CZ20033430A3 - Gen spojený s virulencí parasitů Leishmanie - Google Patents

Description

Gen spojený s virulencí parazitů Leishmanie

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti boje proti leishmanióze. Je důsledkem toho, že byl z izolátů divokého typu Leishmania major identifikován gen kódující protein, nazývaný LmPDI, který má dva úseky, které jsou identické se sekvencí (Cys-GlyHis-Cys) potenciálního aktivního místa proteinové disulfid izomerázy (PDI). Tento protein LmPDI je převážně exprimován v izolátech parazitů s nejvyšší virulencí. To představuje za prvé nový terapeutický cíl pro vývoj léků proti leishmanióze a za druhé nový prvek, který může být složkou kompozice imunogenních a eventuálně vakcinačních přípravků, které jsou určeny k ochraně humánního nebo živočišného hostitele před leishmaniózou.

Dosavadní stav techniky

Leishmaniózy představují heterogenní skupinu nemocí, které postihují několik miliónů jedinců a jsou způsobeny infekcí hostitele protozoálním parazitem rodu Leishmania. Klinický obraz infekce je charakterizován vysokým stupněm polymorfizmu, včetně asymptomatické infekce, jednotlivých nebo rekurentních kožních forem, difúzních nebo anergních kožních forem, mukokutánních forem a viscerálních forem, které jsou fatální při neexistenci specifické léčby. Obecně a v závislosti na geografické distribuci onemocnění, každý druh nebo poddruh Leishmanie je zodpovědný za konkrétní klinickou formu, nicméně to není striktním pravidlem. Kromě toho, ve stejné geografické oblasti může být tentýž druh parazita zodpovědný za klinické formy s měnící se závažností. Tato diverzita v klinickém obraze infekce je alespoň částečně způsobena diverzitou • · · · · 1 • · « • · · · virulence parazita.

V průběhu svého životního cyklu parazit střídá dvě stádia: bičíkatá životní forma, stádium promastigota, který je nalézán v zažívacím traktu hmyzího vektoru (přenašeče parazitů) a stádium amastigota, který je nalézán v makrofázích hostitele. Léky proti leishmanióze je nesnadné používat, nejenom protože jsou toxické a protože se u parazita vyvine ještě častější rezistence (Lira, Sundar et al., 1999). Kromě toho, nedávno vyvinuté a testované vakcíny doposud neprokázaly očekávanou účinnost (Sharifi, FeKri et al., 1998, Khalil, El Hassan et al., 2000).

Neexistence prostředků pro kontrolu leishmaniózy lze částečně vysvětlit složitostí cyklu přenosu parazita a nedostatkem současných znalostí s ohledem na biologii parazita. Během posledních deseti roků bylo identifikováno několik molekul, které mají základní úlohu v biologii a infekčnosti parazita. Modifikace povrchových glykokonjugátů, konkrétně lipofosfoglykanu (LPG), jsou spojovány s modifikacemi infekčnosti a virulence parazita Leishmania (L.) major a L. donovani (Beverley a Turco, 1998), Desjardins a Descoteaux, 1998, Sacks, Módi et al., 2000, Spath, Epstein et al., 2000), což vypadá, že není případ L. Mexičana (IIG 2000, lig, Demar et al., 2001). Molekuly zapojené do biosyntézy LPG: fosfomanóza izomeráza (Garami a lig, 2001), LPG1 (Sacks, Módi et al., 2000, Spath, Epstein et al., 2000), LPG2 (Descoteaux, Luo et al., 1995) a galaktosyl transferáza (De a Roy, 1999) byly také spojovány s virulencí Leishmanie. Nedávno byly popsány další faktory virulence. Zahrnují rodinu cysteinových proteáz (Mottram, Brooks et al., 1998), MAP-kinázy (mitogenem aktivované proteinkinázy) (Wiese, 1998), A2 gen (Znang a Matlashewski, 1997), povrchový glykoprotein gp63 (Chakrabarty, Mukherjee et al., 1997), membránový protein kinetoplastidu (KMP)-II (Mukhopadhyay, Sen et al., 1998), superoxid dismutázu (Paramchuk, Ismail et al., 1997), trypanothion reduktázu (Dumase, Ouellette et al., 1997) a některé členy rodiny proteinů tepelného šoku (HSP) (Hubel, Krabitsch et al., 1997).

