CN115772506A

CN115772506A - 一种溶血性曼氏杆菌plpe蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115772506A
Application number: CN202211586618.1A
Authority: CN
Inventors: 张月梅; 赵世华; 宋越; 王娜; 白帆; 戴伶俐; 张帆; 杨斌; 刘威
Original assignee: Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences
Current assignee: Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences
Priority date: 2022-12-09
Filing date: 2022-12-09
Publication date: 2023-03-10

Abstract

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明所述制备方法以溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白为免疫抗原制备杂交瘤细胞，溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白较为保守，使其作为免疫抗原的特异性较好，使得到的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能够准确识别溶血性曼氏杆菌，专一性更强，避免与多杀性巴氏杆菌、绵羊肺炎支原体和链球菌检测时的交叉反应。

Description

一种溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

溶血性曼氏杆菌是一种严重危害家畜养殖业的人畜共患致病菌，临床上可以导致牛羊出血性败血症等危害严重的病症。溶血性曼氏杆菌一般被认为它是家畜家常带内源性病菌，饲养环境不卫生，加上天气的突变、寒冷、闷热、潮湿拥挤、饲养营养缺乏、饲料突变、长途运输等因素，会使动物产生应激反应，机体抵抗力降低时，溶血性曼氏杆菌则可乘机侵入机体内，经淋巴进入血液，使动物发生内源性感染。

溶血性曼氏杆菌常与巴氏杆菌属其他亚型菌株以及绵羊肺炎支原体等发生混合感染而加剧羊传染性胸膜肺炎的发病过程，导致市场上目前在售的绵羊肺炎支原体灭活疫苗免疫效果不佳。同时，由于市场上目前未见到有效的检测溶血性曼氏杆菌的单克隆抗体和免疫学检测试剂盒，大大降低了对于该菌的早期诊断，为该菌引起的疫病防控带来困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用，所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体可以实现溶血性曼氏杆菌的有效检测，实现溶血性曼氏杆菌相关疫病地积极防控。

本发明提供了一种分泌溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，包括如下步骤：

以溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白为免疫抗原对动物免疫，获得免疫脾脏细胞；

将所述免疫脾脏细胞与骨髓瘤细胞株在PEG下进行细胞融合和筛选，得到阳性杂交瘤细胞；

对所述阳性杂交瘤细胞进行克隆化，直至克隆化装置中克隆化细胞的阳性率为100％，得到所述分泌溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。

优选的，所述免疫包括：依次进行第一次免疫、第二次免疫、第三次免疫和加强免疫，每一次免疫时，所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的用量均为20～50μg/只。

优选的，所述第一次免疫的佐剂为弗氏完全佐剂，所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白和弗氏完全佐剂的体积比为1：1～3；

所述第二次免疫的佐剂为弗氏不完全佐剂，所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白和弗氏不完全佐剂的体积比为1：1～3；

所述第三次免疫的佐剂为生理盐水，所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白和弗生理盐水的体积比为1：1～3；

所述加强免疫的佐剂为生理盐水，所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白和生理盐水的体积比为1:1。

优选的，所述第一次免疫与第二次免疫的间隔时间为28天，所述第二次免疫与第三次免疫的间隔时间为28天，所述第三次免疫和加强免疫的间隔时间为14天。

本发明还提供了一种分泌溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，采用上述技术方案所述的制备方法制备得到。

本发明还提供了一种溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体，由上述技术方案所述的杂交瘤细胞分泌产生。

本发明还提供了上述技术方案所述的溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的制备方法，在致敏的动物腹腔中接种上述技术方案所述的杂交瘤细胞，7～10天后，收集腹水和纯化，得到所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体。

优选的，所述杂交瘤细胞的接种数量为(1～2)×10⁶个/只。

本发明还提供了上述技术方案所述的溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体或上述技术方案所述的制备方法制备得到的溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体在制备检测溶血性曼氏杆菌的免疫检测试剂盒中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种分泌溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，所述制备方法以溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白为免疫抗原制备杂交瘤细胞，溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白较为保守，使其作为免疫抗原的特异性较好，使杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能够准确识别溶血性曼氏杆菌，专一性更强，避免与多杀性巴氏杆菌、绵羊肺炎支原体和链球菌检测时的交叉反应，实现溶血性曼氏杆菌相关疫病地积极防控。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中小试培养选择最佳的诱导条件中融合蛋白的SDS-PAGE检测图；

