CN109517832A - 溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒 - Google Patents

溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒 Download PDF

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CN109517832A CN201811469487.2A CN201811469487A CN109517832A CN 109517832 A CN109517832 A CN 109517832A CN 201811469487 A CN201811469487 A CN 201811469487A CN 109517832 A CN109517832 A CN 109517832A
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Abstract

本发明提供了溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，属于基因工程领域。本发明首次将溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白构建入原核表达载体中，得到溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白的原核表达载体，通过重组表达得到检测溶血性曼氏杆菌的抗原标志物‑PlpE蛋白，且表达的PlpE蛋白经Western Blot分析得到47KDa的目的条带。实验表明，以PlpE蛋白为抗原与大肠杆菌、链球菌、肺炎支原体三种细菌阳性血清进行免疫反应，结果发现均表现为阴性。这说明本发明提供的溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白具有良好的特异性，能够用来作为抗原标志物检测溶血性曼氏杆菌。

Description

溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶 血性曼氏杆菌的试剂盒
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒。
背景技术
溶血性曼氏杆菌原名溶血性巴氏杆菌，是一种革兰氏阴性，不运动，无芽孢，氧化酶阳性，瑞士染色两极着色的兼性厌氧球杆状菌。在血液琼脂上，新分离的菌落呈微弱的β溶血。基于发酵阿拉伯糖和海藻糖的能力进一步分为两个不同的生物型(A，T)。十二个A生物型(血清型1、2、5、6、7、8、 9、12、13、14、16、17)和四个T生物型(血清型3、4、10、15)已被鉴定。溶血性曼氏杆菌是一种严重危害家畜养殖业的人畜共患病，临床上可以导致牛羊出血性败血症等危害严重的病症。一般认为它是家畜家常带内源性病菌，当饲养环境不卫生，加上由于天气的突变、寒冷、闷热、潮湿拥挤、饲养营养缺乏、饲料突变、长途运输等诱因，动物产生应激反应，机体抵抗力降低，病菌可乘机侵入机体内，经淋巴进入血液，发生内源性感染。
溶血性曼氏杆菌的检测和预防通常根据溶血性曼氏杆菌发病机理给出治疗方案，例如，溶血性曼氏杆菌含有多种毒力因子，细菌的加墨在细菌的黏附和侵入上扮演重要角色，外膜蛋白对激发机体的保护免疫应答具有重要作用，同时脂多糖和白细胞毒素能够保证溶血性曼氏杆菌能够逃避呼吸道黏膜对细菌的清楚作用，越过宿主屏障，在肺部增殖，裂解肺泡巨噬细胞和嗜中性粒细胞加强肺的损伤。基于此，公开号为CN101014698A的专利公开了一种作为多种疫苗候选物的保守性内核脂多糖表位，通过分离脂多糖上表达的保守内核寡糖表位作为疫苗用于所述菌感染的治疗。但是目前现有技术中没有关于给出有效果检测溶血性曼氏杆菌的抗原标志物及制备，因此，本领域还没有给出免疫检测的方法的来检测溶血性曼氏杆菌。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，本发明提供所述构建方法能够制备出免疫活性高的抗原。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：
1)以plp e-F、plpe-R为引物，以溶血性曼氏杆菌的总DNA为模板进行 PCR扩增，得到PlpE蛋白编码基因的PCR产物；
所述plp e-F具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述plp e-R具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)将所述PlpE蛋白编码基因的PCR产物和质粒载体分别进行NdeI’和 XhoI酶切，得到PlpE蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段；
