KR19990039782A

KR19990039782A - 간흡충 28 kDa 및 26 kDa 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 26 kDa GST를 코딩하는 유전자, 이 유전자를 대장균에서 발현시켜 얻은 재조합 단백질 및 그의 용도

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Publication number: KR19990039782A
Application number: KR1019970060001A
Authority: KR
Inventors: 조승열; 정영배; 홍성종; 공윤; 강신영
Original assignee: 박원훈; 한국과학기술연구원
Priority date: 1997-11-14
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 1999-06-05

Abstract

본 발명은 간흡충에서 정제한 신규한 28 kDa 및 26 KDa GST (글루타티온 S-트랜스퍼라제), 26 kDa GST를 코딩하는 유전자, 및 이를 이용하여 합성한 재조합 단백질 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 확인한 26 KDa GST는 특이적인 면역원성을 갖기 때문에 이를 이용하여 간흡충증을 높은 민감도로 진단할 수 있다. 따라서, 본 발명은 종래의 간흡충증의 진단 또는 치료시의 문제점을 분자생물학적 측면에서 구명하여 간흡충증 진단시약과 치료제 개발에도 적용이 가능하다.

Description

간흡충 28 ｋＤａ 및 26 ｋＤａ 글루타티온 Ｓ-트랜스퍼라제(ＧＳＴ), 26 ｋＤａＧＳＴ를 코딩하는 유전자, 이 유전자를 대장균에서 발현시켜 얻은 재조합 단백질 및 그의 용도

본 발명은 간질환을 일으키는 간흡충의 인체 병인에 중요한 역할을 담당하는 28 kDa 및 26 kDa 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 정제하고 그의 항원성을 검증하여 간흡충증 진단용 항원으로서의 가치를 검증하고 진단 키트를 제조하기 위하여 26 kDa GST를 암호화하는 전체 유전자 서열을 밝히고 대장균에서 재조합 단백질을 제조하여 그 항원성을 검증한 것이다.

최근 우리나라에서 인체 감염율이 가장 높은 기생충 감염은 간흡충증이며 약 100만명의 감염자가 있는 것으로 추산된다 (보건사회부 한국건강관리협회, 1992). 간흡충증은 낙동강, 한강, 금강 등 대·소 하천 유역에 유행지가 형성되어 있으며, 그 중에서 낙동강 유역이 가장 유행도가 높은 농후 유행지이다. 지역에 따라 간흡충 감염율에 차이가 있는데 (Hong et al., Korean J Parasitol 32: 271-273, 1994), 낙동강 상류 지역의 감염율이 매우 높으며 주민의 48.4%가 감염되어 있는 부락도 있다. 토양매개성 윤충의 감염율은 과거 20년 동안 급속하게 감소되어 현재에는 전국적인 집단관리를 재평가하여 대도시 지역을 관리대상에서 제외시킬 정도가 되었다. 그러나, 민물고기를 날것으로 먹거나 덜 익혀 먹어서 감염되는 간흡충증은 감염율이 낮아지지 않고 있어서 이 질병에 대한 계몽 활동을 지속적으로 펴고 집단 관리를 하여야 한다고 평가되고 있다.

간흡충 감염 초기에는 어린 충체가 간담도를 침범하여 40 ℃에 이르는 고열과 간에 압통이 발생하고, 눈의 공막에 황달기가 나타나는 등 급성 간염 증상이 나타난다(서병설, 임상 기생충학, 2판, 1980). 간흡충 감염이 만성화되면 간흡충이 있는 담도에 상피세포의 과증식이 일어나고 담관벽에 결체 조직이 증가하여 두꺼워지며 담관 주위에 염증 세포 침윤이 일어난다. 이와 같은 조직 반응은 간흡충이 위치하는 주위에만 일어나는 것이 아니라 간흡충이 존재하는 부위로부터 원위부 미세 담도까지 확대되어 발생하며 감염 후기에는 간 외연에 경화성 변화(cirrhotic change)가 나타난다. 간흡충 감염으로 인하여 발생한 담도와 간조직의 기질적인 변화는 간흡충 치료제인 프라지쿠안텔(praziquantel, 상표명 Distocide, 신풍제약)로 충체를 제거하여도 감염되기 전의 정상 조직으로 회복되기까지 오랜 기간이 소요된다. 간흡충을 감염시키고 제2주에 치료하면 간 병변은 치료후 4주 경과시에 모두 소실된다. 그러나, 감염 기간이 4주로 길어지면 치료후 12주까지도 담관과 담관 상피층의 증식 및 담관 주위 섬유화가 완화된 수준으로 계속 남아 있다 (Lee et al., Korean J Parasitol 25:110-122; Seoul J Med 29:253-262, 1988). 감염 후 14주에 치료하면 치료후 1년에 담도 상피세포의 배세포화생(metaplasia)은 소실되지만 나머지 병변은 약화된 정도로 계속 남아 있다 (Hong et al., Seoul J Med 31:117-127, 1990). 따라서, 간흡충증은 감염 초기에, 즉 감염후 2-4주에 치료하는 것이 아주 중요하다.

