped E. coli DH11S, son bien conocidos y accesibles por los expertas en la técnica.

[0063] Construcción de la supresión de lktCA. pCT109GA189-KanAlktCA y pCT109GA189-KanAlktCA-rbs se construyeron como se indica en las figuras 1-3. Brevemente, dos fragmentos de ADN, en dirección 5’ (1,06 kb, SEQ ID NO: 6) y en dirección 3’ (1,29 kb, SEQ ID NO: 7) se amplificaron por PCR de la cepa de M. haemolytica NADC D153 (Figura 1). Se utilizaron células completas como plantilla usando los conjuntos de cebadores, lktCAf (SEQ ID NO: 1)/lktCAdelr (SEQ ID NO: 4) y lktCAr (SEQ ID NO: 2)/lktCAdelf (SEQ ID NO: 3). Los productos de PCR se extrajeron con fenol-cloroformo para inactivar la Taq polimerasa y a continuación se digirieron con MunI antes de la ligadura. Los productos de ligación se amplificaron por PCR con el par de cebadores lktCAf/lktCAr y los productos se clonaron utilizando un vector disponible comercialmente (PCR2.1, Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0064] Se seleccionó un producto que contenía un inserto de aproximadamente 2,3 kb y se confirmó la secuencia correcta a través de la deleción mediante secuenciación de ADN y se denominó pTAΔlktCA. Un casete de kanamicina derivado de pUC4K se colocó en el sitio SalI de pBC SK (Stratagene Inc.) para generar pBCKan. Se transfirió en pBCKan el inserto de leucotoxina con 2,3 kb eliminados en pTAΔlktCA mediante digestión con EcoRI y ligadura en el sitio EcoRI único para formar pBCKanΔlktCA. Este producto se amplificó por PCR usando el par de cebadores lktCAdelf (SEQ ID NO: 3) y lktRBSr (SEQ ID NO: 5) para reemplazar el sitio de unión a ribosoma (RBS) lktC nativo por un RBS consenso (figura 1). El producto se digirió con MunI y se ligó a sí mismo para formar pBCKanΔlktCArbs. Se confirmó la secuencia apropiada adyacente a la deleción mediante secuenciación de ADN. Finalmente, el esqueleto del plásmido pBC de pBCKanΔlktCA y pBCKanΔlktCArbs se reemplazó con el origen de replicación del plásmido sensible a la temperatura de pCT109GA189 (Briggs y Tatum, 2005) mediante la unión de preparaciones digeridas con BssHII de cada uno para generar pCT109GA189KanΔlktCA y pCT109GA189KanΔlktCArbs.

[0065] Se transformaron células D153 de serotipo de M. haemolytica electrocompetentes (cepa parental virulenta) con pCT109GA189KanΔlktCA y pCT109GA189KanΔlktCArbs mediante los procedimientos descritos anteriormente, excepto que el producto de de ligadura no metilado se introdujo directamente en las células competentes. (Briggs y Tatum, 2005) Brevemente, las células se hicieron electrocompetentes haciéndolas crecer hasta fase logarítmica en 100 ml de caldo Columbia (Difco Laboratories, Detroit, MI) a 37ºC con agitación suave. Las células se sedimentaron por centrifugación a 5.000 µg y se lavan en 100 ml de sacarosa 272 mM a 0ºC, y el sedimento se suspendió en un volumen igual de sacarosa 272 mM a 0ºC. Después de la electroporación, las células se recuperaron durante la noche en 10 ml de caldo Columbia a 30ºC. Se extendió el crecimiento (50 µl) sobre placas de agar Columbia que contenían 50 µg/ml de kanamicina, que a continuación se incubaron 36 horas a 30ºC. Se pasaron colonias individuales al caldo que contenía 50 µg/ml de kanamicina y se incubaron durante la noche a 30ºC. El crecimiento (100 µl) se hizo pasar de nuevo a placas de agar Columbia con kanamicina que se incubaron durante la noche a 39ºC. Se pasaron colonias individuales a placas de agar de tripticasa de soja (TSA) que contenía un 5% de sangre de oveja desfibrinada (placas de BA, incubadas durante la noche a 39ºC) y a caldo Columbia sin selección (incubada durante la noche a 30ºC). El crecimiento en caldo se extendió para el aislamiento en placas de BA y se pasó de nuevo en el caldo a 30ºC. Se detectaron colonias no hemolíticas que eran sensibles a la kanamicina en placas de BA después de 1 a 3 pases sin selección. Se seleccionaron colonias representativas de cada cepa receptora y el plásmido de sustitución para un estudio adicional.

[0066] Debido a que el origen del plásmido sensible a la temperatura funciona mal en huéspedes de clonación de E. coli, estos productos de ligadura finales se introdujeron directamente en M. haemolytica. Las etapas de clonación anteriores utilizaron E. coli DH11S (Life Technologies, Rockville, MD) como huésped de clonación.

[0067] Se desarrollaron mutantes no hemolíticos en caldo Columbia a 37ºC durante 3 horas y se recogieron en crecimiento logarítmico tardío. Los sobrenadantes se colocaron en puntos sobre nitrocelulosa junto con los sobrenadantes del parental de tipo natural y un mutante isogénico de leucotoxina negativa. Después del bloqueo y lavado apropiados, la transferencia se sondó con el anticuerpo monoclonal anti-leucotoxina 2C9-1E8 (anticuerpo neutralizante producido por NADC, Ames, IA). Se encontró que los productos mutantes que contienen el sitio de unión al ribosoma nativo expresaban bajos niveles de proteína reactiva con el anticuerpo monoclonal, menos que el producido por la cepa parental de tipo natural. Los productos que contenían el nuevo sitio de unión a ribosomas produjeron niveles mucho más altos de proteína reactiva. Los sobrenadantes de dos productos que expresan altos niveles de leucotoxina se concentraron 15 veces en un filtro de PM 10.000 (Centriprep, Amicon). Los concentrados (1,5 µl) se sometieron a SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se sondaron con anticuerpo 2C9-1E8. El análisis de transferencia Western indicó una nueva proteína reactiva con anticuerpo monoclonal neutralizante antileucotoxina en un peso molecular aparente consistente con el producto de proteína predicha de 27 kDa (LktA trincada). Estos mutantes representativos y los controles de entrecruzamiento simple se analizaron por PCR para demostrar la ausencia de origen sensible a la temperatura y el casete de resistencia a kanamicina (Etapa G). El mutante de M. haemolytica de serotipo A1 fue designado como D153ΔlktCA4-707, que se refiere a las posiciones de aminoácidos en LktC y LktA respectivamente, donde la región suprimida comienza y termina. La inserción de genes se caracterizó por amplificación por PCR usando los cebadores LktCAf (SEQ ID NO: 1) y LktCAr (SEQ ID NO: 2), que flanquean el sitio de deleción. Tal como se ha indicado en la imagen del gel, la amplificación por PCR produjo los esperados ~ 2,3 kb para LktCA truncada y ~ 5,0 kb para la bacteria de tipo natural (Figura 4A). Finalmente, la PCR realizada con los cebadores (SEQ ID NOs: 1 y 2) que flanquean los genes ts ori y genes de resistencia a kanamicina confirmó que esos elementos ya no estaban presentes en el mutante LktCA final para Master Seed (MS). Se aplicaron cinco microlitros del sobrenadante del cultivo concentrado sobre un sistema de SDS-PAGE, se transfirieron sobre una membrana de PVDF y se sondaron con el anticuerpo neutralizante anti-LktA de ratón 2C91E8 (1:1000) como anticuerpo primario. Se utilizó anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (1:4000) acoplado con fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario y se desarrolló en una solución de sustrato que contenía NBT/BCIP durante 1-5 min (figura 4B). La falta de acilasa funcional previene la activación de LktA, y además, la deleción N-terminal de LktA evita la formación de poros en los neutrófilos o macrófagos del animal huésped.

Ejemplo 2 -Eficacia de M. haemolytica atenuada en terneros

[0068] Los terneros se asignaron aleatoriamente a uno de tres grupos, recibiendo cada uno 106 o 107 UFC de la vacuna MH A1 + A6, o el control de RPMI (diluyente). se resuspendieron los serotipos A1 y A6 de Mannheimia haemolytica (MH) liofilizada y se administraron por vía intranasal, 1 ml a cada fosa nasal, de nueve terneros, con edades entre 5-6 semanas. Se observaron los terneros para el consumo de alimento y se tomó la temperatura rectal mañana y la tarde durante 3 días después de la vacunación. La colonización nasal de M. haemolytica A1 y A6 después de la vacunación se analizó por RT-QPCR (diferenciado entre M. haemolytica A1 y A6 a lo largo del estudio). Las vacunas se emplacaron en TSA para recuento exacto de UFC/ml en cada vacuna al día siguiente.

[0069] Estimulación. Se cultivó O/N una solución madre de glicerol fresco de MH A1 virulento en medio BHI, se puso en placas (TSA) al día siguiente y se incubó a 37ºC. Al día siguiente, las placas se rasparon y se diluyeron en medio RPMI suplementado con suero bovino fetal inactivado al 2%. El inóculo se cultivó a 37ºC/200 rpm hasta que se alcanzó la DO600 deseada y el cultivo se diluyó a la dosis deseada de UFC/estimulación y la dilución se puso en placas para enumerar las UFC/ml al día siguiente. El inóculo restante se puso en placas con dilución inmediatamente en el laboratorio. Los terneros se expusieron en el DÍA a través de la administración transtraqueal de 2,4 x 109 UFC en 20 ml de RPMI, seguido con 60 ml de RPMI. Los terneros fueron monitorizados para el cambio en el comportamiento incluyendo letargo, tos, secreción nasal y se puntuaron como se muestra en la Tabla 3. Las temperaturas rectales se monitorizaron en los terneros que mostraban signos clínicos. Los pulmones se puntuaron para lesiones neumónicas y se registraron como % de lesión en cada lóbulo y el tejido pulmonar también se recogió para histopatología. Se tomaron frotis de las lesiones pulmonares y la tráquea para recuperar el organismo de estimulación. La Tabla 1 presenta la programación de estudio.

Tabla 1. Programación de estudio

Edad

Día Suceso

5-6 semanas de vida

0 Día 0 – Sangrado, frotis y vacunación intranasal

7

7 días después de Vax -sangrado y frotis

14

14 días después de Vax -sangrado y frotis

21

21 días después de Vax -sangrado por Vax y frotis

22

22 días después de Vax -sangrado y frotis y estimulación con M. haemolytica A1

22-29

Observar signos clínicos partiendo 8/7, realizar eutanasia a los terneros, si es necesario. La eutanasia y necropsia todos en 8/13

* Se observaron en los terneros el consumo de alimento y la temperatura rectal (mañana/tarde) durante 3 días, después de la vacunación.

Las muestras de cada ternero se evaluaron utilizando células completas, ELISA de Lkt y RT-QPCR. Tabla 2. Criterio de los signos clínicos

0 =

normal

1 =

depresión, anorexia, tos, secreción nasal, disnea

2 =

severamente deprimida, son incapaces de levantarse o caminar, se practicó la eutanasia por razones humanitarias

3 =

muerto al llegar (DOA)

[0070] Resultados. Tres días después de la estimulación, uno de los terneros de control mostró signos graves de neumonía y fue sacrificado (36,92% de lesiones típicas de M. haemolytica). Los 8 terneros restantes se sacrificaron en el día 6 y su porcentaje de implicación pulmonar se describe en la Tabla 3. Los resultados indican claramente que la vacuna proporciona protección cuando se administra por vía intranasal. Tal como se indica en la Tabla 4, la vacunación intranasal de M. haemolytica A1/A6 combinado redujo significativamente (62,0% y 76,7% para el grupo de 6 log y 7 log, respectivamente) las lesiones pulmonares en comparación con el tratamiento simulado. Además, el análisis histopatológico indicó claramente una bronconeumonía necrotizante típica característica de M. haemolytica.

Tabla 4

Animal #

dosis real de vacuna A1/A6 UFC/animal Lesión pulmonar (%) Lesión pulmonar promedio (%) % de reducción promedio en lesión pulmonar en comparación con la simulación

125

1,19x106/9,2x105 24,03*

176

1,19x106/9,2x105 0,0

188

1,19x106/9,2x105 6,40 10,43 62,0

179

1,19x107/9,2x106 0,87

185

1,19x107/9,2x106 1,837

189

1,19x107/9,2x106 14,91* 6,48 76,7

122

Simulado 8,85

177

Simulado 37,75

182

Simulado 36,92 28,84

* Las lesiones (patología macroscópica) fueron debidas a la infección crónica típica por Mycoplasma bovis

Ejemplo 3 -Desarrollo del procedimiento de RT-QPCRpara distinguir entre serotipos A1/A6

5 [0071] La eficacia de la colonización intranasal de M. haemolytica A1/A6 se siguió durante el transcurso del experimento mediante un nuevo procedimiento de QPCR. Brevemente, los genomas de las bacterias de serotipo A1 y A6 descritos anteriormente se compararon contra un genoma A1 y dos A2 disponibles en GenBank. La comparación reveló 63 genes específicos para A1 (D153) y 42 genes específicos para A6 (D174). De estos 105

10 genes se eligió una metaloendopeptidasa específica de IgA de familia S6 (SEQ ID NO: 14) específica para A1 y el gen transportador de betaína/carnitina/colina de la familia de BCCT (SEQ ID NO: 12) específico para A6, respectivamente, para PCR diferencial de tiempo real. Estas secuencias de genes se amplificaron mediante el uso de cebadores específicos de genes, se secuenciaron mediante el procedimiento de Sanger estándar y se verificaron. A continuación, se diseñaron cebadores de PCR a tiempo real y se marcaron las sondas con dos

15 colorantes diferentes (A1-5'6 FAM/ZEN/3 y A6-5'Cy5/3'IBRQ) dentro de cada gen. Para verificar la eficacia de este procedimiento de ensayo se eligieron colonias de M. haemolytica de frotis nasales obtenidos de terneros mantenidos en las instalaciones 7 días después de la vacunación. Las colonias individuales fueron amplificadas mediante PCR a tiempo real Multiplex de colonias usando el kit QuantiTect Probe PCR Mastermix (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante en una máquina MX3000P qPCR (Stratagene). Las colonias A1 y A6 verificadas por el

20 serotipado se utilizaron como controles positivos para PCR en tiempo real Multiplex cuantitativa (RT-qPCR). Los valores de Ct se fijaron en la configuración por defecto de la máquina y cada colonia verificada mediante PCR a tiempo real Multiplex se confirmó mediante PCr específica de leucotoxina (LktA). Los resultados de RT-QPCR 7 días después de la vacunación indicaron una colonización preferencial de A1 sobre A6 (Tabla 5), que se confirmó adicionalmente mediante la PCR de deleción específica del gen de leucotoxina (Tabla 6). Pero los días 14 y 21

25 después de la vacunación indicaron la colonización esencialmente exclusiva de A1 (Tablas 7 y 8).

