KR101257562B1 - 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 생산하여, 간흡충류의 진단 및 치료에 있어 민감도와 특이성이 증강된 항원단백질을 제공하고자 한다.

Description

간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질 {Protein having antigen activity on Liver flukes}

본 발명은 간흡충류의 진단 및 치료에 유용한 항원 활성을 갖는 단백질 및 상기 항원단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

간흡충은 인체 감염시 담관에 기생하여 간흡충증을 일으킨다. 간흡충증은 우리나라에 유행하는 만성 기생충질환으로, 2004년 전 국민의 간흡충 감염률이 2.4%로 약 120만 명의 감염자가 있는 것으로 추산되며 4대강 유역에 간흡충증이 토착화되어 지속적으로 감염자가 발생되고 있다. 간흡충증은 중국, 베트남, 태국, 캄보디아, 라오스, 소련, 동유럽 국가들에서도 유행하고 있다.

간흡충이 간담도에 기생하면서 충란을 산란한다. 충란은 대변에 섞여서 배출되고 민물로 흘러 들어가 제 1중간 숙주인 쇠우렁 또는 몇 가지 담수산 패류에 먹히며, 패류 체내에서 스포로시스트, 레디아를 거쳐 유미유충으로 발육하고, 제2 중간숙주인 잉어과 담수어의 근육내로 침범하여 피낭유충 (metacercaria)으로 발육한다. 사람이나 동물이 피낭유충에 감염된 담수어를 날로 먹으면 피낭유충이 십이지장에서 탈낭하고, 곧바로 총수담관을 경유하여 간내 담도로 이동하여 성충으로 성장한다. 이렇게 감염된 간흡충은 담도에 기생하면서 담도상피를 자극하여 담도염, 담도둘레섬유화, 황달, 소화불량, 간기능저하 등을 일으키고 합병증으로 담석, 간경화, 담낭염을 일으키기도 한다. 담석 경우 간흡충 유행지에서 담석의 약 1/3에서 감흡충 충란이 발견되기도 한다. 오랫동안 심한 염증이 계속되면, 나중에 담관암이 발생하기도 한다. 간흡충류의 감염에 의해 발생되는 담관암, 담관내 결석, 화농성 담관염 등의 다양한 합병증은 간흡충 감염 자체에 비하여 대단히 심각한 질환이므로 이러한 중증 질환으로 발전하기 전에 조기에 감염여부를 진단하고 치료 시기를 앞당기는 것이 매우 중요하다.

간흡충은 프라지콴텔 (praziquantel)을 투여하여 구충한다. 이 약품은 간흡충 뿐만 아니라 폐흡충, 장흡충류, 주혈흡충에 대해서도 우수한 구충효과를 발휘한다. 간흡충 치료 후에 인체에 간흡충에 대한 저항력이 생성되지 않아서 프라지콴텔로 구충한 후에도 간흡충에 재감염이 일어난다.

간흡충증 감염의 진단 방법으로 현재 사용되고 있는 기준검사법은 현미경적대변충란검사법이다. 간흡충 성충 한 마리가 하루에 산란하는 충란 수가 대략 100개 정도이다. 간흡충 충체 부하가 낮은 감염자의 경우에는 현미경적 충란대변검사법의 충란 검출률이 낮아져서 반복검사를 해야 하므로 대변검사 소요시간이 길어진다는 약점이 있다. 환자가 진단용 대변 채취와 제출을 꺼리고 기생충 충란 판독에 숙련된 전문인력이 필요하다는 문제점이 있다. 그 외에 혈청학적 항체검사, 초음파검사법, 내시경적 역행성 담도 조영술, 피내반응검사법이 보완적으로 이용되고 있다. 혈청항체검사법은 간흡충 조단백질을 항원으로 사용하고 있으며, 민감도는 높으나 특이도가 낮다. 조항원단백질들은 간흡충 감염자 혈청에 대해 immunoblotting, ELISA 실시한 결과 민감도는 높으나 특이도가 낮았으며, 교차반응으로 인해 기생충 감염을 감별진단할 수 있는 항원단백질로 적합하지 못하였다 (Chen et al., 1994). 간흡충 조항원은 다른 기생충 감염자 혈청과 교차 반응하는 비특이적 양성반응을 개선하기 위하여 특이도와 민감도가 우수한 단일 항원 단백질을 개발해야하는 어려운 과제를 해결해야 한다.

피내반응검사는 과거에 감염되었던 사람에 있어서도 양성반응을 나타내고(Chung et al., 1995; Sandun et al., 1959; Walton과 주, 1959; 김동찬 외, 1969; 정호연 외,1989), 폐흡충, 유구낭미충 등의 감염자와 교차반응한다 (Hunter, 1958). 따라서 피내반응검사법은 개인이나 집단관리를 위한 검사법으로 이용하기에 제한점이 많은 검사법이다.

1950년대 이후 기생충 특이항체를 검출하는 혈청학적검사법으로 보체결합반응법, 면역형광법, 면역전기영동법, 면역한천확산법, 효소면역검사법 (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) 등이 개발되었다. 혈청학적 검사법은 충체가 어려서 아직 충란을 산란하지 않거나, 충체가 노쇠하여 충란을 생성하지 않은 경우에도 혈청에서 항체를 검출하여 간흡충 감염을 진단할 수 있는 진단법이다. 이 가운데 감염자의 혈액에서 간흡충 항원단백질에 대한 항체를 검출하는 효소면역검사법이 간흡충증 진단에 유용하게 이용되고 있다. 면역혈청학적 검사키트를 개발하기 위해서는 민감도와 특이도가 높은 간흡충 특이항원을 확보하는 것이 중요하다. 그동안 혈청학적으로 간흡충증을 진단하기 위해 간흡충의 조항원이 사용되었다. 이 조항원은 성분을 알지 못하는 대량의 단백질이 혼합된 것으로, 다른 기생충 감염혈청과 교차반응을 보인다. 따라서 이러한 조항원보다 단일단백질로 분리, 정제된 단일 항원단백질이 혈청학적 진단항원으로 유용할 것으로 기대되어 왔다. 그러나, 지금까지의 후보가 될 만한 다수의 항원후보 단백질들을 용해성이 있는 단백질로 한꺼번에 발현, 정제시켜 면역블롯이나 면역효소반응법으로 항원성을 평가하는 것은 일의 규모나 양에 있어 수고가 만만치 않았다.

오랫동안 항원단백질에 대한 연구가 계속 되어 여러 연구진들을 통해 항원 후보단백질들이 평가되었다. 소수의 단백질에 대한 항원성 평가 연구가 최근 10여 년 동안 지속 되어 오고 있으며 아직까지 유용한 진단 시약으로 사용할 수 있는 수준의 민감도와 특이도가 높은 우수한 단일 항원 단백질이 개발되지 못하고 있는 실정이다. 단일항원단백질을 이용할 경우 특이도는 높으나 민감도가 낮아 간흡충 감염부하가 낮은 환자 진단에는 한계가 있는 등 민감도와 특이도가 둘 다 높은 진단법이 정립되지 못하였다. 따라서 항원성이 매우 강력하여 민감도와 특이도가 뛰어난 간흡충 항원단백질 개발이 지속적으로 요구되어 왔다.

이에 본 발명에서는 종래의 간흡충증의 진단항원의 문제점을 분자생물학적, 면역혈청학적 측면에서 규명하여 특이도가 유지되면서 민감도가 우수한 간흡충증 진단 및 치료용 항원을 제공하고자 한다.

본 발명에서는 간흡충류의 진단 및 치료에 유용한 항원활성을 갖는 단백질 및 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명에서는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 유효성분으로 하는 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 제공하고자 한다.

상기 간흡충류는 간흡충, 타이간흡충 및 고양이간흡충으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하고자 한다.

상기 유전자는 서열번호 5 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 유효성분으로 하는 간흡충류 진단용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 유효성분으로 간흡충류 예방용 또는 치료용 백신 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질에 대한 항체를 제공하고자 한다.

본 발명에서는 무세포성 고처리량 (cell-freehigh-throughput) 재조합단백질 발현시스템으로 특이도와 민감도가 우수한 항원단백질을 생산하여 간흡충증의 진단 및 치료에 유용한 항원단백질 및 항원단백질 조성물을 생산하였다. 본 발명의 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질은 특이성과 민감도가 우수하기에 간흡충류 감염의 예방 또는 치료하는 데 좋은 면역원 또는 면역자극제로 활용할 수 있으며, 또한 간흡충류를 진단하는데 진단용 항원으로 활용할 수 있으므로, 본 발명의 산업적 활용가치는 클 것이다.