3)将所述PlpE蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到连接产物；
4)将所述连接产物转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌 PlpE蛋白原核表达载体。
优选的，所述步骤1)中PCR扩增的程序如下：95℃5min；95℃30sec， 56℃30sec，72℃1min，30循环；72℃7min。
优选的，所述步骤1)中PCR扩增的体系如下：
plpE-F引物 2μl
plpE-R引物 2μl
总DNA 2μl
25mmol/LdNTP 1μl
10X pfu缓冲液 5μl
5μ/μl pfu高温聚合酶 0.4μl
ddH<sub>2</sub>O 补齐至50μl
优选的，所述步骤3)中连接的方法是采用T4连接酶进行连接。
优选的，所述连接的体系如下：酶切目的片段的体积为8μl，酶切载体 pET28b(+)的体积为4μl；10X T4 DNA连接酶缓冲液的体积为2μl，5U/μl T4 DNA连接酶的体积为1μl，ddH2O补充至20μl。
优选的，所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为1h。
优选的，所述步骤4)中转化的方法为42℃热激法。
本发明提供了一种用于检测溶血性曼氏杆菌的抗原，所述抗原为所述的方法构建的溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体经诱导表达的抗原。
本发明提供了一种基于间接ELISA法检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，包括以下组成：
包被有所述抗原的检测板；
抗血清；所述血清由所述抗原免疫动物得到；
酶标-山羊抗小鼠Ig G；
样品稀释液；
底物显色液；
洗涤液。
优选的，抗原包被浓度为250ng/m L～1mg/m L。
优选的，抗血清的的稀释倍数为10～100。
本发明提供了溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法，本发明首次将溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白构建入原核表达载体中，得到溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白的原核表达载体，通过重组表达得到检测溶血性曼氏杆菌的抗原标志物-PlpE蛋白，且表达的PlpE蛋白经Western Blot分析得到47KDa的目的条带。实验表明，以PlpE蛋白为抗原与大肠杆菌、链球菌、肺炎支原体三种细菌阳性血清进行免疫反应，结果发现均表现为阴性。这说明本发明提供的溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白具有良好的特异性，能够用来作为抗原标志物检测溶血性曼氏杆菌。
本发明提供了一种基于间接ELISA法检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，所述试剂盒是采用间接ELISA法进行检测。实验表明，48份血清的检测结果表明，相对于间接血凝试验结果而言，该试剂盒的特异性为94％，敏感性为 100％，符合率为95.8％。因此，本发明提供的试剂盒能够用于溶血性曼氏杆菌的检测，并且检测速度快，结果准确。
附图说明
图1为实施例1中plpE片段电泳图；
图2为实施例1中载体pET28b(+)酶切琼脂糖电泳图；
图3为实施例1中融合蛋白小试SDS-PAGE分析图；
图4为实施例1中目的蛋白镍琼脂糖亲和层析SDS-PAGE分析图；
图5为实施例2中目的蛋白SDS-PAGE分析图；
图6为实施例2中目的蛋白SDS-PAGE分析图；
图7为实施例2中目的蛋白浓度测定；
图8为实施例3中溶血性曼氏杆菌阴性血清S/P值分布图。
具体实施方式
本发明提供了溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：
1)以plp e-F、plpe-R为引物，以溶血性曼氏杆菌的总DNA为模板进行 PCR扩增，得到PlpE蛋白编码基因的PCR产物；
所述plp e-F具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述plp e-R具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)将所述PlpE蛋白编码基因的PCR产物和质粒载体分别进行NdeI’和 XhoI酶切，得到PlpE蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段；
3)将所述PlpE蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到连接产物；