Charakterizace faktorů virulence může mít základní význam ve vývoji nových léků nebo vakcín proti těmto nemocem. Preferenční screening proteinu zapojeného do virulence parazita může zabránit zbytečnému výskytu rezistence u méně nebezpečných kmenů, kterážto rezistence může pak být přenášena na další kmeny. Kromě toho mutace cíleného virulentního proteinu, který vyvolává rezistenci na lék, může v tomto případě také způsobit redukci nebo dokonce ztrátu virulence parazita, a tak mít určitý terapeutický účinek.

V průběhu minulých dekád byla použita celá řada přístupů ke studiu faktorů virulence u parazita Leishmanie. Tyto přístupy byly založeny na genetických studiích, jako je například komplementace mutovaných parazitů (Ryan, Garraway et al., 1993, Descoteaux, Luo et al., 1995, Desjardins a Descoteaux, 1997, Wiese, 1998), použití technik vyřazení

funkce (invalidace) genu	(Titus, Gueiros-Filho	et	al.,	1995,
Mottram, Souza et al.,	1996, Dumas, Ouellette	et	al.,	1997,
Hubel, Krobitsch et al.,	1997, Mottram, Brooks	et	al.,	1998)

nebo analýzy genů pro rezistenci na léky u parazitů pozměněných v laboratoři (Cotrim, Garrity et al., 1999, Perez-Victoria, Perez-Victoria et al., 2001). Tyto studie identifikovaly několik genů, které byly důležité pro biologii parazita a nyní byly potvrzeny jako cíle pro nové léky (Selzer, Chen et al., 1997, McKerrow, Engel et al., 1999) nebo pro vývoj a použití atenuovaných mutant jako živých vakcín (Titus, Gueiros-Filho et al., 1995, Streit, Recker et al., 2001). Je důležité poukázat na to, že téměř všechny doposud prováděné studie na virulenci parazita Leishmanie jsou založeny buď na laboratorních klonech, které ztratily svou virulenci po dlouhodobé kultivaci nebo na parazitech geneticky • · manipulovaných v pokusech s mutagenezí, invalidací genu nebo nadměrnou expresí genu. Je tedy možné, že závěry, které se vztahují k virulenci genů identifikovaných za těchto podmínek, nejsou ve skutečnosti významné pro přírodní patogenitu parazita v oblastech přenosu.

Podstata vynálezu

S cílem studovat molekulární základy virulence parazita, a aby se zabránilo metodologickému zkreslení spojenému s použitím laboratorních kmenů, původci na začátku izolovali divoké kmeny Leishmania (L.) major s různými stupni virulence. L. major je agens u zoonotické kožní leishmaniózy (ZCL), která se vyskytuje u lidí v epidemických rozměrech ve velmi široké oblasti, která se rozprostírá bez -přerušení od Mauretánie po Mongolsko. Původci identifikovali izoláty z L. major získané z humánních ZCL lézí, všechny získané během stejného období přenosu a které se lišily svou patogenitou v experimentálním modelu infekce na BALB/c senzitivních myších (viz příklad 1). Rozdíly v experimentální patogenní síle korelují s rozdíly v růstu in vitro, který odráží změny v biologii těchto izolátů divokého typu.

Pak byla použita technika diferenciálního displeje (Liang a Pardee, 1992, Liang, Bauer et al., 1995) pro identifikaci genů, které jsou rozdílně exprimovány mezi úplně jinými izoláty prostřednictvím jejich experimentální patogenní síly u BALB/c myší (dva vysoce virulentní izoláty a dva další méně virulentní izoláty). Tato technika umožňuje to, aby geny, které jsou exprimovány v různých stupních, byly studovány bez předběžné znalosti jejich sekvence. Byly pak identifikovány tři transkripty, které jsou přednostně exprimovány ve dvou izolátech s nejvyšší virulenci. Jeden z těchto transkriptů byl kompletně charakterizován screeningem cDNA knihovny • * ·· ·· «·« ·· · · · ···· ····· · » ·· ····· ··· ·« · · · · · · ·· ·