도 1은 간흡충 EST 클론을 선택하기 위한 것으로, 도 1a는 분비단백질로 예측된 EST에서 절단부위 (cleavage site)를 확인한 것이며, 도 1b는 간흡충 전사체정보은행에서 선택된 EST의 리드 (read) 구성정보를 파악하여 개시코돈 (start codon)과 절단부위 (cleavage site)를 포함하는 1개의 리드 (read)를 선택한 것이다.
도 2은 PCR 프라이머 고안에 관한 것으로, 도 2a는 1차 PCR 프라이머를, 도 2b는 2차 PCR 프라이머를 나타낸다.
도 3은 밀배아 무세포성 단백질 합성 (Wheat germ cell-free protein synthesis) 과정을 나타낸 것이다 (출처: cell-free sciences).
도 4는 항체 단백질칩의 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 인퓨젼 클로닝 (In-fusion cloning)에 관한 것으로, 도 5a는 PCR 프라이머의 고안에 관한 것이며, 도 5b는 밀배아 무성포성 발현벡터 (Wheat germ cell-free expression vector)의 고안에 관한 것이다.
도 6는 간흡충 분비단백질의 cDNA를 확인한 결과를 일부 제시한 것이다.
도 7은 PCR 증폭산물을 나타낸 것으로, 도 7a는 1차 PCR 증폭산물을 일부 나타낸 것이고, 도 7b는 2차 PCR 증폭산물을 일부 나타낸 것이다.
도 8는 재조합 단백질배열-항체반응 (recombinant protein array-Antibody reaction) 형광 발색 결과를 일부 제시한 것이다.
도 9은 각 재조합 단백질의 간흡충 환자 혈청에 대한 양성반응강도를 정상대조군 혈청의 형광강도 (fluorescence intensity)에 대한 비율 (ratio)로 나타낸 것이다.
도 10은 항원 후보 EST 클론들의 cDNA insert를 확인한 것이다.
도 11는 밀배아 시스템 (wheat germ system)에서 생산한 항원후보 재조합단백질의 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 재조합단백질을 정제한 후 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 재조합 후보항원 단백질의 항원성을 검토한 것으로, ELISA를 이용한 간흡충 감염자 혈청 및 대조군 정상인 혈청 (-)에 대한 반응성 분석 결과를 나타낸 것이다 (Cs, 간흡충 감염 혈청; Ov, 타이 간흡충 감염 혈청; Pw, 폐흡충 감염 혈청).

본 발명에서는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질 및 상기 항원단백질을 코딩하는 유전자를 제공하고자 한다. 또한, 본 발명에서는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 유효성분으로 하는 조성물을 제공하고자 한다.

간흡충 감염자가 약 140만명으로 예상되어 국민건강에 심각한 위협이 될 수 있는 만큼, 간흡충의 관리는 필수적이다. 간흡충증 관리의 효율성을 증대시키기 위해서는 불특정 다수에 대한 대단위 검사가 반복적으로 이루어져야 한다. 또한, 병의원에서도 간흡충 감염을 수월하게 검사할 수 있어야 한다. 하지만 현재 간흡충증 진단을 위해서 사용되는 현미경충란검사법 등은 간흡충의 감염여부를 직접적으로 확인할 수 있지만, 감염초기나 경감염 또는 비충란성 감염의 검출이 어렵고 대량으로 검사를 하기에 부적합하며 충란을 감별할 수 있는 숙련된 전문인력이 필요하다는 단점이 있으며, 혈청학적인 진단법은 대단위 집단검사가 가능하지만 간흡충 충체부하가 낮은 경우 위음성(false negative)으로 판독될 가능성이 있는 등 종래의 방법에 따른 간흡충류의 진단 방법으로 민감도와 특이도를 둘 다 만족시키는 진단법이 정립되어 있지 않았다. 이를 극복하기 위하여 본 발명자는 간흡충류의 진단을 위해 민감도와 특이도를 높이면서 보다 저렴한 비용의 항원단백질을 제조하기 위해 노력하던 중, 본 발명의 단백질을 사용하면 항원 특이성이 우수할 뿐만 아니라 민감도를 높일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 제공한다.

본 발명의 간흡충류 (Liver Fluke)는 성충이 동물의 간 및 담도 등에 기생하는 생태를 가진 흡충류일 수 있으며, 바람직하게는 간흡충 (Clonorchis sinensis), 타이간흡충 (Opisthorchis viverrini) 및 고양이간흡충 (Opisthorchis felineus)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명자들은 간흡충류에 감염된 사람 또는 동물로부터 감염 여부를 확인하고 환자의 정확한 진단을 위하여 항원성을 갖는 유전자를 조작하여 항원성이 높은 단백질을 선별하고 제조하였다.

본 발명의 서열번호 1은 하기 실시예의 항원단백질 #12에 해당하는 것으로 183개의 아미노산 서열로 구성된다.

본 발명의 서열번호 2는 하기 실시예의 항원단백질 #15에 해당하는 것으로 107개의 아미노산 서열로 구성된다.

본 발명의 서열번호 3은 하기 실시예의 항원단백질 #17에 해당하는 것으로 139개의 아미노산 서열로 구성된다.

본 발명의 서열번호 4은 하기 실시예의 항원단백질 #18에 해당하는 것으로 274개의 아미노산 서열로 구성된다.

상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열 (도 14 참조)은 피낭유충으로 실험감염시킨 토끼에서 회수한 국내 환자에게서 분리된 간흡충 (Clonorchis sinensis)에서 유래된 것이다. 본 발명의 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 구성된 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 항원단백질은 당업계의 기술 내에 있는 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기법을 이용하여 합성에 의해 또는 재조합에 의해 생산된 것일 수 있는다. 이러한 기법은 문헌 [예, Sambrook Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(1989); DNA Cloning, Volumes I and II(D.N. Glovere, ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed., 1986); Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); Transcription and Translation(B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture(R.I. Freshney, ed., 1986); Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(1984); the Methods in Enzymology series(Academic Press, Inc.), especially volumes 154 and 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H. Miller and M.P. Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds.,(1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press, London); Scopes, (1987), Protein Purificaiton: Principles and Practice, Second Edition(Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986)]을 참조할 수 있는데, 무세포성 고처리량 (cell-freehigh-throughput) 재조합단백질발현시스템에 의해 제조된 재조합단백질일 경우 3차 구조를 유지시키면서도 많은 양의 단백질을 생산시켜 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

또한 상기 제조된 항원단백질은 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 의하여 지질화 내지 당화 등 당해 단백질이 가공된 것도 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

본 발명의 일례로, 본 발명의 항원단백질은 (가) 간흡충 전사체를 분석하여 분비 단백질 및 항원가능성 단백질의 cDNA클론을 선별하는 단계; (나) 상기 선별한 항원호보 단백질 cDNA 클론의 플라스미드 DNA를 추출하여 2단계 (two-step) PCR로 표적 cDNA를 증폭시키는 단계; (다) 상기 증폭시킨 cDNA를 밀배아 무세포 시스템 ( wheat germ cell-free system)을 이용하여 재조합 단백질을 합성하는 단계; 및 (라) 상기 재조합단백질 중에서 간흡충 감염자 혈청을 사용하여 항원성이 높은 클론을 선별하는 단계를 통해 제조된 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질일 수 있다.

본 발명은 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 흡충 감염자 혈청 및 대조군 정상인 혈청에 대하여 분석한 결과, 하기 도 13과 표 6에서 나타난 바와 같이 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 특이도와 민감도가 우수하였다.

본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질은, 단일단백질을 항원으로 한 것 (단일항원)일 수도 있고 복합단백질을 항원으로 한 것 (복합항원)일 수 있다.

간흡충은 담도 내에 기생하여 항원단백질이 담도상피층을 통과하여 숙주의 면역감시체계에 공시되어야 하는 비교적으로 공시효율이 낮은 해부학적 위치에 있다. 이러한 병태생리학적인 특성으로 인하여 간흡충 감염자에서 간흡충 특이항체 생산 효율이 낮으며 혈중 항체가도 높지 않다. 이와 같은 간흡충증의 병태생리학적인 특성을 고려할 때, 본 발명에서는 조항원 (crude extracts)의 높은 민감도를 유지하면서 교차 반응을 최소화시키는 방법으로, 본 발명의 일례로 단일항원을 여러 개 혼합하여 복합항원 (multi-antigen mix)을 제조하여 진단항원으로 사용할 수 있다.

본 발명의 간흡충 복합항원에 사용되는 단일항원단백질들은 특이도가 높아서 다른 기생충 및 병원체들과 감별진단할 수 있을 뿐만 아니라, 항원단백질들 상호간에 항원결정기가 서로 달라서 간흡충 감염자의 혈중에 있는 서로 다른 항체와 결합하여 복합항원의 양성반응율을 증가시킬 수 있다. 간흡충류의 단일항원단백질들이 서로 다른 조직에 분포하거나, 서로 다른 생리-대사경로에 속하면 항원결정기가 상이할 수 있으므로, 단일항원들이 서로 다른 항체와 결합하여 복합항원의 양성반응율 (민감도)을 향상시킬 수 있다.

본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하고자 한다.

본 발명의 유전자는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산을 코딩하는 모든 유전자를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 5 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 표시되는 유전자일 수 있다. 또한, 본 발명의 범위에는 이들 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전위 등과 같은 돌연변이를 통해 변형된 간흡충류에 항원 활성을 갖는 모든 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명의 서열번호 5는 상기 아미노산 서열번호 1 (항원단백질 #12)을 코딩하는 DNA 서열에 해당한다 (도 15 참조).