Tabla 5. Resultados RT-QPCR para frotis nasales de D7 después de la vacunación

ID

A1 A6 ΔLkt ID A1 A6 ΔLkt

151-1

17 11 + 183-1 16 12 +

151-2

15 - + 183-2 - 35

151-3

16 - + 183-3 17 - +

152-4

17 - + 183-4 16 - +

151-5

15 - + 183-5 - 17 +

154-1

- - 186-1 - 42

154-2

- 39 186-2 - 43

154-3

- - 186-3 - -

154-4

- - 186-4 - -

154-5

- 22 186-5 - 20

157-1

15 - + 190-1 - -

157-2

22 - + 190-2 - -

157-3

17 - + 190-3 - 10

157-4

15 33 + 190-4 - -

157-5

16 - + 190-5 - -

160-1

18 13 + 193-1 15 38 +

160-2

- 12 + 193-2 15 - +

160-3

- 12 + 193-3 - 36

160-4

- 12 + 193-4 16 20 +

160-5

- 11 + 193-5 - -

178-1

- - A1 mut. Vx 15 - +

178-2

- - A6 mut. Vx - 11 +

178-3

- - Neg. - -

178-4

- 24

178-5

- 31

181-1

15 15 +

181-2

17 - +

181-3

- 13 +

181-4

17 - +

181-5

15 - +

30 Tabla 6. Resultados PCR para frotis nasales de D7 después de la vacunación 12

ID/colonia

A1 A6 LktΔ ∼2300 pb ID/colonia A1 A6 LktΔ ∼2300 pb

122-1

- - 182-1 - -

122-2

- - 182-2 - -

122-3

- - 182-3 - -

122-4

- - 182-4 - -

122-5

- - 182-5 - -

125-1

16 - + Y 185-1 - 15 + Y

125-2

17 - + Y 185-2 18 - + Y

125-3

17 - + Y 185-3 16 - + Y

125-4

16 - + Y 185-4 - - + Y

125-5

17 - + Y 185-5 22 - + Y

176-1

17 - + Y 188-1 - -

176-2

17 - + Y 188-2 - -

176-3

16 - + Y 188-3 - -

176-4

16 - + Y 188-4 - -

176-5

16 - + Y 188-5 - -

177-1

- - 189-1 16 - + Y

177-2

- - 189-2 16 - + Y

177-3

- - 189-3 21 - + Y

177-4

- - 189-4 16 - + Y

177-5

- - 189-5 17 - +

179-1

17 - + Y Neg. - -

179-2

16 - + Y

179-3

- -

179-4

16 - + Y

179-5

29 - + Y

Tabla 7. Resultados PCR para frotis nasales de D14 después de la vacunación

ID-colonia #

A1 A6 Lkt ΔPCR Lkt Δ ID-colonia # A1 A6 Lkt ΔPCR Lkt Δ

122-1 (Con.

0 0 Neg 182-1 (Con. 0 0 Neg

122-2 (Con.

0 0 Neg 182-2 (Con. 0 0 Neg

122-3 (Con.

0 0 Neg 182-3 (Con. 0 0 Neg

125-1 (6 log)

15 0 Pos Y 185-1 (7 log) 0 0 Neg

125-2 (6 log)

16 0 Pos Y 185-2 (7 log) 0 0 Neg

125-3 (6 log)

16 0 Pos Y 185-3 (7 log) 0 0 Neg

176-1 (6 log)

0 0 Neg 188-1 (6 log) 0 0 Neg

176-2 (6 log)

0 0 Neg 188-2 (6 log) 0 0 Neg

176-3 (6 log)

0 0 Neg 188-3 (6 log) 0 0 Neg

177-1 (Con.

0 0 Neg 189-1 (7 log) 15 0 Pos Y

177-2 (Con.

0 0 Neg 189-2 (7 log) 15 0 Pos Y

177-3 (Con.

0 0 Neg 189-3 (7 log) 15 0 Pos Y

179-1 (7 log)

0 0 Neg A1 Mutante Pos 15 0 Pos Y

179-2 (7 log)

0 0 Neg A6 Mutante Pos 0 16 Pos Y

179-3 (7 log)

0 0 Neg Neg. con. 0 0 Neg

Tabla 8. Resultados PCR para frotis nasales de D21 después de la vacunación

ID-colonia #

A1 A6 Lkt ΔPCR Lkt Δ ID-colonia # A1 A6 Lkt ΔPCR Lkt Δ

122-1 (Con.

0 0 Δ 185-1 (7 log) 15 0 + Y

122-2 (Con.

0 0 185-2 (7 log) 14 0 + Y

122-3 (Con.

0 0 185-3 (7 log) 15 0 + Y

125-1 (6 log)

14 0 + Y 188-1 (6 log) 14 0 + Y

125-2 (6 log)

15 0 + Y 188-2 (6 log) 15 0 + Y

125-3 (6 log)

15 0 + Y 188-3 (6 log) 14 0 + Y

176-1 (6 log)

15 0 + Y 189-1 (7 log) 16 0 + Y

176-2 (6 log)

15 0 + Y 189-2 (7 log) 17 0 + Y

176-3 (6 log)

15 0 + Y 189-3 (7 log) 15 0 + Y

177-1 (Con.

0 0 + Y A1 Mutante Pos 15 0 + Y

177-2 (Con.

0 0 A6 Mutante Pos 0 16 + Y

177-3 (Con.

0 0 Neg. con. 0 0 neg

179-1 (7 log)

0 0 Preestimulación A1 wt. 15 0 + WT

179-2 (7 log)

0 0 Postestimulación A1 wt. 16 0 + WT

179-3 (7 log)

0 0

182-1 (Con.

0 0

182-2 (Con.

0 0

182-3 (Con.

0 0

Ejemplo 3 -Vacunación intranasal de terneros usando vacunas A1 y A6 contra Mannheimia haemolytica seguido de estimulación virulenta

5 [0072] Se asignaron aleatoriamente quince terneros, 4 semanas de vida y alojados en 3 jaulas diferentes/5 terneros por jaula, a uno de los dos grupos de tratamiento. Los terneros fueron vacunados por vía intranasal con los serotipos A1 y A6 de Mannheimia haemolytica viva modificada (reconstituidos a partir de liofilizado, Tabla 9), y la colonización intranasal de A1 y A6 se controló por PCR en tiempo real. Los terneros fueron finalmente estimulados con M. haemolytica A6 virulenta (tipo natural) para determinar la eficacia de la vacuna.

10 Tabla 9. Grupos de tratamiento.

Grupo

Tratamiento dosis total/CFU por animal ruta/volumen Id. del ternero

1

M. haemolytica A1 + A6 107 (1,43x106 + 8,63x105)* intranasal 1 ml por orificio nasal 2, 4, 6, 8, 10

2

M. haemolytica A1 + A6 108 (1,43x107 + 8,63x106)* intranasal 1 ml por orificio nasal 1, 3, 5, 7, 9

3

RPMI liofilizado de control + estabilizante control intranasal 1 ml por orificio nasal 162, 166, 170, 174, 175

*UFC/ml real basadas en el recuento de placas

[0073] Vacunación. Los cultivos liofilizados de M. haemolytica A1 y A6 se enumeraron de un lote almacenado a

15 4ºC. En el día de la vacunación, se diluyeron las vacunas en RPMI (incoloro) a CFU/ml requeridas para cada aislado. Del mismo modo, se diluyó la vacuna simulada (RPMI liofilizado en estabilizante) en RPMI. Las vacunas se emplacaron en TSA para determinar el recuento exacto de UFC/ml en cada vacuna al día siguiente. Las vacunas se mezclaron y se administraron 1 ml/orificio nasal usando una jeringa de repetición unida con una cánula de acuerdo con la dosis en la Tabla 9. El grupo de control fue vacunado primero, seguido por el grupo log de más alto a más

20 bajo. Después de la vacunación, se recogieron las muestras como se describe en la Tabla 10, y se observaron los terneros para el consumo de alimento y se tomaron las temperaturas rectales mañana y tarde durante 3 días después de la vacunación. La colonización nasal de M. haemolytica A1 y A6 después de la vacunación se analizó mediante Q-PCR tal como se describe anteriormente.

25 [0074] Cultivo de estimulación de M. haemolytica A6. Se cultivó una solución madre en glicerol fresco de M. haemolytica A6 O/N en medio BHI, se puso en placas (TSA) al día siguiente y se incubó a 37ºC. El día siguiente, las placas se rasparon y se diluyeron en medio RPMI suplementado con suero bovino fetal inactivado al 2%. El inóculo se cultivó a 37ºC/200 rpm hasta que se alcanzó la DO600 deseada. El cultivo se diluyó hasta la dosis deseada de UFC/estimulación y la dilución se puso en placas para enumerar las UCF/ml exactas al día siguiente. El inóculo fue

30 transportado en hielo y se mantuvo en hielo durante la estimulación, y se administró transtraquealmente utilizando una aguja 14G x 1 pulgada. La dosis fue de 1,09 x 109 UFC/animal en 20 ml de RPMI, seguido por 60 ml de RPMI. Una vez completado, el inóculo restante se puso inmediatamente en placas con dilución. Los terneros fueron monitorizados por cambios de comportamiento incluyendo letargo, tos y secreción nasal y se puntuaron tal como se muestra en la Tabla 11. Se monitorizaron las temperaturas rectales de los terneros que mostraban signos

35 clínicos. Los pulmones se puntuaron para las lesiones neumónicas y se registraronn como % de lesión en cada lóbulo, y se recogieron tejidos para histopatología. Se tomaron frotis también de los pulmones (lesiones) y la tráquea para recuperar el organismo de estimulación.

40 Tabla 10. Programa de Estudio

Edad

Fecha Suceso

4 semanas de vida

0 Día 0 – Sangrado, frotis y vacunación intranasal

7 días después de vax

7 días después de vax-sangrado y frotis

15 días después de vax

15 días después de vax-sangrado y frotis y estimulación con M. haemolytica A6

15 a 20 días después de vax

Observar signos clínicos partiendo del día 15, realizar eutanasia a los terneros, si es necesario. La eutanasia y necropsia todos en el día 20

* Se monitorizaron el consumo de alimento (diario) y la temperatura rectal (dos veces al día) 3 días después de la vacunación.

Tabla 11. Signos clínicos.

Criterio para observaciones

0 =

normal

1 =

depresión, anorexia, tos, secreción nasal, disnea

2 =

severamente deprimida, son incapaces de levantarse o caminar, se practicó la eutanasia por razones humanitarias

3 =

muerto al llegar (DOA)

5[0075] Resultados. Dos días después de la inoculación, los terneros # 5 y 174 mostraron signos graves de neumonía y se sacrificaron. El ternero # 7 murió el día 3, después de la estimulación. Los 12 terneros restantes se sacrificaron el día 5 y su % de implicación pulmonar se describe en la tabla 4. Los resultados indican que el 80% de los animales vacunados estaban protegidos por la vacuna de M. haemolytica A1/A6 modificada viva. Del grupo de 7 log, tres animales (1, 3 y 9) fueron protegidos, mientras que los otros dos animales (5, 7) tenían lesiones significativamente

10 grandes en comparación con los controles. Las grandes lesiones podrían haber sido causadas por un Mannheimia, micoplasma o infección viral existente, que habían sido exacerbadas por la estimulación. En general, el 80% de los vacunados (1, 2, 3, 4, 6, 8, 9 y 10) habían reducido significativamente (reducción del 89,55%) la lesión de pulmón en comparación con el control, y el análisis histopatológico indicó una bronconeumonía necrotizante típica en los animales control.

15 Tabla 12. Grupos de dosificación

Grupo

Animal # dosis de vacuna A1/A6 real UFC/animal Lesión pulmonar (%) Lesión pulmonar promedio (%) % de reducción promedio en la lesión pulmonar en comparación con la vacuna simulada

107

2 1,43x106/8,63x105 0,0

4

1,43x106/8,63x105 8,67

6

1,43x106/8,63x105 5,92

8

1,43x106/8,63x105 4,83

10

1,43x106/8,63x105 0,0 3,88 85,04

108

1 1,43x107/8,63x106 0,0

3

1,43x107/8,63x106 0,0

5

1,43x107/8,63x106 41,58

7

1,43x107/8,63x106 64,47

9

1,43x107/8,63x106 2,295 21,66 14,47

162

Simulada 37,11

166

Simulada 29,82

170

Simulada 11,235

174

Simulada 25,54

175

Simulada 25,97 25,93

[0076] La eficacia de la colonización intranasal de M. haemolytica A1/A6 fue controlada durante el transcurso del

20 experimento mediante procedimientos QPCR descritos anteriormente. Los resultados para 7 y 15 días después de la vacunación indicaron que los animales vacunados tuvieron una colonización preferencial de A1 sobre A6 que se confirmó adicionalmente mediante PCR de deleción específica de gen de leucotoxina (Tablas 13 y 14).