图2为实施例1中融合蛋白的镍琼脂糖亲和层析SDS-PAGE检测图；

图3为实施例1中溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的镍琼脂糖亲和层析SDS-PAGE检测图；

图4为实施例1中溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的镍琼脂糖亲和层析Western Blot检测图；

图5为实施例1中溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的浓度测定标准曲线；

图6为实施例3中溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体WesternBlot的X光片。

具体实施方式

以溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白为免疫抗原对动物免疫，得到免疫脾脏细胞；

本发明以溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白为免疫抗原对动物免疫，得到免疫脾脏细胞。

在本发明中，所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的氨基酸序列优选如SEQ IDNO.1所示，具体为：

GGSGSGGSSSTPNHPKPVLVPKTQNNLQAQNVPQAQNASQAQNAPQAQNAPQAQNAPQVENAPQAQNAPQVENAPQAEVTPPVPQPQSQKIDGSFDKIGSVKLNKEAQTLELSRFTLVDKLGTPPKFDKVSGKKIIEEKDFLVLNLSDINAEQLSGDFLIRRSDDLFYGYYHDTNGKNLVDAADKFSQYFVVYDEKRVNDNISDKLTATYRKKEGFVYGSNPHTKEFAARISKLGDVEIKFENGQAQGSIKDEKDGNAEIFTIKGDTKQLEITPTESNRIIIAILDQNQKSYTPGMEKAIMETKFIDSKAGNSDQKYLIGEAKSDNWQAIMVSEKK。

本发明所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白优选通过对溶血性曼氏杆菌plpE基因进行原核表达和纯化得到。

本发明优选对溶血性曼氏杆菌plpE基因进行原核表达。本发明所述溶血性曼氏杆菌plpE基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示，具体为5’-GGAGGAAGCGGTAGCGGAGGTTCGTCTTCAACACCGAATCACCCCAAA CCAGTACTAGTACCAAAAACACAAAATAATCTTCAAGCACAAAATGTTCCTCAGGCACAAAATGCCTCTCAGGCACAAAATGCCCCTCAGGCACAAAATGCTCCTCAGGCACAAAATGCTCCTCAGGTGGAAAATGCTCCTCAGGCACAAAATGCTCCTCAGGTAGAAAATGCTCCTCAAGCAGAGGTTACTCCGCCTGTACCACAGCCACAATCACAAAAAATTGACGGTTCTTTTGATAAAATTGGTTCAGTAAAACTCAATAAAGAGGCTCAAACTCTTGAGCTTAGTAGATTCACTTTGGTGGATAAATTAGGCACACCACCGAAGTTTGATAAAGTAAGCGGTAAAAAAATTATTGAAGAAAAAGATTTTCTCGTATTAAATTTGTCTGATATTAATGCTGAACAACTCTCTGGCGATTTTCTTATTCGCCGTAGCGATGATCTATTCTATGGCTACTATCACGATACAAATGGCAAAAATCTTGTCGATGCTGCCGATAAATTCAGTCAATATTTTGTCGTGTATGATGAGAAACGGGTAAATGATAATATCTCTGATAAATTAACAGCAACTTACCGTAAAAAAGAAGGCTTTGTATATGGTTCAAATCCACATACTAAAGAATTTGCCGCACGGATCAGCAAATTGGGGGATGTAGAAATTAAATTTGAAAATGGTCAAGCTCAAGGAAGTATAAAAGACGAAAAAGATGGAAATGCTGAGATCTTTACTATTAAAGGTGATACAAAACAGTTAGAGATTACCCCAACGGAAAGTAACCGAATCATTATAGCAATTTTAGACCAAAATCAAAAAAGCTATACTCCAGGAATGGAAAAAGCAATTATGGAAACTAAGTTTATTGATTCAAAGGCTGGTAATTCCGACCAAAAATACTTAATCGGTGAAGCAAAAAGCGATAACTGGCAAGCAATAATGGTTAGCGAGAAAAAATAA-3’。本发明用于所述原核表达的载体优选包括质粒载体，进一步优选为pET28b。本发明用于所述原核表达的菌株优选为大肠杆菌，进一步优选为BL21(DE3)。本发明对所述原核表达的具体步骤没有特殊限定，采用本领域中常规原核表达的步骤即可。