본 발명의 서열번호 6는 상기 아미노산 서열번호 2 (항원단백질 #15)을 코딩하는 DNA 서열에 해당한다 (도 16 참조).

본 발명의 서열번호 7은 상기 아미노산 서열번호 3 (항원단백질 #17)을 코딩하는 DNA 서열에 해당한다 (도 17 참조).

본 발명의 서열번호 8은 상기 아미노산 서열번호 4 (항원단백질 #18)을 코딩하는 DNA 서열에 해당한다 (도 18 참조).

본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 유효성분으로 하는 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질은 특이성과 민감도가 우수하기에, 간흡충류의 진단 시약 또는 진단 키트, 또는 간흡충류의 예방 또는 치료용 백신의 제조에 유용한 성분으로 이용될 수 있고, 간흡충류의 항체 생산에도 제공될 수 있다.

발명의 간흡충류 (Liver Fluke)는 성충이 동물의 간 및 담도 등에 기생하는 생태를 가진 흡충류일 수 있으며, 바람직하게는 간흡충 (Clonorchis sinensis), 타이간흡충 (Opisthorchis viverrini) 및 고양이간흡충 (Opisthorchis felineus)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 적용대상은 인간 또는 비인간을 포함하며, 바람직하게는 인간, 고양이, 개, 소, 양 등일 수 있으나, 이들 일례에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 유효성분으로 하는 예방 또는 치료용 능동 면역화용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 간흡충류 감염으로부터 치료하거나 그로부터 보호하기 위한 목적으로 디자인된 면역화용 백신을 제공하며, 이러한 백신은 당업계에 주지되어 있는 통상의 백신 제조 방법으로 제조될 수 있다.

면역학적 양의, 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 적합한 제약상 허용되는 비히클, 담체 또는 부형제와 조합하고, 인간 또는 동물을 면역화시키는데 유효한 양으로 상기 백신을 적절히 투여할 수 있다. 면역학적 양이란 인간 또는 동물에서 면역원성 반응을 일으키기에 충분한단백질 또는 그의 단편의 양을 지칭하는 것일 수 있다.

활성 성분으로서 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 백신을 제조하는 것은 당업계에 주지되어 있다. 전형적으로, 상기와 같은 백신은 액상 용액 또는 현탁액의 주사제로서 제조될 수 있고, 주사되기 이전에 액상의 용액 또는 현탁액으로 제조되기에 적합한 고체 제형으로도 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다. 활성 면역원성 성분은 대개 제약상 허용가능하고 활성 성분과 부형제 등과 함께 혼합될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들면, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 그의 조합물일 수 있으며, 선택적으로 백신은 소량의 보조 물질, 예를 들면, 습윤제, 유화제, pH 완충제 또는 백신의 효능을 증진시켜 주는 애주번트 (adjuvant)를 함유할 수 있다. 백신은 통상 주사에 의해 비경구적으로, 예를 들면, 피하로 또는 근육내로 투여된다. 기타 다른 투여 방식에 적합한 추가의 제제로는 좌제, 및 몇몇 경우에는 경구용 제제를 포함할 수 있다. 좌제의 경우, 종래의 결합제 및 캐리어는 예를 들면, 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함할 수 있고, 그러한 좌제는 활성 성분을 0.5％ 내지 10％, 바람직하게 1-2％의 범위로 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있으나 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다. 경구용 제제는 예를 들면, 제약 등 급의 만닛톨, 락토스, 전분, 스테아린산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같이 일반적으로 사용되는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 지효성 제제 또는 분제의 형태를 취하고, 활성 성분을 10％-95％, 바람직하게는 25-70％를 포함할 수 있으나 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 백신은 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 예로서, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 산 부가 염을 비롯한, 그의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. 유리 카르복실기로 형성된 염은 또한 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화 제2철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.

백신은 예방학적 또는 치료학적으로 유효하고 면역학적인 양으로 투여될 수 있다. 투여되는 양은 치료하고자 하는 피험체, 항체를 합성할 수 있는 피험체의 면역계의 능력, 및 원하는 보호 정도에 따라 달라질 수 있다. 투여되어야 하는 활성 성분의 정확한 양은 의료 진료의의 판단에 따라 달라질 수 있다. 피하 또는 근육 주사에 투여량은 예를 들면, 피험체 1명당 활성 성분 약 0.001 내지 10 mg일 수 있으며, 경구용, 직장 좌제용, 요도용 또는 질내용 제제의 경우, 투여량은 예시적으로 약 0.005 내지 50mg 범위일 수 있으나, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다. 최초 투여 및 추가 주사에 적합한 요법 또한 달라질 수 있지만, 최초 투여한 후, 후속 주사 또는 기타 다른 투여는 약 1 내지 약 2주 간격으로 수행되는 것이 일반적이나 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질에 대한 항체를 제공한다.

본 발명에서는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는데, 상기 항체들은 예를 들어, 문헌 ("Antibodies: A Laboratory Manual, Lane, H. D. et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) 또는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256:495497(1975)]의 주지된 방법 등 종래의 공지된 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 단백질 또는 그의 단편을 인식하는 항체는 간흡충의 단백질을 통상적인 방법으로 동물에서 적절하게 면역화시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 상기 항체들은 친화성 크로마토그래피, 면역학적 진단법 등에 사용될 수 있다. 면역 진단법은 면역블롯팅, 방사면역측정법(RIA), 효소 면역측정법 (ELISA), 형광 또는 발광 분석법 등으로부터 유용하게 선택될 수 있다.

본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 유효성분으로 하는 예방 또는 치료용 수동 면역화용 조성물을 제공한다.

면역학적 양의, 단백질 또는 그의 단편의 투여를 통해 항체가 환자에서 생성되는 것인 활성 백신 이외에도, 본 발명의 단리된 항체 또는 그의 활성 단편은 또한 감흡충 감염에 대해 수동 면역화시키기 위한 제약 조성물 및/또는 백신 개발에 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는 간흡충류에 의해 유발된 감염을 치료 또는 예방하기 위한 목적으로 인간 또는 동물에게 투여하기에 적합한 제약 조성물로 형성될 수 있다. 본 발명의 항체를 함유하는 제약 조성물은 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 기타 다른 치료학적 화합물, 그의 조합물을 비롯한, 당업계에서 보편적으로 사용되는 임의의 적합한 제약 비히클, 부형제 또는 담체와 함께 조합하여 제조될 수 있다. 제약 조성물의 적합한 투여 방법으로는 국소, 경구, 항문, 질내, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비내, 및 진피내 투여를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 피하 또는 근육 주사에 투여량은 예를 들면, 피험체 1명당 활성 성분 약 0.001 내지 10 mg일 수 있으며, 경구용, 직장 좌제용, 요도용 또는 질내용 제제의 경우, 투여량은 예시적으로 약 0.005 내지 10mg 범위일 수 있으나, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체 조성물은 또한 면역원성 반응을 증진시키는 데 유효한 양으로 적합한 애주번트와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 적합한 애주번트로는 알룸 (인산알루미늄 또는 수산화알루미늄)및 기타 다른 애주번트, 예를 들면, 사포닌 및 그의 정제된 성분인 Quil A, 프로인트 완전 애주번트, RIBBI 애주번트, 및 연구용 및 수의학적 용도로 사용되는 기타 다른 애주번트를 포함할 수 있다. 기타 다른 화학적으로 정의된 제제의 예로는 무라밀 디펩티드, 모노포스포릴 지질 A, 인지질 접합체, 프로테오리포좀 내 접합체의 캡슐화, 및 지질 소포체 중의 단백질 캡슐화를 포함한다.

본 발명에 따른 항체 조성물의 투여를 위한 바람직한 투여량은 감흡충류 감염을 예방 또는 치료하는 데 유효한 양이 되고, 상기 양은 감염의 성질, 및 피험체의 상태에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 항체 또는 제약 제제의 "유효량"이란 원하는 예방학적 또는 치료학적 효과를 발휘할 수 있는, 비독성이되 충분한 상기 제제의 양을 의미하는 것으로 한다. 요구되는, 항체 또는 특정 제제의 정확한 양은 피험체의 종, 연령, 및 일반적인 건강 상태, 치료하려는 병태의 중증도, 사용되는 특정 담체 또는 애주번트, 및 그의 투여 방식 등에 따라 피험체마다 달라질 것이다. 따라서, 임의의 특정 항체 조성물의 "유효량"은 특정의 환경을 토대로 하여 달라질 것이고, 적절한 유효량은 각각 적용시마다 통상의 실험을 사용함으로써 당업계의 숙련인에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 조성물을 투여받는 각개의 피험체에게 적합하도록 조절될 수 있으며, 이는 각 개체의 연령, 체중, 및 대사에 따라 달라질 것이다. 조성물은 또한 안정화제 또는 제약상 허용되는 방부제를 함유할 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체는 투여시에 더 작은 면역원성을 갖도록 변형될 수 있다.

본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 유효성분으로 하는 간흡충류 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질을 진단용 항원으로 하는 진단용 키트를 제공하는 것으로 간흡충류에 의해 발병되는 질병을 진단할 경우, 바람직하게는 혈청학적 진단을 할 경우 유용하며, 본 발명의 단백질은 항원성이 매우 강력하여 민감도와 특이도가 뛰어나며 재조합이나 화학 합성된 단백질만을 항원으로 사용할 수 있기 때문에 조작 및 진단시 안정성이 높다는 장점이 있다.