L. major. Analýza sekvence prokázala homologii s proteinovou rodinou disulfid izomeráz (PDL, Erp60 a Erp72) v eukaryotech. Tento nový protein byl z následujících důvodů nazván LmPDI: jako další členové rodiny PDI, (i) má LmPDI dva CGHC aktivní úseky, (ii) N-koncový úsek tohoto proteinu obsahuje potenciální signální sekvenci a v karboxy-koncovém úseku potenciální signál pro retenci v endoplazmatickém retikulu (EEDL), (iii) může se sám organizovat do oligomerní struktury, (iv) rekombinantní protein vytvořený v E. coli má aktivitu PDI in vitro. Kromě toho, mimo konzervativní úseky uvedené výše, existuje velmi málo podobností mezi LmPDI a dalšími PDI popsanými výše. Ve skutečnosti PDI rodina zahrnuje velké množství vysoce divergentních molekul zapojených do zrání proteinů sekretovaných do endoplazmatického retikula (Noiva 1999, Frand, Cuozzo al 2000). PDI jsou vícefunkční proteiny, které jsou zapojené do složitých mechanismů retence, oprav, regulace exprese, pomáhají změnám v konformaci, aby se umožnilo pouze správně svinutým proteinům opustit endoplazmatické retikulum. Kromě jejich enzymatických funkcí (redukce a izomerizace), byly nedávno PDI přisouzeny další funkce, které zahrnují aktivitu jako chaperon, vazbu peptidů a buněčnou adhezi (Ferrari a Soling, 1999). Je důležité zdůraznit, že LmPDI je převážně exprimován v izolátech s nejvyšší virulencí (příklad 2) . Celkově tyto výsledky svědčí pro to, že LmPDI má důležitou úlohu v přirozené virulencí parazita Leishmanie, a může tak představovat nový cíl pro chemoterapii nebo vakcinaci.

Kromě toho, recentní data týkající se zapojení bakteriálního ekvivalentu PDI (Martin, 1995, Ostermeier, De Sutter et al., 1996) (nazývaný DsbA, disulfidová vazba) poskytují určité náznaky, co se týče úlohy, kterou by tento protein mohl mít v patogenicitě různých mikroorganismů (Yu a Kroll, 1999). Deaktivace genu DsbA dramaticky ovlivňuje • · ·

přežití a virulenci Shigella flexneri (Yu, 1998, Yu, EdwardsJones et al., 2000). DsbA je také zapojen do geneze enterotoxinu Vibrio cholerae (Peek a Taylor, 1992, Yu, Webb et al., 1992). DsbA je také důležitý pro patogenicitu patogenních druhů Escherichia coli: u druhů, které jsou patogenní pro močový trakt, katalyzuje tvorbu disulfidových můstků specifického proteinu chaperonu pilinu (Zhang a Donnenberg, 1996). U enteropatogenních druhů je také vyžadován pro stabilitu a tvorbu pili (Hultgren, Abraham et al., 1993, Wang, Bjes et al., 2000) .

Předkládaná přihláška představuje první dokument, který předpokládá důležitou úlohu PDI jako faktoru virulence u protozoálního parazita. LmPDI může projevovat své účinky tím, že pomáhá změnám v konformaci a stabilitě dalších faktorů esenciálních pro biologii a patogenicitu parazita Leishmanie. Identifikace takových faktorů by byla extrémně výhodná pro lepší pochopení biologie tohoto parazita a pro vývoj nových léčeb nebo vakcín proti leishmaniózám.

V prvním aspektu se vynález tedy týká proteinu zapojeného do virulence Leishmanie, obsahující alespoň jedno (Cys-GlyHis-Cys) místo identické s potenciálním aktivním místem proteinu z rodiny proteinových disulfid izomeráz (PDI). Tento protein je výhodně protein kódovaný parazitem samotným.

Konkrétně se vynález týká proteinu LmPDI z Leishmania major, se sekvencí sekv. id. č. 3 a kterékoliv funkční varianty LmPDI, která má alespoň 40% identitu, výhodně alespoň 80% identitu s LmPDI.