所述原核表达后，本发明优选对含有所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的细胞菌体进行纯化，得到所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白。本发明优选采用镍琼脂糖亲和层析进行所述纯化。本发明对所述纯化的具体步骤没有特殊限定，保证纯化得到的溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的纯度＞80％即可。

得到所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白后，本发明以溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白为免疫抗原对动物免疫，得到免疫后动物。

在本发明中，所述动物优选包括小鼠，进一步优选为BALB/c小鼠，更优选为BALB/c雌鼠。在本发明中，所述免疫优选包括：依次进行第一次免疫、第二次免疫、第三次免疫和加强免疫。

在本发明中，所述第一次免疫优选包括将溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白与弗氏完全佐剂混合乳化后对动物进行第一次免疫。本发明所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白与弗氏完全佐剂的体积比优选为1：1～3，更优选为1:1。本发明所述第一次免疫的方式优选为皮下多点注射；所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的用量优选为20～50μg/只，更优选为25μg/只。

所述第一次免疫后，本发明优选将溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化后对第一次免疫后的动物进行第二次免疫。本发明所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白与弗氏不完全佐剂的体积比优选为1：1～3，更优选为1:1。本发明所述第二次免疫的方式优选为皮下多点注射；所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的用量优选为20～50μg/只，更优选为25μg/只。本发明所述第一次免疫与第二次免疫的间隔时间优选为28天。

所述第二次免疫后，本发明优选将溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白与生理盐水混合乳化后对第二次免疫后的动物进行第三次免疫。本发明所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白与生理盐水的体积比优选为1：1～3，更优选为1:1。本发明所述第三次免疫的方式优选为腹腔注射；所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的用量优选为20～50μg/只，更优选为25μg/只。本发明所述第二次免疫与第三次免疫的间隔时间优选为28天。

所述第三次免疫后，本发明优选将溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白与生理盐水混合乳化后对第三次免疫后的动物进行加强免疫。本发明所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白与生理盐水的体积比优选为1：1～3，更优选为1:1。本发明所述加强免疫的方式优选为腹腔注射；所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的用量优选为20～50μg/只，更优选为25μg/只。本发明所述第三次免疫与加强免疫的间隔时间优选为14天。本发明优选还包括于所述第三次免疫后7天，测定第三次免疫后的动物血液中的PLPE蛋白血清抗体效价，选择PLPE蛋白血清抗体效价相对较高的动物进行细胞融合。

所述加强免疫后，本发明将所述免疫后动物的脾脏细胞与骨髓瘤细胞株在PEG下进行细胞融合和筛选，得到阳性杂交瘤细胞。本发明优选于所述加强免疫后的第3天进行所述细胞融合，更优选为第3天。本发明所述骨髓瘤细胞株优选为NS1、SP2/0或X63细胞株，更优选为SP2/0。本发明所述免疫后动物的脾脏细胞与骨髓瘤细胞株的数量比优选为7：1。本发明对所述免疫后动物的脾脏细胞的制备步骤没有特殊限定，采用本领域中常规步骤制备即可。本发明所述PEG的浓度优选为30％～60％，更优选为50％。本发明所述PEG优选包括PEG4000。本发明优选采用ELISA间接法对得到的融合细胞进行筛选。

得到所述阳性杂交瘤细胞后，本发明对所述阳性杂交瘤细胞进行克隆化，直至克隆化装置中克隆化细胞的阳性率为100％，得到所述分泌溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。本发明所述克隆化装置优选为细胞培养板，更优选为96孔板。本发明对所述克隆化的步骤没有特殊限定，采用本领域中常规克隆化步骤使每个克隆化装置中克隆化细胞的阳性率为100％即可。