과거 간흡충증은 충란 검사법, 피내 반응 검사법과 항체 검사법으로 진단하였다. 그러나, 충란 검사법에서는 충란 발견율이 매우 낮다. 최근에는 효소 면역 측정법에 의하여 환자의 혈청에서 특이항체가를 측정하여 진단하는 방법이 사용되나 역시 민감도에 문제가 있어 널리 이용되지는 못하고 있는 실정이다 (Cho et al., Korean J. Parasitol 27:15-21, 1989).

동물의 조직에 기생하는 기생충은 숙주가 기생충 침입을 방어하기 위한 반응으로 생산하는 유리 라디칼(free radical)을 제거할 수 있는 여러 항산화효소(antioxidant enzyme)를 지니고 있다 (Brophy and Pritchard, Exp Parasitol 79:89-96, 1994). 이 중 GST는 모든 생물 세포의 세포질이나 막에 붙어 있는 이량체 이소엔자임(dimeric isoenzyme)으로서 주 기능은 환원 글루타티온이 친전자성(electrophilic) 화합물에 결합하는 것을 촉매하여 해독 작용을 나타내는 것이다 (Mannervik et al., Proc Natl Acad Sci USA 82:7202-7206, 1985).

최근 GST에 관한 연구는 기생충, 특히 주혈흡충과 간질 (Fasciola hepatica)에 집중되어 만손 주혈흡충 (Schistosoma mansoni), 일본 주혈흡충(Schistosoma japonicum), 간질 등에서 GST가 정제되었으며 각각의 cDNA가 클로닝되어 염기 서열과 아미노산 서열이 비교 분석되었다 (Trottein et al., Mol Biochem Parasitol 41:35-44, 1991; Mol Biochem Parasitol 54:63-72, 1992). 만손 주혈흡충의 GST는 분자량이 26 kDa와 28 kDa인 2 종류의 GST가 있으며, 이 두 GST는 아미노산 서열의 유사성이 약 20% 정도로 매우 낮다 (Trottein et al., Mol Biochem Parasitol 41:35-44, 1991). 만손 주혈흡충의 26 kDa GST(Sm26GST)는 포유 동물의 α 및 μ 클래스와 유사한 구조 및 효소 활성을 가지고 있다 (Taylor et al., EMBO J 7:465-472, 1988). 대장균에서 발현시킨 만손 주혈흡충의 재조합 28 kDa와 26 kDa GST는 효소 활성과 항원성이 높았다 (Smith et al., Mol Biochem Parasitol 27:249-256, 1988; Henkle et al., Mol Biochem Parasitol 40:23-34, 1990).

이와 같이 기생충-숙주 사이의 상호 관계에 관련될 것으로 예상되는 여러 종류의 물질 중에서 간흡충 GST는 숙주의 면역 반응 및 조직 반응에 중요한 발병물질이 될 것으로 예상되며 이 효소의 특성을 분자 수준에서 규명하는 것은 간흡충에 감염된 간에서 일어나는 병변의 진행 과정과 간흡충증에 대한 면역 형성 기전 및 진단에 매우 중요하다고 생각된다. 그러나, 아직 유전자가 클로닝되지 않아 진단과 치료상에서 발생하는 문제를 근본적으로 해결하지 못했다.

