CN109507435A

CN109507435A - Grp78蛋白双抗夹心elisa法检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN109507435A
Application number: CN201811409460.4A
Authority: CN
Inventors: 汪德强; 黄爱龙; 阳媛; 夏露露; 师悦嫄; 魏杰
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2019-03-22

Abstract

本发明提供一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA法检测试剂盒，包括兔多克隆抗体、腹水型单克隆抗体、标准品GRP78蛋白、HRP标记的山羊抗兔IgG、显色液、终止液、封闭液和洗涤液。本发明还提供一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA检测方法，通过制备效价高、特异性好、能识别人体内GRP78蛋白的多抗与单抗，选用GRP78单克隆抗体McAb‑1为捕获抗体，GRP78兔多抗作为检测抗体用于构建双抗夹心ELISA免疫学方法检测血清中GRP78，与其他ELISA方法相比，单克隆抗体与多克隆抗体双夹心，既保证了特异性又增加了灵敏度；同时又对构建的ELISA检测体系进行了方法学系统评估，试剂盒的特异性好，组间差异较小。

Description

GRP78蛋白双抗夹心ELISA法检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA 法检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

GRP蛋白(葡萄糖调节蛋白)，是位于ER的分子伴侣。已知是在如缺乏葡萄糖时，或高级结构发生异常的蛋白质蓄积于小泡(EP)内时，细胞响应来自细胞内外的各种ER压力而诱导表达的蛋白质家族。GRP78是分子量为78KDa的GRP蛋白，又被称为BiP(免疫球蛋白结合蛋白)。GRP78含有两个功能结构域：ATP酶催化活性所需的ATP结合结构域，可以结合水解ATP；底物结合结构域，属于延伸的多肽(Yang J,Nune M,Zong Y,et al.Close andAllosteric Opening of the Polypeptide-Binding Site in a Human Hsp70 ChaperoneBiP[J].Structure(London,England:1993)，2015， (23):2191-2203.)。GRP78在肿瘤细胞系中升高并且与肿瘤细胞增殖，迁移和侵袭性质相关，同时，它可以维持内质网蛋白的折叠功能，维持内质网压力传感器的平衡，以及参与调节肿瘤细胞无活性期内质网相关的凋亡机制，从而调节肿瘤细胞的存活、细胞凋亡和细胞稳态。此外，GRP78在乳腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞癌和前列腺癌等各种癌症细胞系和人类癌组织中，GRP78的高表达与恶性肿瘤、转移以及耐药相关。因此，GRP78的表达可以作为肿瘤行为和治疗反应的生物标志物，其表达与肿瘤的发生发展和分化有极密切的关系。作为一种潜在肿瘤标志物，开发一种准确、方便和经济的检测方法，对该指标的进一步临床应用具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种特异性强，灵敏度高，操作简便、检测快速的GRP78蛋白双抗夹心ELISA法检测试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA法检测试剂盒，包括兔多克隆抗体、腹水型单克隆抗体、标准品GRP78蛋白、HRP标记的山羊抗兔IgG、显色液、终止液、封闭液和洗涤液。

在一个实施方案中，本发明兔多克隆抗体由以下步骤制得：将GRP78 蛋白用于新西兰兔背部皮下多点免疫4-5周，颈动脉采血后分离血清，辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体后进一步DEAE离子交换层析法纯化得到兔多克隆抗体。

在一个实施方案中，本发明腹水型单克隆抗体由以下步骤制得：将稳定分泌抗GRP78单抗的杂交瘤细胞株复苏，用加入15％胎牛血清的IMDM 培养基培养杂家瘤细胞；用弗氏不完全佐剂腹腔注射预免疫雌性Balb/c小鼠，将杂交瘤细胞注射入Balb/c小鼠腹腔，每只杂交瘤细胞注射量控制在 1-5×10⁵个，一周后收集小鼠腹水；将收集的腹水低温离心除去细胞和碎片，然后用0.45μm滤器过滤，纯化，得到腹水型单克隆抗体。

在一个实施方案中，本发明检测试剂盒以腹水型单克隆抗体作为捕获抗体，以兔多抗作为检测抗体。进一步，捕获抗体优选单克隆抗体McAb-1。

在一个实施方案中，本发明检测试剂盒的封闭液选自5％脱脂奶粉、 5％BSA、2.5％BSA、1.25％BSA中的一种；每孔加样250ul，37℃恒温箱孵育，封闭时间为1-4h；酶标二抗孵育时间为37℃孵育20-60min，100ul/孔。进一步，本发明检测试剂盒的封闭条件确定为5％脱脂奶粉37℃封闭2h，酶标二抗孵育时间为37℃孵育40min。