本发明还提供了采用上述技术方案所述的制备方法制备得到的分泌溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。依据溶血性曼氏杆菌plpE基因和溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的保守性制备得到的溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞可以分泌特异性和专一性更强的单克隆抗体。

依据上述优势，本发明还提供了由上述技术方案所述的杂交瘤细胞分泌产生的溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体。

本发明优选于健康动物腹腔内注射致敏剂，1～2周后，得到致敏的动物。本发明所述动物优选包括小鼠或大鼠，更优选为小鼠。本发明所述致敏剂优选包括液体石蜡。在本发明中，当所述动物为小鼠，致敏剂为液体石蜡时，所述液体石蜡的注射剂量优选为0.5mL/只。

得到所述石蜡致敏的小鼠模型后，本发明在石蜡致敏的小鼠模型腹腔中接种上述技术方案所述的杂交瘤细胞，7～10天后，收集腹水。本发明所述所述杂交瘤细胞的接种数量为(1～2)×10⁶个/只，更优选为1×10⁶个/只。本发明优选采用腹腔注射的方式进行所述接种。本发明优选于小鼠腹腔明显膨大后收集腹水。

收集腹水后，本发明优选对所述腹水进行纯化，得到所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体。

在本发明中，所述纯化优选包括如下步骤：对腹水进行第一离心，将得到的上清与饱和硫酸铵混合至半饱和，进行第一搅拌和第二离心，得到第一沉淀；

将所述第一沉淀溶于PBS溶液后，与饱和硫酸铵混合至饱和度为33％，进行第二搅拌和第三离心，得到第三沉淀；

将所述第三沉淀溶于PBS溶液后，进行透析，得到透过液；

对所述透过液进行亲和层析，得到所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体。

本发明优选对腹水进行第一离心，将得到的上清与饱和硫酸铵混合至半饱和，进行第一搅拌和第二离心，得到第一沉淀。本发明所述第一离心的时间优选为10～20min，更优选为15min；转速优选为1500～4000rpm，更优选为4000rpm；温度优选为室温。本发明将得到的上清与饱和硫酸铵混合时，还伴随搅拌，所述混合的方式优选为将所述得到的上清逐滴滴入饱和硫酸铵中；所述混合的温度优选为2～8℃，更优选为4℃。本发明所述第一搅拌的时间优选为30～50min，更优选为30min。本发明所述第二离心的时间优选为25～35min，更优选为30min；转速优选为12000～14000rpm，更优选为13000rpm；温度优选为2～8℃，更优选为4℃。

得到所述第二沉淀后，本发明优选将所述第一沉淀溶于PBS溶液后，与饱和硫酸铵混合至饱和度为33％，进行第二搅拌和第三离心，得到第二沉淀。本发明所述PBS溶液的浓度优选为0.01M；pH值优选为7.2～7.6，更优选为7.4。本发明优选将第一溶液溶于PBS溶液后，在2～8℃下逐滴加入饱和硫酸铵中，且伴随搅拌，更优选为4℃。本发明所述第二搅拌的时间优选为30～50min，更优选为30min。本发明所述第三离心的时间优选为25～35min，更优选为30min；转速优选为12000～14000rpm，更优选为13000rpm；温度优选为2～8℃，更优选为4℃。

得到所述第三沉淀后，本发明优选将所述第三沉淀溶于PBS溶液后，进行透析，得到透过液。本发明所述PBS溶液的浓度优选为0.01M；pH值优选为7.2～7.6，更优选为7.4。本发明所述透析用透析袋的截留分子量优选为30～50KDa，更优选为40KDa。本发明所述透析的温度优选为2～8℃，更优选为4℃；所述透析的时间优选为过夜。

得到所述透过液，本发明优选对所述透过液进行亲和层析，得到所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体。本发明所述亲和层析使用的预装柱优选为蛋白G琼脂糖亲和层析柱；本发明所述亲和层析的上样量优选为0.5～1.0mL/min，更优选为1.0mL/min；洗脱液优选为甘氨酸-盐酸缓冲液，所述甘氨酸-盐酸缓冲液的浓度优选为0.1M；pH值优选为2.7。