또한 본 발명에 따른 간흡충류의 진단용 항원은, 당업계에서 일반적으로 진단항원을 사용하여 질병을 진단하는 모든 진단방법 및 간흡충류 검출을 확인하는 진단방법에 제공될 수 있으며, 이러한 일례로 한천겔침강법 (AGID), 효소결합면역측정법 (ELISA), 면역크로마토그래피 반응법, 간흡충증 신속진단키트(RDT, Rapid Diagnostic Test) 등에 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 피검체로부터 채취한 생물학적 항체시료와 본 발명에 따른 간흡충류 진단용 항원을 반응시켜 항원-항체 반응을 검출하는 진단키트에 제공될 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예 및 실험예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예, 및 실험예에 의해 제한되지 않는다.

< 실시예 >

실시예1 : 간흡충 항원후보 단백질의 cDNA 선별

실시예 1-1 : 간흡충 전사체 정보 분석

1) 간흡충 분비단백질 예측

간흡충 전사체은행에 등록되어 있는 간흡충 전사체 cDNA 클러스터 (cluster) 12,830개를 분비단백질을 생물정보학적으로 예측하는 SignalP-natural networks와 SignalP-hidden Markov model 프로그램(http://www.cbs.dtu .dk/services/SignalP/)을 이용하여 분석하였다.

2) EST clone 선택

간흡충 전사체는 1개의 리드 (read)로 이루어진 싱글릿 (singlet)과 2개 이상의 리드로 이루어진 클러스터로 구성되었다. 분비단백질로 예측된 EST (expressed-sequenced tag)가 클러스터일 경우, 절단부위 (cleavage site)를 포함하고 있는 리드를 선택하였다 (도1 참조).

실시예 1-2 : 항원 단백질 cDNA 선별

간흡충 전사체 정보를 분석하여 항원성을 가지고 있다고 예측되는 EST를 선별하였으며, 간흡충 전사체의 주석 (annotation) 정보를 활용하여 다른 생물체에서 항원성을 가지고 있다고 예측된 단백질과 유사도가 높은 항원 후보의 EST를 선택하였다.

실시예 1-3 : 프라이머 DNA 추출

선별한 EST 클론의 세포 스톡 (cell stock)에서 플라스미드 DNA를 추출하였다.

1) 간흡충 전사체 정보를 획득하기 위해 제작된 간흡충 cDNA 라이브러리는 pBK-CMV, pBluscript-SK(-) 또는 pAD-GAL4-2.1에 구축되어 있다. 선별한 607개의 EST clone 가운데 pBK-CMV 벡터에 구축된 515개 클론은 카나마이신이 포함된 LB 배지에서, pBluescript-SK(-) 또는 pAD-GAL4-2.1에 구축된 92개 클론은 암피실린이 포함된 LB 배지에서 배양하였다.

2) QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)을 사용하여 간흡충 항원후보 단백질의 cDNA가 포함된 플라스미드 DNA 추출하였다.

3) 보유한 간흡충 전사체은행의 정보는 EST 염기서열이기 때문에 삽입 (insert) cDNA의 전체 길이에 대한 정보가 없었다. 이를 확인하기 위하여 pBK-CMV에 구축된 515개 clone은 제한효소 BamHI과 SmaI (Roche, Mannheim, Germany)으로 pBluescript-SK(-)에 구축된 68개와 pAD_GAL4-2.1에 구축된 24개 클론은 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 이중소화시켰다.

실시예 2: 밀배아 세포 근거한 무세포성 단백질 합성 ( Wheat germ cell based cell - free protein synthesis) 시스템을 이용한 재조합단백질 다량 생산

실시예 2-1: Primer 고안 및 합성

1) 1차 PCR 프라이머 고안 (도 2a 참조)

타겟 cDNA에 2차 PCR의 센스 프라이머 (sense primer)인 deSP6E02his-S1가 결합할 수 있도록 S1 서열이 포함되도록 프라이머를 제작하였다.

우선, 절단부위 (Cleavage site)를 포함하는 ORF을 선택하고 개시코돈 (start codon)을 포함하여 23±2 nt 길이의 유전자 특이적 프라이머 (gene-specific primer)를 고안한 후, 센스 프라이머에 S1 서열을 포함시켰다. 안티센스 프라이머 (Antisense primer)는 간흡충 cDNA가 클로닝되어 있는 벡터의 서열을 이용하여 고안하였다. 고안한 프라이머를 바이오니아 (Bioneer, Daejeon, Korea)에서 합성하였다.

2) 2차 PCR 프라이머 고안 (도 2b 참조)

PCR 산물에 SP6 프로모터 서열과 E01 번역 인핸서 서열 (translational enhancer sequence) 및 His-tag이 부가되도록 프라이머를 제작하였다.

SP6 프로모터의 5'-말단의 서열을 포함하는 SPU 프라이머를 고안하였고, SP6 프로모터의 3'-말단의 서열, E01 번역 인핸서 서열 (translational enhancer sequence)와 His-tag 서열을 포함하는 deSP6E02his-S1 프라이머를 고안하였다. 안티센스 프라이머 (Antisense primer)는 1차 PCR에 사용한 것과 동일한 것을 사용하였다. 고안한 프라이머를 바이오니아(Bioneer, Daejeon, Korea)에서 합성하였다.

실시예 2-2: 표적 cDNA 의 증폭

2단계 (Two-step) PCR을 실시하여 밀배아 무세포성 단백질 합성 (wheat germ cell-free protein synthesis)를 위한 선형의 PCR-증폭된 유전자 (linear PCR-amplified gene)를 준비하였다.

1) 1차 PCR

추출한 간흡충 항원후보 단백질의 플라스미드 DNA 1 μl, 10 pM 유전자 특이적 (gene-specific) 1st PCR_센스 프라이머 1 μl, 10 pM 안티센스 프라이머 1 μl, 2 mM 각각 dNTP 1 μl, 25 mM MgCl₂ 2 μl, AmpliTaq Gold polymerase (ABI, Foster City, CA, USA) 0.25 μl, 10x buffer 2 μl, 증류수 11.75 μl를 혼합하여 20 μl의 반응액을 조성하였다. DNA 폴리머라아제 94℃에서 활성화시키고, 94℃에서 1분간 변성, 65℃에서 1분간 어닐링 (annealing), 72℃에서 1분간 확장 (extension)을 25회씩 반응시켰다.

2) 2차 PCR

1:10으로 희석시킨 1차 PCR 산물 1 μl, 0.1 μM deSP6E02his-S1 프라이머 0.5 μl, 10 μM SPU 프라이머 0.5 μl, 10 μM 안티센스 프라이머 0.5 μl, 2.5 mM 각각 dNTP 4 μl, 5 U/μl Ex Taq 폴리머라아제 0.25 μl, 10x 버퍼 5 μl, 증류수 38.25 μl를 혼합하여 50 μl의 반응액을 조성하였다. DNA 폴리머라아제 94℃에서 활성화시키고, 98℃에서 10초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 확장 (extension)을 35회씩 반응시켰다.

실시예 2-3: 간흡충 항원후보 단백질의 대량생산

밀배아 근거한 무세포성 단백질 합성 방법 (Wheat germ based cell-free protein synthesis)으로 간흡충 진단 항원후보 단백질을 생산하였다.

1) 밀배아 무세포성 전사 및 번역 (Wheat germ cell-free transcription 및 translation)

96 웰 플레이트 (well plate)에 1 ug의 2차 PCR산물을 분주하였다.

전사용 (Transcription) 시약은 1.5x 전사용 버퍼 (Transcription buffer), 3. 75 mM NTP mix, 1.2 U/ul RNases 저해제, 2.4 U/ul SP6 RNA 폴리머라아제의 시약을 얼음 위에서 섞어 준비하였고, 번역용 (Translation) 시약은 120 OD/ml WEPRO1240, 40 ng/ul 크리아틴 키나아제 (creatine kinase)를 준비하였다. 사용될 SUB-AMIX 시약을 얼음위에서 녹여 준비하였다.

2차 PCR 산물이 있는 플레이트와 전사용 (Transcription) 시약과 번역용 (Translation) 시약의 혼합물과 준비해 놓은 SUB-AMIX 시약를 자동화된 단백질 합성기기 (robotic protein synthesizer)에 장착하였다.

전사용 (Transcription) 시약이 자동으로 96 웰 플레이트 (well plate)에 첨가되고 37℃에서 6시간 동안 반응하여 mRNA를 생산시켰다.

번역용 (Translation) 시약과 준비해 놓은 SUB-AMIX 시약 시약이 자동으로 첨가되어 26 ℃에서 16시간 동안 반응되어 단백질이 생산되었다 (도 3 참조).

실시예 2-4: 단백질칩을 통한 항원성 검정

본 발명은 밀배아 시스템 (Wheat germ system)을 이용하여 생산된 단백질을 단백질칩을 통해 사람혈청에 반응시켜 항원성을 판단하였다(도 4 참조).