4)将所述连接产物转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌 PlpE蛋白原核表达载体。
本发明以plp e-F、plpe-R为引物，以溶血性曼氏杆菌的总DNA为模板进行PCR扩增，得到PlpE蛋白编码基因的PCR产物。
在本发明中，所述溶血性曼氏杆菌的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的溶血性曼氏杆菌来源即可。本发明对所述DNA提取的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的DNA提取方法即可。
在本发明中，所述PCR扩增的程序优选如下：95℃5min；30循环，95℃ 30sec，56℃30sec，72℃1min；72℃7min。
在本发明中，所述PCR扩增的体系优选如下：
。
得到PlpE蛋白编码基因的PCR产物后，本发明将所述PlpE蛋白编码基因的PCR产物和质粒载体分别进行NdeI’和XhoI酶切，得到PlpE蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段。
在本发明中，所述PCR产物的酶切体系如下：
纯化回收好的片段 1μg(20μl)
10X FD缓冲液 5μl
NdeI’ 1μl(10μ/μl)
XhoI 1μl(10μ/μl)
ddH<sub>2</sub>O 23μl
在本发明中，所述PCR产物的酶切的程序为在37℃条件下反应2h。
在本发明中，所述质粒载体的酶切体系如下：
pET28b(+) 1μg
10X FD缓冲液 5μl
NdeI’ 1μl(10μ/μl)
XhoI 1μl(10μ/μl)
ddH<sub>2</sub>O 42μl
在本发明中，所述质粒载体的的酶切的程序为在37℃条件下反应2h。
本发明对所述NdeI’和XhoI酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的酶来源即可。本发明中，质粒载体优选为pET28b(+)。所述质粒载体购自长沙优宝生物科技有限公司。
得到PlpE蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段后，本发明将所述PlpE 蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到连接产物。
在本发明中，所述连接的方法优选是采用T4连接酶进行连接。所述连接的体系优选如下：述PlpE蛋白编码基因酶切片段的体积为8μl，载体酶切载体的体积为4μl；10X T4DNA连接酶缓冲液的体积为2μl，5U/μl T4 DNA连接酶的体积为1μl，ddH2O补充至20μl。所述连接的温度优选为22℃，所述连接的时间优选为1h。本发明对所述T4连接酶的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶来源即可。实施例中，所述T4连接酶购自Thermo ThermoScientific公司。
得到连接产物后，本发明将所述连接产物转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体。
在本发明中，所述转化的方法优选为42℃热激法。大肠杆菌的感受态优选为BL21(DE3)。本发明对所述大肠杆菌的感受态的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的大肠杆菌的感受态即可。在本发明实施例中，所述大肠杆菌的感受态购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
在本发明中，构建得到溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体后，为获得表达的抗原，还优选包括重组PlpE蛋白的诱导表达和分离纯化。
在本发明中，所述重组PlpE蛋白的诱导表达的方法优选包括以下步骤：
a.将溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体涂布含有终浓度为30μg/mL 卡那霉素的LB固体培养基上培养，长出单个菌落；
b.挑选单个菌落接种于添加30μg/mL卡那霉素的液体培养基中，37℃， 220rpm培养，得到菌液；
c.当所述菌液的OD值达到0.6时，向菌液中添加终浓度为0.5mmol/L的 IPTG，在220rpm和20℃条件下诱导培养，得到菌体；以37℃诱导4h，未加 IPTG诱导剂的作为阴性对照；
d.收集所述菌体，将所述菌体用PBS缓冲液悬浮，超声破碎，得到沉淀和上清液；
e.溶解所述沉淀后添加蛋白质下沉缓冲液混匀，将得到的混合物在沸水浴下保持10min，用SDS-PAGE检测重组表达蛋白。
在本发明中，所述溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白的分离纯化，优选包括以下步骤：
①将上述诱导表达方案中得到的上清液经镍琼脂糖亲和层析，收集洗脱液；