本发明所述免疫检测试剂优选包括ELISA检测试剂盒，进一步优选包括直接ELISA、、间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA和竞争抑制ELISA检测试剂盒，更优选包括夹心ELISA检测试剂盒，最优选为双抗体夹心ELISA检测试剂盒。

以本发明所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体为抗体可以用于建立检测溶血性曼氏杆菌的免疫检测方法或试剂盒，尤其可以建立用于检测溶血性曼氏杆菌的双抗体夹心ELISA检测方法或试剂盒，且此双抗体夹心ELISA检测方法或试剂盒具有高活性、高专一性和抗原无须事前纯化的优点。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种分泌溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，步骤如下：

1、溶血性曼氏杆菌plpE蛋白的原核表达及纯化：

1.1诱导表达融合蛋白

1.1.1转化

取1μLpET28b重组载体转化BL21(DE3)(pET28b重组载体的制备过程参照专利号为CN201811469487.2，公开日为2019年3月26日的中国专利)，pET28b重组载体中含有SEQ IDNO.1所示的溶血性曼氏杆菌plpe基因序列。42℃热击90s后冰上静置2min后涂布含有终浓度为30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上(LB固体培养基的配制方法：4gLB肉汤琼脂粉末用100mLddH₂O溶解，LB肉汤琼脂由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，货号A507003-0250)，37℃培养过夜。

1.1.2小试培养选择最佳的诱导条件

挑取表达菌株BL21(DE3)的单菌落于含有终浓度30μg/mL卡那霉素的LB培养基液体试管中(LB液体培养基的制备方法：25gLB肉汤用1L dd water溶解，LB肉汤由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，货号A507002-0250)37℃，220rpm过夜培养。

将培养的菌液按1:100的体积比分别接种于3个4mLLB液体培养基中，添加30μg/mL卡那霉素，37℃，220rpm培养。

当OD值达到0.6左右时，在2个LB液体培养基中分别添加终浓度为0.5mM的IPTG；组1在220rpm，20℃下诱导过夜；组2在220rpm，37℃下诱导4h；未加IPTG诱导剂的作为阴性对照，记为组3。

将组1、组2和组3在4000rpm离心10min，分别收集菌体，弃上清；菌体分别用500μLPBS(PH7.4)缓冲液悬浮，超声破碎6min，超声破碎0.5s停1.5s，分别离心收集组1、组2和组3中的上清和沉淀，沉淀用500μL包涵体溶解液(包涵体溶解液含有8M Urea，50mM Tris-HCl，150mM NaCl，PH8.0)溶解，分别取40μL样品和10μL 5×protein loading buffer混匀，沸水浴10min。

SDS-PAGE检测，准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液(Tris30g，甘氨酸144.0g，SDS 10g，定容至1L)，上样量10μL，浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min，凝胶电泳结束考染20min，脱色，结果如图1所示，在图1中，M表示Protein Marker；1表示组3中的诱导前总蛋白；2表示组1中得到的20℃诱导得到的上清；3为组1中的20℃诱导得到的沉淀；4表示组2中37℃诱导得到的的上清；5为组2中37℃诱导得到的沉淀。

由图1可以得出，第4泳道中显示有明显表达的约40KD的条带，进而在37℃的条件下诱导表达溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白。

1.1.3大量诱导表达融合蛋白

将培养的菌液按1:100比例接种于4L的LB液体培养基中，添加30μg/mL卡那霉素，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mM IPTG，37℃，220rpm，诱导4h，离心收集细胞菌体。

1.2目的蛋白的纯化

1.2.1超声破碎菌体

将步骤1.1.3收集的细菌菌体用破碎Buffer(50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率400W，20min(超声2S，暂停6S为一个循环)。

超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，弃上清，沉淀用Buffer(8M尿素，50mMTris，300mMNaCl，0.1％TritonX-100，pH8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率400W，20min(超声2S，暂停6S为一个循环)。

超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，收集上清，进行下一步纯化。

1.2.2镍琼脂糖亲和层析

取5mLNi-NTA，用10倍柱床体积的Bindingbuffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。

