CN105277720B - 一种检测肝吸虫IgG4抗体的ELISA试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测肝吸虫IgG4抗体的ELISA试剂盒及其制备方法,所述试剂盒包括:酶标板和酶标检测抗体;其中,所述酶标板上包被有肝吸虫的特异性抗原CsSP46,所述特异性抗原CsSP46的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的片段,所述酶标检测抗体为酶标记的抗人IgG二抗或抗人IgG4二抗。本发明试剂盒制备的重组抗原用于肝吸虫病的ELISA检测,敏感性要高于虫卵检查,敏感性和特异性均高于现有的粗抗原和其他重组抗原;本发明试剂盒可用于肝吸虫病人的临床检验以及治疗后的疗效考核和疾病预防控制中心对流行区人群防治效果的考核和评价,具有广阔的市场前景和巨大的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物免疫检测技术领域,具体涉及一种试剂盒及其制备方法,尤其涉及一种检测肝吸虫IgG4抗体的ELISA试剂盒及其制备方法。
背景技术
肝吸虫亦称华支睾吸虫,因其成虫主要寄生于终宿主的肝胆管内,故俗称肝吸虫。成虫主要寄生在人、犬、猫、猪等的肝胆管内,成虫浸出物及代谢产物中含有抗原成分,感染人体后会诱发多种免疫病理反应,在肝吸虫病人血清中,IgG是最容易检测到的特异性抗体,宿主感染肝吸虫后可诱发较强的体液免疫应答,参与体液免疫的主要免疫球蛋白为IgG,其水平与感染度呈正相关,也就是说肝吸虫IgG抗体水平在一定程度上可反映病人感染程度。在肝吸虫病的诊断及流行病学研究等方面具有重要意义,可辅助诊断肝吸虫感染及筛查感染人群。而IgG4是肝吸虫感染及治疗评价更为特异的指标。
传统上,用患者粪便中肝吸虫虫卵的病原学方法检测肝吸虫病;近年来,免疫检测的方法逐渐被用于肝吸虫病的临床诊断研究中来,并取得了良好的效果。目前实验室和临床应用的免疫学诊断方法主要有皮内试验(ID)、间接血凝试验(IHA)、免疫酶染色试验(IEST)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接荧光抗体试验(IFAT)、酶联免疫印渍技术(ELIB)等等。
CN 103376314 A公开了一种肝吸虫IgG抗体酶联免疫试剂盒,包括肝吸虫可溶性抗原标准液、肝吸虫IgG抗体、酶标板、酶结合物、底物显色液、稀释液、洗涤液和终止液;所述肝吸虫可溶性抗原由感染肝吸虫病人血清中分离纯化而得。CN 102830231 A公开了一种基于检测抗肝吸虫抗原特异性抗体IgG4的肝吸虫感染检测试剂盒及检测方法,可以区分肝吸虫感染患者与非肝吸虫感染患者,该试剂盒以肝吸虫抗原特异性IgG4为检测靶标,提高肝吸虫病检测方法的特异性。但是这些方法都费时、费力,样本不易保存及运输,每次采集的样本检测结果差异较大,操作繁琐,不利于疾控部门及医疗机构进行批量操作,肝吸虫虫卵较小,漏检率高,而且不能对该病做出早期诊断,不利于临床单位的推广应用。酶联免疫吸附试验(ELISA)及其他免疫检测的方法在一定程度上解决了病原学方法检测费时、费力、漏检率高的缺点,但目前均使用天然虫卵抗原提取物作为试剂盒包被抗原,天然抗原存在批间差异大、纯化后杂质较多、含有有效抗原成份不多等缺陷,容易造成试剂盒特异性较差、灵敏度较低、批间差异大等质量问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测肝吸虫IgG4抗体的ELISA试剂盒及其制备方法,该试剂盒具有高灵敏度、高特异性、省时的特点,用于肝吸虫IgG4抗体的批量检测。
为达到此发明的目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种检测肝吸虫IgG4抗体的ELISA试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:酶标板和酶标检测抗体;
其中,所述酶标板上包被有肝吸虫的特异性抗原CsSP46,所述特异性抗原CsSP46的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的片段,所述酶标检测抗体为酶标记的抗人IgG二抗或抗人IgG4二抗;
所述SEQ ID NO.1所示的片段序列如下:
