CN103459414B - 对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质，更具体地，提供一种生成对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质，从而在诊断及治疗肝吸虫类时，增加灵敏度和特异性的抗原蛋白质，上述对肝吸虫类具有活性的蛋白质包含选自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列选自包含序列号1至序列号4的组中。

Description

对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质

技术领域

本发明涉及一种对肝吸虫类的诊断及治疗具有有用的抗原活性的蛋白质及对上述抗原蛋白质进行编码的基因。

背景技术

人体感染肝吸虫时，肝吸虫寄生在胆管中，从而引发肝吸虫症。肝吸虫症作为在韩国流行的慢性寄生虫疾病，2004年韩国国民的肝吸虫感染率为2.4％，预计有约120万人左右的感染者，并且，肝吸虫症在4大江流域形成本土化，从而持续出现感染者。肝吸虫症也在中国、越南、泰国、柬埔寨、老挝、俄罗斯及东欧国家流行。

肝吸虫会寄生在肝胆管中，并产下虫卵。虫卵会随着粪便一同排出，并流向淡水，从而被作为第一中间宿主的沼螺或几种淡水贝类吃掉，并且，在贝类的体内经过胞蚴、雷蚴发育为尾蚴，再向作为第二中间宿主的鲤鱼和淡水鱼的肌肉内侵入，发育为后尾蚴（metacercaria）。人或动物生吃那些被后尾蚴感染的淡水鱼时，后尾蚴在十二指肠中脱囊，并直接经由胆总管向肝内的胆道移动，从而成长为成虫。由此感染的肝吸虫在胆道中寄生，并刺激胆道上皮，来引发胆道炎、胆道周围纤维化、黄疸、消化不良及肝功能低下等，还会引发作为并发症的胆石、肝硬化及胆囊炎。胆石的情况下，在肝吸虫的流行区域中，在胆石的约1/3中发现肝吸虫虫卵。当严重的炎症持续很久时，最后会引发胆管癌。通过肝吸虫类的感染引发的胆管癌、胆管内结石及化脓性胆管炎等多种并发症比起肝吸虫感染本身而言是非常严重的疾病，因此，在发展成此类重症疾病之前，在早期诊断是否感染，并提前治疗是非常重要的。

通过用吡喹酮（praziquantel）给药来对肝吸虫进行驱虫。这种药品不仅对肝吸虫发挥优秀的驱虫效果，还对肺吸虫、肠吸收虫类及裂体吸虫也发挥优秀的驱虫效果。治疗肝吸虫后，人体由于没有生成对肝吸虫的抵抗力，因此，利用吡喹酮进行驱虫后，还会发生肝吸虫的再次感染。

作为肝吸虫症感染的诊断方法，现在所使用的标准检查法是显微镜虫卵粪便检查法。一条肝吸虫成虫一天所产下的虫卵数量大约在100个左右。对肝吸虫虫体的负荷较低的感染者的情况下，显微镜虫卵粪便检查法的虫卵检测率会降低，从而需要进行反复检查，因此，具有粪便检查所需时间过长的缺点。并且，还具有患者不愿意采取和提出诊断用粪便的问题和在解读寄生虫虫卵方面需要熟练的专业人员的问题。除此之外，还补充利用血清学抗体检查、超声波检查法、内视镜逆行性胆道照影术及皮内反应检查法。血清抗体检查法将肝吸虫粗蛋白用作抗原，虽然灵敏度高，但特异度低。粗抗原蛋白对肝吸虫感染者的血清实施免疫印迹（immunoblotting），即，酶联免疫吸附测定法（ELISA，enzymelinkedimmunosorbentassay）的结果表明，虽然灵敏度高，但特异度低，因交叉反应，不适合用作鉴别诊断寄生虫感染的抗原蛋白质（Chenetal.,1994）。肝吸虫粗抗原为了改善与其他寄生虫感染者的血清进行交叉反应的非特异性阳性反应，需要解决研发一种特异度和灵敏度都优秀的单一抗原蛋白质的难题。

皮内反应检查在以前感染过的人群中也显示阳性反应（Chungetal.,1995；Sandunetal.,1959;Walton和主,1959；金东灿外,1969；郑浩然外，1989），并与肺吸虫、猪囊尾蚴等感染者进行交叉反应（Hunter,1958）。因此，皮内反应检查法是一种用作用于个人或集团管理的检查法方面存在很多限制的检查法。

1950年以后，作为检测寄生虫特异性抗体的血清学检查法，研发出补体结合反应法、免疫荧光法、免疫电泳法、免疫琼脂扩散法及酶联免疫吸附测定法（ELISA，enzyme-linkedimmunosorbentassay）等。血清学检查法是在由于虫体幼小而无法产下虫卵，或者由于虫体衰老而无法产下虫卵的情况下，从血清中检测出抗体，来诊断肝吸虫感染的诊断法。其中，从感染者的血液中检测肝吸虫抗原蛋白质的抗体的酶联免疫吸附测定法有效地利用于肝吸虫症的诊断。为了研发免疫血清检查试剂盒，确保灵敏度和特异度都很高的肝吸虫特异抗原是非常重要的。近来，为了以血清学的方式诊断肝吸虫症，使用了肝吸虫的粗抗原。这种粗抗原是由不明成分的大量蛋白质混合而成的，且与其他寄生虫感染血清进行交叉反应。因此，比起此类粗抗原，期待由单一蛋白质分离、纯化而成的单一抗原蛋白质作为血清学诊断抗原更为有用。但是，将到目前为止的可作为候选物质的多个抗原候选蛋白质一次性地表达、纯化为具有溶解性的蛋白质，并通过免疫印迹或免疫酶反应法评价抗原性是在工作的规模或工作量方面也并不轻松。

长久以来，陆续进行有关抗原蛋白质的研究，通过多个研究团队，评价了多个抗原候选蛋白质。对少数蛋白质的抗原性评价研究在最近的10多年间一直持续进行，而到目前为止，尚未研发出可用作有用的诊断试剂的灵敏度和特异度均高的优秀的单一抗原蛋白质。利用单一抗原蛋白质的情况下，虽然特异度高，但由于灵敏度低，因此，对肝吸虫感染负荷低的患者的诊断具有限制等，从而使灵敏度和特异度均高的诊断法无法定立。因此，由于抗原性非常强，需要持续研发灵敏度和特异度都很卓越的肝吸虫抗原蛋白质。

对此，本发明从分子生物学、免疫血清学的方面查明现有的肝吸虫症的诊断抗原的问题，从而提供既能维持特异度，还能使灵敏度优秀的肝吸虫症的诊断及治疗用抗原。

发明内容

要解决的技术问题

本发明要提供具有对肝吸虫类的诊断及治疗有用的抗原活性的蛋白质及对上述蛋白质进行编码的基因。

并且，本发明要提供将对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质作为有效成分的肝吸虫类诊断用组合物。

并且，本发明要提供将对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质作为有效成分的肝吸虫类预防或治疗用疫苗组合物。

技术方案

本发明要提供对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质，该蛋白质包含选自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列选自包含序列号1至序列号4的组中。