Tabla 13. Día 7 después de la vacunación 25

Muestra #

Animal # FAM MH A1 MH A1? CY5 MHA6 MH A6?

1

1

No Ct 16,5 +

2

1 No Ct 38,26 +

3

1 No Ct 16,53 +

4

1 No Ct 25 +

5

2 No Ct No Ct

6

2 No Ct No Ct

7

2 No Ct No Ct

8

2 17,01 + No Ct

9

3 No Ct 15,87 +

10

3 25,11 + 20,81 +

11

3 21,91 + 19,69 +

12

3 22,35 + 21,8 +

13

4 16,52 + No Ct

14

4 17,11 + No Ct

15

4 16,26 + No Ct

16

4 16 + No Ct

17

5 39,07 + 41,17*la representación estaba mal NEG

18

5 15,98 + No Ct

19

5 16,4 + No Ct

20

5 16,44 + No Ct

21

6 17,08 + No Ct

22

6 18,24 + No Ct

23

6 16,8 + No Ct

24

6 17,94 + No Ct

25

7 17,98 + No Ct

26

7 No Ct 16,34 +

27

7 26,57 + 15,46 +

28

7 16,7 + 17,52 +

29

8 16,7 + No Ct

30

8 16,71 + No Ct

31

8 16,1 + No Ct

32

8 15,16 + No Ct

33

9 16,32 + No Ct

34

9 17,03 + No Ct

35

9 16,63 + No Ct

36

9 16,04 + No Ct

37

10 No Ct No Ct

38

10 No Ct No Ct

39

10 No Ct No Ct

40

10 No Ct No Ct

41

162 No Ct No Ct

42

162 No Ct No Ct

43

162 No Ct No Ct

44

162 No Ct No Ct

45

166 No Ct No Ct

46

166 No Ct No Ct

47

166 No Ct No Ct

48

166 No Ct No Ct

49

170 No Ct No Ct

50

170 No Ct No Ct

51

170 No Ct No Ct

52

170 No Ct No Ct

53

174 No Ct No Ct

54

174 No Ct No Ct

55

174 No Ct No Ct

56

174 No Ct No Ct

57

175 No Ct No Ct

58

175 No Ct No Ct

59

175 No Ct No Ct

60

175 No Ct No Ct

61

A1 mut+ 16,66 No Ct

62

A6 mut+ No Ct 13,85

63

A1 wt + 15,87 No Ct

64

Neg 40,77 No Ct

Tabla 14. Día 15 después de la vacunación

Animal #

FAM MH A1 MH A1? CY5 MHA6 MH A6? Lkt del PCR

1

No Ct 40,53

1

No Ct No Ct

1

No Ct No Ct

1

No Ct No Ct

1

No Ct No Ct

2

No Ct No Ct

2

No Ct No Ct

2

No Ct No Ct

2

No Ct No Ct

2

No Ct No Ct

3

No Ct No Ct

3

No Ct 15,1 + Mutante

3

No Ct 15,08 + Mutante

3

No Ct 15,19 + Mutante

3

No Ct 15,3 + Mutante

4

15,82 15,1 + Mutante

4

No Ct No Ct Mutante

4

No Ct No Ct

4

No Ct No Ct

4

No Ct No Ct

5

16,13 + No Ct Mutante

5

15,27 + No Ct Mutante

5

17,03 + No Ct Mutante

5

16,49 + No Ct Mutante

5

18,06 + No Ct Mutante

6

No Ct No Ct

6

No Ct No Ct

6

No Ct No Ct

6

40,05 No Ct

6

No Ct No Ct

7

No Ct 16,83 + Mutante

7

No Ct No Ct +

7

No Ct 14,92 + Mutante

7

No Ct 15,21 + Mutante

7

No Ct 16,16 + Mutante

8

No Ct No Ct

8

No Ct No Ct

8

No Ct No Ct

8

No Ct No Ct

8

No Ct No Ct

9

No Ct No Ct

9

No Ct No Ct

9

No Ct No Ct

9

No Ct No Ct

9

No Ct No Ct

10

15,94 + No Ct Mutante

10

No Ct + No Ct

10

No Ct + No Ct

10

23,82 + No Ct Mutante

10

30,04 + No Ct Mutante

162

No Ct No Ct

162

No Ct No Ct

162

No Ct No Ct

162

No Ct No Ct

162

No Ct No Ct

166

No Ct No Ct

166

No Ct No Ct

166

No Ct No Ct

166

No Ct No Ct

166

No Ct No Ct

170

No Ct No Ct

170

No Ct No Ct

170

No Ct No Ct

170

No Ct No Ct

170

No Ct No Ct

174

No Ct No Ct

174

No Ct No Ct

174

No Ct No Ct

174

No Ct No Ct

174

No Ct No Ct

175

16,24 + No Ct Mutante

175

No Ct + No Ct

175

16,54 + No Ct Mutante

175

No Ct + No Ct Mutante

175

23,06 + No Ct Mutante

LISTADO DE SECUENCIAS

5

[0077]

<110> Merial Limited Lawrence, Paul

10

<120> Vacunas de fabricación y uso mannheimia haemolytica atenuadas y procedimientos de

<130>

MER 12-209P

15

<160> 26

<170>

PatentIn version 3.5

20

<210> <211> <212> <213> 1 26 ADN Secuencia artificial

25

<220> <223> cebador lktCAf

<400> 1 gcattgaatt gatcaactaa tacttg

26

30

35

<210> <211> <212> <213> 2 25 ADN Secuencia artificial

<220> <223>

cebador lktCAr

40

<400> 2 caaggtttct agaaagattt ttcgg 25

45

<210> <211> 3 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5 <223> cebador lktCAdelf

<400> 3 gatcaattga aagctgttga agaaattatc g 31

<210> 4

<211> 29

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador lktCAdelr

20 <400> 4 atacaattga ttcataattt gcactcgat 29

25 <210> 5

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> cebador lktRBSr

<400> 5 caacaattga ttcataattt gcctcctata attattctaa attaggtc 48

<210> 6

<211> 1068 40 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento de PCR 5' deltalktCA

<400> 6 gcattgaatt gatcaactaa tacttggttt ttcaagtgag ttgcaatgcc taaaccatca 60 ccaaaatagt ttggattatt gattttctcc cctacaaaat ctagcccttc gtgttttctt 120

50 gccatctcag ccaataccgg cacatcgcca aaaatagcat caattcgccc attttgcaca 180 tctaaaatag cattttgata agaggcataa gatttcacat tgtactcttt tttctctttt 240 gctaaatagt gttggtaagt agtcccattt tgcacaccaa tcgttttcac cttagcaaaa 300 tctgtatctt ttttcgcaat gaaggcagca gagcttggaa agtaaggctc gctaaataat 360 acttgtttct tacgtggttc cgtaataccc atacctgaaa ttgcagcatc aaattgtttt 420

55 tgttttaggc tttggattaa gctatcaaaa ggttggctat ggaatgtaca atttgcattc 480 atctctttac agatagcatt tgcaatatcc acatcaaaac cgataatttc tcccttctct 540 tcggtcattt caaatggagg atagcttggc tccatcacaa atttgatatc ttgtgcctgc 600 gcagtaacca cacacccgaa taaaagggtc aaaagtgttt ttttcataaa aagtccctgt 660 gttttcatta taaggattac cactttaacg cagttacttt cttaaaaaaa gtcttctttt 720

60 cataaagttt gttttatgtc atacaaacac atcaaattga gatgtagttt ctcaatcctc 780 ttgattcctc tatctcaaaa aaacaaccca aaagaaaaaa gaaaagtata tgttacatta 840 atattacaat gtaattattt tgtttaattt ccctacattt tgtataactt taaaacactc 900 ctttttctct tctgattata taaaagacaa aaaatacaat ttaagctaca aaaaacaaca 960 aaaaacaaca aaaaacacga caataagatc gagtaatgat tatattatgt tataattttt 1020

65 gacctaattt agaataatta tcgagtccaa attatgaatc aattgtat 1068

<210> 7

<211> 1295

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento de PCR 3' deltalktCA

<400> 7

caattgaaag ctgttgaaga aattatcggt acatcacata acgatatctt taaaggtagt

60

aagttcaatg atgcctttaa cggtggtgat ggtgtcgata ctattgacgg taacgacggc

120

aatgaccgct tatttggtgg taaaggcgat gatattctcg atggtggaaa tggtgatgat

180

tttatcgatg gcggtaaagg caacgaccta ttacacggtg gcaagggcga tgatattttc

240

gttcaccgta aaggcgatgg taatgatatt attaccgatt ctgacggcaa tgataaatta

300

tcattctctg attcgaactt aaaagattta acatttgaaa aagttaaaca taatcttgtc

360

atcacgaata gcaaaaaaga gaaagtgacc attcaaaact ggttccgaga ggctgatttt

420

gctaaagaag tgcctaatta taaagcaact aaagatgaga aaatcgaaga aatcatcggt

480

caaaatggcg agcggatcac ctcaaagcaa gttgatgatc ttatcgcaaa aggtaacggc

540

aaaattaccc aagatgagct atcaaaagtt gttgataact atgaattgct caaacatagc

600

aaaaatgtga caaacagctt agataagtta atctcatctg taagtgcatt tacctcgtct

660

aatgattcga gaaatgtatt agtggctcca acttcaatgt tggatcaaag tttatcttct

720

cttcaatttg ctagagcagc ttaattttta atgattggca actctatatt gtttcacaca

780

ttatagagtt gccgttttat tttataaaag gagacaatat ggaagctaac catcaaagga

840

atgatcttgg tttagttgcc ctcactatgt tggcacaata ccataatatt tcgcttaatc

900

cggaagaaat aaaacataaa tttgatcttg acggaaaagg gctttcttta actgcttggc

960

ttttagctgc aaaatcgtta gcgttgaaag cgaaacacat taaaaaagag atttcccgct

1020

tacacttggt gaatttaccg gcattagttt ggcaagataa cggtaaacat tttttattgg

1080

taaaagtgga taccgataat aaccgctatt taacttacaa tttggaacaa gatgctccac

1140

aaattctgtc acaagacgaa tttgaagcct gctatcaagg gcagttaatt ttggtcacgt

1200

ccagagcttc cgtagtaggt caattagcaa agttcgattt cacctggttt attccggcgg

1260

tgatcaaata ccgaaaaatc tttctagaaa ccttg

1295

<210> 8

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador directo de la familia BCCT transportador de BETAÍNA-CARNITINACOLINA

<400> 8 atgttattcg ccgccggaat ggggatc 27

<210> 9

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso de la familia BCCT transportador de BETAÍNA-CARNITINACOLINA

<400> 9 acctgcatca ccccaaagcc aagtg 25

<210> 10

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador directo de SERINA METALO-ENDOPEPTIDASA ESPECÍFICA DE IGA

<400> 10 atgaagacca aaacatttac tcgttc 26

<210> 11

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso de SERINA METALO-ENDOPEPTIDASA ESPECÍFICA DE IGA

<400> 11 agcgcttgtg tccctgaacc agcac 25

<210> 12

<211> 2007

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Gen específico de A6-familia BCCT transportador de BETAÍNA/CARNITINA/COLINA

<400> 12 ttggatttaa tcaaaaaatt aaacacagga agtaccttta gggtaccgat tttcctaccg 60 agtttactct ttgtcagctt tgttgccgtt ttctgtatca tctttccaca gcaagcacaa 120 acctcacttg ataccatcaa aaatagtctc ttccaacatt ttagctggtt ctatattttt 180 gcaggctcta tctttttcct gtttctaatt tttctctctt tcagccgatt gggtgatatt 240 aaattagggg cagataccga tgagcctgaa tttggttttg gctcttggat tgcgatgtta 300 ttcgccgccg gaatggggat cgggttaatg tattttgggg tagcagaacc tattttgcat 360 taccttaaac ccgtccaaca aaatttaact gagccggagc gtatgaaaga agcgatgatg 420 acaacgttct atcattgggg tattcacgct tgggcaattt atggtgtgat tgccttagct 480 cttgcttatt ttggcttcag atataagtta gcactcacta ttcgttccgg attttatccc 540 ttactaaaac atcgtatttc aggcttctgg gggcatttaa ttgatattat tgccctttgt 600 agcacgattt tcggtttaac gactacactt ggctttgggg tgatgcaggt cagtgctggc 660 tttaacaatc taggtttaat tgaacagagc aattttactg ttcttgcgat tatcgtaaca 720 gtagcaatgg ctcttgccgt gttatctgcc gtttcgggcg taggcaaagg ggttaaaatc 780 ttaagtgaaa tcaatctcac attagccgga ttgctactta tttttgtgat aatcaccggc 840 ccaactctat tacttttctc aagcttcacc gaaaatttag gctattattt tagctcgctg 900 cttgagatga gtttccgtac cttcgcttat gaaccggaac atcaaggctg gctaagcggc 960 tggacggtcc tttattgggc atggtgggca tcttgggcgc catttgttgg tttgtttatt 1020 gccaagatct ctaaaggcag aaccattcgt gaatttattt taggggtgct atttgttcca 1080 tcgctgttta acattttatg gatgaccagc ttcggcagct ctgccatttg gttcgatcaa 1140 caaactgccg gtgctttagc tgaagtcagc ggcaataccg aacaactgtt atttaccttt 1200 tttgagcaat taccgtttgg ctctattgcc tctttcgttg ccgtcattgt tatcagtatt 1260 ttctttatca cctctgccga ctcggggatt tttgttctca acagcattgc ttcacaaggc 1320 gaagaaaatg caccgaaatg gcaaagcgtg ctttggggag cattattagc catcttagcg 1380 ttatcactac tctattcggg tggcttggct tctctgcaaa caatgacact gattatcgcc 1440 ttaccattta ccttcattat gctgattctc tgtatcggct tatggaaagg attaatggta 1500 gataaccaat acttcaacaa aaaattctcg caaggtagcc aacattgggc gggtaaagat 1560 tggaaacaac gcttggagaa aatcatcaac ccaagcaata agcaagatgt ccgtcacttc 1620 tttattaaag ttgccagacc agcattttta gaacttatcg aggaatttga aagctatggc 1680 ttaatcgcta aaatgaattt caccaacgaa caaaacccga aattagagtt tgaagtggtg 1740 aaagaaaatt tacgcaattt catttacggc attgaaagtg tgccacggga attatcggat 1800 ttggtggtag gtgacgacaa cctaccgaac attgagcaaa ataccattta cgagccgatt 1860 acttatttct tagacgggcg gaaaggttat gatgtgcaat atatgaccaa agaagagttg 1920 attgccgacg tgctgcaaca gtatgaacgc tttatcaatt tagcgatgga caactcgcac 1980 gacttaatga cggctgattt caatcac 2007