따라서, 본 발명의 목적은 현재 간흡충증의 진단 또는 치료시의 문제점을 분자 생물학적 측면에서 구명하여 간흡충증 진단 시약과 치료제 개발에 적용가능한 기초적이고 근본적인 정보를 제공하기 위하여 간흡충에서 28 kDa 및 26 KDa GST를 정제하고, 그 중 26 kDa GST의 유전자 염기 서열을 확인하고, 이를 이용하여 재조합 단백질을 얻고, 이의 간흡충증 진단 용도로 사용하고자 하는 것이다.

도 1은 글루타티온을 이용한 흡착 크로마토그래피 및 이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 의해 간흡충의 28 및 26 kDa 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (이하 GST라 칭함)를 동시에 정제한 결과를 나타내는 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동 분석 사진.

도 2은 간흡충 28 및 26 kDa GST의 항원성을 면역블롯(immunoblot)에 의해 분석한 결과를 나타낸 도면.

도 3는 간흡충 26 kDa GST의 유전자를 찾기 위한 과정을 나타내는 계통도.

도 4는 간흡충에서 전령 RNA에 상보성인 cDNA 라이브러리 (cDNA library) 제조 과정 중의 이중가닥의 합성 결과를 나타낸 도면.

도 5은 간흡충 GST의 염기서열을 결정하기 위해 제작한 만손 주혈흡충 GST의 부분 염기서열.

도 6은 도 5의 염기서열과 간흡충 cDNA를 사용하여 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭한 간흡충 GST의 430 bp 증폭산물을 나타낸 도면.

도 7은 GST 유전자의 효소 절단 부위를 표시한 유전자 지도.

도 8는 간흡충 26 kDa GST의 유전자 서열과 아미노산 서열.

도 9은 간흡충 26GST의 아미노산 서열을 다른 기생충 GST의 아미노산 서열과 비교 분석한 결과를 나타낸 도면.

도 10은 간흡충 GST의 발현 정도를 측정한 노던 분석 결과를 나타낸 도면.

도 11는 간흡충 26 kDa GST의 발현 플라스미드인 JM83의 작제 과정을 나타내는 계통도.

도 12은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 재조합 GST의 분석 사진.

도 13는 간흡충 재조합 GST의 항원성을 검증한 면역블롯 결과 사진.

본 발명은 세가지 실시태양으로 나누어진다. 우선 하나는 간흡충에서 각각 28 kDa 및 26 kDa의 분자량을 갖는 두 GST 효소를 정제하여 그 항원성을 구명하는 것이며, 두 번째는 간흡충 26 kDa GST를 암호화하는 유전자를 찾고 분석하는 것이며, 마지막은 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균에서 재조합 GST를 생산하고 이의 항원성을 검증하는 것이다.

본 발명은 먼저 간흡충에서 GST를 정제하기 위하여 글루타티온-흡착 크로마토그래피 및 이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 의해 간흡충의 28 및 26 kDa GST를 동시에 정제하고 그 결과를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다 (도 1). 이어서, 표 1에는 간흡충에서 최종 정제한 28 및 26 kDa GST의 생화학적 특성을 분석한 결과를 나타내었다. 상기 정제한 간 흡충의 28 kDa 및 26 kDa GST는 다른 기생충이나 고등동물에서 정제한 GST 중 어느 것에도 포함되지 않은 새로운 형태의 GST이었다. 이 간흡충 28 및 26 kDa GST 두 단백질을 항원으로 사용한 면역블롯에 의해 항원성을 검증한 결과 이 단백질은 간흡충증 환자의 혈청에 대해서만 특이적으로 민감하게 반응하였다 (도 2).