Původci definují funkční variantu LmPDI v tomto textu jako protein, který je schopný komplementovat LmPDI v testu infekčnosti prováděném s kmenem L. major, ve kterém byl LmPDI gen deaktivován. Termín test infekčnosti, jak se používá v tomto textu, znamená kterýkoliv test, který může vyhodnotit biologické vlastnosti vztahující se k růstu parazita obvykle • · · · · · uvedeny tři spojované s virulencí. Konkrétně mohou být následující typy testů:

• Růstová kinetika formy promastigota parazita v tekutém médiu, například technika typ popsaného v bodu 2 příkladu 5, • Infekční kapacita myších makrofágů kultivovaných in vitro, s použitím techniky, jako je například ta popsaná v příkladu 6 a v článku autorů Kebaier et al., 2001, • Kapacita indukovat experimentální myší leishmaniózu infekcí senzitivních myší (například BALB/c). Technika je detailně popsaná například v bodu 3 příkladu 5, a v článku autorů Kebaier et al., 2001.

Procento identity s LmPDI bylo vyhodnoceno s použitím programu CLUSTAL W verze 1.8 (Thompson J D, Higgins D G a Gibson T J) nebo programu BOXSHADE verze 3,21 (Hoffman K a Baron Μ) , které uvedli procento identity LmPDI s proteiny z PDI rodiny několika živočišných druhů mezi 27 % a 36 % (viz příklad 2).

Ve druhém aspektu se vynález týká rekombinantního polypeptidu obsahujícího alespoň jeden fragment proteinu o více než 10 aminokyselinách, jak byl definován výše, pokud je vhodné, fúzovaný s dalším polypeptidovým fragmentem, rekombinantní polypeptid je schopný spustit imunologickou reakci proti epitopu LmPDI, když je podáván zvířeti. Vynález se také týká rekombinantního polypeptidu obsahujícího alespoň jeden fragment proteinu o více než 10 aminokyselinách, jak byl definován výše, pokud je vhodné, fúzovaný s dalším polypeptidovým fragmentem, rekombinantní polypeptid je způsobilý k tomu, aby byl rozpoznáván protilátkami namířenými proti proteinu LmPDI.

V tomto textu by termín polypeptid měl být chápán ve svém širším smyslu, tj . včetně sekvencí alespoň o 10 aminokyselinách (nebo více, kde je uvedeno), které mohou nebo nemusí obsahovat glykosylované motivy nebo glykolipidy, a bez ohledu na jejich primární, sekundární nebo terciální strukturu. Fragment LmPDI přítomný v rekombinantních polypeptidech podle vynálezu popsaný výše může být dlouhý více než 15, 20, 30, 50 nebo 100 aminokyselin nebo ještě více.

LmPDI, rekombinantní nebo purifikovaný z infikovaných buněk, a polypeptid podle vynálezu mohou být použity pro imunizaci humánního nebo zvířecího hostitele, pro jeho ochranu před leishmaniózou nebo pro produkci a získávání protilátek namířených proti LmPDI, jak bylo popsáno v příkladu 2.

Konkrétní rekombinantní polypeptid podle vynálezu je protein LmPDI-(His)6 se sekvencí sekv. id. č. 4, popsaný v příkladu 2.

Dalším příkladem rekombinantního polypeptid podle vynálezu je fúzni protein mezi LmPDI fragmentem obsahujícím nejméně jeden epitop LmPDI a nosným polypeptidem, který podporuje prezentaci daného fragmentu imunitnímu systému. Konkrétně to může být fúze celého LmPDI nebo jeho části s fragmentem β-laktamázy nebo tetanickým či difterickým anatoxinem nebo s kterýmkoliv dalším polypeptidem z patogenního organismu, konkrétné parazitárního, bakteriálního nebo virového původu.

V dalším aspektu se vynález týká sekvence nukleové kyseliny kódující protein nebo polypeptid, jak bylo popsáno výše. Výhodná sekvence nukleové kyseliny zahrnuje sekvenci kódující LmPDI se sekvencí ze sekv. id. č. 2 nebo fragment uvedené sekvence o velikosti 30 nukleotidů nebo více, výhodně více než 100 nukleotidů, kódující polypeptid obsahující alespoň jeden charakteristický epitop LmPDI.

Vynález se také týká vektoru nukleové kyseliny, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podle vynálezu. Jako příklad lze uvést plazmid, kozmid, fág nebo virus. Výhodně vektor podle vynálezu umožní expresi proteinu nebo polypeptidu ·· ·· c ···· ····· · · ·« · · ··· podle vynálezu v hostitelské buňce. Konkrétně vektor podle vynálezu umožňuje expresi LmPDI v bakteriální nebo eukaryotické buňce.