<210> 13

<211> 669

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> traducción de la seq ID NO: 12

<400> 13 Leu Asp Leu Ile Lys Lys Leu Asn Thr Gly Ser Thr Phe Arg Val Pro 15 10 15 Ile Phe Leu Pro Ser Leu Leu Phe Val Ser Phe Val Ala Val Phe Cys

20 25 30 Ile Ile Phe Pro Gln Gln Ala Gln Thr Ser Leu Asp Thr Ile Lys Asn 35 40 45 Ser Leu Phe Gln His Phe Ser Trp Phe Tyr Ile Phe Ala Gly Ser Ile

50 55 60

Phe Phe Leu Phe Leu Ile Phe Leu Ser Phe Ser Arg Leu Gly Asp Ile

65 70 75 80

Lys Leu Gly Ala Asp Thr Asp Glu Pro Glu Phe Gly Phe Gly Ser Trp

85 90 95 Ile Ala Met Leu Phe Ala Ala Gly Met Gly Ile Gly Leu Met Tyr Phe 100 105 110 Gly Val Ala Glu Pro Ile Leu His Tyr Leu Lys Pro Val Gln Gln Asn 115 120 125 Leu Thr Glu Pro Glu Arg Met Lys Glu Ala Met Met Thr Thr Phe Tyr

130 135 140

His Trp Gly Ile His Ala Trp Ala Ile Tyr Gly Val Ile Ala Leu Ala

145 150 155 160

Leu Ala Tyr Phe Gly Phe Arg Tyr Lys Leu Ala Leu Thr Ile Arg Ser

165 170 175 Gly Phe Tyr Pro Leu Leu Lys His Arg Ile Ser Gly Phe Trp Gly His 180 185 190 Leu Ile Asp Ile Ile Ala Leu Cys Ser Thr Ile Phe Gly Leu Thr Thr 195 200 205 Thr Leu Gly Phe Gly Val Met Gln Val Ser Ala Gly Phe Asn Asn Leu

210 215 220

Gly Leu Ile Glu Gln Ser Asn Phe Thr Val Leu Ala Ile Ile Val Thr

225 230 235 240

Val Ala Met Ala Leu Ala Val Leu Ser Ala Val Ser Gly Val Gly Lys

245 250 255 Gly Val Lys Ile Leu Ser Glu Ile Asn Leu Thr Leu Ala Gly Leu Leu 260 265 270 Leu Ile Phe Val Ile Ile Thr Gly Pro Thr Leu Leu Leu Phe Ser Ser 275 280 285 Phe Thr Glu Asn Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Ser Leu Leu Glu Met Ser

290 295 300

Phe Arg Thr Phe Ala Tyr Glu Pro Glu His Gln Gly Trp Leu Ser Gly

305 310 315 320

Trp Thr Val Leu Tyr Trp Ala Trp Trp Ala Ser Trp Ala Pro Phe Val

325 330 335 Gly Leu Phe Ile Ala Lys Ile Ser Lys Gly Arg Thr Ile Arg Glu Phe 340 345 350 Ile Leu Gly Val Leu Phe Val Pro Ser Leu Phe Asn Ile Leu Trp Met 355 360 365 Thr Ser Phe Gly Ser Ser Ala Ile Trp Phe Asp Gln Gln Thr Ala Gly

370 375 380

Ala Leu Ala Glu Val Ser Gly Asn Thr Glu Gln Leu Leu Phe Thr Phe

385 390 395 400

Phe Glu Gln Leu Pro Phe Gly Ser Ile Ala Ser Phe Val Ala Val Ile

405 410 415 Val Ile Ser Ile Phe Phe Ile Thr Ser Ala Asp Ser Gly Ile Phe Val 420 425 430 Leu Asn Ser Ile Ala Ser Gln Gly Glu Glu Asn Ala Pro Lys Trp Gln 435 440 445 Ser Val Leu Trp Gly Ala Leu Leu Ala Ile Leu Ala Leu Ser Leu Leu 450 455 460 Tyr Ser Gly Gly Leu Ala Ser Leu Gln Thr Met Thr Leu Ile Ile Ala

465 470 475 480 Leu Pro Phe Thr Phe Ile Met Leu Ile Leu Cys Ile Gly Leu Trp Lys 485 490 495 Gly Leu Met Val Asp Asn Gln Tyr Phe Asn Lys Lys Phe Ser Gln Gly 500 505 510 Ser Gln His Trp Ala Gly Lys Asp Trp Lys Gln Arg Leu Glu Lys Ile 515 520 525 Ile Asn Pro Ser Asn Lys Gln Asp Val Arg His Phe Phe Ile Lys Val

530 535 540 Ala Arg Pro Ala Phe Leu Glu Leu Ile Glu Glu Phe Glu Ser Tyr Gly 545 550 555 560 Leu Ile Ala Lys Met Asn Phe Thr Asn Glu Gln Asn Pro Lys Leu Glu

565 570 575 Phe Glu Val Val Lys Glu Asn Leu Arg Asn Phe Ile Tyr Gly Ile Glu 580 585 590 Ser Val Pro Arg Glu Leu Ser Asp Leu Val Val Gly Asp Asp Asn Leu 595 600 605 Pro Asn Ile Glu Gln Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Ile Thr Tyr Phe Leu

610 615 620 Asp Gly Arg Lys Gly Tyr Asp Val Gln Tyr Met Thr Lys Glu Glu Leu 625 630 635 640 Ile Ala Asp Val Leu Gln Gln Tyr Glu Arg Phe Ile Asn Leu Ala Met

645 650 655 Asp Asn Ser His Asp Leu Met Thr Ala Asp Phe Asn His 660 665

<210> 14

<211> 4017

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Gen específico de A1 -Serina metalo-endopeptidasa específica de IgA

<400> 14 atgaagacca aaacatttac tcgttcttat cttgcttctt ttgtaacaat cgtattaagt 60 ttacctgctg tagcatctgt tgtacgtaat gatgtggact atcaatactt ccgcgatttt 120 gccgaaaata aaggaccatt ttcagttggt tcaatgaata ttgatattaa agacaacaat 180 ggacaacttg taggcacgat gcttcataat ttaccaatgg ttgattttag tgctatggta 240 agaggtggat attctacttt aattgcacca caatatttag ttagtgttgc acataatact 300 ggatataaaa atgttcaatt tggtgctgca ggttataacc ctgattcaca tcactatact 360 tataaaattg ttgaccgcaa tgattatgaa aaggttcaag gagggttgca cccagactat 420 catactcctc gattaaataa attagtaaca gaagttgtgc ctgccgcagt caccaatgca 480 ggtacatcta ttaaacccta cttaaatgaa gaacgcttcc ctatgtttct tcgtgctggt 540 tcagggacac aagcgctaag aggaaaagaa agtaataaaa caactggaat cgctggtgct 600 tatgaatatc ttactggcgg taccacatta caattatcta aaagctcccc tgatcactgg 660 ttagattatt caagtaacct ttatcaagta agctatggac cactttcaac ctatgcacta 720 cctggtgata gtggttcagg ttcttacgcc tatgatatga acgaaaaacg atgggtatta 780 gttggtgtgc tcaatttcta taatggtatg gataatcaat tcaaccgctc tgcgattatc 840 cgtaaagatt tccacgagaa aaaatttgcc gaagatattg caggaacaat caataatacc 900 gtacaaaatg cacaattcaa ttggactgct caaggtaaat ccagctctct tagtcaatca 960 aataatgtgc aaaaactcaa cgttgatcta aaagatagta gcattgcaaa ccaaaacact 1020 tctctgccac aagaaaatca cggtaaaacc attaatttta atggtaaaga tgcaactatt 1080 gtactaaaac aggatattga ccaaggtgca ggtgcattaa atctgaacgc taatctcact 1140 attcgtcctg aaacagacca aacttggcaa ggtgcaggta ttatcgtcgg taaagataaa 1200 aaagtgaatt ggcaagtaaa aaatccacaa ggcgatcgtt tatctaaact cggggaagga 1260 acactctatg taaatggacg tggacagaat cttggcgata tcagtgtagg tgatggtatt 1320 gtaatactta accagcaagc cgatcaccaa ggaagaaaac aggcctttaa tacagtagga 1380 atcgtaagtg gtcgccccac tgttgtgcta ggtagtgcag atcaagttaa tcccgataat 1440 atttactttg gatttcgcgg aggtcgttta gacctaaacg gtaacagcat cgcctttaaa 1500 cgtattcaaa acagcgataa acatgctcgt attgtaaacc acaatcgcga tcacatttct 1560 accttaataa tacaaggcca agatcctctc actagtaatg atcttatatg gggaaaatgg 1620 gcaagtaata gcccagcaga catttacgaa tataccaatc cttatcaaaa taaacgcaaa 1680 gattacttcc gtctgaaagg taattcgaga gtatattatc caacgaatgc tacaagtaac 1740 gatcactggg aatttctttc cagtaaccgc gagcaagcaa tacagaaaat cctagatgcc 1800 aaaaacttaa gacagcgcta tgacacgttt aatggtttta taggggaaga tgcttccaat 1860

aaaactaatg ggatattaaa tgtcgtgttt gatacaaaaa cagaagtaaa tacagaacaa 1920 gataaattaa agaatatcta cacaatgtcg ggaggattta accttaatgg tgaactcacc 1980 cttaaaggtg gtacattgtt gctttctggt cacccaacgc cacacgctta tgatattaag 2040 aataagcatg atgttgtgcg tgaaaacgat tggcaagaca gccattttac tgctaaaaat 2100 5 atcacggtaa ataaaatggc acaactctat atcgggagaa atgtcaatga agtaaatagt 2160 cactttactg cgactgataa agccaaactc aatttaggat ttattaatcg ttcaacgcca 2220 agttgctatg attctgaata cacaggcact acacattgtg aagtgcaagc ggtcatttcc 2280 gataatattt ttgcaaatct agcaacaacc gccattaaag gtaatgttaa attacaaaac 2340 catagccaat taaatttagg caaagcaaac ctcactggtt ctgtacaagc tgatcaaaca 2400 actcatatca ctttagcaaa tcacagtcac tggttaaaca atggtacgag ccagattggg 2460 catcttacaa tggaaaaagg gtcgatcctt agcctaaacg ataaatttgc taccacggaa 2520 atcccagtcc gattcaacaa gatgatcatc caaggtaatc taaaaggtaa tggacgaatt 2580 aactataccg caaatttagc caagggcgaa tctgatcatc tccaagttga cggtattgct 2640 gaaggaaatt ttgtccttgc cgttagaaat agcacaactg aagcaaatcc aaaaagctca 2700 15 ttaaacctac taagcttaaa aaatagcaac caagaaggca ataaagcttc tatttctcta 2760 gaaaataatt atgttgatct aggtacttat cgttatgtat tagaaaatcg taatcacaat 2820 taccatttat ttaatccatt aataccaaat tcaacctcta aagagatgaa tgctacatct 2880 gtatcctcta ttccaaaaaa ggaatctgtt actaatgttc ctactttaga taagaaagaa 2940 actgaacaaa atcttactca actacaaaaa gatttttcag cacaccaatt agaaaatcaa 3000 aaagcaaaac aatctatgat aaatgctcaa tctgagctaa gacgactcaa ttcacaactg 3060 aatgtattgc aaaaatatgt gaattctcgt cgcttaggtt actatactca gcaggcagtt 3120 ttagaacaaa ttagcattat tcaaaataaa attaaacaaa cacaaacaat atttaatgac 3180 gctaatgcaa ctgtaaaact cacagatcaa aagctagaag aagccaaatt agctctaggc 3240 tctgtaaacg atcttgtatt aataaaagcc tctgctccag caatgcaagc aactaatcaa 3300 25 gatacgagta tgatgaatat tattcaagca gattggataa gccaatacgc taacacagca 3360 ctttctgaac tctcggcaca ggctaattct gctctgcaaa tcagtaatag cttagatcgc 3420 caactcttca aacaaagcga taaattcaac gtatggagca gcgtcgaaca tcagaaaacc 3480 gagcataaat cagatttata ccgcccgtat aaacaacaaa ccaacctgac ccaactgggc 3540 atacaaatgc cgatagataa cggtttaatg tttggagttg cattatctaa aaaccacgct 3600 aacgcggaat ttaacgaggg tgtaaacggt aaatcgaatc tactaatggc aagcctatat 3660 ggtaagtggc aatctcaaca aggcactttt atcagccttg atggcagcta cggtaaagca 3720 aaaaaccaac tctacctatt tggtgaaaac cactttaccc gccgaatttc ctctattggt 3780 gctaacattg gacatcaatt tgacctcgca ggagttcaaa ttcagccaac aataggagca 3840 agatactacc atttcagcgg ccaagactat acactaggag gagcgaaaat cagctcacca 3900 35 aatacccact ttatgacata tcaagcgggt ctaaaagcta gtaaaacttt tcattggatg 3960 actggaaagt tgaaccaagc attacaaccc actatgtgga tgcaagtaac aaacgct 4017

<210> 15

<211> 1339

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> traducción de seq ID NO:14