간흡충 충체에서 RNA를 추출하여 이 단백질의 일차 구조를 결정하였다. 도 3은 간흡충 26 kDa GST의 유전자를 찾기 위한 과정을 나타내는 계통도이다. 일반적으로 어떤 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 찾기 위해서는 먼저 목적하는 단백질을 생산하는 세포로부터 전령 RNA(이하 mRNA라 칭함)를 얻어야 한다. 이렇게 얻어진 mRNA들을 역전사를 사용하여 상보적 DNA(cDNA)를 제조하고, 이렇게 제조한 cDNA에 (dC)n 테일을 붙이고, (dG)n 테일을 붙인 벡터와 접합(annealing)시킨 후 알맞는 균주에 도입하면 형질전환된 균주는 다양한 mRNA에 대응하는 cDNA를 가지게 되는데, 이렇게 만들어진 균주의 DNA를 cDNA 라이브러리라고 부른다 (도 4 참조). 이 cDNA 라이브러리로부터 크기가 0.5 kb 이상인 cDNA만을 선별하였다. 이 형질전환 균체 중에서 원하는 유전자를 보유하는 균체를 선별하기 위하여 콜로니 하이브리다이제이션(colony hybridization) 방법 (Maniatis et al., 1982 "molecular cloning", pp312-319)을 이용하였다. 프로브로서 이미 다른 종에서 알려져 있는 유전자 서열을 이용하고 역전사 중합효소 연쇄반응을 통하여 부분적인 유전자 서열을 획득하였다 (도 5 및 도 6 참조). 이렇게 얻어진 생성물에 방사선 동위원소로 표지하여 GST의 유전자 서열을 갖는 양성 클론을 획득하고 이 서열을 플라스미드인 pBS SK(-) 운반체에 서브클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 얻은 후 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결 방법 (Maniatis et al., 1982 "molecular cloning")에 의해 T3 및 T7 프라이머를 이용하여 간흡충에서 900 bp의 GST의 유전자 서열을 결정하였으며 (도 7), 블라스트 써치 (blast search) 프로그램으로 GST임을 확인하였고, 효소 절단 부위 및 아미노산 서열로의 변환 및 다른 기생충의 GST와의 아미노산의 비교 분석에는 DNA 스트라이더 (strider) 1.0 분석 프로그램을 사용하였다 (도 8 및 도 9 참조). 이어서, GST의 발현정도를 알아보기 위하여 GST 유전자 (CsGST)를 방사선 동위원소로 표지하여 노던 분석(northern analysis)을 실시하였다. 그 결과, 약 0.8 kb 크기의 유전자가 발현되는 것을 확인하였다 (도 10).

GST 유전자(CsGST)를 대장균에서 발현시키기 위하여, 유전자를 유전자 조작에 의해 발현벡터 JM83에 도입시킨 후 (도 11 참조) 재조합 단백질을 합성하였다. 즉, 간흡충 26GST 유전자가 들어있는 대장균(E. coli) JM83 벡터를 10 ㎖ LB/암피실린 배양액에 접종하고 37 ℃에서 18시간 동안 배양하였다. 이 배양액에 다시 500 ㎖의 LB/암피실린 배양액을 첨가하고 OD가 0.6이 될 때까지 배양하였다. IPTG를 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가한 후 다시 3시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 JM83을 침전시키고 마우스 토니시티 인산염 완충액 (mouse tonicity phosphate buffer) (MTPB; 150 mM NaCl, 16 mM Na₂HPO₄, 4 mM NaH₂PO₄, pH 7.3)에 현탁시켰다. 이 현탁액에 트리톤(Triton) X-100을 첨가하고 (최종농도 1 %), 초음파 파쇄기(sonicator)로 파쇄시켜 균질액을 만든 후 4 ℃에서 10,000 x g로 20분 동안 원심분리하고 상청액을 회수하여 재조합 단백질로 사용하였다. 도 12는 이와 같은 방법에 의하여 합성한 재조합 단백질의 전기영동상 분석을 나타낸 것이다. 도시한 바와 같이, 재조합 간흡충 26GST가 단일밴드로 나타나 양호하게 합성되었음을 알 수 있다. 이어서, 이 재조합 단백질을 항원으로 사용하여 간흡충증 환자 혈청과 반응시켜 재조합 단백질의 항원성을 검증한 결과, 30명의 환자 중 27명의 환자가 양성반응을 나타내 항원성이 우수한 것을 확인하였다 (도 13). 한편, 이 재조합 단백질의 효소 활성도를 측정한 결과 효소 활성을 지니고 있었다 (표 2).

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하나, 이들에 의해 본 발명이 어떠한 방식으로도 한정되는 것은 아니다.