Vynález se také týká pěstované buňky obsahující vektor, jak byl definován výše. Buňka může být baktérie, kvasinka, hmyzí buňka, savčí buňka nebo kterýkoliv další typ buněk. Může být použita buď pro to, aby exprimovala a eventuálně produkovala protein nebo polypeptid podle vynálezu nebo aby produkovala vektor, který pak bude sloužit k expresi proteinu nebo polypeptidu podle vynálezu v dalším typu buněčné kultury nebo in vivo. Pouze jako příklad, který rozsah vynálezu nijak neomezuje, mohou být uvedeny buňky CHO, buňky VĚRO, buňky BHK21 a hmyzí buňky jako buněčné typy, které mohou být použity in vitro v kontextu předkládaného vynálezu. Podobně, BCG a Salmonella typhimurium mohou být uvedeny jako buňky, které mohou být použity in vivo. Konečně je důležité si všimnout, že podávání virového vektoru jedinci, například viru vakcínie nebo DNA kódující polypeptid nebo protein, jak bylo popsáno výše, pro vakcinační účely, je také zahrnut v rozsahu vynálezu.

Konkrétní buňka podle vynálezu je bakteriální kmen LmPDIXLi, uložený ve sbírce mikroorganizmů Collection National de Culture des Microorganismes [CNCM, National Collection of Microorganism Cultures], dne 31.01.2002 pod přístupovým číslem 1-2621. Tento kmen je odvozen z bakteriálního kmene XLl-blue MRF', s genotypem A(mrcA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endAl sup E44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lac[F' proAB lac^qZ ΔΜ15 TnlO (Tet')], transformovaným plazmidem pBK-CMV- LmPDI. Tento plazmid odpovídá plazmidu pBK-CMV prodávanému firmou Stratagene (La Jolla, CA) , ke kterému byla přidána cDNA z LmPDI mezi restrikční místa EcoRI a Xhol.

Vynález se také týká sondy nukleové kyseliny, která specificky hybridizuje za stringentních podmínek se sekvencí • · ·· · ···· ····· · · ·· ····· • · · · · · · ·· · · ··«· ·· · nukleové kyseliny ze sekv. id. č. 2, což umožní, že je zjišťována přítomnost nebo nepřítomnost genu virulence, který kóduje LmPDI v biologickém vzorku.

Původci definují stringentní hybridizační podmínky neboli přísné hybridizační podmínky v tomto textu jako podmínky, které umožňují specifickou hybridizaci dvou DNA molekul při teplotě přibližně 65 °C, například v roztoku 6x SSC, 0,5% SDS, 5x Denhardtův roztok a 100 μg/ml denaturované nespecifické DNA nebo kterémkoliv roztoku s rovnocennou iontovou silou a po kroku promývání prováděném při teplotě 65 °C, například většinou v roztoku 0,2x SSC a 0,1% SDS nebo kterémkoliv roztoku s rovnocennou iontovou silou. Nicméně stringentnost podmínek může být upravena odborníkem jako funkce velikosti sekvence, která má být hybridizována, jejího obsah GC nukleotidů, a kteréhokoliv dalšího parametru, například podle protokolů popsaných autory Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. vydání, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Ve výše uvedené definici a v předkládaném textu by termín specifický měl být chápán ve svém nej širším významu, ve kterém se v laboratořích normálně používá. Molekula A tedy specificky rozeznává molekulu B, jestliže v komplexní směsi má molekula A afinitu pro molekulu B, která je významně vyšší než její afinita pro další molekuly směsi, takže je možné detekovat molekulu B prostřednictvím molekuly A.

Stringentní podmínky použité v tomto textu jsou ty, které umožňují, že jsou detekovány PDI z různých druhů Leishmanie spíše než ty pocházející z hostitele a dalších mikroorganismů v přítomnosti radioaktivně značené sondy syntetizované z cDNA z LmPDI.