在一个实施方案中，本发明显色液为TMB显色液，100ul/孔，37℃恒温箱避光孵育，终止液为2mol/L硫酸，50ul/孔，洗涤液为PBST千分之一 Tween20。

本发明第二目的在于提供一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA检测方法，该方法操作简便、检测快速，特异性强，灵敏度高。

一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA检测方法，按照双抗体夹心ELISA 测抗原的方式，采用棋盘方阵滴定，以腹水型单克隆抗体McAb-1作为捕获抗体，以兔多抗作为检测抗体，与羊抗兔酶标二抗反应后，获取OD450值；然后根据以下标准曲线回归方程计算GRP78蛋白浓度；

y＝0.263x-1.114，

其中，y为OD450值，x为GRP78重组蛋白浓度的自然对数。

具体的说，一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA检测方法，按照双抗体夹心ELISA测抗原的方式，采用棋盘方阵滴定；采用以下步骤：将单克隆抗体McAb-1作为捕获抗体分别稀释至10μg、5μg、2.5μg、1.25μg/ml，100ul/ 孔包被酶标板，4℃孵育过夜；洗涤液洗板4次后；加入封闭液250ul/孔， 37℃恒温箱孵育；再次洗板4次后；分别与梯度稀释的重组GRP78蛋白反应， PBS作为阴性对照，上样量100ul/孔，37℃恒温箱孵育1h后，洗板4次；然后加入不同稀释浓度的检测抗体(兔多抗)，稀释比例为1:1000、1:2000、 1:4000和1:8000，100ul/孔，37℃恒温孵育1h，洗板四次；再加入羊抗兔酶标二抗，稀释比例为1:10000、1:20000和1:30000，100ul/孔，37℃避光孵育20min、40min和1h后，洗板四次；再加入TMB显色液100ul/孔，37℃避光孵育20min后，加入终止液50ul/孔，立即检测OD450nm吸光度值。同时，反过来将兔多抗作为捕获抗体分别稀释至1:1000、1:2000、1:4000，包被酶标板，不同稀释浓度1:1000、1:2000、1:4000和1:8000的单克隆抗体McAb-1作为检测抗体，进行同样实验；获取OD450值；根据以下标准曲线回归方程计算GRP78蛋白浓度；

y＝0.263x-1.114，

其中，y为OD450值，x为GRP78重组蛋白浓度的自然对数。

有益效果

1、目前国内外检测GRP78的方法主要是通过PCR或者western blot定性检测GRP78基因或者蛋白表达变化，而血清GRP78的表达尚未得到明确的描述。本发明通过制备效价高、特异性好、能识别人体内GRP78蛋白的多抗与单抗，并利用制备的抗体建立双抗夹心ELISA免疫学方法，对血清中 GRP78蛋白提供一种高特异性与高敏感性相结合的定性检测方法。

2、一般来说，多抗识别位点更多更适合用来作为捕获抗体包被酶标板来捕获样品中的GRP78，但是发明人在研究过程中意外发现，单克隆抗体作为捕获抗体的效果明显比多抗要好，因此本发明选用了GRP78单克隆抗体 McAb-1为捕获抗体，GRP78兔多抗作为检测抗体。

3、本发明使用了效价高、稳定性好的GRP78兔多抗与腹水型鼠单抗，能同时特异性的识别原核表达GRP78重组蛋白与真核细胞GRP78，将获得的 GRP78多抗、单抗用于构建双抗夹心ELISA免疫学方法检测血清中GRP78，与其他ELISA方法相比，单克隆抗体与多克隆抗体双夹心，既保证了特异性又增加了灵敏度；同时又对构建的ELISA检测体系进行了方法学系统评估，试剂盒的特异性好，组间差异较小。

附图说明

图1是GRP78兔多抗DEAE纯化后SDS-PAGE电泳图，其中1.辛酸-硫酸铵沉淀后兔多抗，2.穿透液，3.洗脱液；

图2是ProteinG免疫亲和层析法纯化腹水型单克隆抗体图；

图3是GRP78腹水型单抗纯化后SDS-PAGE电泳图；

图4是GRP78抗体免疫组化染色效果图；

图5是双抗夹心ELISA法的标准曲线。

实施例

为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。要说明的是：以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制。本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。本发明所用原料与试剂均为市售产品。