将步骤1.2.1收集的上清上柱，流速为2mL/min，收集穿透液。

10倍柱床体积的Bindingbuffer清洗柱子，流速10mL/min。

分别采用含有20mM、50mM和100mM咪唑Washbuffer洗杂，流速5mL/min，收集洗脱液。

Elutionbuffer洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液。

注：Bindingbuffer含有8M尿素，50mMTris，300mMNaCl和0.1％TritonX-100，pH8.0；

含有20mM的Washbuffer含有8M尿素，50mMTris，300mMNaCl和20mM咪唑，pH8.0；

含有50mM的Washbuffer含有8M尿素，50mMTris，300mMNaCl和50mM咪唑，pH8.0；

含有100mM的Washbuffer含有8M尿素，50mMTris，300mMNaCl和100mM咪唑，pH8.0；

Elutionbuffer含有8M尿素，50mMTris，300mMNaCl和500mM咪唑，pH8.0。

将收集到的组分进行SDS-PAGE检测，如图2所示，在图2中，M表示Protein marker；1表示上样；2表示流出；3表示含有20mM咪唑洗脱液的洗脱组分；4-5表示含有50mM咪唑的洗脱液的洗脱组分；6-7表示含有100mM咪唑的洗脱组分。

由图2可以得出：采用含有50mM咪唑的洗脱液的洗脱组分(泳道5)纯度最好。

将纯度较好的组分5透析到pH值为7.4的1×PBS缓冲液中，16h后换一次Buffer继续透析4h，0.45μmCA滤膜过滤分装1mL/管，-80℃保存。

1.2.3纯化蛋白的检测

1.2.3.1SDS-PAGE检测

将组分5进行SDS-PAGE检测，具体步骤为：准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液，上样量1μg，浓缩胶80V 20min，分离胶120V60min，凝胶电泳结束后进行考马斯亮蓝染色20min，脱色。结果如图3所示，在图3中，M表示Protein marker；1表示溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白。

1.2.3.2Western blot检测

将组分5进行Western blot检测，具体步骤如下：

制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶：浓缩胶5％分离胶12％

制样：上样量：1ug。

电泳：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60min。

转膜：湿转，250mA 90min。

封闭：5％的脱脂奶粉，37℃缓慢振荡2h。

孵育一抗：一抗为兔抗his标签，抗体公司：Sangon Biotech,编号：D110002，1:500稀释，37℃缓慢振荡60min。

孵育二抗：二抗为羊抗兔，抗体公司：Sangon Biotech,编号：D110058，1:8000稀释，37℃缓慢振荡60min。

显色：TMB显色。结果如图4所示，在图4中，M表示Protein marker；1表示溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白。

由图3～4可以得出，融合蛋白经镍琼脂糖亲和层析后，SDS-PAGE电泳分析和Westernblot检测在40KD位置均出现明显条带，表明溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白成功得到了纯化。

1.2.4溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白浓度的测定

采用非干扰型蛋白浓度测定试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：SK3071)按照说明书测定溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的浓度，结果如表1和图5所示，由表1和图5可以得出，溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白浓度的为1.05mg/mL，BSA浓度为2mg/mL，测定蛋白体积为20μL。

表1溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白浓度测定中间值

由以上结果，可以得出，本发明成功获得了纯化的溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白，溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示。

2、动物免疫

鼠抗原免疫

取6周龄雌性BALB/c小鼠四只进行免疫(体重大约18～22g)，分别编号为M1、M2、M3和M4。共进行三次免疫，采取皮下多点注射。每次每只小鼠溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白免疫用量为25μg；

初次免疫用溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白等体积的弗氏完全佐剂乳化后通过皮下多点注射进行免疫；

28天后进行第二次免疫，第二次免疫用溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，通过皮下多点注射进行免疫；

28天后进行第三次免疫，第三次免疫用溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白等体积的生理盐水乳化后，通过腹腔注射进行免疫；

第三次免疫后7天尾静脉采血，通过间接ELISA检测方法测血清中的抗体效价，确定四只小鼠是否有针对目标的抗体生成，结果如表2所示，其中检测原为溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白，包被浓度为1μg/mL。