②将所述洗脱液透析和滤膜过滤，得到滤液中是纯化的蛋白。
本发明中，所述镍琼脂糖亲和层析时Binding buffer洗柱的流速5mL/min。所述上清液上柱的流速为2mL/min。
本发明提供了一种基于间接ELISA法检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，包括以下组成：
包被有抗原的检测板；所述抗原为所述的方法构建的溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体表达的抗原；
抗血清；所述血清由所述抗原免疫动物得到；
酶标-山羊抗小鼠Ig G；
样品稀释液；
底物显色液；
洗涤液。
本发明提供的试剂盒包括包被有抗原的检测板，所述抗原为上述技术方案所述的方法构建的溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体表达的抗原。所述抗原包被浓度优选为250ng/mL。本发明对所述包被方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的包被方法即可。所述包被有抗原的检测板进行封闭。所述封闭用封闭液优选为质量浓度为5％的脱脂奶粉。
本发明提供的试剂盒包括抗血清；所述血清由所述抗原免疫动物得到。抗血清的稀释倍数优选为10～100倍，更优选为50倍。所述抗血清的作用时间优选为60min。
本发明提供的试剂盒包括样品稀释液。所述样品稀释液优选为pH值为 9.6的碳酸盐缓冲液。
本发明提供的试剂盒包括酶标-山羊抗小鼠Ig G。所述酶标二抗的工作浓度为1:20000，作用时间为30min。
本发明提供的试剂盒包括底物显色液。当酶标-山羊抗小鼠Ig G中酶为 HRP时，所述底物显色液为TMD显色液。所述底物显色液的作用时间优选为20min。
本发明提供的试剂盒包括洗涤液。所述洗涤液为PBST缓冲液；所述PBST 缓冲液为包含体积浓度为0.1％Tween20的PBS溶液。
所述试剂盒的使用方法同常规的间接ELISA试剂盒的使用方法。
下面结合实施例对本发明提供的溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.目的片段plpE扩增
1.1引物
引物 序列
plp e-F cgc<u>catatg</u>ggaggaagcggtagcg(SEQ ID No.1)
plpe-R ccg<u>ctcgag</u>ttattttttctcgctaac(SEQ ID No.2)
下划线处为酶切位点NdeI和XhoI
1.2扩增体系
PCR反应采用的是pfu高温聚合酶。
PCR各个成分的用量：(引物浓度为1OD溶于400μl ddH2O)。
上游引物plpE-F 2μl
下游引物plpE-R 2μl
细菌总DNA 2μl
dNTP 1μl(25mMeach)
10X pfu Buffer 5μl
Pfu 0.4μl(5μ/μl)
ddH<sub>2</sub>O 补齐至50μl
1.3 PCR程序：
1.4完成后进行电泳，如图1。目的条带为1023bp。
1.5回收纯化好的片段备用酶切
所用为生工产的PCR纯化试剂盒
2.目的片段和载体的酶切
2.1将上述PCR产物进行酶切
1)、PCR产物片段酶切体系50μl
纯化回收好的片段 1μg(20μl)
10X FD Buffer 5μl
NdeI’ 1μl(10μ/μl)
XhoI 1μl(10μ/μl)
ddH<sub>2</sub>O 23μl
以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h。
2)、载体的酶切体系：
pET-28b(+) 1μg
10X FD Buffer 5μl
NdeI’ 1μl(10μ/μl)
XhoI 1μl(10μ/μl)
ddH<sub>2</sub>O 42μl
以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h
载体酶切电泳图如图2所示。其中图2中条带的大小为5369bp。
2.2回收酶切的载体和片段
3.目的片段与载体连接
3.1将回收纯化好的目的DNA片段和载体进行连接。
连接体系：20μl
酶切目的片段：8μl
酶切载体pET-28b(+)4μl
10X T4 DNAligase Buffer 2μl
T4 DNAligase 1μl(5μ/μl)
ddH2O补充至20μl
上述连接混合液放在22℃PCR仪1h即可
所用的连接酶为Thermo Thermo Scientific公司生产。
4.转化，筛选克隆
4.1转化
将上述连接液进行转化，转化采用42℃热激法进行，感受态菌株为TOP10。取1μlpET28b(+)重组载体转化BL21(DE3),42℃热击90s后冰上静置2min后涂布含有终浓度为30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，LB BorthAgar由生工提供，货号A507003-0250，使用时4g粉末用100mL ddH2O 溶解，37℃培养过夜。