1) 단백질칩 준비

유리슬라이드에 시약을 처리하여 항체가 잘 붙도록 아민칩 (amine chip)을 준비하였다. 구체적으로, 유리슬라이드를 70 ℃ 온도의 H₂O₂/NH₄OH/H₂O(1:1:5,v/v)용액에 10분간 담가 세척한 후, 1.5% 3-아미노프로필트리메톡실란 (aminopropyltrimethoxysilane)을 95% 에탄올(v/v)에 녹인 용액에 2시간 동안 둔 후, 에탄올, 증류수의 순서대로 3번씩 씻어주었다. 이 아민 도포된 (amine-modified) 유리 슬라이드를 에어가스로 말리고, 110 ℃에서 1시간 동안 구워주었다. 이 슬라이드에 직경 1.5 mm 인 200개 (25x8) spot 모양의 테프론 테이프를 붙여 웰 (well) 형태의 단백질칩 (protein chip)을 제작하였다.

2) 항체슬라이드 제작

준비된 아민칩에 안티 히스티딘 (anti-histidine) 항체를 처리하여 항체 슬라이드를 제작하고 재조합 단백질과 반응시켰다. 즉, 펜타- 히스 항체 (penta-His antibody) (Qiagen, Hilden, Germany)를 10 ug/ml의 농도로 인산 버퍼 (phosphate buffer)에 희석하여 1 ul씩 스포팅 (spotting)하고 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 반응시킨 어레이 (array)를 0.1% Tween-20가 첨가된 PBS로 10분간 세척하고 2차 증류수로 5분간 세척한 다음 에어가스로 말렸다 (단계마다 동일). 이 후 단백질칩에 대한 비특이적 상호작용 (nonspecific interaction)을 브로킹 (blocking) 하기 위해 5% BSA가 첨가된 PBS/T로 37℃에서 1시간 처리해준 후 세척 (위와 동일) 한 다음, 각각의 밀배아 시스템 (wheat germ system)을 이용하여 생산한 항원 단백질을 1 ul씩 각 웰 (well)에 스포팅 (spotting) 한 후 37℃에서 1시간 반응시킨 후 세척하였다. ELISA검사를 통해 기생충증에 감염되지 않은 환자의 혈청 또는 간흡충중에 감염된 환자들의 pooled-혈청을 인산버퍼로 50배 희석시켜 이 희석된 환자혈청을 1 ul 씩 각 웰 (well)에 스포팅 (spotting) 한 후 37℃에서 1시간 반응 후 세척하였다. 각각의 웰 (well)에 alexa 546-anti-human IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 10 ug/ml의 농도로 스포팅 후 37℃에서 1시간 반응시킨 후 슬라이드를 1% Tween-20가 포함된 PBS에서 20분간, 2차 증류수에서 5분간 세척하였다. 형광 스캐너 (fluorescence scanner)를 이용하여 543 nm laser (Perkin Elmer, MA, USA)로 각각의 강도 (intensity)를 측정하였다. 모든 실험은 3차례 반복실험하였다 (Jung et al., 2009).

실시예 3: 단백질 칩을 통해 항원 후보로 선택된 EST 의 클로닝과 wheat germ cell - free system 을 이용한 재조합단백질의 과량 생산과 단백질 칩을 통한 항원성 평가

실시예 3-1 : 항원후보 EST 의 클로닝

단백질 칩을 통해 항원성이 높게 평가되어 선별된 EST (expressed-sequenced tag)의 ORF를 밀배아 무세포성 시스템 (Wheat germ cell-free system)의 재조합 단백질을 생산하기 위해 밀배아 무세포성 시스템 발현벡터에 클로닝을 실시하였다.

1) 인퓨전 클로닝 (In-fusion cloning) 실시

삽입체의 양 말단에 밀배아 무세포성 발현벡터 (wheat germ cell-free expression vector) (pEU-E01-His-TEV-N2) 에 대해 상동서열 (homologous sequence)를 포함하도록 프라이머를 제작하였다. 또한, PCR하여 벡터와 삽입체의 상동 부위의 융합이 일어나도록 하는 효소를 이용하여 정확하고 빠르게 클로닝하도록 실시하였다.

우선, 센스 프라이머와 안티센스 프라이머 각각에는 5' 방향에 EcoRV나 BamHI 제한효소부위를 포함하여 벡터에 상동한 16-20 bp의 서열을 포함하고 3' 방향에는 선별된 EST에 대해 특이적인 22-33 bp의 서열을 첨가하여 (도 5a 참조) 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 1.25 U의 EX Taq 폴리머라아제 (Takara, Japan), 1x 버퍼, 20 uM dNTP, 각각 0.4 pmole의 센스 프라이머, 안티센스 프라이머를 첨가하여 반응액을 조성하였다. DNA 폴리머라아제를 94℃에서 5분간 활성시키고, 94℃ 에서 1분간 변성 (denaturation), 63℃또는 68℃에서 30초간 어닐링 (annealing), 72℃에서 1분간 확장 (extention)을 30회씩 반응시켰다. 이후, 1% 아가로스겔에 전기영동하여 PCR 산물의 질과 양을 확인한 후 PCR 정제키트 (Qiagen, Germany)를 사용하여 정제하였다. EcoRV와 BamHI 제한 효소 처리된 pEU-E01-His-TEV-N2 vector (Cellfree sciences, Japan; 도 5b)와 정제된 PCR 산물을 가지고 인퓨전 어드벤티지 PCR 클로닝 키트 (In-fusion advantage PCR cloning kit) (Clontech, USA)를 이용하여 각각 37℃에서 15분간, 50℃에서 15분간 반응시켰다. 반응물을 TE 버퍼에 5배로 희석하고 그중 2.5 ul를 TOP10 (Invitrogen, USA) 세포에 트랜스포메이션 (transformation)하고 암피실린이 포함된 LB배지에 도포한 후 37℃에서 16 시간 두어 박테리아 콜로니를 배양하였다. 얻어진 콜로니는 rapid PCR과 콜로니 배양후 miniprep를 실시하여 얻은 DNA를 제한효소로 처리 후 아가로스겔에 전기영동하여 삽입체 크기를 확인하여 선별되었고, 자동 염기서열분석 (automatic sequencing) (Macrogen, 서울)을 실시하여 ORF연결을 검정하였다.

2) 플라스미드 DNA의 과량생산

1ug/ul의 고농도 플라스미드 DNA가 준비하기 위해 박테리아를 배양하여 midiprep을 실시하였다. 우선적으로, ORF가 확인된 클론의 박테리아를 암피실린을 포함한 LB배양액에 밤새 배양하였다. RNase A를 첨가하지 않은 Midiprep kit (Viogene, Taiwan)를 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하여 모아 TE 버퍼에 녹여 1 ug/ul 되도록 준비하였다.

실시예 3-2 : 간흡충 항원후보 단백질의 과량생산

밀배아 근거한 무세포성 단백질 합성 (Wheat germ based cell-free protein synthesis) 방법으로 히스티딘 태그 (histidine tag)가 부가된 간흡충 항원후보 재조합단백질을 대량 생산하고 니켈 (nickel) 세파로오즈를 사용하여 정제하였다.

실시예 3-1-2에서 정제한 플라스미드 DNA를 25 ug씩 분주하였다.

전사용 시약은 한 반응당 250 ul씩 되도록 1x 번역용 버퍼, 2.5 mM 뉴클레오티드 트리포스페이트 (NTP mix), 1 U/ul RNase 저해제, 1 U/ul SP6 RNA 폴리머라아제의 시약을 얼음 위에서 섞어 준비하였다. 상기 혼합액을 37 ℃ 배양기 (incubator)에서 6시간 동안 반응시켜서 RNA로 전사한 후, 반응액을 아가로스젤에 전기영동하여 RNA의 양과 질을 확인하였다. 번역용 시약은 얼음 위에서 녹여 120 OD/ml WEPRO7240H, 40 ng/ul 크레아틴 키나아제 (creatine kinase)를 준비하였다. 전사용 시약에서 생성된 mRNA 용액 250 ul와 번역용 혼합물 (translation mixture) 250 ul 를 섞어서 6-웰 플레이트의 각 웰에 분주하였다. 얼음 위에서 녹여 준비한 5.5 ml의 1x SUB-AMIX SGC용액을 번역용 혼합물 (translation mixture)위에 오버레이 (overlay)하였고, 증발을 방지하기 위해 파라핀으로 봉(sealing)하였다. 상기 혼합액을 15 ℃에서 20시간 동안 반응시켜서 단백질을 생산하였다.

이후, 니켈 세파로오즈 (Nickel sepharose)의 액체 부분을 따라내고 증류수를 첨가하였다. 컬럼에 레진 (resin)을 쏟아 붓고 equilibration buffer (=wash buffer: 20 mM phosphate buffer, 0.3 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 7.5)를 컬럼에 장전하였으며, 재조합단백질이 발현된 용액 (solution)을 컬럼에 10번 통과시킨 후, 컬럼을 컬럼 부피의 10배되는 워싱 버퍼로 세척하였다. 용출 버퍼 (elution buffer) (20 mM phosphate buffer, 0.3 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.5)를 사용하여 재조합단백질을 용출 (elution)시켰고, 용출시킨 재조합단백질을 PBS 버퍼에 투석하였다. 그런 다음, 단백질의 농도를 측정하고, 단백질 발현 정도를 검정하기 위하여 정제한 단백질을 12.5% SDS-PAGE를 실시하였다.