材料与方法

材料

E.coli B834由重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室保存；蛋白Marker、HRP标记的山羊抗兔、BCA试剂盒购自购自Thermo Fisher；荧光标记的羊抗鼠IgG二抗及DAPI染剂购自上海碧云天生物科技有限公司；IMDM完全培养基购自Hyclone；胎牛血清购BI；8株分泌抗 GRP78抗体杂交瘤细胞购自苏州强耀生物；肝癌细胞系Huh7、Hep1-SK由重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室保存；2只新西兰雄兔、BALB/c雌性小鼠购自重庆医科大学动物中心。本研究所涉及的动物实验均符合重庆医科大学实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准。

ChemiDoc^TM Touch化学发光成像仪、蛋白质电泳及湿转装置购自 Bio-Rad公司，超声波处理系统购自SONICS公司，Ni²⁺-NTA亲和层析柱、 DEAE亲和层析柱、Protein G亲和层析柱及AKTA pure蛋白纯化系统购自 GE Healthcare公司，蛋白质超滤系统购自Micon公司。

实施例1

GRP78蛋白的表达与纯化

GRP78蛋白表达参照杨伟在《中国卫生检验杂志》公开的方法(葡萄糖调节蛋白78的表达、纯化及ATP酶活性试验，中国卫生检验杂志，2016.26 (16)：2319-2322)构建pW28-GRP78重组质粒，将质粒转化成B834感受态形式，然后涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，并在37℃下培养过夜。在含有卡那霉素的5ml液体LB中随机挑取6个单克隆菌落进行扩增，并在37℃，200r/min振荡器中孵育每个试管中的单克隆细菌至OD 600nm 0.1-0.2，将每个试管中的单克隆菌液分别取1ml于3个1.5ml EP管中，分为3组，1组加入1μl IPTG(诱导蛋白表达)；1组为空白对照不作处理；最后一管也不做处理作为保菌液。然后将所有菌液37℃摇床继续孵育 3-4小时至OD_600nm 0.6。将保菌组于甘油中-20℃保存；诱导组与空白组菌液离心，13000rpm，3min，弃去上清后，加入70ul双蒸水和30μl 2.5×SDS Loading Buffer将沉淀悬起，沸水煮10min，再离心(12000rpm，20min)，将上清液进行蛋白质电泳以鉴定蛋白质的表达，选取目的基因表达量及诱导效果最佳的菌落。进行表达条件优化得：将已经初步放大的菌液按1∶100 体积比接种至含有卡那霉素LB液体培养基中，37℃，200r/min，摇床培养至OD_600nm约为0.8时，加入诱导剂IPTG(终浓度0.3mmol/L)，于19℃恒温条件下诱导表达16-20h。

GRP78蛋白纯化离心(5000rpm，4℃，20min)收菌，弃去上清液后，将细胞重悬于适量的结合缓冲液(10mmol/L PBS pH 8.0,300mmol/L NaCl)中，在冰水浴中超声破碎：0℃，超声波4s，间隔6s，振幅28％，超声时间15min。将破菌液低温高速离心，12000rpm，30min，4℃。收集上清液，将上清液通过用结合缓冲液平衡的Ni²⁺-NTA亲和层析柱，流速为 6-8s/滴，然后加入250ml洗涤缓冲液(45mmol/L咪唑，10mmol/ml)，洗去杂蛋白质，最后用30mL洗脱缓冲液(500mmol/L咪唑，10mmol/L PBS pH 8.0,300mmol/L NaCl)洗脱目标蛋白质。然后将洗脱的目的蛋白至于超滤杯中超滤浓缩，并通过加入10mmol/L PBS pH8.0缓冲液稀释蛋白后再次超滤，重复3次，降低咪唑浓度。最后将蛋白浓缩至0.5-1ml，BCA法测定浓度。分装，-80℃储存备用。

将构建的pW28-GRP78重组质粒转入E.coli B834感受态原核表达，挑选IPTG诱导表达效果好的单克隆菌落，经蛋白质纯化，获得可溶性上清液表达的蛋白质。经过Ni²⁺柱亲和纯化，500mmol/L咪唑浓度条件下洗脱目的蛋白，所得蛋白分子量与重组GRP78蛋白质表观分子量相符合，用Image J软件灰度扫描分析其纯度在80％以上；超滤浓缩后BCA法测得GRP78蛋白浓度为0.5mg/ml。