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGRPHADEEIIIDPTYGDRWTYAQYFDYDLRGRPLGFIHRLQGRQSYRYLSEIDKTYTALFVVGVILATTVLPMIWSYLCILKVYLFNRIRTKWQMEREKRACATHKNFLQPDDPDEYAAIFCRSVFNRLHASPAGKQIPKDLADYEAIRFAVQRPNWLVNKMEEAVHRAEYGFTKNQVVSGELDDMLKLAVKQKRIKTRKPLSLAGKLRARYMLARGEGRSQKDHRLTPEMLMLLGWQHLYRRHVRDANEENYAWWLNQMKTLPVESREVLERLQTIVDKQRKRRKFRGAKTFEELDPSSTDASSLPREIKKPEIIEPTRRRHKRSTPKIEISPPELHRNERLISEKQNPEEAMMLREILGMEHLRHVRLRRVRRRRSSHKRNAQSSKTPKZ。
作为试剂盒,酶标板和酶标检测抗体是其核心成分,只要有这两种成分就能实现基本的抗原-抗体结合反应。至于辅助成分,比如样品稀释液、洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照,可以与上述三种成分配套组装在一个试剂盒中,也可以单独提供,因此本发明中试剂盒可以包括这些辅助成分,也可以不包括,本发明优选包括这些辅助成分,以方便使用。
本发明中,通过肝吸虫现有基因数据库,发掘了一个特有的经非经典途径分泌的碱性蛋白CsSP46,通过基因工程手段从肝吸虫的基因序列中获得,作为一种特异性抗原,可作为肝吸虫病检测的特异性包被抗原,相比于直接用从感染肝吸虫病人血清中纯化的肝吸虫抗原,专一性更强,效果更好;本发明首选肝吸虫所特有的抗原性指数高的分泌抗原,以提高其诊断的特异性和敏感性。
优选地,所述特异性抗原CsSP46的基因序列包含如SEQ ID NO.2所示的片段,所述片段的序列如下:
ATGGGACGTCCCCATGCAGATGAAGAGATCATCATTGACCCAACCTATGGAGATCGCTGGACCTATGCACAGTATTTCGATTACGATCTGCGTGGCCGTCCATTGGGTTTCATCCATCGACTTCAAGGTCGGCAAAGTTACCGTTATCTGAGTGAAATTGATAAAACCTACACGGCCCTTTTTGTAGTTGGGGTGATACTCGCAACAACTGTGTTGCCTATGATATGGAGCTACTTGTGTATACTCAAAGTCTATTTGTTCAATCGAATTCGTACCAAATGGCAGATGGAGCGCGAAAAGCGCGCTTGTGCAACACACAAAAACTTTCTACAGCCGGACGATCCAGACGAATATGCTGCCATTTTTTGCCGGTCTGTTTTCAACAGGTTACATGCATCTCCAGCTGGGAAGCAAATACCAAAAGACCTGGCTGACTATGAAGCTATTCGATTTGCCGTCCAACGACCCAACTGGCTAGTGAATAAAATGGAGGAAGCCGTGCATAGGGCAGAGTATGGCTTCACGAAAAATCAGGTTGTCAGTGGAGAGCTGGACGATATGTTGAAACTGGCTGTGAAACAGAAGCGCATCAAAACTCGAAAACCTTTGTCATTAGCTGGGAAGTTGAGGGCTCGGTATATGCTGGCTAGAGGTGAAGGTCGAAGTCAGAAAGATCACAGACTGACTCCAGAAATGTTGATGCTCCTCGGTTGGCAACACCTGTACAGACGACACGTACGTGATGCGAACGAAGAAAACTATGCCTGGTGGTTAAACCAGATGAAAACATTACCCGTGGAGTCACGTGAAGTACTTGAACGCTTACAAACTATTGTTGATAAACAGCGAAAACGCCGGAAATTTCGTGGAGCAAAAACCTTTGAAGAACTCGATCCCAGTTCAACAGACGCATCAAGTTTGCCGCGGGAGATTAAGAAGCCGGAAATTATAGAGCCAACTAGAAGACGCCACAAGAGAAGTACTCCAAAAATTGAAATATCACCTCCCGAACTGCACAGAAATGAACGACTAATTAGTGAAAAACAAAATCCAGAAGAGGCAATGATGTTGCGGGAGATCCTGGGCATGGAACACCTCAGGCATGTACGGCTGAGGCGTGTGCGCCGAAGAAGATCTAGTCACAAAAGGAACGCACAATCATCAAAGACTCCCAAGTAA。
优选地,所述酶标检测抗体为用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗人IgG二抗或抗人IgG4二抗,优选为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG二抗或抗人IgG4二抗;进一步优选为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG4二抗。