表2四只小鼠第三次免疫后血清中抗体的效价

动物编号	100	1K	3K	9K	27K	81K	243K	阴性对照	效价	免疫进度
											M1	2.252	2.317	2.228	1.906	1.418	0.480	0.243	0.111	1:81000	三免
M2	2.360	2.156	2.116	1.928	1.685	0.891	0.339	0.127	1:81000	三免
											M3	2.517	2.357	2.284	2.158	1.868	0.949	0.379	0.123	1:81000	三免
M4	2.456	2.224	2.128	2.115	2.029	1.328	0.555	0.117	1:243000	三免

备注：100表示免疫后血清被PBS按照1:100进行稀释，1K表示免疫后血清被PBS按照1:1000进行稀释，以此类推。

比较四只小鼠效价，最后选择M4小鼠用于细胞融合，融合前三天，进行加强免疫，加强免疫的时间也为第三次免疫后的第14天。

加强免疫用溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白等体积的生理盐水混合，腹腔注射，得到免疫后小鼠。

3、溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

3.1骨髓瘤细胞的复苏

从液氮中取出冻存从液氮中取出冻存骨髓瘤细胞S/P20，立即放入37℃水浴中融化，离心，弃上清，用少量完全培养液(RPMI1640培养基(+10％胎牛血清))打散细胞团，加入约5mL完全培养基于冻存管中，用吸管吹打均匀，全部吸出转至细胞培养瓶中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养。待细胞长满瓶底后传至另一细胞瓶中培养，在倒置显微镜下观察其细胞状态，当细胞浓度适宜约80％融合度、外形良好的情况下表示细胞状态良好，备做融合用。

3.2免疫脾细胞的制备

步骤2中得到的免疫后小鼠，眼球摘除采血，分离血清作为检测时的阳性对照血清。

将小鼠颈椎脱臼致死，浸泡于酒精消毒，移入超净工作台内，固定于解剖板上，用灭菌剪刀、镊子分别剪开左侧皮肤和腹膜，无菌取出脾脏置于已盛有基础培养液(RPMI1640培养基(无血清))的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入另一盛约有10mL的基础培养液(RPMI1640培养基(无血清))的平皿内的滤膜中，用两个注射器上的弯针头将脾脏刺孔，然后其中一个弯针头固定滤膜，另一个弯针头挤压滤膜，使脾细胞完全释放到平皿中的基础培养液中。用无菌滴管吹打细胞制成单细胞悬液，收获脾细胞悬液。将平皿中脾细胞悬液转移到离心管中，离心，弃上清，用无血清细胞培养液(RPMI1640培养基)离心洗涤一次，得到免疫脾细胞。

3.3细胞融合

用体积浓度为50％的PEG4000将分离得到的脾细胞与提前复苏备用的骨髓瘤细胞进行融合，离心，弃上清，用细胞培养液离心洗涤一次，加入HAT细胞培养液吹打成单细胞悬液，铺入96孔细胞培养板。

3.4阳性杂交瘤细胞的筛选

细胞融合后第7天，培养板孔底长出肉眼可见的克隆，首先通过ELISA间接法对所有细胞孔进行初次筛选，记录呈现强阳性的细胞孔。对初筛呈阳性的各细胞孔应及时在24孔细胞培养板中进行扩大培养和克隆化。

3.5阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法将含有阳性杂交瘤细胞的细胞悬液连续稀释至统计上每孔加样仅含单个细胞，转移至96孔板培养，经过数次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100％时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，即获得分泌溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，共得到阳性单克隆杂交瘤细胞株28株。

将获得的分泌溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞在细胞培养瓶中扩大培养，而后冻存及制备腹水等。

实施例2

一种溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的制备方法，步骤如下：

1阳性单克隆杂交瘤细胞株单克隆抗体特性鉴定

1.1阳性单克隆杂交瘤细胞株单克隆抗体亚类鉴定

委托生工生物工程(上海)股份有限公司对28株阳性单克隆杂交瘤细胞株单克隆抗体特性进行测定，

结果如表3所示：

表3单克隆抗体的类型鉴定结果

由表3可以得出，制备得到的28株阳性单克隆杂交瘤细胞株，22株为IgG类抗体细胞株。

1.2阳性单克隆杂交瘤细胞株单克隆抗体的效价测定

采用间接ELISA方法对步骤1.1中得到的阳性单克隆杂交瘤细胞株单克隆抗体进行抗体效价测定，结果如表4所示。

表4阳性单克隆抗体细胞株的抗体效价检测结果

由表4可以得出，克隆号为5D5 G4 D6的单克隆抗体的效价最高，即得到溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体细胞株。