抗GRP78多克隆抗体制备与纯化

将纯化的GRP78蛋白用于新西兰兔背部皮下多点免疫4-5周，颈动脉采血后分离血清，辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体后进一步DEAE离子交换层析法纯化得到多抗。SDS-PAGE电泳分析纯度,电泳结果如图1所示，兔多抗血清辛酸-硫酸沉淀后得到纯度较高抗体，DEAE离子交换层析进一步纯化后抗体纯度达90％，用间接法ELISA进行抗体效价检测，以样品孔OD值与阴性对照孔OD值比值大于2.1为判断标准，纯化后的兔多抗效价为1:16000。

抗GRP78腹水型单克隆抗体制备与纯化

抗GRP78腹水型单克隆抗体的制备将购买的稳定分泌抗GRP78单抗的杂交瘤细胞株复苏，用加入15％胎牛血清的IMDM培养基培养杂家瘤细胞。提前一周用弗氏不完全佐剂腹腔注射(0.2ml/只)预免疫雌性Balb/c小鼠，将杂交瘤细胞注射入Balb/c小鼠腹腔，每只杂交瘤细胞注射量控制在 1-5×10⁵个，一周后收集小鼠腹水。将收集的腹水低温离心(10000g，10min， 4℃)除去细胞和碎片，然后用0.45μm滤器过滤，取1ml腹水用于纯化，剩下腹水分装后-80℃保存。

抗GRP78腹水型单克隆抗体的纯化采用ProteinG免疫亲和层析法纯化单克隆抗体。将腹水与Binding Buffer(10mmol/L PBS，pH7.4)1:1混合，将混合液按照GE AKTA pure提供的操作方案上样，经过ProteinG亲和层析柱，最后用Elution Buffer(0.1mol/L甘氨酸，pH2.7)，收集第二个特异性蛋白流出峰，及时用中和液(1mol/L Tris-HCL pH 9.0)中和pH至7.0。经PBS 透析后用BCA法测定浓度，SDS-PAGE电泳分析纯度,经ELISA检测其效价，Western Blot、免疫荧光实验以及免疫组化鉴定其特异性。

将8株杂交瘤细胞大量培养后注射入小鼠腹腔收集腹水得到抗GRP78 腹水型鼠单抗，通过Protein G纯化腹水，收集第二个特异性蛋白流出峰，如图2所示，得到高纯度IgG。如图3所示的SDS-PAGE电泳分析，抗体纯度大于90％，可以满足后续实验要求。8株单克隆抗体的亚型分别为： McAb-1、McAb-4、McAb-9、McAb-25和McAb-39为G2a型，McAb-23、 McAb-36和McAb-38为G2b型。用间接法ELISA进行抗体效价检测，以样品孔OD值与阴性对照孔OD值比值大于2.1为判断标准，挑选出效价最高的McAb-1用于后续实验。

抗GRP78抗体的鉴定

GRP78兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体WB检测，采用过表达系统检测 GRP78抗体，将感染过表达GRP78腺病毒的Hep1-SK细胞裂解液与GRP78 原核表达蛋白进行WB检测，结果所示均在78KD左右检测到了目的蛋白GRP78，且发现原核表达GRP78蛋白条带略小于真核细胞条带，这是由于原核表达的蛋白未经过糖基化修饰，因此表达的GRP78分子量比理论值略小。用纯化后的GRP78兔多抗和鼠单抗分别在肝癌细胞Huh7细胞进行免疫荧光染色，结果显示两种抗体都可以与细胞中的GRP78蛋白结合，呈现绿色荧光并主要分布于胞浆中，结果如图4所示。小鼠肺癌组织免疫组化结果可见GRP78抗体在小鼠肺癌组织切片中呈阳性反应，并阳性主要定位于细胞浆。

实施例2

双抗夹心ELISA法检测系统的建立按照双抗体夹心ELISA测抗原的基本流程，采用棋盘方阵滴定方法。将前面实验纯化后的单克隆抗体 McAb-1作为捕获抗体分别稀释至10μg、5μg、2.5μg、1.25μg/ml，包被酶标板。分别与梯度稀释的重组GRP78蛋白反应，PBS作为阴性对照。然后加入不同稀释浓度的检测抗体(纯化后的兔多抗)，稀释比例为1:1000、 1:2000、1:4000和1:8000。再加入羊抗兔酶标二抗，稀释比例为1:10000、 1:20000和1:30000。同时，反过来将纯化后的兔多抗作为捕获抗体分别稀释至1:1000、1:2000、1:4000，包被酶标板，不同稀释浓度1:1000、1:2000、 1:4000和1:8000的单克隆抗体McAb-1作为检测抗体，进行同样实验。获取OD450值，根据阳性对照与阴性对照OD值的比值，即P/N值，并同时确定捕获抗体、检测抗体及酶标二抗的最佳搭配和工作浓度，确立ELISA 检测体系。