上述肝吸虫类可以是选自肝吸虫、泰国肝吸虫及猫肝吸虫的组中。

本发明要提供一种对上述蛋白质进行编码的基因。

由选自碱基序列的全部或一部分中的序列来表示上述基因，上述碱基序列选自包含序列号5至序列号8的组中。

本发明要提供肝吸虫类诊断用组合物，该组合物将对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质作为有效成分，上述对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质包含选自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列选自包含序列号1至序列号4的组中。

本发明要提供肝吸虫类预防用或治疗用疫苗组合物，该组合物将对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质作为有效成分，上述对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质包含选自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列选自包含序列号1至序列号4的组中。

本发明要提供对肝吸虫类具有抗原的蛋白质的抗体，上述对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质包含选自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列选自包含序列号1至序列号4的组中。

技术效果

本发明利用无细胞高通量（cell-freehigh-throughput）重组蛋白质的表达系统，生产特异度和灵敏度优秀的抗原蛋白质，从而生产对肝吸虫症的诊断及治疗有用的抗原蛋白质及抗原蛋白质组合物。本发明的对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质，它的片段或突变体由于具有优秀的特异性和灵敏度，在预防或治疗肝吸虫类感染方面可用作很好的免疫原或免疫刺激剂，并且，在诊断肝吸虫类方面可用作诊断用抗原，因此，本发明的产业上的利用价值将会非常大。

附图说明

图1是用于选择肝吸虫表达序列标签（EST，ExpressedSequenceTag）克隆的，图1a表示从预测为分泌蛋白质的EST中确认切割位点（cleavagesite），图1b表示掌握选自肝吸虫转录体信息库中的EST的读序（read）结构信息，来选择包含起始密码子（startcodon）和切割位点（cleavagesite）的一个读序（read）。

图2是涉及聚合酶链式反应（PCR，PolymeraseChainReaction）引物的研制，图2a表示第一次PCR引物，图2b表示第二次PCR引物。

图3表示麦胚无细胞蛋白质合成（Wheatgermcell-freeproteinsynthesis）过程（出处：cell-freesciences）。

图4表示抗体蛋白芯片的说明图。

图5涉及融合克隆（In-fusioncloning），图5a涉及PCR引物的研制，图5b涉及麦胚无细胞表达运载体（Wheatgermcell-freeexpressionvector）的研制。

图6部分表示确认肝吸虫分泌蛋白质的互补脱氧核糖核酸（cDNA，complementaryDeoxyribonucleicacid）的结果。

图7表示PCR扩增产物，图7a部分表示第一次PCR扩增产物，图7b部分表示第二次PCR扩增产物。

图8部分表示重组蛋白陈列-抗体反应（recombinantproteinarray-Antibodyreaction）的荧光发色结果。

图9是以正常对照组血清的荧光强度（fluorescenceintensity）的比率（ratio）表示对各个重组蛋白质的肝吸虫患者血清的阳性反应强度。

图10表示确认多个抗原候选EST克隆的cDNA插入（insert）。

图11表示麦胚系统（wheatgermsystem）中生产的抗原候选抗原重组蛋白质的表达结果。

图12表示对重组蛋白质进行纯化之后的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis）结果。

图13是检测重组候选抗原蛋白质的抗原性的，是表示利用ELISA的对肝吸虫感染者血清及对照组正常人血清（-）的反应性分析结果（Cs，肝吸虫感染血清；Ov，泰国肝吸虫感染血清；Pw，肺吸虫感染血清）。

具体实施方式

本发明提供对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质及对上述蛋白质进行编码的基因。并且，本发明还要提供将对肝吸虫类具有活性的蛋白质作为有效成分的组合物。

肝吸虫感染者预计有大约140万人，从而对韩国国民的健康产生严重的威胁，因此，对肝吸虫的管理是必须的。为了增大肝吸虫症管理的效率性，要反复形成对非特定多数的大规模的检查。并且，医院也要能够容易检查肝吸虫感染。但是，目前用于肝吸虫症的诊断的显微镜虫卵检查法等虽然能够直接确认是否感染肝吸虫，但很难检测出感染初期或轻感染或非虫卵性感染，也不适合进行大量检查，并且，需要能够鉴别虫卵的熟练的专业人员，并且，血清学的诊断法虽然能够进行大规模的集体诊断，但在肝吸虫虫体的负荷低的情况下，有可能被解读为假阴性（falsenegative）等的基于现有方法的肝吸虫类的诊断方法未能定立同时满足灵敏度和特异度的诊断法。为了克服这些问题，本发明者为了诊断肝吸虫类，为了提供灵敏度和特异度的同时制备费用更加低廉的抗原蛋白质而付出努力的过程中，确认了一旦使用本发明的蛋白质，既能使抗原的特异性优秀，还能提高灵敏度，从而完成了本发明。

以下，详细说明本发明。

本发明提供对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质，上述对肝吸虫类具有活性的蛋白质包含选自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列选自包含序列号1至序列号4的组中。

本发明的肝吸虫类（LiverFluke）可以是成虫具有寄生在动物的肝及胆道等的生态条件的吸虫类，优选地，可以是选自包含肝吸虫（Clonorchissinensis）、泰国肝吸虫（Opisthorchisviverrini）及猫肝吸虫（Opisthorchisfelineus）的组中的一种。

本发明的对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质意味着可根据被肝吸虫类感染的人或动物来源抗血清来识别的蛋白质。其中，“根据抗血清来识别”意味着与抗血清中包含的抗体成分相结合，并且，通常能够通过为了检测这一结合所使用的免疫印迹法、ELISA及免疫沉淀法等免疫学方法对其抗原进行检测和/或定量。这些抗原蛋白质对于人类或动物而言，作为诱导对肝吸虫类感染的感染防御免疫的疫苗用抗原，也作为用于诊断是否感染及进行状态的抗原非常有用。

本发明者从被肝吸虫类感染的人类或动物中确认是否感染，并为了准确诊断患者，操作具有抗原性的基因，来筛选和制备抗原性高的蛋白质。

本发明的序列号1相当于下述实施例的抗原蛋白质#12，由183个氨基酸序列组成。

本发明的序列号2相当于下述实施例的抗原蛋白质#15，由107个氨基酸序列组成。

本发明的序列号3相当于下述实施例的抗原蛋白质#17，由139个氨基酸序列组成。

本发明的序列号4相当于下述实施例的抗原蛋白质#18，由274个氨基酸序列组成。

上述序列号1至序列号4的氨基酸序列（参照图14）是来源于以实验方式被后尾蚴感染的兔子中回收的从韩国患者中分离的肝吸虫（Clonorchissinensis）的。本发明的蛋白质不仅意味着由选自包含序列号1至序列号4的组中的氨基酸组成的蛋白质或上述蛋白质的多个片段蛋白质，还能通过一种以上的置换、缺失、逆位及转位等突变，使此类蛋白质包含作为本发明目的的对肝吸虫类具有抗原活性的所有变异蛋白质。

在本发明中，只要是由被肝吸虫类感染的人或动物来源的抗血清来识别的，由序列号1至序列号4表示的一部分氨基酸序列组成的多肽也包含在本发明的抗原蛋白质中。由这些一部分氨基酸序列组成的多肽将由例如由序列号1至序列号4表示的氨基酸序列组成的抗原蛋白质作为原料，通过使用赖氨酰肽链内切酶、胰蛋白酶等蛋白酶的消化酶进行切割后，或者通过由溴化氰等化学处理进行切割后，通过蛋白质纯化方法之一的已知方法，对具有抗原性的目的肽片段进行隔离纯化等来获得。并且，将上述序列号1至序列号4表示的氨基酸序列作为对象，并通过化学合成法制备利用公知的抗原决定基（epitope）预测程序来决定的肽片段之后，可通过免疫印迹法、ELISA及免疫沉淀法等免疫学方法来验证其抗原性。