实施例2
2小试培养选择最佳的诱导条件
◆挑取表达菌株BL21(DE3)的单菌落于试管中(4mL LB培养基，LB Borth 由生工提供，货号A507002-0250，使用时25g用1L ddH2O溶解。30μg/mL 卡那霉素)37℃，220rpm过夜培养。
◆将培养的菌液按1:100比例分别接种于4mL LB培养基中，添加 30μg/mL卡那霉素，37℃，220rpm培养。
◆当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，220rpm，分别20℃诱导过夜；37℃诱导4h，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。
◆4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，菌体用500μL PBS(PH7.4) 缓冲液悬浮，超声破碎6min，超0.5s停1.5s，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μL包涵体溶解液(8Murea，50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH值8.0)溶解，分别取40μL样品和10μL 5×proteinloading buffer混匀，沸水浴 10min。
◆SDS-PAGE检测，准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液(Tris 30g，甘氨酸144.0g，SDS10g，定容至1L)，上样量10μL，浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min，凝胶电泳结束考染20min，脱色。
2.1.3大量诱导表达融合蛋白
将培养的菌液按1:100比例接种于4L的LB液体培养基中，添加30μg/mL 卡那霉素，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mM IPTG，37℃，220rpm，诱导4h，离心收集细胞菌体。
2.2目的蛋白的纯化
2.2.1超声破碎菌体
◆将收集的细菌菌体用破碎缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0) 溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率400W，20min(超声2S，暂停6S为一个循环)。
◆超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，弃上清，沉淀用Bμffer(8M 尿素，50mMTris，300mM NaCl，0.1％TritonX-100，pH8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率400W，20min(超声2S，暂停6S为一个循环)。
◆超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，收集上清进行下一步纯化。
2.2.2镍琼脂糖亲和层析
◆取5mLNi-NTA，用10倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。
◆上柱，流速为2mL/min，收集穿透液。
◆10倍柱床体积的Binding buffer清洗柱子，流速10mL/min。
◆Washbuffer洗杂，流速5mL/min，收集洗脱液。
◆Elutionbuffer洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液。
注：Binding buffer(8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，0.1％TritonX-100，pH8.0)
Wash buffer(8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，20/50/100mM Imidazole， pH值为8.0)
Elutionbuffer(8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，500mM Imidazole， pH8.0)
将收集到的组分进行SDS-PAGE检测，见图二，将纯度较好的3/5/6组分透析到1×PBS，pH＝7.4中，16h后换一次Bμffer继续透析4h，0.45μm CA 滤膜过滤分装1mL/tube，-80℃保存。
2.2.4纯化蛋白的检测
2.2.4.1 SDS-PAGE检测