优选地,所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液和终止液。
优选地,所述样品稀释液为0.006-0.015mol/L的pH为6-6.5的不含蛋白的磷酸吐温缓冲液;优选为0.01mol/L的pH为6.35的不含蛋白的磷酸吐温缓冲液。
优选地,所述洗涤液为浓缩洗涤液,优选为含Tween-20的磷酸盐缓冲液。
优选地,所述终止液为硫酸溶液。
优选地,所述试剂盒还包括酶底物溶液。
优选地,所述酶底物溶液包括显色液A和显色液B。
优选地,所述显色液A为过氧化脲、柠檬酸、磷酸氢二钠和吐温20的混合液。
优选地,所述显色液B为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺和柠檬酸的混合液。
优选地,所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
优选地,所述阳性对照为肝吸虫IgG抗体阳性对照。
优选地,所述阴性对照为肝吸虫IgG抗体阴性对照。
第二方面,本发明提供一种如第一方面所述的检测肝吸虫IgG4抗体的ELISA试剂盒的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(1)通过基因工程手段获得CsSP46特异性抗原;
(2)用所述特异性抗原CsSP46包被空白酶标板,得到包被的酶标板;
(3)将所述包被的酶标板与酶标检测抗体组合成试剂盒;
任选地,还包括将样品稀释液、洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照组合到试剂盒中。
优选地,所述步骤(1)具体包括:
(a)通过PCR扩增技术获得所述CsSP46的基因序列,并将CsSP46的基因序列重组到表达载体中,构建重组载体;
(b)将重组载体转化到克隆菌种,筛选含有所述CsSP46基因序列的阳性转化菌;
(c)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体,并转化到表达菌中,得到含有所述CsSP46基因序列的阳性表达菌,对所述阳性表达菌扩大培养,诱导所述CsSP46蛋白表达;
(d)亲和层析纯化所述CsSP46蛋白。
本发明的CsSP46蛋白可以通过在适当的宿主中表达得到,也可以通过常规肽合成技术化学合成得到,优选的是在适当的宿主中表达得到。
第三方面,本发明提供一种如第一方面所述的检测肝吸虫IgG4抗体的ELISA试剂盒的使用方法,所述使用方法包括如下步骤:
(1)试剂盒在室温平衡30min,浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水进行20倍稀释,得稀释洗涤液;
(2)加样:取包被了肝吸虫特异性重组抗原CsSP46的酶标板,检测孔加入100μL样品稀释液,再加入10μL待测血清,对照孔分别直接加入相应的对照样本,在37℃下避光反应30min;
(3)洗板:两点吸液,浸泡式洗涤5次,浸泡时间为60秒,洗完后扣干;
(4)除空白对照孔外,每孔加酶结合物100μL,振荡均匀,置37℃下避光反应20min,按步骤3洗板并扣干;
(5)显色:每孔加显色液A和显色液B各50μL,振荡混匀,置37℃下避光显色10min;
(6)测定:每孔加终止液50μL,振荡混匀后,以空白对照孔调零,在450nm波长(630nm作参比波长)读数。
优选地,所述读数后的结果判定为
(1)有效性判定:
空白对照孔OD值<0.05,若大于0.05,则实验无效;
阴性对照孔OD值≤0.10,若有1孔阴性对照孔OD值大于0.10则应舍去,若两孔阴性对照OD值大于0.10,应重复试验;
阳性对照孔OD值≥0.5,若小于0.5,则实验无效;
(2)结果判定:
临界值(COV)为0.12;
样本OD值≥COV值时,判为肝吸虫抗体阳性;
样本OD值<COV值时,判为肝吸虫抗体阴性。
本发明中,所述COV是通过700份真阴性人血清样本进行测试,并进行统计学计算,对于正态分布,均可按正态曲线下面积与“平均数±标准差”的对应关系估计正常值范围,即X±μδ。式中X为均数,μ为常数,δ为标准差。当正常值范围为95%时,单侧μ值为2.0,因此确定临界值的粗略计算公式为如下模式:COV=n+阴性对照平均OD值。n为常数,即μδ值。该700份真阴性人血清样本OD均值为0.05,标准差δ为0.035,计算得出COV值为0.12。
本发明试剂盒的检测分析原理:
本产品采用的是酶联免疫诊断技术,包被在酶标板上的特异性肝吸虫重组抗原CsSP46可以特异性结合阳性人血清中的抗肝吸虫抗体,加入的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG4二抗与之结合,形成肝吸虫重组抗原-血清中的抗肝吸虫抗体-辣根过氧化物酶标记的抗人IgG4二抗三者特异性的复合物,再加入显色剂A和显色剂B后,经辣根过氧化物催化显色剂A、显色剂B,发生氧化还原反应产生特异波长的光波,经含450nm/630nm波长的酶标仪读数后即可进行定性判断。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明试剂盒酶标检测抗体通过HRP标记的抗体来进一步增加反应的灵敏度,同时降低检测抗体的用量和成本;
(2)本发明试剂盒制备的重组抗原用于肝吸虫病的ELISA检测,敏感性要高于虫卵检查,敏感性和特异性均高于现有的粗抗原和其他重组抗原,完全适合于肝吸虫病的现场筛查;
(3)本发明试剂盒还可用于肝吸虫病人的临床检验以及治疗后的疗效考核和疾病预防控制中心对流行区人群防治效果的考核和评价,具有广阔的市场前景和巨大的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明CsSP46蛋白重组质粒酶切鉴定;
其中,M1,M2-标准分子量;1-PCR产物;2-重组质粒双酶切;3-空质粒双酶切;
图2为本发明pET-28a(+)-CsCsSP46在大肠杆菌中的表达产物及其纯化产物;
其中,M-蛋白marker;1-未诱导的BL21-pET-28a(+);2-诱导后的BL21-pET-28a(+);3-未诱导的BL21-pET-28a(+)-CsSP46;4-诱导后的BL21-pET-28a(+)-CsSP46;5-诱导后的BL21-pET-28a(+)-CsSP46超声裂解上清部分;6-诱导后的BL21-pET-28a(+)-CsSP46超声裂解沉淀部分;7-重组纯化蛋白。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1:制备CsSP46蛋白
肝吸虫CsSP46基因的克隆,表达载体的构建及鉴定,如图1所示:
(1)根据肝吸虫的基因序列设计引物:
上游引物:5’-ATACATATGATGGGACGTCCCCATGCAGATG-3’(SEQ ID NO.3),其中下划线部分为Xho I酶切位点;
下游引物:5’-GGGCTCGAGTTACTTGGGAGTCTTTGATGATTG-3’(SEQ ID NO.4),其中下划线部分为Nde I酶切位点。
采用常规小量细菌DNA提取方法即碱裂解法提取肝吸虫的基因组。
PCR扩增:以提取的质粒为模板进行PCR扩增,反应体系如下:
设置一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下:
所获得PCR产物进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒(QIAquickGel Extraction)纯化。采用TAKARA pMD18-T kit参照说明书体系进行连接。
(2)验证:所述酶切采用将过夜培养的菌液采用试剂盒的提取的方法纯化质粒,电泳检测无误后进行双酶切,酶切体系如下:
同时酶切pET-28a(+)质粒,作为阴性对照,酶切温度为37℃,时间为1h。所获得酶切产物进行1.2%的琼脂糖凝胶回收目的条带。
结果如图1所示,双酶切验证后的电泳图可以看出,1的PCR产物是一条1000多的目的条带,2双酶切后具有一条1000多的目的条带和5000多的酶切后的质粒,3空质粒酶切后的质粒与2酶切后的质粒大小相同。
(3)通过同源重组法,将连接产物重组到表达载体pET-28a(+)(购自TAKARA公司)中,构建重组载体;将所述重组载体转化到克隆菌DH5α大肠杆菌中,筛选含有所述CsSP46基因序列的阳性转化菌;具筛选可以通过X-Gal等方法筛选含有所述CsSP46基因序列的阳性转化菌;
具体地,将上述回收到的目的片段和载体进行连接。采用的TAKARA T4连接酶体系如下:
按上述方法将连接产物转化到DH5α感受态,并在LB(Kan+)平板进行培养,37℃过夜,挑取单菌落进行PCR鉴定。
(4)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体,PCR验证并酶切验证,验证基因片段的大小,证明PCR得到的序列正确。将所述测序证明正确的重组载体转化到表达菌BL21大肠杆菌中,得到含有所述CsSP46基因序列的阳性表达菌;
具体地,挑取6个单菌落在37℃下过夜培养。将过夜培养的菌液以1:100的比例加入5mL Amp+LB培养基中,37℃220rpm培养2h。取出1mL菌液作为未诱导对照,其余按照体积加入IPTG至终浓度为0.4mM,37℃180rp培养4h。取1mL菌液12000g离心10min,弃上清,用100ul去离子水重悬沉淀,加入等体积的2×SDS loadingbuffer,沸水浴10min,取上清用12%SDS-PAGE电泳检测。