本发明的对肝吸虫类具有抗原活性的抗原蛋白质有可能是利用所属领域技术中的分子生物学、微生物学、重组DNA及免疫学的常规技术，并通过合成或重组来生产的，上述对肝吸虫类具有抗原活性的抗原蛋白质的特征在于，包含选自包含序列号1至序列号4的组中的氨基酸序列。上述技术能够参照文献[例如，SambrookMolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition(1989);DNACloning,VolumesIandII(D.N.Glovere,ed.,1985);OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.,1986);NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.,1984);TranscriptionandTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.,1984);AnimalCellCulture(R.I.Freshney,ed.,1986);ImmobilizedCellsandEnzymes(IRLPress,1986);B.Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning(1984);theMethodsinEnzymologyseries(AcademicPress,Inc.),especiallyvolumes154and155;GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.H.MillerandM.P.Calos,eds.,1987,ColdSpringHarborLaboratory);MayerandWalker,eds.,(1987),ImmunochemicalMethodsinCellandMolecularBiology(AcademicPress,London);Scopes,(1987),ProteinPurificaiton:PrinciplesandPractice,SecondEdition(Springer-Verlag,N.Y.),andHandbookofExperimentalImmunology,VolumesI-IV(D.M.WeirandC.C.Blackwell,eds.,1986)]，但在通过无细胞高通量（cell-freehigh-throughput）重组蛋白质表达系统制备的重组蛋白质的情况下，既能维持三级结构，还能生产大量的蛋白质，从而可呈现优秀的效果。

并且，上述制备的抗原蛋白质通过所属技术领域中公知的方法对该蛋白质进行脂质化或糖化等加工也能属于本发明的范围。

作为本发明的一例，本发明的抗原蛋白质可以是通过如下方法制备的对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质。步骤1，分析肝吸虫转录体，来筛选分泌蛋白质及抗原候选蛋白质的cDNA克隆；步骤2，提取上述筛选的抗原候选蛋白质cDNA克隆的质粒DNA，并通过两步（two-step）PCR扩增目标cDNA；步骤3，利用麦胚无细胞系统（wheatgermcell-freesystem），将上述扩增的cDNA合成为重组蛋白质；以及步骤4，在上述重组蛋白质中，使用肝吸虫感染者的血清，来筛选抗原性高的克隆。

本发明将对肝吸虫类具有抗原的蛋白质对吸虫感染者的血清及对照组正常人的血清进行分析的结果发现，如图13和表6所示，由本发明的序列号1至序列号4的氨基酸序列组成的蛋白质具有优秀的特异度和灵敏度。

本发明的对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质可以是将单一蛋白质作为抗原的（单一抗原），也可以是将复合蛋白质作为抗原的（复合抗原），上述对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质包含选自包含序列号1至序列号4的组中的氨基酸序列。

肝吸虫寄生在胆道内，位于抗原蛋白质需要通过胆道上皮层，在宿主的免疫监视体系中公示的公示效率比较低的解剖学位置。由于此类病态生理学的特性，肝吸虫感染者中，肝吸虫特异抗体的生产效率较低，血中抗体效价也不高。考虑此类肝吸虫症的病态生理学特性时，本发明中作为维持粗抗原（crudeextracts）的高灵敏度，并使交叉反应最小化的方法，作为本发明的一例，能够混合多个单一抗原来制备复合抗原（multi-antigenmix），由此可用作诊断抗原。

在本发明的肝吸虫复合抗原中使用的多个单一抗原蛋白质由于特异度高，因此，既能与其他寄生虫及病原体进行鉴别诊断，还因抗原蛋白质相互之间的抗原决定基相互不同，因此，能够与肝吸虫感染者血液中的相互不同的抗体相结合，来增加复合抗原的阳性反应率。肝吸虫类的单一抗原蛋白质分布在相互不同的组织，或属于相互不同的生理-代谢途径时，会使抗原决定基相异，因此，多个单一抗原能够与相互不同的抗体相结合，来提高复合抗原的阳性反应率（灵敏度）。

本发明要提供对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质进行编码的基因，上述对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质包含选自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列选自包含序列号1至序列号4的组中。

本发明的基因可包含对序列号1至序列号4的氨基酸序列的全部或一部分进行编码的任何基因，但优选地，可以是由选自碱基序列的全部或一部分中的序列表示的基因，其中，上述碱基序列选自包含序列号5至序列号8的组中。并且，本发明的范围还可包含对通过一种以上的置换、缺失、逆位及转位等突变来使此类蛋白质变形的对肝吸虫类具有抗原活性的所有变异蛋白质进行编码的基因。

本发明的序列号5相当于对上述氨基酸序列号1（抗原蛋白质#12）进行编码的DNA序列（参照图15）。

本发明的序列号6相当于对上述氨基酸序列号6（抗原蛋白质#15）进行编码的DNA序列（参照图16）。

本发明的序列号7相当于对上述氨基酸序列号3（抗原蛋白质#17）进行编码的DNA序列（参照图17）。

本发明的序列号8相当于对上述氨基酸序列号4（抗原蛋白质#18）进行编码的DNA序列（参照图18）。

本发明要提供将对肝吸虫类具有活性的蛋白质作为有效成分的组合物，上述对肝吸虫类具有活性的蛋白质，其特征在于，包含氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列选自包含序列号1至序列号4的组中。

本发明的对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质及其片段或突变体由于具有优秀的特异性和灵敏度，因此，能够在制备肝吸虫类的预防或治疗用疫苗时作为有用的成分来利用，并且，也能提供于肝吸虫类的抗体生产。

本发明的肝吸虫类（LiverFluke）可以是成虫具有寄生在动物的肝及胆道等的生态条件的吸虫类，优选地，可以是选自包含肝吸虫（Clonorchissinensis）、泰国肝吸虫（Opisthorchisviverrini）及猫肝吸虫（Opisthorchisfelineus）的组中的一种。

本发明的适用对象包括人类或非人类，优选地，可以是人类、猫、狗、牛、羊等，但并不局限于此。

本发明提供将对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质作为有效成分的预防或治疗用主动免疫化用疫苗组合物，上述对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质包含选自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列选自包含序列号1至序列号4的组中。

本发明提供免疫化用疫苗，其设计目的在于，治疗肝吸虫类感染或者防止被肝吸虫类感染，而此类疫苗能够通过所属领域主旨的常规的疫苗制备方法来制备。

将免疫学量的对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质或其片段与制药方面接受的适合的辅料、运载体或赋形剂进行组合，并以对人类或动物进行免疫化方面有效的量，适当注射上述疫苗，上述对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质包含选自包含序列号1至序列号4的组中的氨基酸序列。免疫学量也可以是指在人类或动物身上充分产生免疫原性反应的蛋白质或其片段的数量。