量1μg，浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min，准备12％的SDS-PAGE， Tris-Gly电泳缓冲液，上样凝胶电泳结束后进行考马斯亮蓝染色20min，脱色。
2.2.4.2 Westernblot检测
◆制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶：浓缩胶5％，分离胶12％；
◆制样：上样量：1μg。
◆电泳：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60min。
◆转膜：湿转，250mA 90min。
◆封闭：5％的脱脂奶粉，37℃缓慢振荡2h。
◆孵育一抗：一抗为兔抗his标签，抗体公司：Sangon Biotech,编号： D110002，1:500稀释，37℃缓慢振荡60min。
◆孵育二抗：二抗为羊抗兔，抗体公司：Sangon Biotech，编号：D110058， 1:8000稀释，37℃缓慢振荡60min。
◆显色：TMB显色。
(三)、实验结果
3.1融合蛋白诱导结果
通过2.1.2步骤小试样品进行SDS-PAGE分析，结果图3所示，其中 M:ProteinMarker；1：诱导前总蛋白；2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀。
结果分析：由SDS-PAGE图可以看出，在37℃上清中有明显表达。
3.2目的蛋白镍琼脂糖亲和层析结果
SDS-PAGE分析结果表明，经不同浓度咪唑洗脱后，50mM Imidazole洗脱组分(泳道5)纯度最好(图4)。其中图4中，M：Protein marker；1：上样；2：流出；3:20mM Imidazole洗脱组分；4-5：50mM Imidazole洗脱组分； 6-7：500mM Imidazole洗脱组分。
3.3目的蛋白SDS-PAGE分析
融合蛋白经镍琼脂糖亲和层析后，SDS-PAGE电泳分析在相应位置出现明显条带(图5)，表明融合蛋白成功得到了纯化。其中图5中，M：Protein marker；1：目的蛋白。
3.5目的蛋白WesternBlot分析
按照Westernblot实验步骤用TMB显色试剂盒显色，Western Blot分析在相应位置出现明显条带(图6)。图6中M：Prestained protein marker；1：目的蛋白。
3.6目的蛋白浓度测定
用SK3071非干扰型蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白，测定融合蛋白浓度为1.05mg/ml，BSA浓度为2mg/ml，测定蛋白体积为20μl，结果如图7所示，测定结果见表2-1。
表2-1测定蛋白浓度一览表
测试1 测试2 平均值 BSA(μg)
0.549 0.562 0.5555 50
0.646 0.654 0.65 40
0.791 0.782 0.7865 24
0.827 0.837 0.832 16
0.888 0.887 0.8875 8
0.946 0.936 0.941 0
0.873 0.87 0.8715 目的蛋白
(四)、实验结论
经以上实验过程，成功纯化出目的蛋白。
实施例3
以溶血性曼氏杆菌PLPE蛋白为包被抗原检测溶血性曼氏杆菌的间接 ELISA检测方法。
二、实验方案
1材料
1.1抗原
间接ELISA抗原PLPE重组蛋白由本课题组表达和纯化。纯化后抗原浓度为1mg/m L左右。
1.2动物血清
溶血性曼氏杆菌大鼠标准阳性血清、标准阴性血清、大肠杆菌、链球菌、绵羊肺炎支原体3种羊阳性血清均为本课题组保存。
1.3其他试剂
HRP-山羊抗小鼠Ig G购于华美生物工程公司，四甲基联苯胺(TMB)购于天根生化科技有限公司，ELISA试验用96孔板条购于宝生物工程(大连) 有限公司。
2方法
将ELISA重组抗原用0.05mol/L、pH值为9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释成一定倍数，包被反应板，每孔100μL，置4℃冰箱过夜；次日甩掉包被液，用PBST洗涤反应板，再用8道移液器加入封闭液200μL/孔，37℃1小时；取出加PBST洗板；用稀释液按一定倍数稀释血清，每孔加100μL，37℃作用一定时间，用洗液洗板；取稀释的二抗液，每孔100μL，37℃作用1小时，洗涤同前；取TMB底物液每孔加100μL，室温作用一定时间，用2mol/L H2SO4终止反应；用酶标仪在波长450nm处测定每孔内降解物的吸收值(A)值，每个样品每次平行2孔，取其平均值。
2.1包被抗原的制备
将含有质粒plpE-pET-28b的大肠杆菌在含有100μg/m L卡那霉素的LB 平板上划线，37℃培养过夜后挑取单个菌落，接种于100μg/m L卡那霉素的 LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。将此菌作为菌种液，以1：100的比例接种于新鲜的100μg/m L卡那霉素的LB液体培养基中，置于摇床中37℃振摇培养至A600为0.6(大约4h)加入终浓度为1m M的IPTG，继续培养 4h，常规方法收集菌体，将沉淀悬浮于PBS中，经超声波裂解细胞，收集上清，将上清通过0.45μm滤膜，过滤去除杂质。然后将处理好的细菌诱导裂解样品经GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱纯化。分光光度仪测定纯化的蛋白浓度为1mg/m L。