<400> 15 Met Lys Thr Lys Thr Phe Thr Arg Ser Tyr Leu Ala Ser Phe Val Thr 15 10 15 Ile Val Leu Ser Leu Pro Ala Val Ala Ser Val Val Arg Asn Asp Val 20 25 30 Asp Tyr Gln Tyr Phe Arg Asp Phe Ala Glu Asn Lys Gly Pro Phe Ser 35 40 45 55 Val Gly Ser Met Asn Ile Asp Ile Lys Asp Asn Asn Gly Gln Leu Val 50 55 60 Gly Thr Met Leu His Asn Leu Pro Met Val Asp Phe Ser Ala Met Val 65 70 75 80 Arg Gly Gly Tyr Ser Thr Leu Ile Ala Pro Gln Tyr Leu Val Ser Val 85 90 95 Ala His Asn Thr Gly Tyr Lys Asn Val Gln Phe Gly Ala Ala Gly Tyr 100 105 110 Asn Pro Asp Ser His His Tyr Thr Tyr Lys Ile Val Asp Arg Asn Asp 115 120 125 65 Tyr Glu Lys Val Gln Gly Gly Leu His Pro Asp Tyr His Thr Pro Arg 130 135 140 Leu Asn Lys Leu Val Thr Glu Val Val Pro Ala Ala Val Thr Asn Ala 145 150 155 160

Gly Thr Ser Ile Lys Pro Tyr Leu Asn Glu Glu Arg Phe Pro Met Phe 165 170 175 Leu Arg Ala Gly Ser Gly Thr Gln Ala Leu Arg Gly Lys Glu Ser Asn 180 185 190 5 Lys Thr Thr Gly Ile Ala Gly Ala Tyr Glu Tyr Leu Thr Gly Gly Thr 195 200 205 Thr Leu Gln Leu Ser Lys Ser Ser Pro Asp His Trp Leu Asp Tyr Ser 210 215 220 Ser Asn Leu Tyr Gln Val Ser Tyr Gly Pro Leu Ser Thr Tyr Ala Leu 225 230 235 240 Pro Gly Asp Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ala Tyr Asp Met Asn Glu Lys 245 250 255 Arg Trp Val Leu Val Gly Val Leu Asn Phe Tyr Asn Gly Met Asp Asn 260 265 270 15 Gln Phe Asn Arg Ser Ala Ile Ile Arg Lys Asp Phe His Glu Lys Lys 275 280 285 Phe Ala Glu Asp Ile Ala Gly Thr Ile Asn Asn Thr Val Gln Asn Ala 290 295 300 Gln Phe Asn Trp Thr Ala Gln Gly Lys Ser Ser Ser Leu Ser Gln Ser 305 310 315 320 Asn Asn Val Gln Lys Leu Asn Val Asp Leu Lys Asp Ser Ser Ile Ala 325 330 335 Asn Gln Asn Thr Ser Leu Pro Gln Glu Asn His Gly Lys Thr Ile Asn 340 345 350 25 Phe Asn Gly Lys Asp Ala Thr Ile Val Leu Lys Gln Asp Ile Asp Gln 355 360 365 Gly Ala Gly Ala Leu Asn Leu Asn Ala Asn Leu Thr Ile Arg Pro Glu 370 375 380 Thr Asp Gln Thr Trp Gln Gly Ala Gly Ile Ile Val Gly Lys Asp Lys 385 390 395 400 Lys Val Asn Trp Gln Val Lys Asn Pro Gln Gly Asp Arg Leu Ser Lys 405 410 415 Leu Gly Glu Gly Thr Leu Tyr Val Asn Gly Arg Gly Gln Asn Leu Gly 420 425 430 35 Asp Ile Ser Val Gly Asp Gly Ile Val Ile Leu Asn Gln Gln Ala Asp 435 440 445 His Gln Gly Arg Lys Gln Ala Phe Asn Thr Val Gly Ile Val Ser Gly 450 455 460 Arg Pro Thr Val Val Leu Gly Ser Ala Asp Gln Val Asn Pro Asp Asn 465 470 475 480 Ile Tyr Phe Gly Phe Arg Gly Gly Arg Leu Asp Leu Asn Gly Asn Ser 485 490 495 Ile Ala Phe Lys Arg Ile Gln Asn Ser Asp Lys His Ala Arg Ile Val 500 505 510 45 Asn His Asn Arg Asp His Ile Ser Thr Leu Ile Ile Gln Gly Gln Asp 515 520 525 Pro Leu Thr Ser Asn Asp Leu Ile Trp Gly Lys Trp Ala Ser Asn Ser 530 535 540 Pro Ala Asp Ile Tyr Glu Tyr Thr Asn Pro Tyr Gln Asn Lys Arg Lys 545 550 555 560 Asp Tyr Phe Arg Leu Lys Gly Asn Ser Arg Val Tyr Tyr Pro Thr Asn 565 570 575 Ala Thr Ser Asn Asp His Trp Glu Phe Leu Ser Ser Asn Arg Glu Gln 580 585 590 55 Ala Ile Gln Lys Ile Leu Asp Ala Lys Asn Leu Arg Gln Arg Tyr Asp 595 600 605 Thr Phe Asn Gly Phe Ile Gly Glu Asp Ala Ser Asn Lys Thr Asn Gly 610 615 620 Ile Leu Asn Val Val Phe Asp Thr Lys Thr Glu Val Asn Thr Glu Gln 625 630 635 640 Asp Lys Leu Lys Asn Ile Tyr Thr Met Ser Gly Gly Phe Asn Leu Asn 645 650 655 Gly Glu Leu Thr Leu Lys Gly Gly Thr Leu Leu Leu Ser Gly His Pro 660 665 670 65 Thr Pro His Ala Tyr Asp Ile Lys Asn Lys His Asp Val Val Arg Glu 675 680 685 Asn Asp Trp Gln Asp Ser His Phe Thr Ala Lys Asn Ile Thr Val Asn 690 695 700

Lys Met Ala Gln Leu Tyr Ile Gly Arg Asn Val Asn Glu Val Asn Ser 705 710 715 720 His Phe Thr Ala Thr Asp Lys Ala Lys Leu Asn Leu Gly Phe Ile Asn 725 730 735 5 Arg Ser Thr Pro Ser Cys Tyr Asp Ser Glu Tyr Thr Gly Thr Thr His 740 745 750 Cys Glu Val Gln Ala Val Ile Ser Asp Asn Ile Phe Ala Asn Leu Ala 755 760 765 Thr Thr Ala Ile Lys Gly Asn Val Lys Leu Gln Asn His Ser Gln Leu 770 775 780 Asn Leu Gly Lys Ala Asn Leu Thr Gly Ser Val Gln Ala Asp Gln Thr 785 790 795 800 Thr His Ile Thr Leu Ala Asn His Ser His Trp Leu Asn Asn Gly Thr 805 810 815 15 Ser Gln Ile Gly His Leu Thr Met Glu Lys Gly Ser Ile Leu Ser Leu 820 825 830 Asn Asp Lys Phe Ala Thr Thr Glu Ile Pro Val Arg Phe Asn Lys Met 835 840 845 Ile Ile Gln Gly Asn Leu Lys Gly Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Thr Ala 850 855 860 Asn Leu Ala Lys Gly Glu Ser Asp His Leu Gln Val Asp Gly Ile Ala 865 870 875 880 Glu Gly Asn Phe Val Leu Ala Val Arg Asn Ser Thr Thr Glu Ala Asn 885 890 895 25 Pro Lys Ser Ser Leu Asn Leu Leu Ser Leu Lys Asn Ser Asn Gln Glu 900 905 910 Gly Asn Lys Ala Ser Ile Ser Leu Glu Asn Asn Tyr Val Asp Leu Gly 915 920 925 Thr Tyr Arg Tyr Val Leu Glu Asn Arg Asn His Asn Tyr His Leu Phe 930 935 940 Asn Pro Leu Ile Pro Asn Ser Thr Ser Lys Glu Met Asn Ala Thr Ser 945 950 955 960 Val Ser Ser Ile Pro Lys Lys Glu Ser Val Thr Asn Val Pro Thr Leu 965 970 975 35 Asp Lys Lys Glu Thr Glu Gln Asn Leu Thr Gln Leu Gln Lys Asp Phe 980 985 990 Ser Ala His Gln Leu Glu Asn Gln Lys Ala Lys Gln Ser Met Ile Asn 995 1000 1005 Ala Gln Ser Glu Leu Arg Arg Leu Asn Ser Gln Leu Asn Val Leu 1010 1015 1020 Gln Lys Tyr Val Asn Ser Arg Arg Leu Gly Tyr Tyr Thr Gln Gln 1025 1030 1035 Ala Val Leu Glu Gln Ile Ser Ile Ile Gln Asn Lys Ile Lys Gln 1040 1045 1050 45 Thr Gln Thr Ile Phe Asn Asp Ala Asn Ala Thr Val Lys Leu Thr 1055 1060 1065 Asp Gln Lys Leu Glu Glu Ala Lys Leu Ala Leu Gly Ser Val Asn 1070 1075 1080 Asp Leu Val Leu Ile Lys Ala Ser Ala Pro Ala Met Gln Ala Thr 1085 1090 1095 Asn Gln Asp Thr Ser Met Met Asn Ile Ile Gln Ala Asp Trp Ile 1100 1105 1110 Ser Gln Tyr Ala Asn Thr Ala Leu Ser Glu Leu Ser Ala Gln Ala 1115 1120 1125 55 Asn Ser Ala Leu Gln Ile Ser Asn Ser Leu Asp Arg Gln Leu Phe 1130 1135 1140 Lys Gln Ser Asp Lys Phe Asn Val Trp Ser Ser Val Glu His Gln 1145 1150 1155 Lys Thr Glu His Lys Ser Asp Leu Tyr Arg Pro Tyr Lys Gln Gln 1160 1165 1170 Thr Asn Leu Thr Gln Leu Gly Ile Gln Met Pro Ile Asp Asn Gly 1175 1180 1185 Leu Met Phe Gly Val Ala Leu Ser Lys Asn His Ala Asn Ala Glu 1190 1195 1200 65 Phe Asn Glu Gly Val Asn Gly Lys Ser Asn Leu Leu Met Ala Ser 1205 1210 1215 Leu Tyr Gly Lys Trp Gln Ser Gln Gln Gly Thr Phe Ile Ser Leu 1220 1225 1230

Asp Gly Ser Tyr Gly Lys Ala 1235 1240 Glu Asn His Phe Thr Arg Arg 1250 1255 5 Gly His Gln Phe Asp Leu Ala 1265 1270 Gly Ala Arg Tyr Tyr His Phe 1280 1285 Gly Ala Lys Ile Ser Ser Pro 1295 1300 Ala Gly Leu Lys Ala Ser Lys 1310 1315 Leu Asn Gln Ala Leu Gln Pro 1325 1330 15 Ala

<210> 16

<211> 2354

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

25 <220>

Lys Asn Gln Leu Tyr 1245 Ile Ser Ser Ile Gly 1260 Gly Val Gln Ile Gln 1275 Ser Gly Gln Asp Tyr 1290 Asn Thr His Phe Met 1305 Thr Phe His Trp Met 1320 Thr Met Trp Met Gln 1335

Leu Phe Gly Ala Asn Ile Pro Thr Ile Thr Leu Gly Thr Tyr Gln Thr Gly Lys Val Thr Asn

<223> deltaLKTCA completo con RBS original

<400> 16

gcattgaatt gatcaactaa tacttggttt ttcaagtgag ttgcaatgcc taaaccatca 60 ccaaaatagt ttggattatt gattttctcc cctacaaaat ctagcccttc gtgttttctt 120 gccatctcag ccaataccgg cacatcgcca aaaatagcat caattcgccc attttgcaca 180 tctaaaatag cattttgata agaggcataa gatttcacat tgtactcttt tttctctttt 240 gctaaatagt gttggtaagt agtcccattt tgcacaccaa tcgttttcac cttagcaaaa 300 tctgtatctt ttttcgcaat gaaggcagca gagcttggaa agtaaggctc gctaaataat 360 35 acttgtttct tacgtggttc cgtaataccc atacctgaaa ttgcagcatc aaattgtttt 420 tgttttaggc tttggattaa gctatcaaaa ggttggctat ggaatgtaca atttgcattc 480 atctctttac agatagcatt tgcaatatcc acatcaaaac cgataatttc tcccttctct 540 tcggtcattt caaatggagg atagcttggc tccatcacaa atttgatatc ttgtgcctgc 600 gcagtaacca cacacccgaa taaaagggtc aaaagtgttt ttttcataaa aagtccctgt 660 gttttcatta taaggattac cactttaacg cagttacttt cttaaaaaaa gtcttctttt 720 cataaagttt gttttatgtc atacaaacac atcaaattga gatgtagttt ctcaatcctc 780 ttgattcctc tatctcaaaa aaacaaccca aaagaaaaaa gaaaagtata tgttacatta 840 atattacaat gtaattattt tgtttaattt ccctacattt tgtataactt taaaacactc 900 ctttttctct tctgattata taaaagacaa aaaatacaat ttaagctaca aaaaacaaca 960 45 aaaaacaaca aaaaacacga caataagatc gagtaatgat tatattatgt tataattttt 1020 gacctaattt agaataatta tcgagtccaa attatgaatc aattgaaagc tgttgaagaa 1080 attatcggta catcacataa cgatatcttt aaaggtagta agttcaatga tgcctttaac 1140 ggtggtgatg gtgtcgatac tattgacggt aacgacggca atgaccgctt atttggtggt 1200 aaaggcgatg atattctcga tggtggaaat ggtgatgatt ttatcgatgg cggtaaaggc 1260 aacgacctat tacacggtgg caagggcgat gatattttcg ttcaccgtaa aggcgatggt 1320 aatgatatta ttaccgattc tgacggcaat gataaattat cattctctga ttcgaactta 1380 aaagatttaa catttgaaaa agttaaacat aatcttgtca tcacgaatag caaaaaagag 1440 aaagtgacca ttcaaaactg gttccgagag gctgattttg ctaaagaagt gcctaattat 1500 aaagcaacta aagatgagaa aatcgaagaa atcatcggtc aaaatggcga gcggatcacc 1560 55 tcaaagcaag ttgatgatct tatcgcaaaa ggtaacggca aaattaccca agatgagcta 1620 tcaaaagttg ttgataacta tgaattgctc aaacatagca aaaatgtgac aaacagctta 1680 gataagttaa tctcatctgt aagtgcattt acctcgtcta atgattcgag aaatgtatta 1740 gtggctccaa cttcaatgtt ggatcaaagt ttatcttctc ttcaatttgc tagagcagct 1800 taatttttaa tgattggcaa ctctatattg tttcacacat tatagagttg ccgttttatt 1860 ttataaaagg agacaatatg gaagctaacc atcaaaggaa tgatcttggt ttagttgccc 1920 tcactatgtt ggcacaatac cataatattt cgcttaatcc ggaagaaata aaacataaat 1980 ttgatcttga cggaaaaggg ctttctttaa ctgcttggct tttagctgca aaatcgttag 2040 cgttgaaagc gaaacacatt aaaaaagaga tttcccgctt acacttggtg aatttaccgg 2100 cattagtttg gcaagataac ggtaaacatt ttttattggt aaaagtggat accgataata 2160 65 accgctattt aacttacaat ttggaacaag atgctccaca aattctgtca caagacgaat 2220 ttgaagcctg ctatcaaggg cagttaattt tggtcacgtc cagagcttcc gtagtaggtc 2280 aattagcaaa gttcgatttc acctggttta ttccggcggt gatcaaatac cgaaaaatct 2340 ttctagaaac cttg 2354