制备作为活性成分的包含本发明的氨基酸序列或一部分氨基酸序列的疫苗是所属领域主旨的。典型的有，如上的疫苗能够制备成液状溶液或悬浮液的注射剂，也能在注射前制备成液状的溶液或在制备成悬浮液之前制备成适合的固体剂型。制剂还能进行乳化。活性免疫原性成分大概在制药上可被接受，并能与活性成分和赋形剂等一同进行混合。适合的赋形剂有，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物，并且，选择性地，疫苗可含有少量的辅助物质，例如，润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂或增进疫苗的功效的佐剂（adjuvant）。疫苗通常利用注射方式，进行肠胃外给药，例如，皮下给药或肌肉内给药。适合其他不同给药方式的追加制剂可包含栓剂，以及在一些情况下，可包含口服用制剂。栓剂的情况下，现有结合剂及运载体可包含例如，聚亚烷基二醇或甘油三酸酯，并且，此类栓剂可由含有0.5％至10％的活性成分的混合物形成，优选地，由含有1％～2％活性成分的混合物形成，但本发明的范围并不局限于此。口服用制剂可包含例如，制药等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等普遍使用的赋形剂。此类组合物能够采用液剂、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉剂的形态，并可包含10％～95％的活性成分，优选地，包含25％～70％的活性成分，但本发明的范围并不局限于此。

本发明的疫苗可包含例如由盐酸或磷酸之类的无机酸或由乙酸、乙二酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成的酸加成盐以及制药上接受的盐。并且，由游离羧基形成的盐可由例如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙或氢氧化铁之类的无机碱及异丙基胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等有机碱衍生。

疫苗能够以预防学或治疗学的有效量，给药到需要该疫苗的受试者。给药的量会根据所要治疗的受试者、可合成抗体的受试者的免疫系统的能力及所需的保护程度有所不同。要进行给药的活性成分的准确剂量会根据医疗诊疗医生的判断有所不同。就皮下或肌肉注射的给药量而言，例如，相当于每一名受试者的活性成分约为0.001mg至10mg，在口服用、直肠栓剂用，尿道用或阴道用制剂的情况下，给药量能够在约0.005mg至50mg的范围，但本发明的范围并不局限于此。虽然适合最初给药及追加注射的治疗法也会不同，但在最初给药之后，普遍隔着大约1周至约2周进行后续的注射或其他不同给药过程，但本发明的范围并不局限于此。

并且，本发明提供对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质的抗体，上述对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质包含选自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列选自包含序列号1至序列号4的组中。

本发明提供能够与对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质或其片段进行特异性结合的抗体，具体地，上述多个抗体能够根据例如文献（"Antibodies:ALaboratoryManual,Lane,H.D.etal.eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,1989）或文献[KohlerandMilstein,Nature256:495497(1975)]中主旨的方法等现有的公知方法容易地制备。具体地，本发明的识别蛋白质或其片段的抗体，通过常规的方法，对动物身上的肝吸虫的蛋白质进行适当的免疫化，从而能够容易地制备。上述多个抗体能够用于亲和性色谱法、免疫学诊断法等。免疫学诊断法能够有用地选自免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、荧光或发光分析法等中。

本发明提供将对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质作为有效成分的肝吸虫类预防或治疗用被动免疫化用组合物，上述对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质包含选自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列选自包含序列号1至序列号4的组中。

除了免疫学量的活性疫苗以外，本发明的单利的抗体或上述抗体的活性片段也能适用于制药组合物合/或疫苗研发，使得对肝吸虫感染进行被动免疫化，上述活性疫苗通过蛋白质或蛋白质片段的用药，使抗体在患者体内生成。

本发明的抗体为了治疗或预防由肝吸虫类引起的感染，可形成为适合给药到人类或动物的制药组合物的形态。本发明的包含抗体的制药组合物能够与盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其他不同的治疗学化合物，以及包含它们的组合物的所属领域普遍使用的任一适合的制药辅料、赋形剂或运载体一同进行组合来制备而得。制药组合物的适合的给药方法可包括局部、口服、肛门、阴道、静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、鼻内及真皮内给药，但并不局限于此。就皮下或肌肉注射的给药量而言，例如，相当于每一名受试者的活性成分约为0.001mg至10mg，在口服用、直肠栓剂用，尿道用或阴道用制剂的情况下，给药量能够在约0.005mg至50mg的范围，但本发明的范围并不局限于此。

本发明的抗体组合物还能以增进免疫原性反应方面有效的量与适合的佐剂一同进行给药。例如，适合的佐剂可包含明矾（磷酸铝或氢氧化铝）及其他不同佐剂，例如，皂苷及其纯化后的成分QuilA、弗氏完全佐剂、RIBBI佐剂以及用于研究用及兽医学用途的其他不同佐剂。化学定义的其他制剂的例包含胞壁酰二肽、单磷酰脂质A、磷脂质结合体、蛋白脂质体内结合体的胶囊化及脂质囊泡中的蛋白质的胶囊化。

本发明的用于给药抗体组合物的优选给药量成为对预防或治疗肝吸虫类感染有效的量，并且，上述量会根据感染的性质及受试者的状态而不同。根据本发明所使用的抗体或制药制剂的“有效量”意味着能够发挥预防学或治疗学效果的，非毒性且充分的上述制剂的量。所需的抗体或特定制剂的准确量根据受试者的种类、年龄、一般健康状态、要治疗的病态的重症度、所使用的特定运载体或佐剂及其给药方式等会有所不同。因此，任一特定抗体组合物的“有效量”以特定的环境为基础，会有所不同，而适当的有效量在分别适用时，使用常规的实验，从而会根据所属领域技术人员来决定。给药量能够调节为适合接收组合物的各个受试者，并且，上述给药量根据各个个体的年龄、体重及代谢，会有所不同。并且，组合物可含有稳定剂或制药上接受的防腐剂。追加地，本发明的抗体可变形为在给药时具有更小的免疫原性的抗体。

本发明提供将对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质作为有效成分的肝吸虫类诊断用组合物，上述对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质包含选自氨基酸序列的全部或一部分中的序列，上述氨基酸序列选自包含序列号1至序列号4的组中。

本发明提供将对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质作为诊断用抗原的诊断用试剂盒，上述对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质包含选自包含序列号1至序列号4的组中的氨基酸序列，在诊断由肝吸虫类引发的疾病的情况下，优选地，在进行血清学诊断时有用，并且，本发明的蛋白质由于抗原性非常强大，灵敏度和特异度卓越，且只能将重组或化学合成的蛋白质作为抗原来使用，因此，具有在操作及诊断时，稳定性高的优点。

并且，本发明的肝吸虫类的诊断用抗原能够提供于所属领域中普遍使用诊断抗原来诊断疾病的所有诊断方法及确认肝吸虫类检测的诊断方法，并且，作为一例，可使用于琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）、酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）、免疫色谱反应法及肝吸虫症快速诊断测试（RDT，RapidDiagnosticTest）等。即，本发明使从受试者身上采取的生物学抗体试样和本发明的肝吸虫类诊断用抗原进行反应，从而可提供给检测抗原-抗体反应的诊断试剂盒。