실시예 3-3: ELISA 기법을 이용한 재조합단백질의 항원성 검정

밀배아 무세포성 단백질 합성 (Wheat germ based cell-free protein synthesis) 시스템에서 발현, 정제한 단백질을 최종농도 2.5 ug/ml 이 되도록 0.05 M 카보네이트 버퍼 (carbonate buffer) (pH 9.6)에 희석시켜 96 well EIA 플레이트 웰 (plate well)에 200 ul씩 분주하였다. 대조군으로 간흡충 충체에 PBS를 첨가하여 균질기 (homogenizer)로 마쇄하였다. 균질액을 원심분리하여 상층액을 회수하여 조항원을 준비하였다. 조항원을 카보네이트 완충액으로 농도가 5 ug/ml 되도록 보정하여 사용하거나 200 ul씩 분주하여 -70℃에 보관하였다. 항원 플레이트를 4℃에서 밤새 반응시킨 후, 항원 플레이트를 PBS-0.05% tween-20 (PBS/T)로 5번 세척하였다. 항원성 검정에 간흡충 감염자 환자 혈청 83개, 타이간흡충 감염자 혈청 35개, 폐흡충 감염자 혈청 14개, 기생충 비감염 정상인 혈청 40개를 사용하였다. 환자의 혈청을 PBS/T로 1:100으로 희석하였다. 각 항원이 도포(coating)된 각 웰에 희석된 혈청 200 ul씩을 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBS/T로 5번 세척하였다. Goat-peroxidase human IgG 2차 항체를 1:4000으로 PBS/T에 희석하여 각 웰에 200 ul씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 각 웰을 PBS/T로 5번 세척하였다. 메탄올에 녹아있는 기질 o-페닐렌 다이아민 (phenylene diamine)을 최종농도 0.005%가 되도록 증류수에 희석하고 최종농도 0.025%가 되도록 과산화수소를 첨가하였다. 각 웰 (well)에 희석된 기질 200 ul 을 첨가하고 20분후에 25 ul의 8 N H₂SO₄를 넣어 발색반응을 정지시킨 후, ELISA 리더 (reader)에서 490 nm로 흡광도를 측정하였다. 이후, 정상인 대조군의 흡광도 평균값에 표준편차 2배를 합한 값을 cutoff 값으로 설정하고 양성 혈청을 판정하였다.

< 실험예 및 결과>

실험예 1. 간흡충 항원후보 단백질의 cDNA 선별

실험예 1-1: 간흡충 분비단백질의 cDNA 선별

연구진이 보유하고 있는 간흡충 전사체를 분석하여 항원후보 단백질의 cDNA를 선별하였다. SignalP 3.0으로 분석하여 분비단백질로 예측된 793개 간흡충 전사체 정보를 확보하였는데, 247개의 싱글릿 (singlet)과 546개의 콘티그 (contig)가 선별되었다. 콘티그 (Contig)는 리드 (read) 구성 정보를 확인하여 절단부위 (cleavage site)를 포함하는 리드를 선택하였는데, 동일한 리드가 선택된 237개를 제외하였고, 간흡충 분비단백질의 EST 리드 556개를 선택하였다.

하기 표 1은 간흡충 분비단백질의 cDNA를 선별한 것이다.

실험예 1-2: 간흡충 항원성 단백질 cDNA 선별

항원성이 있다고 예측되는 EST가 코딩하는 아미노산 서열을 분석하여 cDNA를 선별하였다. 주석정보를 분석하여 71개의 EST가 항원성이 있는 단백질을 코딩할 것으로 예측되었는데, NCBI 등록정보와 발표된 논문을 확인하여 항원성이 확인된 것은 제외시켜 51개를 최종적으로 선택하였다. 콘티그의 리드 구성정보를 확인하여 주석 (annotation) 정보와 ORF가 일치하는 리드를 선택하였다 (표 2 참조).

실험예 1-2: 간흡충 항원성 단백질 cDNA 선별

항원성이 있다고 예측되는 EST가 코딩하는 아미노산 서열을 분석하여 cDNA를 선별하였다. 주석정보를 분석하여 71개의 EST가 항원성이 있는 단백질을 코딩할 것으로 예측되었는데, NCBI 등록정보와 발표된 논문을 확인하여 항원성이 확인된 것은 제외시켜 51개를 최종적으로 선택하였다. 콘티그의 리드 구성정보를 확인하여 주석 (annotation) 정보와 ORF가 일치하는 리드를 선택하였다.

하기 표 2는 간흡충 항원성 단백질의 cDNA를 선별한 것이다.

실험예 2. 플라스미드 DNA 추출 및 삽입 cDNA 확인

하기 도 6에 나타난 바와 같이, 간흡충 항원후보 단백질 EST의 플라스미드 DNA를 추출하고 제한효소 2종으로 이중소화시켜서 삽입 cDNA를 확인하였다. 이때, 선별된 EST 클론들은 모두 0.3-2.5 kb의 삽입 cDNA를 가지고 있었다 (도 6 참조).

실험예 3. 밀배아 세포 근거한 무세포성 단백질 합성 시스템 ( Wheat - germ cell based cell - free protein synthesis system )을 이용한 재조합단백질 다량 생산

실험예 3-1. 프라이머 고안 및 제작

1) 1차 PCR 프라이머 고안 및 제작

간흡충 항원후보 단백질을 코딩하고 있는 cDNA를 증폭시키기 위해 S1-유전자 특이적 프라이머(5‘-CCACCCACCACCACCAATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3') 480개 (표 3 참조)와 안티센스 프라이머 (5'-TAATACGACTCACTATAG-3') 1개를 제작하였다.

2) 2차 PCR 프라이머 고안 및 제작

2차 PCR에 사용할 SPU 프라이머 (5'-GCGTAGCATTTAGGTGACACT-3')와 deSP6E02his-S1 프라이머

(5'-GGTGACACTATAGAACTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTATGGGACATCATCATCATCATCATCTCCACCCACCACCACCAATG-3')를 제작하였다.

하기 표 3은 고안 및 제작된 S1-Gene-specific primer를 나타낸 것이다.

실험예 3-2. Target cDNA 의 PCR 증폭산물

2단계 (Two-step PCR)을 통해 전사과 번역 조절인자가 부가된 타겟 cDNA가 증폭되었다. 1차 PCR 산물은 특이성이 높게 단일 크기로 증폭되었다 (도 7a 참조). 2차 증폭산물은 2차 PCR 프라이머에 부가된 nucleotide 때문에 1차 증폭산물보다 각각 98 bp씩 길이가 증가되었다 (도 7b 참조). 밀배아 세포 근거한 무세포성 단백질 합성 시스템 (Wheat-germ cell based cell-free protein synthesis system)으로 재조합 단백질 생산에 사용될 수 있다고 판정되었다.

실험예 3-3. 간흡충 항원부호 단백질의 대량생산

간흡충 항원후보 단백질 EST의 2차 PCR생성물을 template로 사용하고 밀배아 무세포시스템과 자동화 시스템 (automatic system)을 이용하여 총 434개의 간흡충 항원 후보재조합 단백질을 합성하였다.

실험예 3-4. 단백질 칩을 통한 항원성 검정

아민도포슬라이드를 사용하여 434개 항원 후보단백질로 제작한 항원 어레이 (Antigen array)를 간흡충 감염자 혈청에 반응시켜 우수한 항원성을 보이는 EST를 선별하였다 (도 8참조).

슬라이드글라스에 히스티딘 항체를 도포하여 재조합 단백질을 포획하고, 간흡충증 환자의 혈청 또는 정상대조군 혈청을 1차 항체로, 형광물질로 표지된 2차 항체를 반응시켰다. 각 항원후보 단백질에 대한 FI (Flurescence intersity) 값을 정량하였으며, 모든 실험을 세 번 반복하였다.

하기와 같이, 정량화된 FI값은 다음의 식에 따라 분석되었다. 각각의 항원단백질에 대한 정상대조군 혈청을 처리한 FI값에 대해 간흡충 감염차 혈청 FI값의 fold 값으로 환산하여 분석하였다.

FI값의 fold 값 = [간흡충 감염자 pooled 혈청의 F1-background (wheat germ lysate only)의 FI] / [정상대조군 individual 혈청의 F1-background (wheat germ lysate only)의 FI]

세 차례 측정된 fold 값의 평균값을 구하고 fold값 6.85를 cutoff value로 설정하였다. EST 18개가 우수한 항원성을 보이는 후보항원으로 선별되었다 (도 9참조).

하기 표 4는 선별된 간흡충 항원후보의 정보를 나타낸 것으로, 18종의 EST 중 10종은 주혈흡충에서 발견된 단백질과 상동성을 갖고 있었다.