2小鼠腹水的制备

取6周龄健康雌性小鼠，腹腔注射0.5mL液体石蜡致敏，一到两周后，小鼠腹腔注射(1～2)×10⁶个实施例2中筛选的克隆号为5D5 G4 D6的杂交瘤细胞，观察小鼠状态7～10天后待小鼠腹腔明显膨大后收集腹水，离心上清液即为腹水，分装、标记，备用。

3单克隆抗体的纯化

将步骤2中得到的腹水离心15min(4000rpm，室温)，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH值为7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至饱和硫酸铵的质量分数为33％，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS缓冲液(0.01M，pH值为7.4)，在PBS缓冲液(0.01M，pH值为7.4)中4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。

硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5mL超纯水过柱，再用5mL 0.4M PB缓冲液(pH值为7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10mL 0.4M PB缓冲液(pH为7.0)平衡纯化小柱；5mL0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH为2.7)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH值为8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。

实施例3

溶血性曼氏杆菌特异性试验

溶血性曼氏杆菌与相关细菌交叉反应试验

以PLPE纯化蛋白为包被抗原，以0.25mg/mL的抗原包被浓度包被酶标板，分别以本发明中制备的PLPE蛋白单克隆抗体(5D5 G4 D6)和多杀性巴氏杆菌阳性血清、链球菌阳性血清、绵羊肺炎支原体阳性血清(以巴氏杆菌、链球菌、绵羊肺炎支原体分别免疫BALB/c小鼠获得的阳性血清)为一抗，羊抗鼠IgG为二抗(天津三箭生物技术有限公司，货号：LK2003)，并设置阴性血清对照，采用间接ELISA方法检测溶血性曼氏杆菌与相关细菌交叉反应情况，见下表5：

表5采用间接ELISA方法检测溶血性曼氏杆菌与相关细菌交叉反应结果

溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体蛋白免疫印记试验

以PLPE纯化蛋白于SDS-PAGE胶板上样，以PLPE蛋白单克隆抗体(5D5G4 D6)为一抗，羊抗鼠IgG为二抗(天津三箭生物技术有限公司，货号：LK2003)，进行WesternBlot试验，结果见图6：

由图6可以得出，经WesternBlot试验可见，X光片上出现单一条带，表明所得溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体可以与溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白特异性结合，溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体可以特异性识别溶血性曼氏杆菌。

由以上实施例可以得出：本发明提供的溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体专一性和特异性均较强，均可实现溶血性曼氏杆菌的有效免疫检测。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种分泌溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

对所述阳性杂交瘤细胞进行克隆化，直至克隆化装置中克隆化细胞的阳性率为100％，得到所述杂交瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述免疫包括：依次进行第一次免疫、第二次免疫、第三次免疫和加强免疫，每一次免疫时，所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白的用量均为20～50μg/只。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一次免疫的佐剂为弗氏完全佐剂，所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白和弗氏完全佐剂的体积比为1：1～3；

所述第三次免疫的佐剂为生理盐水，所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白和生理盐水的体积比为1：1～3；

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述第一次免疫与第二次免疫的间隔时间为28天，所述第二次免疫与第三次免疫的间隔时间为28天，所述第三次免疫和加强免疫的间隔时间为14天。

5.一种分泌溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，采用权利要求1～4任一项所述的制备方法制备得到。

6.一种溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体，其特征在于，由权利要求5所述的杂交瘤细胞分泌产生。

7.权利要求6所述的溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，在致敏的动物腹腔中接种权利要求5所述的杂交瘤细胞，7～10天后，收集腹水和纯化，得到所述溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述杂交瘤细胞的接种数量为(1～2)×10⁶个/只。

9.权利要求6所述的溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体或权利要求7～8任一项所述的制备方法制备得到的溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白单克隆抗体在制备检测溶血性曼氏杆菌的免疫检测试剂盒中的应用。