优选实施方式

以下，通过实施例及实验例更加详细说明本发明。这些实施例及实验例仅用于例示本发明，因此，本发明的范围并不局限于这些实施例及实验例。

实施例

实施例1：肝吸虫抗原候选蛋白质的cDNA筛选

实施例1-1：肝吸虫转录体信息的分析

1）肝吸虫分泌蛋白质的预测

利用以生物信息学的方式预测分泌蛋白质的信号P-自然网络（SignalP-naturalnetworks）和信号P-隐马尔可夫模型（SignalP-hiddenMarkovmodel）程序（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析了在肝吸虫转录体库中登录的肝吸虫转录体cDNA簇（cluster）12830个。

2）EST克隆（clone）的选择

肝吸虫转录体由单态（singlet）和簇组成，上述单态由一个读序（read）组成，上述簇由2个以上的读序组成。预测为分泌蛋白质的表达序列标签（EST，expressed-sequencedtag）为簇的情况下，选择了包含切割位点（cleavagesite）的读序（参照图1）。

实施例1-2：抗原蛋白质cDNA的筛选

分析肝吸虫转录体信息，来筛选被预测为具有抗原性的EST，并且，利用肝吸虫转录体的注释（annotation）信息，来选择与在其他生物体中被预测为具有抗原性的蛋白质具有高相似度的抗原候选的EST。

实施例1-3：引物DNA的提取

从筛选的EST克隆的细胞库存（cellstock）中，提取质粒DNA。

1）为了获取肝吸虫转录体信息而制备的肝吸虫cDNA库构建于pBK-CMV、pBluscript-SK（-）或pAD-GAL4-2.1。在筛选的607个EST克隆当中，构建于pBK-CMV载体的515个克隆在包含卡那霉素的溶菌肉汤（LB，lysogenybroth）培养基中培养，构建于pBluescript-SK（-）或pAD-GAL4-2.1的92个克隆在包含氨苄西林的LB培养基中培养。

2）使用质粒小抽试剂盒（QIAprepSpinMiniprepKit）（凯杰公司（QIAGEN），希尔敦（Hilden），德国（Germany）），提取包含肝吸虫抗原候选蛋白质的cDNA的质粒DNA。

3）由于所拥有的肝吸虫转录体库的信息是EST碱基序列，因此，没有插入（insert）cDNA整体长度的相关信息。为了对此进行确认，构建于pBK-CMV的515个克隆利用限制性内切酶BamHI和SmaI（罗氏公司（Roche），曼海姆（Mannheim），德国（Germany））进行双酶切，构建于pBluescript-SK（-）的68个克隆和构建于pAD_GAL4-2.1的24个克隆利用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切。

实施例2：利用基于麦胚细胞的无细胞蛋白质合成（Wheatgermcellbasedcell-freeproteinsynthesis）系统的重组蛋白质的大量生产

实施例2-1：引物（Primer）的研制及合成

1）第一次PCR引物的研制（参照图2a）

制备包含S1序列的引物，使得靶cDNA能够与deSP6E02his-S1相结合，上述deSP6E02his-S1为第二次PCR的正义引物（senseprimer）。

首先，选择包含切割位点（Cleavagesite）的开放阅读框（ORF，openreadingframe），并包含起始密码子（startcodon）来研制23±2nt长度的基因特异性引物（gene-specificprimer）之后，在正义引物中包含S1序列。反义引物（Antisenseprimer）是利用克隆了肝吸虫cDNA的载体的序列来研制的。研制的引物是由柏业公司（Bioneer，大田（Daejeon），韩国（korea））合成的。

2）第二次PCR引物的研制（参照图2b）

制备引物，使得在PCR产物中附加SP6启动子序列和E01翻译增强子序列（translationalenhancersequence）及多聚组氨酸标签（His-tag）。

研制了包含SP6启动子的5’-末端序列的SPU引物，并研制了包含SP6启动子的3’-末端序列、E01翻译增强子序列（translationalenhancersequence）和His-tag序列的deSP6E02his-S1引物。反义引物（Antisenseprimer）使用了与第一次PCR中使用的反义引物相同的反义引物。研制的引物是由柏业公司（Bioneer，大田（Daejeon），韩国（korea））合成的。

实施例2-2：靶cDNA的扩增

实施两步（Two-step）PCR，制备了用于麦胚无细胞蛋白质合成（wheatgermcell-freeproteinsynthesis）的线性PCR-扩增基因（linearPCR-amplifiedgene）。

1）第一次PCR

将提取的肝吸虫抗原候选蛋白质的质粒DNA1μl、10pM基因特异性（gene-specific）第一次PCR正义引物1μl、10pM反义引物1μl、2mM各个脱氧核苷三磷酸（dNTP）1μl，25mM氯化镁（MgCl₂）2μl、AmpliTaq黄金聚合酶（应用生物系统公司（ABI），福特斯市（FosterCity），加利福尼亚州（CA），美国（USA））0.25μl、10×缓冲液2μl及蒸馏水11.75μl进行混合，制备20μl的反应液。对DNA聚合酶进行25次如下过程：在94℃的温度下激活，在94℃的温度下进行1分钟变性，在65℃的温度下进行1分钟退火（annealing），在72℃的温度下进行1分钟延伸（extension）。

2）第二次PCR

将以1:10的比率稀释的第一次PCR产物1μl、0.1μM的deSP6E02his-S1引物0.5μl、10μM的SPU引物0.5μl、10μM反义引物0.5μl、2.5mM的各个脱氧核苷三磷酸（dNTP）4μl、5U/μl的ExTag聚合酶0.25μl、10×缓冲液5μl及蒸馏水38.25μl进行混合，制备50μl的反应液。对DNA聚合酶进行35次如下过程：在94℃的温度下激活，在98℃的温度下进行10秒钟变性，在60℃的温度下进行30秒钟退火（annealing），在72℃的温度下进行1分钟延伸（extension）。

实施例2-3：肝吸虫抗原候选蛋白质的大量生产

利用基于麦胚的无细胞蛋白质合成方法（Wheatgermbasedcell-freeproteinsynthesis）生产肝吸虫诊断抗原候选蛋白质。

1）麦胚无细胞转录及翻译（Wheatgermcell-freetranscription及translation）

在96孔板（wellplate）中分别注入1ug的第二次PCR产物。

转录用（Transcription）试剂是将1.5×转录用缓冲液（Transcriptionbuffer）、3.75mM核苷三磷酸（NTP）混合物、1.2U/ul核糖核酸酶（RNases）抑制剂、2.4U/ulSP6RNA聚合酶的试剂在冰上混合而成的，作为翻译用（Translation）试剂准备了120OD/ml的WEPRO1240、40ng/ul的肌酸激酶（creatinekinase）。将所要使用的SUB-AMIX试剂在冰面上融化。

将具有第二次PCR产物的孔板、转录用（Transcription）试剂和翻译用（Translation）试剂的混合物以及准备好的SUB-AMIX试剂安装于自动化的蛋白质合成设备（roboticproteinsynthesizer）。

转录用（Transcription）试剂自动添加到96孔板（wellplate），并在37℃的温度下进行6小时反应，来生产信使核糖核酸（mRNA，MessageRNA）。