抗体效价结果表明单抗McAb-1效价最高，因此选用单抗McAb-1与GRP78兔多抗用于棋盘滴定实验。结果如表1显示，单抗McAb-1与兔多抗同时作为捕获抗体效果比较，单抗作为捕获抗体捕获效率与特异性都更好，单抗McAb-1包被浓度为2.5ug/ml，检测抗体兔多抗稀释比例为1:1000 时效果最佳。在蛋白标准品浓度为2500ng/ml时，McAb-1与兔多抗各组合的P值与N值如表1。

表1捕获抗体检测抗体工作浓度确定

注：表中数值为OD_450nm值

封闭条件以及羊抗兔酶标二抗作用时间优化选择5％脱脂奶粉、 5％BSA、2.5％BSA、1.25％BSA四种封闭液进行双抗夹心ELISA反应确定最适封闭液，每个酶标孔中加入250ul封闭液，37℃恒温箱中孵育，实验结果见下表2。

表2封闭液优化

进一步，通过封闭37℃1h、37℃2h和37℃4h确定最适封闭时间，优化结果见下表3。确定最适封闭条件后在最适的羊抗兔酶标二抗抗体浓度下，将反应时间设为:37℃，20min、40min和1h，以确定酶标抗体的最佳反应时间。

表3封闭时间优化

双抗夹心ELISA法的优化

在检测蛋白浓度为2500ng/ml时，以OD450值和P/N值为优化标准。在选择四种不同封闭液的条件下，如表2结果所示，5％脱脂奶粉相对不同浓度的BSA，阴性对照值最低，P/N值最高，因此封闭液选用5％脱脂奶粉；以及在不同封闭时间条件下，如表3，封闭2h阴性对照值最低；同时，表4结果显示，酶标二抗的最佳工作比例为1:30000。

表4酶标二抗工作浓度确定

注：表中数值为OD_450nm值

酶标二抗孵育时间优化结果如表5所示，酶标二抗在孵育时间60min、 40min、20min时，孵育40min时P/N值最高，阴性对照值最低。综上结果，我们将封闭条件确定为5％脱脂奶粉37℃封闭2h，酶标二抗孵育时间为37℃ 40min。

表5酶标二抗孵育时间优化

标准曲线制作及灵敏度的确定取GRP78重组蛋白作为标准品，稀释度从2500ng/ml开始，阴性对照为NGL重组蛋白，空白对照为PBS。进行双抗夹心ELISA检测，每次设置3个重复孔并重复3次。以纵坐标为 OD450值，横坐标为GRP78重组蛋白浓度的对数值，进行标准曲线制作。

标准蛋白质浓度范围为2500至156ng/ml，曲线接近直线，线性关系最好。将OD450值绘制在纵坐标上，GRP78重组蛋白浓度的自然对数绘制在横坐标上(图5)。通过计算4个阴性孔的平均值为(x)0.104，以P/N≥2.1 (P＝0.208，N＝0.104)的最低GRP78重组蛋白浓度为标准，计算试剂盒的最低检测极限为152.3ng/ml。标准差(SD)为0.001，吸收值x+SD＝0.106。根据标准曲线的回归方程y＝0.263x-1.114，x＝ln(x)，R²＝0.990，得出相对应的GRP78蛋白浓度为103.41ng/ml，因此该ELISA方法的检测灵敏度为 103.41ng/ml。由此可知此双抗夹心方法检测GRP78蛋白的线性范围是 103.41～2500ng/ml。

试剂盒的特异性检测利用双抗夹心ELISA方法检测，使用GRP78 重组蛋白、NAGL重组蛋白、PCT重组蛋白、BNP重组蛋白、HBc重组蛋白和BSA蛋白进行交叉反应来进行试剂盒特异性检测，检测蛋白稀释浓度为2000ng/ml，进行双抗夹心ELISA检测。以检测蛋白浓度为2000ng/ml 对试剂盒的特异性进行检测，如表6结果显示，GRP78重组蛋白与GRP78 双夹心试剂盒结合的OD450值，明显高于其它蛋白与试剂盒结合的 OD450值，P/N值小于2.1说明无交叉反应，特异性好。