<210> 17 5 <211> 2354

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> deltalktCA completo (con RBS de consenso)

<400> 17 gcattgaatt gatcaactaa tacttggttt ttcaagtgag ttgcaatgcc taaaccatca 60 ccaaaatagt ttggattatt gattttctcc cctacaaaat ctagcccttc gtgttttctt 120 15 gccatctcag ccaataccgg cacatcgcca aaaatagcat caattcgccc attttgcaca 180 tctaaaatag cattttgata agaggcataa gatttcacat tgtactcttt tttctctttt 240 gctaaatagt gttggtaagt agtcccattt tgcacaccaa tcgttttcac cttagcaaaa 300 tctgtatctt ttttcgcaat gaaggcagca gagcttggaa agtaaggctc gctaaataat 360 acttgtttct tacgtggttc cgtaataccc atacctgaaa ttgcagcatc aaattgtttt 420 tgttttaggc tttggattaa gctatcaaaa ggttggctat ggaatgtaca atttgcattc 480 atctctttac agatagcatt tgcaatatcc acatcaaaac cgataatttc tcccttctct 540 tcggtcattt caaatggagg atagcttggc tccatcacaa atttgatatc ttgtgcctgc 600 gcagtaacca cacacccgaa taaaagggtc aaaagtgttt ttttcataaa aagtccctgt 660 gttttcatta taaggattac cactttaacg cagttacttt cttaaaaaaa gtcttctttt 720 25 cataaagttt gttttatgtc atacaaacac atcaaattga gatgtagttt ctcaatcctc 780 ttgattcctc tatctcaaaa aaacaaccca aaagaaaaaa gaaaagtata tgttacatta 840 atattacaat gtaattattt tgtttaattt ccctacattt tgtataactt taaaacactc 900 ctttttctct tctgattata taaaagacaa aaaatacaat ttaagctaca aaaaacaaca 960 aaaaacaaca aaaaacacga caataagatc gagtaatgat tatattatgt tataattttt 1020 gacctaattt agaataatta taggaggcaa attatgaatc aattgaaagc tgttgaagaa 1080 attatcggta catcacataa cgatatcttt aaaggtagta agttcaatga tgcctttaac 1140 ggtggtgatg gtgtcgatac tattgacggt aacgacggca atgaccgctt atttggtggt 1200 aaaggcgatg atattctcga tggtggaaat ggtgatgatt ttatcgatgg cggtaaaggc 1260 aacgacctat tacacggtgg caagggcgat gatattttcg ttcaccgtaa aggcgatggt 1320 35 aatgatatta ttaccgattc tgacggcaat gataaattat cattctctga ttcgaactta 1380 aaagatttaa catttgaaaa agttaaacat aatcttgtca tcacgaatag caaaaaagag 1440 aaagtgacca ttcaaaactg gttccgagag gctgattttg ctaaagaagt gcctaattat 1500 aaagcaacta aagatgagaa aatcgaagaa atcatcggtc aaaatggcga gcggatcacc 1560 tcaaagcaag ttgatgatct tatcgcaaaa ggtaacggca aaattaccca agatgagcta 1620 tcaaaagttg ttgataacta tgaattgctc aaacatagca aaaatgtgac aaacagctta 1680 gataagttaa tctcatctgt aagtgcattt acctcgtcta atgattcgag aaatgtatta 1740 gtggctccaa cttcaatgtt ggatcaaagt ttatcttctc ttcaatttgc tagagcagct 1800 taatttttaa tgattggcaa ctctatattg tttcacacat tatagagttg ccgttttatt 1860 ttataaaagg agacaatatg gaagctaacc atcaaaggaa tgatcttggt ttagttgccc 1920 45 tcactatgtt ggcacaatac cataatattt cgcttaatcc ggaagaaata aaacataaat 1980 ttgatcttga cggaaaaggg ctttctttaa ctgcttggct tttagctgca aaatcgttag 2040 cgttgaaagc gaaacacatt aaaaaagaga tttcccgctt acacttggtg aatttaccgg 2100 cattagtttg gcaagataac ggtaaacatt ttttattggt aaaagtggat accgataata 2160 accgctattt aacttacaat ttggaacaag atgctccaca aattctgtca caagacgaat 2220 ttgaagcctg ctatcaaggg cagttaattt tggtcacgtc cagagcttcc gtagtaggtc 2280 aattagcaaa gttcgatttc acctggttta ttccggcggt gatcaaatac cgaaaaatct 2340 ttctagaaac cttg 2354

<210> 18

<211> 249

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Traducción de deltaLKTCA

<400> 18 65 Met Asn Gln Leu Lys Ala Val Glu Glu Ile Ile Gly Thr Ser His Asn 15 10 15 Asp Ile Phe Lys Gly Ser Lys Phe Asn Asp Ala Phe Asn Gly Gly Asp 20 25 30

Gly Val Asp Thr Ile Asp Gly Asn Asp Gly Asn Asp Arg Leu Phe Gly 35 40 45 Gly Lys Gly Asp Asp Ile Leu Asp Gly Gly Asn Gly Asp Asp Phe Ile 50 55 60 5 Asp Gly Gly Lys Gly Asn Asp Leu Leu His Gly Gly Lys Gly Asp Asp 65 70 75 80 Ile Phe Val His Arg Lys Gly Asp Gly Asn Asp Ile Ile Thr Asp Ser 85 90 95 Asp Gly Asn Asp Lys Leu Ser Phe Ser Asp Ser Asn Leu Lys Asp Leu 100 105 110 Thr Phe Glu Lys Val Lys His Asn Leu Val Ile Thr Asn Ser Lys Lys 115 120 125 Glu Lys Val Thr Ile Gln Asn Trp Phe Arg Glu Ala Asp Phe Ala Lys 130 135 140 15 Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu Lys Ile Glu Glu Ile 145 150 155 160 Ile Gly Gln Asn Gly Glu Arg Ile Thr Ser Lys Gln Val Asp Asp Leu 165 170 175 Ile Ala Lys Gly Asn Gly Lys Ile Thr Gln Asp Glu Leu Ser Lys Val 180 185 190 Val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys His Ser Lys Asn Val Thr Asn Ser 195 200 205 Leu Asp Lys Leu Ile Ser Ser Val Ser Ala Phe Thr Ser Ser Asn Asp 210 215 220 25 Ser Arg Asn Val Leu Val Ala Pro Thr Ser Met Leu Asp Gln Ser Leu 225 230 235 240 Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Ala Ala 245

<210> 19

<211> 372

<212> ADN 35 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> lisina-aciltransferasa activadora de leucotoxina lktc d153_00985 d153_00985 serotipe A1 (EC 2.3.1.) (Proteína C activadora de toxina) (Leucotoxina C) -LKTC

<400> 19 atgctactta tagataacgg tattccgatc gcttattgta gttgggcaga tttaaacctt 60 gagactgagg tgaaatatat taaggatatt aattcgttaa caccagaaga atggcagtct 120 45 ggtgacagac gctggattat tgattgggta gcaccattcg gacattctca attactttat 180 aaaaaaatgt gtcagaaata ccctgatatg atcgtcagat ctatacgctt ttatccaaag 240 cagaaagaat taggcaaaat tgcctacttt aaaggaggta aattagataa aaaaacagca 300 aaaaaacgtt ttgatacata tcaagaagag ctggcaacag cacttaaaaa tgaatttaat 360 tttattaaaa aa 372

<210> 20

<211> 124 55 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Traducción de SEQ ID 19

<400> 20 Met Leu Leu Ile Asp Asn Gly Ile Pro Ile Ala Tyr Cys Ser Trp Ala 15 10 15 Asp Leu Asn Leu Glu Thr Glu Val Lys Tyr Ile Lys Asp Ile Asn Ser 65 20 25 30 Leu Thr Pro Glu Glu Trp Gln Ser Gly Asp Arg Arg Trp Ile Ile Asp 35 40 45 Trp Val Ala Pro Phe Gly His Ser Gln Leu Leu Tyr Lys Lys Met Cys

50 55 60 Gln Lys Tyr Pro Asp Met Ile Val Arg Ser Ile Arg Phe Tyr Pro Lys 65 70 75 80 Gln Lys Glu Leu Gly Lys Ile Ala Tyr Phe Lys Gly Gly Lys Leu Asp 5 85 90 95 Lys Lys Thr Ala Lys Lys Arg Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Glu Leu Ala 100 105 110 Thr Ala Leu Lys Asn Glu Phe Asn Phe Ile Lys Lys 115 120

<210> 21

<211> 2859 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> precursor de hemolisina-adenilato ciclasa bifuncional d153_00984 d153_00984 -LKTA

<400> 21 atgggaacta gacttacaac cctatcaaat gggctaaaaa acactttaac ggcaaccaaa 60 agtggcttac ataaagccgg tcaatcatta acccaagccg gcagttcttt aaaaactggg 120 25 gcaaaaaaaa ttatcctcta tattccccaa aattaccaat atgatactga acaaggtaat 180 ggtttacagg atttagtcaa agcggccgaa gagttgggga ttgaggtaca aagagaagaa 240 cgcaataata ttgcaacagc tcaaaccagt ttaggcacga ttcaaaccgc tattggctta 300 actgagcgtg gcattgtgtt atccgctcca caaattgata aattgctaca gaaaactaaa 360 gcaggccaag cattaggttc tgccgaaagc attgtacaaa atgcaaataa agccaaaact 420 gtattatctg gcattcaatc tattttaggc tcagtattgg ctggaatgga tttagatgag 480 gccttacaga ataacagcaa ccaacatgct cttgctaaag ctggcttgga gctaacaaat 540 tcattaattg aaaatattgc taattcagta aaaacacttg acgaatttgg tgagcaaatt 600 agtcaatttg gttcaaaact acaaaatatc aaaggcttag ggactttagg agacaaactc 660 aaaaatatcg gtggacttga taaagctggc cttggtttag atgttatctc agggctatta 720 35 tcgggcgcaa cagctgcact tgtacttgca gataaaaatg cttcaacagc taaaaaagtg 780 ggtgcgggtt ttgaattggc aaaccaagtt gttggtaata ttaccaaagc cgtttcttct 840 tacattttag cccaacgtgt tgcagcaggt ttatcttcaa ctgggcctgt ggctgcttta 900 attgcttcta ctgtttctct tgcgattagc ccattagcat ttgccggtat tgccgataaa 960 tttaatcatg caaaaagttt agagagttat gccgaacgct ttaaaaaatt aggctatgac 1020 ggagataatt tattagcaga atatcagcgg ggaacaggga ctattgatgc atcggttact 1080 gcaattaata ccgcattggc cgctattgct ggtggtgtgt ctgctgctgc agccggctcg 1140 gttattgctt caccgattgc cttattagta tctgggatta ccggtgtaat ttctacgatt 1200 ctgcaatatt ctaaacaagc aatgtttgag cacgttgcaa ataaaattca taacaaaatt 1260 gtagaatggg aaaaaaataa tcacggtaag aactactttg aaaatggtta cgatgcccgt 1320 45 tatcttgcga atttacaaga taatatgaaa ttcttactga acttaaacaa agagttacag 1380 gcagaacgtg tcatcgctat tactcagcag caatgggata acaacattgg tgatttagct 1440 ggtattagcc gtttaggtga aaaagtcctt agtggtaaag cctatgtgga tgcgtttgaa 1500 gaaggcaaac acattaaagc cgataaatta gtacagttgg attcggcaaa cggtattatt 1560 gatgtgagta attcgggtaa agcgaaaact cagcatatct tattcagaac gccattattg 1620 acgccgggaa cagagcatcg tgaacgcgta caaacaggta aatatgaata tattaccaag 1680 ctcaatatta accgtgtaga tagctggaaa attacagatg gtgcagcaag ttctaccttt 1740 gatttaacta acgttgttca gcgtattggt attgaattag acaatgctgg aaatgtaact 1800 aaaaccaaag aaacaaaaat tattgccaaa cttggtgaag gtgatgacaa cgtatttgtt 1860 ggttctggta cgacggaaat tgatggcggt gaaggttacg accgagttca ctatagccgt 1920 55 ggaaactatg gtgctttaac tattgatgca accaaagaga ccgagcaagg tagttatacc 1980 gtaaatcgtt tcgtagaaac cggtaaagca ctacacgaag tgacttcaac ccataccgca 2040 ttagtgggca accgtgaaga aaaaatagaa tatcgtcata gcaataacca gcaccatgcc 2100 ggttattaca ccaaagatac cttgaaagct gttgaagaaa ttatcggtac atcacataac 2160 gatatcttta aaggtagtaa gttcaatgat gcctttaacg gtggtgatgg tgtcgatact 2220 attgacggta acgacggcaa tgaccgctta tttggtggta aaggcgatga tattctcgat 2280 ggtggaaatg gtgatgattt tatcgatggc ggtaaaggca acgacctatt acacggtggc 2340 aagggcgatg atattttcgt tcaccgtaaa ggcgatggta atgatattat taccgattct 2400 gacggcaatg ataaattatc attctctgat tcgaacttaa aagatttaac atttgaaaaa 2460 gttaaacata atcttgtcat cacgaatagc aaaaaagaga aagtgaccat tcaaaactgg 2520 65 ttccgagagg ctgattttgc taaagaagtg cctaattata aagcaactaa agatgagaaa 2580 atcgaagaaa tcatcggtca aaatggcgag cggatcacct caaagcaagt tgatgatctt 2640 atcgcaaaag gtaacggcaa aattacccaa gatgagctat caaaagttgt tgataactat 2700 gaattgctca aacatagcaa aaatgtgaca aacagcttag ataagttaat ctcatctgta 2760

agtgcattta cctcgtctaa tgattcgaga aatgtattag tggctccaac ttcaatgttg 2820 gatcaaagtt tatcttctct tcaatttgct agagcagct 2859