翻译用（Translation）试剂和准备好的SUB-AMIX试剂会自动添加，并在26℃的温度下进行16小时反应，来生产蛋白质（参照图3）。

实施例2-4：通过蛋白芯片的抗原性鉴定

本发明将利用麦胚系统（Wheatgermsystem）生产的蛋白质通过蛋白芯片与人血清进行反应，来判断抗原性（参照图4）。

1）准备蛋白芯片

在载玻片上处理试剂，准备胺芯片（aminechip），使得抗体更加紧贴。具体地，将载玻片在温度为70℃的H₂O₂/NH₄OH/H₂O（1:1:5，v/v）溶液中浸泡10分钟，并进行清洗后，在95％的乙醇（v/v）中溶解1.5％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷（aminopropyltrimethoxysilane）的溶液中浸泡2小时后，按乙醇、蒸馏水的顺序依次清洗3次。利用空气干燥这胺改性（amine-modified）载玻片，并在110℃的温度下烘烤1小时。在这载玻片贴上直径为1.5mm的200个（25×8）斑点（spot）形状的铁氟龙胶带，来制备孔板（well）形状的蛋白芯片（proteinchip）。

2）抗体载玻片的制备

在准备好的胺芯片处理抗组氨酸（anti-histidine）抗体，来制备抗体载玻片，并与重组蛋白质进行反应。即，将五抗体（penta-Hisantibody）（凯杰公司，希尔敦，德国）以10ug/ml的浓度在磷酸缓冲液（phosphatebuffer）中稀释，按每1ul进行点样（spotting），并在37℃的温度下进行2小时反应之后，利用添加0.1％的吐温20（Tween-20）的磷酸盐缓冲液（PBS），将反应好的陈列（array）清洗10分钟，第二次利用蒸馏水清洗5分钟，然后用空气干燥（每个步骤都相同）。之后，为了封闭（blocking）对蛋白芯片的非特异性相互作用（nonspecificinteraction），在37℃的温度下处理1小时添加5％牛血清白蛋白（BSA）的PBS/T之后进行清洗（如同上述），然后分别将利用麦胚系统（wheatgermsystem）生产的抗原蛋白质按每1ul向各个孔板（well）点样（spotting）之后，在37℃的温度下反应1小时后进行清洗。通过ELISA检测，利用磷酸缓冲液将未感染寄生虫症患者的血清或感染肝吸虫症患者的混合（pooled）血清稀释到50倍，将稀释的患者血清按每1ul向各个孔板（well）点样（spotting）之后，在37℃的温度下反应1小时后进行清洗。在各个孔板（well）中，以10ug的浓度点样alexa546-抗人免疫球蛋白（alexa546-anti-humanIgG）（英杰生命科技有限公司（Invitrogen），卡尔斯巴德（Carlsbad），加利福尼亚州（CA），美国（USA））之后，在37℃的温度下反应1小时，然后在包含1％的Tween-20的磷酸盐缓冲液中清洗载玻片20分钟，第二次在蒸馏水中清洗5分钟。利用荧光扫描仪（fluorescencescanner），以543nm的激光（珀金埃尔默公司（PerkinElmer），马萨诸塞州（MA），美国（USA））分别测定强度（intensity）。所有实验均反复进行三次（Jungetal.,2009）。

实施例3：利用通过蛋白芯片被选为抗原候选的EST的克隆和麦胚无细胞系统（wheatgermcell-freesystem）的重组蛋白质的过量生成和通过蛋白芯片的抗原性评价

实施例3-1：抗原候选EST的克隆

为了生产麦胚无细胞系统（Wheatgermcell-freesystem)的重组蛋白质，将通过蛋白芯片获得高评价的抗原性而被筛选的表达序列标签（EST，expressed-sequencedtag）的ORF在麦胚无细胞系统表达载体中实施了克隆。

1）实施融合克隆（In-fusioncloning）

制备引物，使得在插入体的两个末端对麦胚无细胞表达运载体（wheatgermcell-freeexpressionvector）（pEU-E01-His-TEV-N2）包含同源序列（homologoussequence）。并且，进行PCR，利用能够使载体和插入体的同源部位产生融合的酶，准确、迅速地实施了克隆。

首先，正义引物和反义引物分别在5’方向包含EcoRV或BamHI限制性内切酶位点，来包含与载体同源的16～20bp的序列，而在3’方向添加对筛选的EST特异的22～33bp的序列（参照图5a），将质粒DNA作为模板，添加1.25U的EXTag聚合酶（宝生物公司（Takara），日本（Japan））、1×缓冲液、20uM的脱氧核苷三磷酸（dNTP）、分别为0.4皮摩尔（pmole）的正义引物及反义引物，来制备反应液。对DNA聚合酶进行30次如下过程：在94℃的温度下激活，在94℃的温度下进行1分钟变性（denaturation），在63℃或68℃的温度下进行30秒钟退火（annealing），在72℃的温度下进行1分钟延伸（extension）。之后，进行琼脂糖凝胶电泳，来确认PCR产物的质量和数量之后，使用PCR纯化试剂盒（凯杰公司（Qiagen），德国（Germany））进行纯化。利用融合优势PCR克隆试剂盒（In-fusionadvantagePCRcloningkit）（克隆技术公司（Clontech），美国（USA）），将由EcoRV或BamHI限制性内切酶处理的pEU-E01-His-TEV-N2载体（无细胞科学公司（Cellfreesciences），日本（Japan）；参照图5b）和纯化的PCR产物，分别在37℃的温度下进行15分钟反应、在50℃的温度下进行15分钟反应。将反应物在三羟基甲基氨基甲烷缓冲液（TEbuffer，Tris(hydroxymethyl)metylaminomethanebuffer）中稀释为5倍，将其中的2.5ul转化（transformation）到TOP10（Invitrogen公司，美国）细胞，并涂敷于包含氨苄西林的LB培养基之后，在37℃的温度下放置16小时，来培养细菌菌落。所获得的菌落经过快速PCR和菌落培养之后，利用限制性内切酶来处理通过实施小量质粒提取（miniprep）而获得的DNA之后，进行琼脂糖凝胶电泳，由此确认插入体的大小并进行筛选，并实施自动测序（automaticsequencing）（千年基因公司（Macrogen），首尔），来鉴定ORF连接。

2）质粒DNA的过量生产

为了准备1ug/ul的高浓度质粒DNA，培养细菌，实施中量质粒提取（midiprep）。首先，将已确认ORF的克隆的细菌在包含氨苄西林的LB培养基中培养一夜。利用未添加核糖核酸酶A（RNaseA）的中量质粒提取试剂盒（midiprepkit）（富联生物科技股份有限公司（Viogene），台湾（Taiwan））纯化质粒DNA，并进行收集后，在TE缓冲剂中溶解，以使质粒DNA的浓度达到1ug/ul。

实施例3-2：肝吸虫抗原候选蛋白质的过量生产

利用基于麦胚的无细胞蛋白质合成（Wheatgermbasedcell-freeproteinsynthesis）方法，大量生产附加组氨酸标签（histidinetag）的肝吸虫抗原候选重组蛋白质，并使用镍（nickel）琼脂糖凝胶进行纯化。