Jako příklad lze uvést to, že sonda podle vynálezu, která specificky hybridizuje se sekvencí ze sekv. id. č. 2 za stringentních podmínek, je taková, že Southern blot prováděný • · · · β s použitím značené sondy, když je prováděn na DNA vzorku z buněk infikovaných kmenem L. major, který exprimuje LmPDI, má alespoň jeden jasně zřetelný pás vyšší intenzity než další pásy (nespecifické) , pás se neobjeví na Southern blotu prováděném za stejných podmínek na DNA vzorku z buněk, které nejsou infikované kmenem L. major.

V dalším aspektu se vynález týká nukleotidového primeru, který umožňuje specifickou amplifikaci alespoň části sekvence ze sekv. id. č. 1, z buněk infikovaných Leishmanií, a tak umožní, že může být určena přítomnost nebo nepřítomnost genu virulence, který kóduje LmPDI v biologickém vzorku. Amplifikace bude nazývána specifická, jestliže amplifikační reakce prováděná na kontrolních buňkách neinfikovaných Leishmanií nemá za následek významnou amplifikaci kterékoliv sekvence, zatímco stejná reakce prováděná na vzorku obsahujícím nukleotidovou sekvenci ze sekv. id. č. 1 má za následek amplifikaci alespoň jednoho fragmentu dané sekvence.

Sondy a primery uvedené výše mohou být, pokud je to potřebné, značeny a/nebo prezentovány v diagnostických soupravách (křtech), které také tvoří část vynálezu. Může být výhodné určovat přítomnost a eventuální hladinu exprese genu pro LmPDI během infekce Leishmanií, například určovat míru infekce parazitem a/nebo možnost léčby, která zahrnuje použití LmPDI inhibitoru.

V dalším provedení vynález poskytuje purifikované protilátky specificky rozpoznávající LmPDI. Mohou to být monoklonální nebo polyklonální humánní, humanizované nebo zvířecí protilátky. Protilátky mohou například na LmPDI afinitní koloně s popsaného v části příkladů. Specifické LmPDI protilátky mohou mít celou řadu aplikací. Mohou sloužit pro detekci přítomnosti LmPDI v biologickém vzorku, například diagnostikovat leishmaniózu a/nebo určovat možnost použití LmPDI inhibitoru být purifikovány, použitím protokolu » · · · · · · k léčbě leishmaniózy.

Vynález se tedy také týká in vitro způsobu diagnózy infekce parazitem odpovědným za leishmaniózu. Takový způsob může být prováděn s použitím polypeptidů nebo proteinu podle vynálezu nebo protilátky namířené proti tomuto proteinu nebo s použitím sond, jak bylo definováno výše.

Konkrétní diagnostický způsob podle vynálezu obsahuje následující kroky:

• Přivedení alespoň jedné kontaktu s biologickým protilátky podle vynálezu do vzorkem od pacienta částečně infikovaného parazitem odpovědným za leishmaniózu v podmínkách, které umožní tvorbu imunitního komplexu mezi protilátkou a antigenními proteiny obsaženými ve vzorku, • Detekce komplexu.

Komplex může být detekován s použitím kteréhokoliv prostředku, který je odborníkovi znám (enzymatická reakce, fluorescenční přenos nebo podobně).

Protilátky podle vynálezu mohou být obsaženy v diagnostických soupravách stejným způsobem jako sondy nebo priméry uvedené výše.

Diagnostické soupravy pro provedení způsobu popsaného výše tvoří integrální část předkládaného vynálezu.

Souprava může například obsahovat • Alespoň jednu protilátku podle vynálezu, • Médium vhodné pro vytvoření imunitního komplexu mezi antigenními proteiny obsaženými v analyzovaném vzorku a danou protilátkou, • Činidla umožňující detekci takto vytvořených komplexů, • Pokud je to vhodné, kontrolní vzorky.

Alternativně, protilátky podle vynálezu mohou tvořit část kompozice léčiva určeného pro profylaxi, atenuaci nebo pro léčbu některých leishmanióz.

·· · · · * ·· fc

V dalším aspektu vynálezu se vynález týká imunogenního přípravku obsahujícího protein a/nebo rekombinantní polypeptid a/nebo sekvenci nukleové kyseliny a/nebo vektor a/nebo buňku podle vynálezu, jak bylo popsáno výše, uvedený imunogenní přípravek je schopný stimulace in vitro proliferace mononukleárních buněk derivovaných z jedinců, kteří přišli do kontaktu s parazitem Leishmanií. Výhodný imunogenní přípravek podle vynálezu je schopný stimulace in vitro proliferace mononukleárních buněk derivovaných z jedinců, kteří přišli do kontaktu s Leishmania major.