2.2判定标准的确定
在已经确定的间接ELISA条件下，对经间接血凝试验检测抗体阴性的20 份羊血清，用重组抗原包被的酶标板进行A450的测定，结果进行统计学分析，将x+3s作为溶血性曼氏杆菌阳性临界值，x+2s作为阴性临界值，确定判定标准。
2.3特异性试验
2.3.1交叉反应试验
用已建立的间接ELISA方法对大肠杆菌、链球菌、肺炎支原体3种羊阳性血清进行检测，每种血清做3个重复，同时做阴阳性对照，确定重组抗原与其它羊细菌阳性血清之间是否发生交叉反应。
2.3.2阻断试验
取1份阳性血清和1份阴性血清，各作两份倍比稀释，其中一份的每个稀释度与最适工作浓度的重组抗原37℃作用1h，另一份稀释的阴阳性血清作为对照，按照所建立的间接ELISA方法进行试验。
2.3.3敏感性试验
将标准阳性血清从1:200开始进行倍比稀释，按间接ELISA程序进行测定，依据已确定的判定标准，A450值判定为阳性时的最高稀释倍数即为抗体检出最低效价。
2.3.4稳定性试验
2.3.4.1批内重复试验
用同一批制备的重组蛋白分别在1周、2周、3周、4周、5周、6周时，包被反应板，检测4份溶血性曼氏杆菌抗体水平不同的血清，每份血样每个时间点做3个重复。在使用同一批蛋白包被的ELISA试验中，除包被时间点不同外，其余反应条件相同，按间接ELISA程序测定，对测定结果进行统计学分析。
2.3.4.2保存期试验
用重组蛋白包被酶标板，用5％脱脂奶粉封闭液封闭并洗涤后，分成两份，分别保存于2℃～8℃和-20℃。标准阳性血清保存液、标准阴性血清保存液、酶标抗体保存液和它们各自的工作液保存于-20℃。20×PBST保存于2℃-8℃。分别于30d、60d、90d、120d、150d后取出一部分进行试验，与新包被板进行比较，每次试验重复8孔。得出的数值进行t检验。
2.3.5对比试验
按已经建立的间接ELISA方法与间接血凝试验抗体检测结果分别平行测定48份血清样本，计算S/P值,确定检测结果并进行比较。计算建立的诊断方法对间接血凝试验的特异性、敏感性和符合率。
符合率＝(自制试剂盒检测已知阳性血清中阳性份数+自制试剂盒检测已知阴性血清中阴性血清份数)/(参照间接血凝检测阳性份数+参照间接血凝检测阴性份数)
敏感性＝自制试剂盒检测已知阳性血清中阳性份数/参照间接血凝检测阳性份数
特异性＝自制试剂盒检测已知阴性血清中阴性血清份数/参照间接血凝检测阴性份数
2.3.6间接方法的初步运用
用建立的间接ELISA方法，检测保存的53份血清样品，计算样品溶血性曼氏杆菌抗体阳性率。
3结果
3.1判定标准确定
取20份经间接血凝实验检测为阴性的羊血清，按间接ELISA步骤进行试验。以样品号为横坐标，以阴性血清S/P值为纵坐标，得到溶血性曼氏杆菌阴性血清的S/P数值分布图(图8)。可以观察到这些样品的S/P值主要分布在 0-0.05之间，占血清样品的85％,数据分布合理，可以作为制定判定标准的依据。
这些数据经统计学处理，样品平均值和标准差分别为x＝0.0.168与 s＝0.081，得到置信区间上限x+3s＝0.411，因而把0.411作为溶血性曼氏杆菌阴性血清的下限；x+2s＝0.33定为可疑界限，因而把0.33作为溶血性曼氏杆菌阴性血清的上限；根据统计学原理，S/P≥x+3s时，可以在99.9％的水平上判定为阳性。因此，我们得出间接ELISA判定标准，在标准阳性阴性血清之积差大于2.5时，即阴阳性对照成立的情况下，血清样品A值≥0.411者判为阳性，血清样品A值<0.33者判为阴性。介于0.411和0.33之间的血清样品重新检测。
S/P＝(样品血清A值－标准阴性血清A值)/(标准阳性血清A值－标准阴性血清A值)
3.2特异性试验结果
3.2.1交叉反应试验结果
用已建立的间接ELISA方法对大肠杆菌、链球菌、肺炎支原体三种细菌阳性血清进行检测的结果见表3-1。结果表明：上述血清均为阴性，说明制备的溶血性曼氏杆菌抗原与上述病原无交叉反应，表现了很好的特异性。
表3-1交叉反应试验结果
3.2.2阻断性试验结果
阻断性试验结果见表3-2，可以看出各稀释度的阳性血清与重组抗原反应后A值下降明显，与阴性血清逐渐相近；随着血清稀释倍数增加，阳性血清 A值逐渐降低，而阴性血清处理前后A值几乎无变化，这表明表达抗原具有良好的特异性。
表3-2阻断性试验结果
3.3敏感性试验结果
将标准阳性血清从1:200开始进行倍比稀释，进行间接ELISA测定，得出标准阳性抗体稀释1:3200时，结果为阴性，见表3-3，表明本方法敏感性较高。
表3-3敏感性试验结果
3.4稳定性试验结果
3.4.1批内及批间重复试验结果