将实施例3-1-2中进行纯化的质粒DNA按每25ug分别注入。

将1×翻译用缓冲剂、2.5mM的核苷三磷酸（NTP混合物（mix））、1U/ul的RNase抑制剂及1U/ul的SP6RNA聚合酶试剂在冰上混合，使得每次反应中使用的转录用试剂为250ul。在温度为37℃的培养基（incubator）中，将上述混合液反应6小时，来转录为RNA后，反应液进行琼脂糖凝胶电泳，从而确认RNA的数量和质量。翻译用试剂在冰上融化，从而准备120OD/ml的WEPRO7240H及40ng/ul的肌酸激酶（creatinekinase）。混合转录用试剂中生成的mRNA溶液250ul和翻译用混合物（translationmixture）250ul，并分别注入到6-孔板的每个孔中。将在冰上融化而成的5.5ml的1×SUB-AMIXSGC溶液覆盖（overlay）在翻译用混合物（translationmixture）上，为了防止蒸发，利用石蜡进行密封（sealing）。在15℃的温度下，将上述混合液反应20小时，来生产蛋白质。

之后，倒出镍琼脂糖凝胶（Nickelsepharose）的液体部分，并添加蒸馏水。向色谱柱倒入树脂（resin），并向色谱柱装填平衡缓冲液（equilibrationbuffer=冲洗缓冲液（washbuffer）：20mM磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer），0.3MNaCl，20mM咪唑（imidazole），pH7.5），使表达重组蛋白质的溶液（solution）10次经由色谱柱之后，利用达到色谱柱体积10倍的冲洗缓冲液清洗色谱柱。使用洗脱缓冲液（elutionbuffer）（20mM磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer），0.3MNaCl，20mM咪唑（imidazole），pH7.5）来洗脱（elution）重组蛋白质，并将洗脱的重组蛋白质向磷酸盐缓冲液进行透析。之后，为了测定蛋白质的浓度和鉴定蛋白质的表达程度，对纯化的蛋白质进行12.5％SDS-PAGE。

实施例3-3：利用ELISA方法的重组蛋白质的抗原性鉴定

在0.05m碳酸盐缓冲液（carbonatebuffer）（pH9.6）中，稀释在麦胚无细胞蛋白质合成（Wheatgermbasedcell-freeproteinsynthesis）系统中进行表达、纯化的蛋白质，使得最终浓度成为2.5ug/ml，然后按每200ul分别注入到96孔的酶联免疫（EIA，EnzymeImmunoassay）孔板（wellplate）中。作为对照组，在肝吸虫的虫体中添加磷酸盐缓冲液，并利用均质器（homogenizer）进行磨碎。对匀浆进行离心分离，并回收上清液，来制备粗抗原。用碳酸盐缓冲液调节粗抗原，使其浓度达到5ug/ml后使用，或者按每200ul分别注入后，在-70℃的温度下保管。在4℃的温度下，将抗原包被孔板反应一整夜之后，利用磷酸盐缓冲液-0.05％tween-20（PBS/T）清洗5次抗原包被孔板。在抗原性鉴定中，使用了肝吸虫感染者的血清83个，泰国肝吸虫感染者的血清35个，肺吸虫感染者的血清14个，寄生虫非感染正常人的血清40个。利用PBS/T，将患者的血清稀释成1:100。在抗原包被（coating）的各个孔中放入稀释的血清200ul，并在37℃的温度下反应1小时，利用PBS/T，将各个孔清洗5次。山羊-过氧化物酶-人免疫球蛋白（Goat-peroxidasehumanIgG）第二抗体以1:4000的比率在PBS/T中被稀释，按每200ul分别注入到各个孔中，并在37℃的温度下反应1小时，利用PBS/T，将各个孔清洗5次。在蒸馏水中稀释被甲醇溶解的基质o-苯二胺（phenylenediamine），使得最终浓度达到0.005％，并添加过氧化氢，使得最终浓度达到0.025％。向各个孔（well）添加已稀释的基质200ul，经过20分钟后添加25ul的8NH₂SO₄，来使显色反应停止，然后在酶联免疫检测仪（ELISAreader）中，以490nm测定吸光度。之后，将在正常人对照组的吸光度平均值加上标准偏差2倍后的值设定为截止（cutoff）值，并判定阳性血清。

实验例及结果

实验例1.肝吸虫抗原候选蛋白质的cDNA筛选

实施例1-1肝吸虫分泌蛋白质的cDNA筛选

分析研究团队所持有的肝吸虫转录体，来筛选抗原候选蛋白质的cDNA。利用信号P3.0（SignalP3.0）进行分析，来确保被预测为分泌蛋白质的793个肝吸虫转录体的信息，此时筛选出247个单态（singlet）和546个重叠群（contig）。重叠群（contig）通过确认读序（read）结构信息来选择包含切割位点（cleavagesite）的读序，但除了被选的237个相同读序之外，选择了肝吸虫分泌蛋白质的EST读序556个。

下列表1表示筛选肝吸虫分泌蛋白质的cDNA。

表1

实验例1-2：肝吸虫抗原性蛋白质cDNA的筛选

分析被预测为具有抗原性的EST所编码的氨基酸序列，来筛选cDNA。分析注释信息，预测为71个EST将会对具有抗原性的蛋白质进行编码，但确认美国国立生物技术信息中心（NCBI，NationalCenterforBiotechnologyInformation）登录信息和已发表的论文后，除去已确认抗原性的，并最终选择了51个。确认重叠群的读序结构信息，来选择与注释（annotation）信息具有一致的ORF的读序（参照表2）。

下列表2表示筛选肝吸虫抗原性蛋白质的cDNA。

表2

实验例2.质粒DNA的提取及插入cDNA的确认

如图6所示，提取肝吸虫抗原候选蛋白质EST的质粒DNA，并利用两种限制性内切酶进行双酶切，来确认插入cDNA。此时，所筛选的多个EST克隆都具有0.3～2.5kb的插入cDNA（参照图6）。

实施例3.利用基于麦胚细胞的无细胞蛋白质合成系统（Wheat-germcellbasedcell-freeproteinsynthesissystem）的重组蛋白质的大量生产

实施例3-1.引物的研制及制备

1）第一次PCR引物的研制及制备

为了扩增对肝吸虫抗原候选蛋白质进行编码的cDNA，制备了480个S1-基因特异性引物（5’-CCACCCACCACCACCAATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’）（参照表3）和1个反义引物（5’-TAATACGACTCACTATAG-3’）。

2）第二次PCR引物的研制及制备

制备了在第二次PCR中使用的SPU引物（5'-GCGTAGCATTTAGGTGACACT-3'）和deSP6E02his-S1引物（5'-GGTGACACTATAGAACTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTATGGGACATCATCATCATCATCATCTCCACCCACCACCACCAATG-3'）。

下列表3表示已研制及制备的S1基因特异性引物（S1-Gene-specificprimer）。

表3

实验例3-2.靶（Target）cDNA的PCR扩增产物

通过两步骤聚合酶链式反应（Two-stepPCR），使附加了转录和翻译调节因子的靶cDNA。第一次PCR产物以特异性高的单一大小进行扩增（参照图7a）。第二扩增产物由于在第二次PCR引物中附加的核苷酸（nucleotide），比第一扩增产物分别增加了98bp的长度（参照图7b）。利用基于麦胚细胞的无细胞蛋白质合成系统（Wheat-germcellbasedcell-freeproteinsynthesissystem）判定能够使用于重组蛋白质的生产。