실시예

<실시예 1>

참붕어에서 피낭유충을 분리하여 토끼에 1000마리씩 경구 감염시키고, 3개월 후에 간에서 회수한 성충을 생리 식염수에서 3회 세척하여 폐 조직이나 이물질을 제거한 후 미리 냉각시킨 50 mM 인산염 완충 염수 (phosphate buffered saline, PBS, pH 7.8)를 가하여 균질화시킨 후, 700 x g에서 5분간 2차례 원심분리하여 핵 분획을 제거하였다. 다시 20,000 g로 60분 동안 원심분리하여 세포질과 미토콘드리아 분획을 분리하였다. 이 상층액을 조효소로 사용하여 조효소로부터 GST를 정제하기 위해 우선 2.6 × 5 ㎝의 글루타티온-아가로스 친화도 컬럼을 사용하였다. 컬럼에 조효소를 흡착시키고, 글루타티온/DTT 용출액을 이용하여 흡착된 단백질을 용출시켰다. 부분정제한 효소를 1.6 × 7 ㎝의 Q-세파로스(Sepharose) 이온 교환 컬럼에 흡착시키고 0, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2 M NaCl 농도 구배로 용출시킨 후 상기 설명한 바와 같은 방법으로 효소 활성을 측정하였다. 효소활성이 높은 분획을 수집하여 20 mM 아세테이트 완충액(pH 6.3)에 투석, 농축한 다음 7.5-15% 농도 구배 겔에서 정제된 28 kDa과 26 kDa의 단백질을 확인하였다 (도 1 참조). 또한, 정제된 GST 효소활성도를 측정하여 하기 표 1에 나타내었다. 아울러, 이 단백질의 항원성을 검증한 결과 이 두 단백질은 간흡충증 환자의 혈청에 대해서만 특이한 반응을 나타내고, 다른 기생충증 환자, 즉, 폐흡충증, 간질증 및 주혈흡충증 환자 혈청과는 반응을 나타내지 않았다 (도 2 참조).

간흡충에서 최종 정제한 28 및 26 kDa GST의 생화학적 특성의 비교

억제제^*	효소
억제제^*	28 kDa	26 kDa
브로모술포프탈레인(Bromosulfophthalein)	1.52±0.01	1.48±0.08
시바크론 블루(Cibacrone blue)	0.75±0.26	3.69±1.62
알벤다졸(Albendazole)	947±307	38.5±9.97
프라지쿠안텔(Praziquantel)	21.7±3.15	25.0±5.75
*억제제에 의한 억제 효과는 IC₅₀(50%의 효소 활성을 억제하는 억제제의 농도)으로 표시함.%억제 = 100[I]/(IC₅₀+[I])I: 억제제의 농도

<실시예 2>

GST를 생산하는 유전자를 얻기 위하여 먼저 성충으로부터 cDNA 라이브러리를 제조하였다 (도 3 참조). 간흡충 피낭유충을 200개씩 토끼에 경구감염시키고 6개월 후에 토끼의 간에서 간흡충 성충을 회수하였다. 성충 200마리로부터 약 1.5 ㎎의 전체 RNA를 분리하였다. 전체 RNA를 분리하기 위하여 RNA zol B (미국 텍사스주 소재의 Biotech Co.)를 이용하였다. 이렇게 얻어낸 전체 RNA를 1 M 포르말린 (formaldehyde)이 혼합된 1.1% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 실시하였다. 그 결과, 간흡충의 경우에 18S의 밴드가 진하게 염색되었다. 전체 RNA 중에서 mRNA와 특이적으로 결합하는 올리고 (dT) 기질을 이용하여 mRNA 13 ㎍을 순수 분리하였다. 이렇게 준비된 mRNA 중 8 ㎍을 주형으로 하고 5' 말단에 제한효소 Xho I 절단 염기서열이 붙은 올리고 (dT) 프라이머와 역전사효소(AMV-RT)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 라이브러리를 제작하기 위하여 합성한 이중가닥 cDNA(ds-cDNA)는 크기가 0.5 kb 이상이었으며, 대부분 0.8-2.8 kb 범위에서 관찰되었다 (도 4 참조). 단일가닥에 DNA 중합효소를 이용하여 크기가 상이한 이중가닥을 만들었다. 여기에 운반체(벡터)에 접합되도록 제한효소 EcoRI 링커를 붙인 다음 EcoRI 말단을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase)로 포스포릴레이션(phosphorylation)시켰다. 링커를 붙인 cDNA의 XhoI 부위에 오버행(overhang)을 만들었다. 이 cDNA를 세파크릴(sephacryl) S-400 스펀(spun) 컬럼 (Pharmarcia Co.)에 통과시켜 0.5 kb 이상을 모았다 (도 4 참조). 그런 다음 준비된 cDNA 약 100 ng과 1 ㎍의 운반체(Uni-Zap XR 벡터, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 Stratagene Co.)를 반응시켜 접합시킨 후, 시험관내 패키징 (in virtro packaging) (Giga Pak Gold II, Stratagene Co.)시켜 대장균 SURE 균주 (Stratagene Co.)를 형질전환시킴으로써 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 이 라이브러리는 재조합 파지 DNA 1 ㎍당 1.0 x 10⁷pfu의 역가를 보였으며 0.1%의 배경(back ground)을 가지고 있었다.