<210> 22

<211> 953

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Traducción de SEQ ID 21

<400> 22 15 Met Gly Thr Arg Leu Thr Thr Leu Ser Asn Gly Leu Lys Asn Thr Leu 15 10 15 Thr Ala Thr Lys Ser Gly Leu His Lys Ala Gly Gln Ser Leu Thr Gln 20 25 30 Ala Gly Ser Ser Leu Lys Thr Gly Ala Lys Lys Ile Ile Leu Tyr Ile 35 40 45 Pro Gln Asn Tyr Gln Tyr Asp Thr Glu Gln Gly Asn Gly Leu Gln Asp 50 55 60 Leu Val Lys Ala Ala Glu Glu Leu Gly Ile Glu Val Gln Arg Glu Glu 65 70 75 80 25 Arg Asn Asn Ile Ala Thr Ala Gln Thr Ser Leu Gly Thr Ile Gln Thr 85 90 95 Ala Ile Gly Leu Thr Glu Arg Gly Ile Val Leu Ser Ala Pro Gln Ile 100 105 110 Asp Lys Leu Leu Gln Lys Thr Lys Ala Gly Gln Ala Leu Gly Ser Ala 115 120 125 Glu Ser Ile Val Gln Asn Ala Asn Lys Ala Lys Thr Val Leu Ser Gly 130 135 140 Ile Gln Ser Ile Leu Gly Ser Val Leu Ala Gly Met Asp Leu Asp Glu 145 150 155 160 35 Ala Leu Gln Asn Asn Ser Asn Gln His Ala Leu Ala Lys Ala Gly Leu 165 170 175 Glu Leu Thr Asn Ser Leu Ile Glu Asn Ile Ala Asn Ser Val Lys Thr 180 185 190 Leu Asp Glu Phe Gly Glu Gln Ile Ser Gln Phe Gly Ser Lys Leu Gln 195 200 205 Asn Ile Lys Gly Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Asn Ile Gly 210 215 220 Gly Leu Asp Lys Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val Ile Ser Gly Leu Leu 225 230 235 240 45 Ser Gly Ala Thr Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp Lys Asn Ala Ser Thr 245 250 255 Ala Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala Asn Gln Val Val Gly 260 265 270 Asn Ile Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu Ala Gln Arg Val Ala 275 280 285 Ala Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala Leu Ile Ala Ser Thr 290 295 300 Val Ser Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ala Phe Ala Gly Ile Ala Asp Lys 305 310 315 320 55 Phe Asn His Ala Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala Glu Arg Phe Lys Lys 325 330 335 Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu Tyr Gln Arg Gly Thr 340 345 350 Gly Thr Ile Asp Ala Ser Val Thr Ala Ile Asn Thr Ala Leu Ala Ala 355 360 365 Ile Ala Gly Gly Val Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ser Val Ile Ala Ser 370 375 380 Pro Ile Ala Leu Leu Val Ser Gly Ile Thr Gly Val Ile Ser Thr Ile 385 390 395 400 65 Leu Gln Tyr Ser Lys Gln Ala Met Phe Glu His Val Ala Asn Lys Ile 405 410 415 His Asn Lys Ile Val Glu Trp Glu Lys Asn Asn His Gly Lys Asn Tyr 420 425 430

Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg Tyr Leu Ala Asn Leu Gln Asp Asn 435 440 445 Met Lys Phe Leu Leu Asn Leu Asn Lys Glu Leu Gln Ala Glu Arg Val 450 455 460 5 Ile Ala Ile Thr Gln Gln Gln Trp Asp Asn Asn Ile Gly Asp Leu Ala 465 470 475 480 Gly Ile Ser Arg Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser Gly Lys Ala Tyr Val 485 490 495 Asp Ala Phe Glu Glu Gly Lys His Ile Lys Ala Asp Lys Leu Val Gln 500 505 510 Leu Asp Ser Ala Asn Gly Ile Ile Asp Val Ser Asn Ser Gly Lys Ala 515 520 525 Lys Thr Gln His Ile Leu Phe Arg Thr Pro Leu Leu Thr Pro Gly Thr 530 535 540 15 Glu His Arg Glu Arg Val Gln Thr Gly Lys Tyr Glu Tyr Ile Thr Lys 545 550 555 560 Leu Asn Ile Asn Arg Val Asp Ser Trp Lys Ile Thr Asp Gly Ala Ala 565 570 575 Ser Ser Thr Phe Asp Leu Thr Asn Val Val Gln Arg Ile Gly Ile Glu 580 585 590 Leu Asp Asn Ala Gly Asn Val Thr Lys Thr Lys Glu Thr Lys Ile Ile 595 600 605 Ala Lys Leu Gly Glu Gly Asp Asp Asn Val Phe Val Gly Ser Gly Thr 610 615 620 25 Thr Glu Ile Asp Gly Gly Glu Gly Tyr Asp Arg Val His Tyr Ser Arg 625 630 635 640 Gly Asn Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Ala Thr Lys Glu Thr Glu Gln 645 650 655 Gly Ser Tyr Thr Val Asn Arg Phe Val Glu Thr Gly Lys Ala Leu His 660 665 670 Glu Val Thr Ser Thr His Thr Ala Leu Val Gly Asn Arg Glu Glu Lys 675 680 685 Ile Glu Tyr Arg His Ser Asn Asn Gln His His Ala Gly Tyr Tyr Thr 690 695 700 35 Lys Asp Thr Leu Lys Ala Val Glu Glu Ile Ile Gly Thr Ser His Asn 705 710 715 720 Asp Ile Phe Lys Gly Ser Lys Phe Asn Asp Ala Phe Asn Gly Gly Asp 725 730 735 Gly Val Asp Thr Ile Asp Gly Asn Asp Gly Asn Asp Arg Leu Phe Gly 740 745 750 Gly Lys Gly Asp Asp Ile Leu Asp Gly Gly Asn Gly Asp Asp Phe Ile 755 760 765 Asp Gly Gly Lys Gly Asn Asp Leu Leu His Gly Gly Lys Gly Asp Asp 770 775 780 45 Ile Phe Val His Arg Lys Gly Asp Gly Asn Asp Ile Ile Thr Asp Ser 785 790 795 800 Asp Gly Asn Asp Lys Leu Ser Phe Ser Asp Ser Asn Leu Lys Asp Leu 805 810 815 Thr Phe Glu Lys Val Lys His Asn Leu Val Ile Thr Asn Ser Lys Lys 820 825 830 Glu Lys Val Thr Ile Gln Asn Trp Phe Arg Glu Ala Asp Phe Ala Lys 835 840 845 Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu Lys Ile Glu Glu Ile 850 855 860 55 Ile Gly Gln Asn Gly Glu Arg Ile Thr Ser Lys Gln Val Asp Asp Leu 865 870 875 880 Ile Ala Lys Gly Asn Gly Lys Ile Thr Gln Asp Glu Leu Ser Lys Val 885 890 895 Val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys His Ser Lys Asn Val Thr Asn Ser 900 905 910 Leu Asp Lys Leu Ile Ser Ser Val Ser Ala Phe Thr Ser Ser Asn Asp 915 920 925 Ser Arg Asn Val Leu Val Ala Pro Thr Ser Met Leu Asp Gln Ser Leu 930 935 940 65 Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Ala Ala 945 950

<210> 23

<211> 2124

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> exportadores de bacteriocina/lantibiótico de tipo ABC d153_00983 d153_00983 contienen un dominio doble de glicina peptidasa N-terminal -LKTB

<400> 23 atggaagcta accatcaaag gaatgatctt ggtttagttg ccctcactat gttggcacaa 60 taccataata tttcgcttaa tccggaagaa ataaaacata aatttgatct tgacggaaaa 120 gggctttctt taactgcttg gcttttagct gcaaaatcgt tagcgttgaa agcgaaacac 180 attaaaaaag agatttcccg cttacacttg gtgaatttac cggcattagt ttggcaagat 240 aacggtaaac attttttatt ggtaaaagtg gataccgata ataaccgcta tttaacttac 300 aatttggaac aagatgctcc acaaattctg tcacaagacg aatttgaagc ctgctatcaa 360 gggcagttaa ttttggtcac gtccagagct tccgtagtag gtcaattagc aaagttcgat 420 ttcacctggt ttattccggc ggtgatcaaa taccgaaaaa tctttctaga aaccttgatt 480 gtttcgatct ttttgcaaat ttttgcccta attacaccgc tattcttcca agttgttatg 540 gataaagtac tggtgcatcg aggtttttca accttgaata tcattacggt tgccttagct 600 attgtgatca tctttgaaat tgtactaagt ggtttgagaa cctatgtttt ttctcatagc 660 actagccgta ttgatgttga attaggcgct aaattatttc gacatttatt atcactaccc 720 atttcttatt ttgaaaacag acgagttgga gatacagtcg ctagggttag agaattagat 780 caaattcgta atttccttac cggacaagca ttaacctcgg tgttagatct cttattctct 840 tttatctttt ttgccgtaat gtggtattac agcccaaaat taaccttggt aattcttggt 900 tcattgccct gctatatttt atggtcaatt tttattagtc cgattttaag acggcgttta 960 gatgagaaat ttgcccgaag tgctgataac caagcattct tagttgagtc ggtaacagcc 1020 atcaatatga ttaaagcgat ggcggttgct ccacaaatga cggatacatg ggataaacag 1080 ctggcaagct atgtttcatc aagtttccgt gtcaccgtat tagcaaccat tgggcaacaa 1140 ggtgtacaac ttattcaaaa aaccgttatg gtgattaacc tttggttagg ggcacactta 1200 gttatttcag gcgatctgag tattgggcaa ttaattgcct ttaatatgct atcagggcaa 1260 gtgattgcac cggtgattcg gctggctcag ctctggcaag atttccaaca agttgggatt 1320 tccgtcactc gcttaggtga tgttttaaac tctccaaccg aacaatatca aggcaaatta 1380 tcactaccag aaataaaagg cgatatctca tttaaaaata tccgctttag atataaacca 1440 gatgcaccaa ctattttaaa taatgtgaat ttagaaatta ggcaaggaga agtgattggg 1500 attgttggac gttccggttc aggcaaaagt actctgacta aattactgca acgtttttat 1560 attcctgaaa atgggcaggt tttgattgat ggacatgatc tagccttagc tgatccaaac 1620 tggctacgcc gtcaaatagg tgtagtgctg caagataatg tgttattaaa ccgcagtatc 1680 cgagaaaata ttgcgctatc agatccagga atgccaatgg agcgagtaat ttatgcagca 1740 aaattagcag gggctcacga ttttatttca gaattgcgtg aaggttataa caccattgtg 1800 ggtgaacaag gagcggggct ttcaggcggg caacgccaac ggattgcgat tgctcgagct 1860 ttggtaaaca acccgaaaat cctgattttt gatgaggcaa ccagtgccct cgattacgaa 1920 tctgagcata ttattatgca aaatatgcaa aaaatatgcc aaggcagaac cgtgattttg 1980 attgcacatc gtttatcgac cgtcaaaaat gcggatcgaa ttattgtgat ggaaaagggg 2040 gaaattgttg agcaaggcaa gcaccacgaa ttactgcaaa acagtaacgg actttattcc 2100 tacttacacc aattacaact taat 2124

<210> 24

<211> 708

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Traducción de SEQ ID 23

<400> 24 Met Glu Ala Asn His Gln Arg Asn Asp Leu Gly Leu Val Ala Leu Thr 15 10 15 Met Leu Ala Gln Tyr His Asn Ile Ser Leu Asn Pro Glu Glu Ile Lys 20 25 30 His Lys Phe Asp Leu Asp Gly Lys Gly Leu Ser Leu Thr Ala Trp Leu 35 40 45 Leu Ala Ala Lys Ser Leu Ala Leu Lys Ala Lys His Ile Lys Lys Glu 50 55 60 Ile Ser Arg Leu His Leu Val Asn Leu Pro Ala Leu Val Trp Gln Asp

65 70 75 80 Asn Gly Lys His Phe Leu Leu Val Lys Val Asp Thr Asp Asn Asn Arg 85 90 95 Tyr Leu Thr Tyr Asn Leu Glu Gln Asp Ala Pro Gln Ile Leu Ser Gln 100 105 110 Asp Glu Phe Glu Ala Cys Tyr Gln Gly Gln Leu Ile Leu Val Thr Ser 115 120 125 Arg Ala Ser Val Val Gly Gln Leu Ala Lys Phe Asp Phe Thr Trp Phe