#	선택 EST	size		homology
		DNA (bp)	Protein (aa)	description	accession #	Identity	similarity	ref.**
1	CSA03055	711	236	tetraspanin family protein 16 invertebrate [Schistosoma mansoni]	XP_002569677.1	61	79	1
2	CSA05948	702	233	hypothetical protein [Schistosoma mansoni]	XP_002571754.1	43	66	1
3	CSA12898	858	285	growth hormone inducible transmembrane protein [Schistosoma mansoni]	XP_002574047.1	61	75	2
4	CSA16074	516	171	Secretory carrier-associated membrane protein 2 [Schistosoma japonicum]	CAX73062.1	71	81	1
5	CSA17665	1030	345	wipi-2 [Schistosoma mansoni]	XP_002576588.1	47	59	1
6	CSA17770	810	269	hypothetical protein, conserved [Trypanosoma brucei gambiense DAL972]	CBH11066.1	26	48	un
7	CSA18047	789	262	Vaculor amino acid transporter 6 [Ajellomyces capsulatus G186AR]	EEH05512.1	24	36	un
8		339	112	egg antigen [Paragonimus westermani]	AAS19361.1	56	67	3
9	CSM16820	1026	342	phosphatidylinositol glycan, class K [Schistosoma japonicum]	CAX82646.1	69	80	2
10	CSM19335	921	306	hyphthetical protein [Schistosoma japonicum]	XP_002578148.1	66	78	1
11		393	130	30S ribosomal protein S8 [Schistosoma mansoni]	XP_002578848.1	93	96	1
12	CSA04599_3	552	183	AGAP010490-PA [Anopheles gambiae str. PEST]	XP_558026.3	33	53	4
13	CSA13676_1	855	284	hypothetical protein [Schistosoma japonicum]	CAX69435.1	33	55	2
14	CSA16201_3	1176	391	(acyl-carrier-protein) S-malonyltransferase [Ruminococcus sp. 18P13]	CBL18351.1	24	40	un
15	CSA17308_3	324	107	hypothetical protein [Saccoglossus kowalevskii]	XP_002731613.5	30	40	un
16	CSA19035_1	390	129	FAD-dependent pyridine nucleotide-disulphideoxido reductase [Sulfolobus islandicus]	YP_002832212.1	31	52	5
17	CSA19133_3	420	139	predicted protein [Thalassiosira pseudonana CCMP1335]	XP_002293814.1	30	41	6
18	CSA28266_3	825	274	lysosome-associated membrane glycoprotein [Schistosoma mansoni]	XP_002574693.1	33	51	1

** references

1. Berriman, M, et al., (2009) The genome of the blood fluke Schistosoma mansoni. Nature 460 (7253), 352-358

2. Zhou Y, et al., (2009) The Schistosoma japonicum genome reveals features of host-parasite interplay. Nature 460(7253):345-51.

3. Lee, J.S., et al., (2007) Molecular cloning and characterization of a major egg antigen in Paragonimus westermani and its use in ELISA for the immunodiagnosis of paragonimiasis. Parasitol. Res. 100(4):677-681

4. Mongin, E., et al., (2004) The Anopheles gambiae genome: an update. Trends Parasitol. 20(2):49-52

5. Reno, M.L., et al., (2009)Biogeography of the Sulfolobus islandicus pan-genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106(21): 8605-8610

6. Bowler, C., et al., (2008) The Phaeodactylum genome reveals the evolutionary history of diatom genomes. Nature 456 (7219):239-244

실험예 4. 단백질 칩을 통해 항원 후보로 선택된 EST 의 클로닝과 밀배아 무세포성 시스템 ( wheat germ cell - free system )을 이용한 재조합단백질의 대량 생산과 ELISA를 통한 항원성 평가

실험예 4-1. 항원후보 EST의 클로닝

아민칩 (Amine chip) 분석에서 선별된 총 18종의 간흡충항원후보를 밀배아기반 무세포 발현시스템에서 사용되는 발현벡터 (wheat germ cell-free system expression vector: pEU-E01-His-TEV-N2)에 클로닝하고 rapid PCR을 실시하여 삽입 DNA를 확인하였다. 플라스미드 DNA를 추출하고 제한효소 2종으로 이중소화시켜 삽입과 벡터 DNA를 확인하였다 (도 10 참조). 또한 자동화 염기서열 분석 (automatic sequencing)을 실시하여 태크 펩티드 (tag peptide)와 표적 항원단백질의 ORF가 올바르게 연결된 것을 확인하였다.

실험예 4-2. 간흡충 항원후보 단백질 대량생산 및 정제

밀배아 무세포성 시스템 (Wheat germ cell-free system)을 이용하고 전사와 연역 과정을 자동화기기를 사용하여 실시하였다 (도 3 참조). 생성된 재조합단백질을 부가되어있는 히스티딘 태그 (histidine tag)를 이용하여 니켈 세파로오즈 (nickel sepharose)로 정제하였다. 웨스턴 블로팅 (Western blotting)을 통해 히스티딘 테깅 (Histidine tagging)된 예상하는 크기의 재조합단백질이 확인되었다(도 11 참조).

아민칩 (Amine chip)으로 선별된 총 18종의 단백질 중, 항원성이 우수해 보이는 11종을 재조합단백질로 대량 생산하기 위하여 실험하였다. 그 결과 6종은 불용성 단백질로 발현되었고, 1종은 발현 정도가 미약했으며 4종만이 수용성 단백질로 발현되어 정제하였다 (도 12 참조). 재조합 단백질을 두 번 발현, 정제하였다. 각각 500 ul씩 단백질을 용출시켜서 얻어진 단백질 농도는 표 5에 나타난 바와 같았다.

즉, 하기 표5는 후보 항원단백질들의 1차 및 2차 생산 및 정제된 농도를 나타낸 것이다.

Ag #	1차 정제 ( ug / ul )	2차 정제 ( ug / ul )	총량 ( ug /1000 ul )
#12	0.43	0.42	425
#15	0.64	0.59	615
#17	0.83	0.96	895
#18	0.31	0.31	310

실험예 4-3. ELISA 기법을 이용한 재조합단백질의 항원성 검정

ELISA를 이용하여 재조합 후보항원 단백질의 항원성을 흡충 감염자 혈청 및 대조군 정상인 혈청에 대하여 분석한 결과는 도 13에 나타나 있고, 하기 표 6에는 각 항원의 cutoff값을 적용한 특이도와 민감도 (OD @ 490 nm)가 요약되어 있다.

하기 도 13에서 나타난 바와 같이, 각 후보항원에 각각의 cutoff 기준값을 적용하였을 때, Ag17가 민감도 77.1%로 조항원의 민감도에 근접하였으며 특이도는 71.2%로 조항원의 약 2배에 해당하는 증강 효과를 나타내어 재조합항원들중 가장 우수한 항원으로 평가되었다. 다른 후보항원 Ag12, Ag15, Ag18는 민감도는 조항원에 미치지 못하였으나 특이도는 68.5- 76.4%로 조항원에 비해 우수한 성능을 나타내었다.

이상의 결과로 볼 때 종래에 사용되던 간흡충의 조항원에 근접한 민감도를 나타내는 Ag17과 조항원에 비해 월등히 높은 특이도를 보이는 Ag12, 15, 18이 특이도를 유지하면서 민감도를 증강시키는 복합항원 제조용 후보항원으로 유용하다고 평가되었다. 이는 다양한 조합과 배율로 혼합되어 최고의 특이도와 민감도를 나타낼 수 있는 복합 재조합 단백질로 사용될 수 있음을 시사한다.

Antigen No.		12	15	17	18	crude
Cutoff OD value		0.53	0.36	0.40	0.30	0.32
민감도 (%)	간흡충증	50.6	55.4	77.1	51.8	91.6
특이도 (%)	타이간흡충증	51.4	68.6	48.6	37.1	2.9
	폐흡충증	85.7	64.3	50.0	64.3	14.3
	정상대조군	95.0	100.0	100.0	97.5	95.0
	합 계	76.4	71.2	71.2	68.5	46.1