将经检测诱导成功的菌株扩大培养和诱导,将过夜培养的菌液1:100稀释至200mL新鲜LB培养基中,按照上述诱导条件对其进行诱导。
经诱导后的菌液12000g离心10min,收集菌体。以1/10体积的裂解缓冲液重悬菌体,超声破碎,控制功率200W,工作条件为超声4s暂停10s 90次,以冰浴降温,重复3次以彻底破碎细菌。将经超声破碎处理的菌液12000g离心10min后,分别取上清和沉淀经12%SDS-PAGE验证蛋白表达方式。
结果如图2所示,可以看出,成功构建的BL21-pET-28a(+)-CsSP46再经过诱导后,在46-50kDa处出现明显条带,超声裂解后,目的蛋白主要存在于沉淀中,且与重组蛋白理论分子量48.7kDa吻合,可见已成功得到CsSP46蛋白。
(5)亲和层析纯化所述CsSP46蛋白,具体地,可以通过Ni-NTA柱亲和层析纯化等方式分离纯化所述CsSP46蛋白。
具体地,可以采用GE公司的Ni-NTA亲和层析预装柱(NiSepharose HighPerformance)按照产品说明书纯化目的蛋白CsSP46。实验中,用蒸馏水以50-100cm/h的线性流速洗5个柱体积,用6个柱体积的结合缓冲液以150cm/h的线性流速平衡柱子,然后加入预处理过的样品,用缓冲液洗涤,直到吸收达到基线。采用逐步洗脱法用洗脱缓冲液洗脱,收集各阶段样品,SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。
实施例2:辣根过氧化物酶标记的二抗的选择
取10mg辣根过氧化物酶溶于2mL 0.4mol/L pH8.0的NaHCO3中,加入1%DNFB无水乙醇溶液0.2mL,室温下搅拌1h;加入2mL 0.06mol/L的NaIO4,避光搅拌30min;加入2mL0.16mol/L的乙二醇,室温搅拌1h,装入透析袋,对0.01mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液2000mL,4℃透析过夜,换液3次;在6mL醛化辣根过氧化物酶溶液中加入含10mg抗人IgG4的碳酸盐缓冲液2mL,室温避光搅拌3h;加入10mg NaHB4,放4℃过夜;装入透析袋,对0.01mol/L,pH7.2PBS,4℃透析24h,换液3次;3000r/min离心30min,除去沉淀物。上清通过sephadexG-200凝胶柱层析,PBS洗脱,小量分装,低温保存。
用肝吸虫重组抗原CsSP46进行ELISA分别检测肝吸虫病患者血清中的特异性IgG和IgG4抗体,用ELISA试剂盒对80例肝吸虫病人治疗前后血清中IgG/IgG4抗体进行检测。
结果显示,疗前IgG阳性率96.25%,IgG4阳性率97.5%,检出率基本相同;疗后IgG阳性率65.22%,IgG4阳性率28.26%;故IgG4可作为肝吸虫病疗效考核指标之一。
实施例3:试剂盒的组装
(1)包被酶标板:将纯化得到的重组抗原CsSP46包被96孔酶标板,4℃包被过夜。次日取出后以PBST洗板3次,每次3min。以PBST溶液配制的1%BSA作为封闭液,每孔加入封闭液100ul,37℃封闭1h。封闭结束后用PBST洗板3次,每次3min。装入96孔酶标板专用包装袋,用封口机封口后4℃保存。
(2)辣根过氧化物酶标记抗人IgG4:辣根过氧化物酶标记抗人IgG4可通过技术服务外包获得或商购,通过本领域常规方法制备,在2%BSA的0.01mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.4中保存。
试剂盒其他溶液配制:
(3)样品稀释液:不含蛋白成分的0.01mol/L的PBST,pH6.35;
(4)浓缩洗涤液:氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-202mL和蒸馏水20mL;
(5)终止液:2mol/L硫酸;
(6)显色液A:过氧化脲1g,10.3g柠檬酸,35.8g Na2HPO4·12H2O,吐温-20 100μL,蒸馏水1000mL,pH5;
(7)显色液B:四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解),10.3g柠檬酸,蒸馏水1000mL,pH2.4。
组建的试剂盒包括以下几个方面:96孔酶标板、检测抗体、样品稀释液、洗涤液、终止液、TMB底物、阳性对照、阴性对照及产品说明书。
实施例4:试剂盒的使用方法
(1)试剂盒在室温平衡30min,浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水进行20倍稀释,得稀释洗涤液;