130 135 140

Ile Pro Ala Val Ile Lys Tyr Arg Lys Ile Phe Leu Glu Thr Leu Ile

145 150 155 160

Val Ser Ile Phe Leu Gln Ile Phe Ala Leu Ile Thr Pro Leu Phe Phe

165 170 175 Gln Val Val Met Asp Lys Val Leu Val His Arg Gly Phe Ser Thr Leu 180 185 190 Asn Ile Ile Thr Val Ala Leu Ala Ile Val Ile Ile Phe Glu Ile Val 195 200 205 Leu Ser Gly Leu Arg Thr Tyr Val Phe Ser His Ser Thr Ser Arg Ile

210 215 220

Asp Val Glu Leu Gly Ala Lys Leu Phe Arg His Leu Leu Ser Leu Pro

225 230 235 240

Ile Ser Tyr Phe Glu Asn Arg Arg Val Gly Asp Thr Val Ala Arg Val

245 250 255 Arg Glu Leu Asp Gln Ile Arg Asn Phe Leu Thr Gly Gln Ala Leu Thr 260 265 270 Ser Val Leu Asp Leu Leu Phe Ser Phe Ile Phe Phe Ala Val Met Trp 275 280 285 Tyr Tyr Ser Pro Lys Leu Thr Leu Val Ile Leu Gly Ser Leu Pro Cys

290 295 300

Tyr Ile Leu Trp Ser Ile Phe Ile Ser Pro Ile Leu Arg Arg Arg Leu

305 310 315 320

Asp Glu Lys Phe Ala Arg Ser Ala Asp Asn Gln Ala Phe Leu Val Glu

325 330 335 Ser Val Thr Ala Ile Asn Met Ile Lys Ala Met Ala Val Ala Pro Gln 340 345 350 Met Thr Asp Thr Trp Asp Lys Gln Leu Ala Ser Tyr Val Ser Ser Ser 355 360 365 Phe Arg Val Thr Val Leu Ala Thr Ile Gly Gln Gln Gly Val Gln Leu

370 375 380

Ile Gln Lys Thr Val Met Val Ile Asn Leu Trp Leu Gly Ala His Leu

385 390 395 400

Val Ile Ser Gly Asp Leu Ser Ile Gly Gln Leu Ile Ala Phe Asn Met

405 410 415 Leu Ser Gly Gln Val Ile Ala Pro Val Ile Arg Leu Ala Gln Leu Trp 420 425 430 Gln Asp Phe Gln Gln Val Gly Ile Ser Val Thr Arg Leu Gly Asp Val 435 440 445 Leu Asn Ser Pro Thr Glu Gln Tyr Gln Gly Lys Leu Ser Leu Pro Glu

450 455 460

Ile Lys Gly Asp Ile Ser Phe Lys Asn Ile Arg Phe Arg Tyr Lys Pro

465 470 475 480

Asp Ala Pro Thr Ile Leu Asn Asn Val Asn Leu Glu Ile Arg Gln Gly

485 490 495 Glu Val Ile Gly Ile Val Gly Arg Ser Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu 500 505 510 Thr Lys Leu Leu Gln Arg Phe Tyr Ile Pro Glu Asn Gly Gln Val Leu 515 520 525 Ile Asp Gly His Asp Leu Ala Leu Ala Asp Pro Asn Trp Leu Arg Arg

530 535 540

Gln Ile Gly Val Val Leu Gln Asp Asn Val Leu Leu Asn Arg Ser Ile

545 550 555 560

Arg Glu Asn Ile Ala Leu Ser Asp Pro Gly Met Pro Met Glu Arg Val

565 570 575 Ile Tyr Ala Ala Lys Leu Ala Gly Ala His Asp Phe Ile Ser Glu Leu 580 585 590 Arg Glu Gly Tyr Asn Thr Ile Val Gly Glu Gln Gly Ala Gly Leu Ser 595 600 605 Gly Gly Gln Arg Gln Arg Ile Ala Ile Ala Arg Ala Leu Val Asn Asn

610 615 620

Pro Lys Ile Leu Ile Phe Asp Glu Ala Thr Ser Ala Leu Asp Tyr Glu

625 630 635 640

Ser Glu His Ile Ile Met Gln Asn Met Gln Lys Ile Cys Gln Gly Arg

645 650 655 Thr Val Ile Leu Ile Ala His Arg Leu Ser Thr Val Lys Asn Ala Asp 660 665 670 Arg Ile Ile Val Met Glu Lys Gly Glu Ile Val Glu Gln Gly Lys His 675 680 685 His Glu Leu Leu Gln Asn Ser Asn Gly Leu Tyr Ser Tyr Leu His Gln

690 695 700

Leu Gln Leu Asn

<210> 25

<211> 1434

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de secreción de microcina H47 d153_00982 d153_00982 -LKTD

<400> 25 atgaaaatat ggcttagtgg tatttatgaa tttttcctac gctataaaaa catttgggca 60 gaagtatgga aaattcgtaa agaattagac cacccaaaca gaaaaaaaga cgaaagtgaa 120 tttttaccgg cacatttaga actgattgaa accccggttt ctaaaaaacc acgtctaatt 180 gcttatttga ttatgctatt tttagttgtg gcaattgtgc ttgccagtgt aagcaaagtt 240 gaaattgtgg cgactgctcc cggtaaatta acttttagtg gcagaagtaa agaaattaaa 300 ccgattgaaa acgccattgt acaagaaatt ttcgttaaag atgggcagtt tgtggaaaaa 360 gggcaattat tagtcagctt aactgcattg ggttctgatg cagatatcaa aaagaccatg 420 gcttcacttt ctttagctaa actggagaac tatcgctacc aaactttgct tactgccatt 480 gaaaaagagt ccttgccggt gattgattta tctagaaccg aatttaaaga ttcatcggaa 540 gaagatcgac tacgtattaa acacttaatt gaggagcaat acaccacttg gcaaaaacaa 600 aaaacacaga aaactttagc gtataagcgt aaagaggctg aaaaacaaac aatatttgcc 660 tatgtccgta aatatgaagg tgcaacacgt attgaacaag aaaaattaaa agactttaag 720 gcactttata aacagaagtc tttatctaag cacgaacttc ttgcgcaaga aaataaatta 780 attgaggctc agaatgagct agctgtttat cgctcaaaat taaatgaatt agaaaatgat 840 ctactcaatg taaaagaaga acttgaattg atcacgcaat tctttaaaag cgatgtgttg 900 gaaaaattaa agcaacatat tgaaaatgaa cgccaacttc ggctcgagtt agaaaaaaat 960 aatcaacgca gacaggcctc gatgatcaga gcaccggttt ccggtacggt tcagcaactg 1020 aaaattcaca ctataggtgg tgttgttacg actgctgaaa ccttgatgat cattgtgccg 1080 gaagacgatg tgttagaggc caccgctctg gttccaaaca aagatatcgg ctttgttgca 1140 gcagggcagg aggtgattat taaagtggaa actttccctt atacacgcta tggttatcta 1200 actggtcgaa ttaaacatat tagcccggat gcgattgaac aacctaatgt aggcttagtt 1260 tttaatgcaa ctatagctat agataggaag aatctaacat cgcctgatgg gcgaaaaatt 1320 gatttgagtt caggtatgac aataactgct gaaatcaaaa ccggtgaacg gagtgtaatg 1380 agttatttac tcagcccatt agaagaatct gtcacagaaa gtttaaggga acgc 1434

<210> 26

<211> 478

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Traducción de SEQ ID 25

<400> 26 Met Lys Ile Trp Leu Ser Gly Ile Tyr Glu Phe Phe Leu Arg Tyr Lys 15 10 15 Asn Ile Trp Ala Glu Val Trp Lys Ile Arg Lys Glu Leu Asp His Pro

20 25 30 Asn Arg Lys Lys Asp Glu Ser Glu Phe Leu Pro Ala His Leu Glu Leu 35 40 45 Ile Glu Thr Pro Val Ser Lys Lys Pro Arg Leu Ile Ala Tyr Leu Ile

50 55 60 Met Leu Phe Leu Val Val Ala Ile Val Leu Ala Ser Val Ser Lys Val 65 70 75 80 Glu Ile Val Ala Thr Ala Pro Gly Lys Leu Thr Phe Ser Gly Arg Ser 5 85 90 95 Lys Glu Ile Lys Pro Ile Glu Asn Ala Ile Val Gln Glu Ile Phe Val 100 105 110 Lys Asp Gly Gln Phe Val Glu Lys Gly Gln Leu Leu Val Ser Leu Thr 115 120 125 10 Ala Leu Gly Ser Asp Ala Asp Ile Lys Lys Thr Met Ala Ser Leu Ser 130 135 140 Leu Ala Lys Leu Glu Asn Tyr Arg Tyr Gln Thr Leu Leu Thr Ala Ile 145 150 155 160 Glu Lys Glu Ser Leu Pro Val Ile Asp Leu Ser Arg Thr Glu Phe Lys 15 165 170 175 Asp Ser Ser Glu Glu Asp Arg Leu Arg Ile Lys His Leu Ile Glu Glu 180 185 190 Gln Tyr Thr Thr Trp Gln Lys Gln Lys Thr Gln Lys Thr Leu Ala Tyr 195 200 205 20 Lys Arg Lys Glu Ala Glu Lys Gln Thr Ile Phe Ala Tyr Val Arg Lys 210 215 220 Tyr Glu Gly Ala Thr Arg Ile Glu Gln Glu Lys Leu Lys Asp Phe Lys 225 230 235 240 Ala Leu Tyr Lys Gln Lys Ser Leu Ser Lys His Glu Leu Leu Ala Gln 25 245 250 255 Glu Asn Lys Leu Ile Glu Ala Gln Asn Glu Leu Ala Val Tyr Arg Ser 260 265 270 Lys Leu Asn Glu Leu Glu Asn Asp Leu Leu Asn Val Lys Glu Glu Leu 275 280 285 30 Glu Leu Ile Thr Gln Phe Phe Lys Ser Asp Val Leu Glu Lys Leu Lys 290 295 300 Gln His Ile Glu Asn Glu Arg Gln Leu Arg Leu Glu Leu Glu Lys Asn 305 310 315 320 Asn Gln Arg Arg Gln Ala Ser Met Ile Arg Ala Pro Val Ser Gly Thr 35 325 330 335 Val Gln Gln Leu Lys Ile His Thr Ile Gly Gly Val Val Thr Thr Ala 340 345 350 Glu Thr Leu Met Ile Ile Val Pro Glu Asp Asp Val Leu Glu Ala Thr 355 360 365 40 Ala Leu Val Pro Asn Lys Asp Ile Gly Phe Val Ala Ala Gly Gln Glu 370 375 380 Val Ile Ile Lys Val Glu Thr Phe Pro Tyr Thr Arg Tyr Gly Tyr Leu 385 390 395 400 Thr Gly Arg Ile Lys His Ile Ser Pro Asp Ala Ile Glu Gln Pro Asn 45 405 410 415 Val Gly Leu Val Phe Asn Ala Thr Ile Ala Ile Asp Arg Lys Asn Leu 420 425 430 Thr Ser Pro Asp Gly Arg Lys Ile Asp Leu Ser Ser Gly Met Thr Ile 435 440 445 50 Thr Ala Glu Ile Lys Thr Gly Glu Arg Ser Val Met Ser Tyr Leu Leu 450 455 460 Ser Pro Leu Glu Glu Ser Val Thr Glu Ser Leu Arg Glu Arg 465 470 475

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Vacuna para provocar una respuesta inmunogénica en un animal, comprendiendo la vacuna bacterias que contienen una mutación atenuante en un gen, en la que la mutación modifica la expresión y/o la actividad biológica

   5 de un polipéptido o proteína codificada por el gen, dando lugar a una virulencia atenuada de las bacterias, en la que la mutación es una deleción dentro del marco que da lugar a que las bacterias secreten una leucotoxina (LktA) truncada, en la que además las bacterias son los serotipos A1 y A6 de Mannheimia haemolytica, en la que además la deleción está dentro del locus del gen de LktCA que codifica acilasa (LktC) y leucotoxina A

   10 (LktA), en la que además la secuencia de aminoácidos de la forma truncada secretada de LktA consiste en la secuencia codificada por la SEQ ID NO: 16 o 17.
2. 2. Vacuna, según la reivindicación 1, que comprende además un portador, vehículo, diluyente o excipiente 15 farmacéutica o veterinariamente aceptable.

3. 3.

   Vacuna, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un adyuvante.

4. 4.

   Vacuna, según la reivindicación 3, en la que el adyuvante es bacterias inactivadas, virus inactivados, fracciones

   20 de bacterias inactivadas, lipopolisacáridos bacterianos, toxinas bacterianas, o derivados o combinaciones de los mismos.
5. 5. Vacuna, según la reivindicación 3 ó 4, que comprende además bacterias adicionales en combinación con M. haemolytica.

6. 6.

   Vacuna, según la reivindicación 5, que comprende P. multocida e Histophilus somni (H. Somni).

7. 7.

   Vacuna, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para usar en la vacunación de un animal contra las

   enfermedades causadas por M. haemolytica, en la que la vacuna se administra al menos una vez. 30

8. 8.

   Vacuna para usar, según la reivindicación 7, en la que el animal es un animal bovino.

9. 9.

   Vacuna para usar, según la reivindicación 8, en la que el animal bovino es un ternero que tiene 28 días o más.

   35 10. Vacuna para usar, según la reivindicación 7, en la que la vacuna se administra por vía intranasal.
10. 11. Vacuna para usar, según la reivindicación 7, en la que la vacuna es para la protección de los animales bovinos contra la cepa de M.haemolytica A1 o A6, en la que la vacuna se administra por vía intranasal.