表6试剂盒特异性鉴定

回收率实验于定量的血清样本中加入一定量的GRP78蛋白 (800ng/ml)，重复测定并计算器均值，回收率为测定值与理论值的比率。在5例正常血清样本中加入800ng/mlGRP78重组蛋白，如表7结果显示，测得样本GRP78蛋白回收率在70.36％～85.85％，平均回收率为76.24％。

表7血清中GRP78蛋白的回收率

双夹心ELISA法的可重复性检测重复4次试验，每次4份不同的样本(阳性样本和阴性样本)，每个样本在4块ELISA板中进行重复性试验，统计学软件分析结果。不同批次包被的ELISA板对4份不同样本检测，如表8结果显示，变异系数在4.20％～8.30％，小于10％，说明重复性好。

表8组间重复性鉴定

注：表中数值为OD_450nm值。

Claims

1.一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA法检测试剂盒，包括兔多克隆抗体、腹水型单克隆抗体、标准品GRP78蛋白、HRP标记的山羊抗兔IgG、显色液、终止液、封闭液和洗涤液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述兔多克隆抗体由以下步骤制得：将GRP78蛋白用于新西兰兔背部皮下多点免疫4-5周，颈动脉采血后分离血清，辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体后进一步DEAE离子交换层析法纯化得到兔多克隆抗体。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述腹水型单克隆抗体由以下步骤制得：将稳定分泌抗GRP78单抗的杂交瘤细胞株复苏，用加入15%胎牛血清的IMDM培养基培养杂家瘤细胞；用弗氏不完全佐剂腹腔注射预免疫雌性Balb/c小鼠，将杂交瘤细胞注射入Balb/c小鼠腹腔，每只杂交瘤细胞注射量控制在1-5×10⁵个，一周后收集小鼠腹水；将收集的腹水低温离心除去细胞和碎片，然后用0.45μm滤器过滤，纯化，得到腹水型单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：以腹水型单克隆抗体作为捕获抗体，以兔多抗作为检测抗体。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：捕获抗体为单克隆抗体McAb-1。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述封闭液选自5%脱脂奶粉、5%BSA、2.5%BSA、1.25%BSA中的一种；每孔加样250ul，37℃恒温箱孵育，封闭时间为1-4h；酶标二抗孵育时间为37℃孵育20-60min，100ul/孔。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：封闭条件为5%脱脂奶粉37℃封闭2h，酶标二抗孵育时间为37℃孵育40min。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述显色液为TMB显色液，100ul/孔，37℃恒温箱避光孵育，终止液为2mol/L硫酸，50ul/孔，洗涤液为PBST千分之一Tween20。

9.一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA检测方法，按照双抗体夹心ELISA测抗原的方式，采用棋盘方阵滴定，以腹水型单克隆抗体McAb-1作为捕获抗体，以兔多抗作为检测抗体，与羊抗兔酶标二抗反应后，获取OD450值；然后根据以下标准曲线回归方程计算GRP78蛋白浓度；

y=0.263x - 1.114，

其中，y为OD450值，x为GRP78重组蛋白浓度的自然对数。

10.一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA检测方法，按照双抗体夹心ELISA测抗原的方式，采用棋盘方阵滴定；其特征在于：将单克隆抗体McAb-1作为捕获抗体分别稀释至10μg、5μg、2.5μg、1.25μg /ml，100ul/孔包被酶标板，4℃孵育过夜；洗涤液洗板4次后；加入封闭液250ul/孔，37℃恒温箱孵育；再次洗板4次后;分别与梯度稀释的重组GRP78蛋白反应，PBS作为阴性对照，上样量100ul/孔，37℃恒温箱孵育1h后，洗板4次；然后加入不同稀释浓度的检测抗体（兔多抗），稀释比例为1:1000、1:2000、1:4000和1:8000，100ul/孔，37℃恒温孵育1h，洗板四次；再加入羊抗兔酶标二抗，稀释比例为1:10000、1:20000和1:30000，100ul/孔，37℃避光孵育20min、40min和1h后，洗板四次；再加入TMB显色液100ul/孔，37℃避光孵育20min后，加入终止液50ul/孔，立即检测OD450nm吸光度值；同时，反过来将兔多抗作为捕获抗体分别稀释至1:1000、1:2000、1:4000，包被酶标板，不同稀释浓度1:1000、1:2000、1:4000和1:8000的单克隆抗体McAb-1作为检测抗体，进行同样实验；获取OD450值；根据以下标准曲线回归方程计算GRP78蛋白浓度；

y=0.263x - 1.114，

其中，y为OD450值，x为GRP78重组蛋白浓度的自然对数。