<110> CHUNG ANG University Industry Academic Cooperation <120> Protein having antigen activity on Liver flukes <130> DP-2011-0139 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Antigen #12 aa for Liver flukes <400> 1 Met Ser Ser Asn Trp Ser Leu Cys Glu Gly Cys Cys Leu Ala Glu Pro 1 5 10 15 Cys Pro Val Thr Ala Asp Val Ile Thr Asp Asp Leu Arg Asn Asn Val 20 25 30 Leu His Asn Asn Phe Pro Lys Lys Gln Asn Ile Thr Lys Val Gln Ser 35 40 45 Val Gly Cys Ser Leu Thr Leu His Met Leu Ala Pro Lys Gln Ser Ser 50 55 60 Glu Phe Met Glu Cys Thr Arg Pro Val Ser Val Gln Pro Ala Cys Ser 65 70 75 80 Asp Arg Asn Phe Ser Pro Gln Gly Ala Gly Asp Ser Pro Thr Asp Thr 85 90 95 Gln Val Thr Ser Ile Phe Ser Lys Thr Phe Thr Ser Ser Ile Ser Leu 100 105 110 Pro Leu Ser Lys Thr Pro Asp Ile Ser Asn Glu Cys Asn Lys Asn Leu 115 120 125 Gln Thr Thr Leu Val Tyr Tyr Asp Asp Ser Asp Tyr Asp Ala Ser Asp 130 135 140 Cys Glu Tyr Gln Glu His Trp Glu Val Ser Asp Leu Val Asn Lys Glu 145 150 155 160 Ser Ala Thr Pro Asp Ser Ala Trp Glu Trp Glu Gln Leu His Ser Thr 165 170 175 Arg Ser Ala Pro Asp Tyr Val 180 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Antigen #15 aa for Liver flukes <400> 2 Met Ile Ser Leu Met Leu Thr Thr Leu Leu Leu Ala Ala Ile Ala Ala 1 5 10 15 Glu Glu Glu Glu Lys Pro Met Phe Glu Cys Tyr Gln Thr His Asp Met 20 25 30 Asn Phe Thr Lys Asp Ser Ser Ser Thr His Pro Asn Cys Ile His Cys 35 40 45 Val Tyr Asp Glu Thr Leu His Asp Gly Gln Val Val Ala Val Ser Arg 50 55 60 Met Cys Val Gly Lys Gln Cys Val Ser Tyr Asn His Val Phe Glu Gly 65 70 75 80 Tyr Gly Gln Asn Arg Ile Cys Cys Ser Glu Lys Leu Cys Asn Val Asp 85 90 95 Lys Glu Thr Gly Met Phe Ser Phe Val Leu Glu 100 105 <210> 3 <211> 139 <212> PRT <213> Antigen #17 aa for Liver flukes <400> 3 Met Ile Ser Phe Pro Gly Thr Thr Ser Ala Phe Phe Leu Phe Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Gln Ala Tyr Ser Gly Pro Leu Glu Glu Cys Val Arg Asn Val Thr 20 25 30 Thr Cys Asp Ala Glu Thr Gln Glu Cys Ala Ile Lys Ala Leu Thr Arg 35 40 45 Cys Asn Leu Pro Asp Asn Pro Gly Ala Asn Val Leu Val Lys Cys Lys 50 55 60 Glu Ile Val Ala Asn Cys Ser Met Thr Glu Pro Asn Thr Ile Asn Cys 65 70 75 80 Thr Asn Gly Val Leu Asn Cys Met Asp Glu Ala Ile Lys Arg Glu Ser 85 90 95 Thr Gly Gly Ala Thr Val Leu Gln Pro Met Leu Thr Thr Trp Ile Ser 100 105 110 Ile Leu Val Leu Leu Ala Ala Ile Ile Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Glu 115 120 125 Met Thr Ser Thr Ala Trp Ser Thr Asn Gly Glu 130 135 <210> 4 <211> 274 <212> PRT <213> Antigen #18 aa for Liver flukes <400> 4 Met Asn Thr Phe Ala Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Pro Leu Leu Ile 1 5 10 15 Asp Ser Gln Asn Thr Ser Lys Thr Thr Thr Thr Thr Pro Thr Ser Thr 20 25 30 Ser Thr Pro Pro Asp Thr Thr Val Thr Pro Ala Pro Thr Val Pro Ser 35 40 45 Tyr Ser Val Leu Asn Gly Thr Asp Ile Cys Leu Leu Val Gln Met Asn 50 55 60 Ile Lys Leu Gly Ile Thr Tyr Phe Asn Thr Lys Gly Glu Pro Leu Met 65 70 75 80 Arg Asn Phe Tyr Ile Asn Ser Thr Arg Gln Phe Asp Ile Val Thr Asn 85 90 95 Gly Thr Cys Gly Ile Glu Leu Glu Thr Leu Met Leu Thr Trp Trp Pro 100 105 110 Glu Gln Ser Gln Ser Lys Asp Ala Pro Ser Trp Ser Leu Gly Leu Gln 115 120 125 Phe His Lys Arg Ala Asp Gly His Phe Ser Leu Asp Phe Met Asp Leu 130 135 140 Arg Tyr Ile Thr Asn Thr Ser Leu Phe Pro Asp Thr Asn Glu Thr Ser 145 150 155 160 Ile His Tyr Val Ser Arg Asn Asp Ser Gln Phe Thr Cys Pro Val Gly 165 170 175 Ser Tyr Phe Gln Cys Met Ala Ala Gln Ser Ser Lys Leu Thr Lys Pro 180 185 190 Ser Ser Ile Gly Asp Val Val Val Gln Pro Glu Val Phe Val Thr Leu 195 200 205 Ser Asp Leu Lys Ala Glu Ala Phe Arg Ser Gly Asn Ser Pro Ile Phe 210 215 220 Val Gly Ser Met Arg Glu Cys Ser Ala Asp Tyr Val Pro Asn Lys Val 225 230 235 240 Val Pro Ile Val Val Gly Val Ala Leu Ala Ala Met Ile Ile Ile Ala 245 250 255 Leu Ile Thr Phe Val Ile Ser Ser Gly Arg Arg Gln Arg Gly Tyr Gln 260 265 270 Glu Ile <210> 5 <211> 1140 <212> DNA <213> Antigen #12 bp for Liver flukes <400> 5 agggtgactc gtctagcacc acaaacagtc ggttggcagt ctacagcagt gaatgtactt 60 cggtacctga aagctgtttc gagattttga ggaacataaa acggacacaa gtccctgcga 120 gtccagaaaa tcagcagcac gctttacttt gcctgatgcg atctatttca atcgtttcag 180 ctatcgattc ctggacaaat gtgggcttaa cagcactccc ccaaaagtct tcggtcctaa 240 aacaagtacc taaaacgtgt atgtccagta actggtcctt gtgcgagggt tgctgtttag 300 ccgagccttg cccggtaact gcagatgtga ttacggatga tctacggaac aatgtacttc 360 ataacaactt cccaaagaaa cagaatatta cgaaggtaca atccgttggt tgctcattga 420 cccttcacat gttggctccg aaacaatcat ccgaatttat ggagtgcacc aggcctgttt 480 ctgtccagcc cgcttgttcg gatagaaact tttcaccaca aggagctggg gatagtccca 540 ctgacacaca agttaccagc atattcagca agactttcac ttcttctatt tctttgccac 600 tgtcaaaaac accggacatt tcgaatgagt gtaataaaaa cctacaaaca actttggtgt 660 actacgacga cagcgattat gatgcttcag attgtgaata ccaagagcac tgggaagtgt 720 cggatctggt taacaaggaa tccgcgacac cggacagtgc ttgggaatgg gagcagttgc 780 acagtacgcg gtcagccccc gattacgtgt gacacaatgt acgctgacta caaaggacaa 840 aaagcgaaaa ccacccgagt atgttccttt tggcgcttaa cacggtcagc ttaaatgaaa 900 aaaaacacca cagtgtctgt aaaagaggac cgtaagaata cttccttcat gacgccttgc 960 caaacaacca ttctattgga aattttataa tatgttttga aattccatgg agcattgctt 1020 ttgtctaaaa ctatggcgtg acaaactttt tatctgagtt caccatctgc caagatggac 1080 tatgactttc tgtatcctat tgcgtcgtct catttgcatg cacaatataa actttgaagt 1140 1140 <210> 6 <211> 838 <212> DNA <213> Antigen #15 bp for Liver flukes <400> 6 gttgttcaag catgatcagt cttatgctga caactcttct gctcgcagcg attgcggccg 60 aggaggagga aaagccgatg ttcgagtgtt atcaaacgca tgatatgaac tttaccaaag 120 attcatcaag cacacatcca aattgtattc actgcgtcta tgacgagacg cttcatgatg 180 gtcaagtagt cgcggtctcc cgtatgtgtg ttggaaaaca atgtgtctct tacaatcatg 240 tgtttgaggg ttacgggcaa aaccgcatct gctgctctga aaagctgtgc aatgtggaca 300 aggaaacggg tatgttttca tttgttctgg aataggaatc cagtagccag ccatccctgt 360 atcaacttca cgtaatatgt tatttgtcta tttgttgtgg gtggttgcag gatttatatt 420 gcacacactc acatcactct cgtttgaaca gtcatccgct tgtcttggcg cacttattct 480 ggtgagtcca cacaaagatg gggaagcact ggactcgagt ttcgctctta tcagagcaaa 540 tgagcagtgc atatccttgg ccgtgcccgg ggtttgaact catgagtggc aagtgtgtta 600 ccactactat gcgaacgcac gctggacaca tctgaatttt 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Claims (7)

1. 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 간흡충류에 항원 활성을 갖는 단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 간흡충류는 간흡충, 타이간흡충 및 고양이간흡충으로 이루어진 군에서 선택된 단백질.
3. 제 1항에 따른 단백질을 코딩하는 유전자.
4. 제3항에서 있어서, 상기 유전자는 서열번호 5 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 표시되는 유전자.
5. 제 1항에 따른 단백질을 유효성분으로 하는 간흡충증 진단용 조성물.
6. 삭제
7. 제1항에 따른 단백질에 대한 항체.
   

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