实验例3-3.肝吸虫抗原候选蛋白质的大量生产

将肝吸虫抗原候选蛋白质EST的第二次PCR产物用作模板（template），并利用麦胚无细胞系统和自动系统（automaticsystem）合成了共计434个肝吸虫抗原候选重组蛋白质。

实验例3-4.通过蛋白芯片的抗原性鉴定

使用胺包被载玻片，将由434个抗原候选蛋白质制得的抗原陈列（Antigenarray）与肝吸虫感染者的血清进行反应，来筛选呈现优秀抗原性的EST（参照图8）。

在载玻片涂敷组氨酸抗体，来捕获重组蛋白质，并将肝吸虫症患者的血清或正常对照组血清作为第一抗体，与由荧光物质标志的第二抗体反应。对各个抗原候选蛋白质的荧光强度（FI，Flurescenceintersity）值进行定量化，如此，所有试验反复进行三次。

如下所述，定量化的荧光强度值根据如下公式进行分析。将在各个抗原蛋白质上处理正常对照组血清而得的荧光强度值，换算为肝吸虫感染者血清荧光强度值的倍值来进行分析。

FI值的倍值=[肝吸虫感染者混合血清的F1-本底（仅为麦胚裂解物）（F1-background(wheatgermlysateonly）的FI]/[正常对照组个体血清的F1-本底（仅为麦胚裂解物）的FI]

求得三次检测后的倍值的平均值，并将倍值6.85设定为截止值（cutoffvalue）。有18个EST被筛选为具有优秀的抗原性的候选抗原（参照图9）。

下列表4表示筛选的肝吸虫抗原候选的信息，在这18种EST当中，有10种与在裂体吸虫中发现的蛋白质具有同源性。

表4

**参考文献

1.Berriman,M,etal.,(2009)ThegenomeofthebloodflukeSchistosomamansoni.Nature460(7253),352-358

2.ZhouY,etal.,(2009)TheSchistosomajaponicumgenomerevealsfeaturesofhost-parasiteinterplay.Nature460(7253):345-51.

3.Lee,J.S.,etal.,(2007)MolecularcloningandcharacterizationofamajoreggantigeninParagonimuswestermanianditsuseinELISAfortheimmunodiagnosisofparagonimiasis.Parasitol.Res.100(4):677-681

4.Mongin,E.,etal.,(2004)TheAnophelesgambiaegenome:anupdate.TrendsParasitol.20(2):49-52

5.Reno,M.L.,etal.,(2009)BiogeographyoftheSulfolobusislandicuspan-genome.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(21):8605-8610

6.Bowler,C.,etal.,(2008)ThePhaeodactylumgenomerevealstheevolutionaryhistoryofdiatomgenomes.Nature456(7219):239-244

实验例4.通过蛋白芯片被选为抗原候选的EST的克隆和利用麦胚无细胞系统（wheatgermcell-freesystem）的重组蛋白质的大量生产，以及通过ELISA的抗原性评价

实验例4-1.抗原候选EST的克隆

将在胺芯片（Aminechip）分析中被筛选的共计18种肝吸虫抗原候选物质在麦胚无细胞表达系统中使用的表达载体（wheatgermcell-freesystemexpressionvector:pEU-E01-His-TEV-N2）中进行克隆，并实施快速（rapid）PCR，来确认插入DNA。提取质粒DNA，并利用两种限制性内切酶进行双酶切，从而确认插入DNA及载体DNA（参照图10）。并且，实施自动测序（automaticsequencing），来确认标签肽（tagpeptide）和靶抗原蛋白质的ORF是否准确连接。

实施例4-2.肝吸虫抗原候选蛋白质的大量生产及纯化

利用麦胚无细胞系统（Wheatgermcell-freesystem），并使用自动化设备实施转录和推定过程（参照图3）。利用附加的组氨酸标签（histidinetag），并通过镍琼脂糖凝胶（nickelsepharose）来纯化已生成的重组蛋白质。通过蛋白质印迹法（Westernblotting）确认标记组氨酸（Histidinetagging）的预期大小的重组蛋白质（参照图11）。

利用胺芯片（Aminechip）筛选的共计18种蛋白质中，为了将抗原性优秀的11种蛋白质大量生产为重组蛋白质而进行实验。其结果，6种被表达为不溶性蛋白质，1种表达程度甚微，只有4种表达为水溶性蛋白质并对其进行纯化（参照图12）。对重组蛋白质进行两次表达、纯化。分别按每500ul的蛋白质进行洗脱而获得的蛋白质浓度如图5所示。

即，下列表5表示候选抗原蛋白质的第一次及第二次生成及纯化的浓度。

表5

抗原#	第一次纯化(ug/ul)	第二次纯化(ug/ul)	总量(ug/1000ul)
				#12	0.43	0.42	425

#15	0.64	0.59	615
				#17	0.83	0.96	895
#18	0.31	0.31	310

实验例4-3.利用ELISA方法的重组蛋白质的抗原性鉴定

利用ELISA，对吸虫感染者的血清及对照组正常人的血清进行有关重组候选抗原蛋白质抗原性的分析结果显示在图13中，下列表6中归纳了适用各个抗原的截止值的特异度和灵敏度（OD490nm）。

如图13所示，向各个候选抗原分别适用截止基准值时，抗原（Ag）17的灵敏度为77.1％，接近粗抗原的灵敏度，且特异度为71.2％，呈现相当于粗抗原约2倍的增强效果，因此，在重组抗原中被评价为最优秀的抗原。其他候选抗原Ag12、Ag15及Ag18的灵敏度虽然未能达到粗抗原的灵敏度，但特异度为68.5～76.4％，呈现比粗抗原更加优秀的性能。

由以上结果可见，呈现接近以往使用的肝吸虫的粗抗原灵敏度的Ag17和特异度显著高于粗抗原的Ag12、Ag15及Ag18被评价为有用地作为既能维持特异度还能增强灵敏度的复合抗原制备用候选抗原。由此给出了上述这些抗原与多种组合按比率混合而可用作呈现最高的特异度和灵敏度的复合重组蛋白质的技术启示。

表6

产业上的可利用性

本发明利用无细胞高通量（cell-freehigh-throughput）重组蛋白质表达系统，生产特异度和灵敏度都很优秀的抗原蛋白质，从而生成对肝吸虫症的诊断及治疗有用的抗原蛋白质及抗原蛋白质组合物。本发明的对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质、上述蛋白质的片段或突变体由于具有优秀的特异性和灵敏度，因此，能够在预防或治疗肝吸虫类感染方面作为很好的免疫原或免疫刺激剂来使用，并且，由于能够用作诊断肝吸虫类的诊断用抗原，因此，本发明的产业上利用价值将会非常大。

Claims (6)

1.一种对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列为序列号1至序列号4，以及所述肝吸虫类选自肝吸虫、泰国肝吸虫及猫肝吸虫的组。

2.一种基因，其特征在于，对权利要求1所述的蛋白质进行编码。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，上述基因的碱基选自序列号5至序列号8的组。

4.一种肝吸虫类诊断用组合物，其特征在于，将权利要求1所述的蛋白质作为有效成分。

5.一种免疫刺激剂，其特征在于，将权利要求1所述的蛋白质作为有效成分。

6.一种抗体，其特征在于，针对权利要求1所述的蛋白质。