<실시예 3>

간흡충 GST의 유전자 염기 서열을 찾아내기 위하여 만손 주혈흡충의 GST 염기서열을 기준으로 프로브를 합성하고 간흡충 cDNA를 주형으로 사용하여 PCR을 실시하여 430 bp의 염기 서열을 지닌 PCR 증폭산물을 얻었다 (도 6). 이 증폭산물을 프로브로 이용하여 cDNA 라이브러리 약 300,000 pfu를 면역스크리닝(immunoscreening)하여 양성 클론 13개, 즉 Cs26GST-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13을 정제하였다. 양성 클론의 유전자 제한 지도를 작성한 결과, 6개 클론 (Cs26GST-1, 2, 3, 7, 8, 9 및 13)은 cDNA의 크기가 약 900 bp이고, KpnI과 XbaI 제한효소 부위를 지니고 있었다 (도 7 참조). 다른 7개의 클론은 삽입체의 크기가 2,200 bp이고 두 종류의 서로 다른 cDNA가 결합된 것이었다. 삽입체의 크기가 900 bp인 클론들의 염기 서열을 결정하였다. 이 클론들은 5'-말단에 결실된 염기 수에 차이가 있을 분 전체적인 염기 서열은 차이가 없었다. 그 중, 가장 긴 클론 (Cs26GST9)은 크기가 775 bp이었고 번역된 아미노산 서열 중 1개가 메티오닌으로 시작되면서 218개의 아미노산 잔기로 구성된 개방 해독 프레임 (open reading frame)을 지니고 있었다 (도 8 참조). 컴퓨터를 이용한 분석에서 이 펩티드의 분자량은 25.1 kDa로 계산되었고 등전점은 6.08로 예측되었다. 이 펩티드의 소수성은 -0.14이었다. 5'-말단의 비코딩 영역에는 염기가 19개 있었다. 3'-말단의 비번역 영역은 18개의 (A)가 연결된 폴리(A) 테일과 이 테일의 19 염기 윗쪽에 AAAATA로 구성된 폴리아데닐화 (polyadenylation) 부위로 추정되는 부위를 지니고 있었다. 이어서, 이 단백질의 아미노산 서열을 다른 기생충의 GST의 서열과 비교한 결과 이 단백질은 폐흡충 26 kDa GST와 68.8%, 간질 GST와 63.8%, 만손 주혈흡충 26 kDa GST와 56% 및 일본 주혈흡충 26GST와 55.5%의 상동성을 보였다. 한편, 사람 GST M3과는 42%의 상동성을 보였다 (도 9). 이 클론을 간흡충 26GST(Cs26GST)라 명명하였고, 젠 뱅크 (Gen Bank)에 L47992로 등록하였다. 이 단백질의 특성을 분석한 결과 π강 GST의 글루타티온 결합 부위인 G-부위를 구성하는 10개의 아미노산 중 7개의 아미노산, 즉, Try7, Gly12, Trp41, Lys45, Pro53, Ser64 및 Glu96이 일치하고 있었다 (도 8 및 도 9 참조).