(2)加样:取包被了肝吸虫特异性重组抗原CsSP46的酶标板,检测孔加入100μL样品稀释液,再加入10μL待测血清,对照孔分别直接加入相应的对照样本,在37℃下避光反应30min;
(3)洗板:两点吸液,浸泡式洗涤5次,浸泡时间为60秒,洗完后扣干;
(4)除空白对照孔外,每孔加酶结合物100μL,振荡均匀,置37℃下避光反应20min,按步骤3洗板并扣干;
(5)显色:每孔加显色液A和显色液B各50μL,振荡混匀,置37℃下避光显色10min;
(6)测定:每孔加终止液50μL,振荡混匀后,以空白对照孔调零,在450nm波长(630nm作参比波长)读数。
结果判定为:
(1)有效性判定:
空白对照孔OD值<0.05;
阴性对照孔OD值≤0.10;
阳性对照孔OD值≥0.5;
(2)结果判定:
临界值(COV)为0.12;
样本OD值≥COV值时,判为肝吸虫抗体阳性;
样本OD值<COV值时,判为肝吸虫抗体阴性。
实施例5:试剂盒的灵敏度和特异性检测
通过用本发明特异性重组抗原CsSP46与天然纯化虫体抗原分别包被酶标板,其余试剂盒组分同实施例3,采用实施例4的方法同时进行检测,结果如下表所示:
表1
统计项目 | 重组抗原CsSP46 | 天然虫体抗原 |
内控阳性参考品 | 15/15 | 12/15 |
内控阴性参考品 | 15/15 | 12/15 |
内控灵敏度参考品 | 0.427(检出) | 0.099(未检出) |
内控精密性参考品 | 1.25%(≤15%) | 6.39%(≤15%) |
20份未感染肝吸虫血清 | 20/20 | 17/20 |
20份轻度感染肝吸虫血清 | 19/20 | 15/20 |
20份中度感染肝吸虫血清 | 20/20 | 16/20 |
10份重度感染肝吸虫血清 | 10/10 | 10/10 |
本发明的试剂盒性能明显优于天然虫体抗原,无论灵敏度,精密性都明显高于天然虫体抗原。
实施例6:试剂盒的抗干扰测试
通过实施例3组装的试剂盒,采用实施例4的方法对样品进行检测:样品包括:未经肝吸虫感染的溶血血清20组:RX1-RX20,高血脂血清20组:GZ1-GZ20,血吸虫感染者血清40组:S.J1-S.J40,肺吸虫感染者血清5组:F1-F5,旋毛虫感染者血清5组:X1-X5,乙肝表面抗原阳性血清40组:Y1-Y40,检测结果如下表所示:
表2
从表2可以看出,溶血血清及高血脂血清对于检测结果没有影响,并不会导致假阳性结果的出现。
综上所述,本发明试剂盒不受溶血血清及高血脂血清的干扰,制备的重组抗原用于肝吸虫病的ELISA检测,敏感性要高于虫卵检测,敏感性和特异性均高于现有的粗抗原和其他重组抗原,适合于肝吸虫病的现场筛查;本发明试剂盒还可用于肝吸虫病人的临床检验以及治疗后的疗效考核和疾病预防控制中心对流行区人群防治效果的考核和评价,具有广阔的市场前景和巨大的经济效益。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (22)
1.一种检测肝吸虫IgG4抗体的ELISA试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:酶标板和酶标检测抗体;
其中,所述酶标板上包被有肝吸虫的特异性抗原CsSP46,所述特异性抗原CsSP46的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的片段,所述酶标检测抗体为酶标记的抗人IgG二抗或抗人IgG4二抗。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述特异性抗原CsSP46的基因序列包含如SEQ ID NO.2所示的片段。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述酶标检测抗体为用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗人IgG二抗或抗人IgG4二抗。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述酶标检测抗体为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG二抗或抗人IgG4二抗。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述酶标检测抗体为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG4二抗。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液和终止液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述样品稀释液为0.006-0.015mol/L的pH为6-6.5的不含蛋白的磷酸吐温缓冲液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述样品稀释液为0.01mol/L的pH为6.35的不含蛋白的磷酸吐温缓冲液。