4份血清进行6次重复性实验结果显示A450平均值稳定，经统计学分析，变异系数从1.4％～9.6％，均小于10％，显示同一批抗原具有良好的稳定性，ELISA试验批内重复性良好(表3-4)。
表3-4批内重复试验结果
3.4.2保存期试验结果
包被好的酶标板、酶标二抗、血清等在-20℃条件下保存，5个月后与新包被的酶标板A450值无明显区别，而在2℃-8℃下保存，第4个月时保存的酶标板与新包被的酶标板相比，A450明显降低，呈现显著差异(表3-5)。
表3-5保存期试验结果
判定标准：P＜0.05为差异显著。
3.5对比试验结果
重组蛋白建立的间接ELISA诊断方法与间接血凝试验检检测结果比较如表3-6。48份血清的检测结果表明，相对于间接血凝试验检而言，该诊断方法的特异性为94％，敏感性为100％，符合率为95.8％(表3-6)。
表3-6重组蛋白间接ELISA方法与间接血凝试验检测结果比较
3.6间接ELISA方法的初步应用
应用建立的诊断方法对53份血清样品进行检测，结果发现53份血清样品中有6份阳性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 内蒙古自治区农牧业科学院
<120> 溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgccatatgg gaggaagcgg tagcg 25
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgctcgagt tattttttct cgctaac 27

Claims (10)

1.溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：
1)以plp e-F、plpe-R为引物，以溶血性曼氏杆菌的总DNA为模板进行PCR扩增，得到PlpE蛋白编码基因的PCR产物；
所述plp e-F具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述plp e-R具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)将所述PlpE蛋白编码基因的PCR产物和质粒载体分别进行NdeI’和XhoI酶切，得到PlpE蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段；
3)将所述PlpE蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到连接产物；
4)将所述连接产物转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR扩增的程序如下：95℃5min；30循环，95℃30sec，56℃30sec，72℃1min；72℃7min。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR扩增的体系包括如下组分：
plpE-F引物 2μl plpE-R引物 2μl 总DNA 2μl 25mmol/LdNTP 1μl 10Xpfu缓冲液 5μl 5μ/μlpfu高温聚合酶 0.4μl ddH<sub>2</sub>O 补齐至50μl。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中连接的方法是采用T4连接酶进行连接。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述连接的体系包括如下组分：酶切目的片段的体积为8μl，酶切质粒载体的体积为4μl；10X T4DNA连接酶缓冲液的体积为2μl，5U/μl T4DNA连接酶的体积为1μl，ddH2O补充至20μl。
6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为1h。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中转化的方法为42℃热激法。
8.溶血性曼氏杆菌的检测抗原，其特征在于，所述抗原为权利要求1～7任意一项所述的方法构建的溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白原核表达载体经诱导表达的抗原。
9.一种基于间接ELISA法检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，其特征在于，包括以下组成：
包被有权利要求8所述抗原的检测板；
抗血清；所述血清由所述抗原免疫动物得到；
酶标-山羊抗小鼠Ig G；
样品稀释液；
底物显色液；
洗涤液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原的包被浓度为250ng/mL～1mg/mL。
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