<실시예 4>

간흡충 26 kDa GST의 mRNA에 대한 노던 블롯을 실시하여 이 단백질의 발현 정도를 측정하였다. 간흡충 전체 RNA를 이용한 노던 블롯에서 약 0.9 kb 크기에서 시그날이 나와 (도 10 참조), 클로닝된 Cs26GST cDNA보다 약 100 뉴클레오티드 정도 더 큰 것으로 확인되었다. 이어서, 재조합 단백질의 항원성을 검증하기 위하여 우선 Cs26GST에 대한 재조합 단백질을 합성하였다. 우선 선정된 클론의 코딩 영역을 발현 벡터인 pGEX-4T (스웨덴 웁살라 소재의 Pharmacia Biotech, Co.)의 다중 클로닝 부위 (multicloning site)에 서브클로닝하였다. pGEX-4T의 운반 단백질은 일본 주혈흡충의 26 kDa 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Sj26-GST)이므로 pGEX-4T의 씨이퀀싱 (sequencing) 프라이머를 이용하여 해독 프레임이 맞게 (in-frame) 서브클로닝된 것을 확인하였다 (도 11 참조). 대장균 DH5α(Stratagene Co.)를 형질전환시키고 IPTG로 유도시켜서 합성단백질을 발현시킨 후 배양액을 원심분리시키고 침전물을 초음파 파쇄기로 균질화시켰다. 균질액을 20,000 xg로 10분간 원심분리하여 상청액을 취한 다음 S-겹합 글루타티온 (GSH)-아가로스 친화도 컬럼 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma)에 로딩하고 트리스(Tris)-NaOH 30 mM (pH 9.1)/7 mM 글루타티온/1 mM DTT 용액으로 용출시키면서 분획을 모았다. 그 후, 트롬빈으로 재조합 단백질을 Sj26-GST에서 분리시키고 GSH-아가로스 친화도 컬럼을 통과시켜서 재조합 단백질을 정제하였다 (도 12). 이 단백질을 항원으로 사용하여 환자의 혈청과 면역블롯을 실시한 결과 30명의 환자중 28명이 양성 반응을 나타내었다 (도 13 참조). 아울러, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 재조합 Cs26GST의 비활성도를 측정한 결과 6.6 단위/mg이었고, 대조군으로 사용한 간흡충 성충에서 정제한 GST의 비활성도도 6.6 단위/mg이었다.

재조합 단백질의 효소 비활성도

	총 효소 활성도(단위/ml)	단백질 함량(mg/ml)	비활성도(단위/mg)
재조합 효소	67.3	10.2	6.6
정제한 효소	41.8	6.3	6.6

본 발명에 따르면, 간흡충에서 정제한 28 kDa 및 26 KDa GST, 26 kDa GST의 유전자 염기 서열 및 이를 이용하여 합성한 재조합 단백질이 제공되고, 이 단백질의 특이적인 면역원성을 이용하여 간흡충증을 높은 민감도로 진단할 수 있다. 따라서, 본 발명은 종래의 간흡충증의 진단 또는 치료시의 문제점을 분자생물학적 측면에서 구명하여 간흡충증 진단시약과 치료제 개발에도 적용이 가능하다.

Claims

하기의 생화학적 특성을 갖는 간흡충에서 정제한 28 kDa 및 26 kDa 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST).

억제제^* 효소 28 kDa 26 kDa 브로모술포프탈레인(Bromosulfophthalein) 1.52±0.01 1.48±0.08 시바크론 블루(Cibacrone blue) 0.75±0.26 3.69±1.62 알벤다졸(Albendazole) 947±307 38.5±9.97 프라지쿠안텔(Praziquantel) 21.7±3.15 25.0±5.75 *억제제에 의한 억제 효과는 IC₅₀(50%의 효소 활성을 억제하는 억제제의 농도)으로 표시함.%억제 = 100[I]/(IC₅₀+[I])I: 억제제의 농도
아래의 염기서열을 갖는 간흡충의 26 kDa GST 유전자.
제2항에 기재된 간흡충의 26 kDa GST의 유전자를 포함하는 플라스미드 JM83.
제3항의 플라스미드로 형질전환된 대장균 DH5α.
제2항에 기재된 간흡충의 26 kDa GST의 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하여 26 kDa GST를 발현시키고, 발현된 26 kDa GST를 회수하는 것을 특징으로 하는 간흡충 26 kDa GST의 제조 방법.
제5항에서 얻어진 26 kDa GST를 간흡충증 진단용 항원으로서 포함하는 간흡충증 진단제.