9.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述洗涤液为浓缩洗涤液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述洗涤液为含Tween-20的磷酸盐缓冲液。
11.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述终止液为硫酸溶液。
12.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括酶底物溶液。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其特征在于,所述酶底物溶液包括显色液A和显色液B。
14.根据权利要求13所述的试剂盒,其特征在于,所述显色液A为过氧化脲、柠檬酸、磷酸氢二钠和吐温20的混合液。
15.根据权利要求13所述的试剂盒,其特征在于,所述显色液B为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺和柠檬酸的混合液。
16.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
17.根据权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述阳性对照为肝吸虫IgG抗体阳性对照。
18.根据权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述阴性对照为肝吸虫IgG抗体阴性对照。
19.一种如权利要求1-18中任一项所述的检测肝吸虫IgG4抗体的ELISA试剂盒的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)通过基因工程手段获得CsSP46特异性抗原;
(2)用所述特异性的抗原CsSP46包被空白酶标板,得到包被的酶标板;
(3)将所述包被的酶标板与酶标检测抗体组合成试剂盒;
任选地,还包括将样品稀释液、洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照组合到试剂盒中。
20.根据权利要求19所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)具体包括:
(a)通过PCR扩增技术获得所述CsSP46的基因序列,并将CsSP46的基因序列重组到表达载体中,构建重组载体;
(b)将重组载体转化到克隆菌种,筛选含有所述CsSP46基因序列的阳性转化菌;
(c)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体,并转化到表达菌中,得到含有所述CsSP46基因序列的阳性表达菌,对所述阳性表达菌扩大培养,诱导所述CsSP46蛋白表达;
(d)亲和层析纯化所述CsSP46蛋白。
21.根据权利要求1-18中任一项所述的检测肝吸虫IgG4抗体的ELISA试剂盒的使用方法,其特征在于,所述使用方法包括如下步骤:
(1)试剂盒在室温平衡30min,浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水进行20倍稀释,得稀释洗涤液;
(2)加样:取包被了肝吸虫特异性重组抗原CsSP46的酶标板,在检测孔加入100μL样品稀释液,再加入10μL待测血清,对照孔分别直接加入相应的对照样本,在37℃下避光反应30min;
(3)洗板:两点吸液,浸泡式洗涤5次,浸泡时间为60秒,洗完后扣干;
(4)除空白对照孔外,每孔加酶结合物100μL,振荡均匀,置37℃下避光反应20min,按步骤3洗板并扣干;
(5)显色:每孔加显色液A和显色液B各50μL,振荡混匀,置37℃下避光显色10min;
(6)测定:每孔加终止液50μL,振荡混匀后,以空白对照孔调零,在450nm波长(630nm作参比波长)读数。
22.根据权利要求21所述的使用方法,其特征在于,所述读数后的结果判定为:
(1)有效性判定:
空白对照孔OD值<0.05;
阴性对照孔OD值≤0.10;
阳性对照孔OD值≥0.5;
(2)结果判定:
临界值(COV)为0.12;
样本OD值≥COV值时,判为肝吸虫抗体阳性;
样本OD值<COV值时,判为肝吸虫抗体阴性。
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