Ve výhodném provedení imunogenních přípravků podle vynálezu měly přípravky formu, která je farmaceuticky přijatelná pro podávání humánnímu nebo zvířecímu hostiteli.

Původci prokázali, že LmPDI citlivě reaguje na in vitro indukci produkce cytokinů mononukleárními buňkami, které pocházejí z jedinců, kteří přišli do kontaktu s L. major a že expresní profil cytokinů odpovídá profilu, který byl pozorován během imunitní reakce typu Thl (viz příklad 3) . Imunogenní přípravek, tak jak byl popsán výše, který je schopný indukce imunitní reakce typu Thl, když je podáván humánnímu nebo zvířecímu hostiteli, tak představuje konkrétně výhodné provedení předkládaného vynálezu.

Vynález se také týká vakcinačního přípravku obsahujícího protein a/nebo rekombinantní polypeptid a/nebo sekvenci nukleové kyseliny a/nebo vektor a/nebo buňku podle vynálezu, jak bylo popsáno výše, uvedený vakcinační přípravek je zamýšlen pro ochranu humánního nebo zvířecího hostitele proti leishmanióze. Výhodně jsou vakcinační přípravky podle vynálezu formulovány způsobem, který je farmaceuticky přijatelný pro podávání humánnímu nebo zvířecímu hostiteli.

Vakcinační přípravek může být v kapalné formě pro podávání pacientovi injekcí, buď subkutánně nebo intramuskulárně, nebo ve formě perorální vakcíny, ve formě masti nebo ve formě částic navázaných k nukleotidové sekvenci podle vynálezu, například DNA adsorpcí na povrch částic. Druhá uvedená forma umožní to, že vakcína bude podávána biobalistickými metodami (s použitím „gen gun). Důležité je poznamenat, že formulace vakcinačních přípravků uvedené v tomto textu jsou uváděny pouze jako příklady a nejsou žádným způsobem omezující.

Imunogenní a/nebo vakcinační přípravky podle vynálezu mohou také obsahovat jeden antigen nebo více antigenů, které jsou heterologní, co se týče Leishmanií, a/nebo jednu sekvenci nebo více sekvencí nukleových kyselin, které kódují uvedené antigeny. Přípravky podle vynálezu mohou tedy spustit imunologickou reakci proti několika různým patogenům, a pokud je to vhodné, mohou tvořit polyvakcíny.

Očkovací postup a dávky účinné látky musí být přizpůsobeny typu použité vakcíny a druhu savce, kterému je účinná látka podávána.

Vynálezem jsou také zahrnuty způsoby očkování proti Leishmaniím, které zahrnují podávání přípravku obsahujícího protein a/nebo rekombinantní polypeptid a/nebo sekvenci nukleové kyseliny a/nebo vektor a/nebo buňku podle vynálezu, jak bylo popsáno výše, humánnímu nebo zvířecímu hostiteli.

Určením úlohy LmPDI ve virulenci Leishmanií lze předpokládat, že mohou být také umožněny nové strategie pro identifikaci účinných molekul pro inhibici růstu parazita. Bylo zjištěno, že molekula, která inhibuje PDI, jako je například bacitracin nebo chlormerkuribenzensulfonová kyselina (pCMBS), inhibuje růst Leishmanií v tekutém médiu (příklad 4). Vynález se tedy také týká způsobu screeningu molekul, které jsou vnímavé na inhibici růstu Leishmania major, který zahrnuje krok hodnocení kapacity uvedených molekul inhibovat aktivitu LmPDI. Proteinové disulfid izomerázy obecně mají velké množství aktivit, konkrétně oxido-redukční, izomerázovou • · · · · ···· ····· · · · · ····· ··· ·· ·· ···· ·· « aktivitu a chaperonovou aktivitu. Způsoby screeningu podle vynálezu se mohou týkat inhibice kterékoliv funkce LmPDI.

V konkrétním způsobu screeningu podle vynálezu je krok hodnocení kapacity molekuly inhibovat aktivitu LmPDI prováděn v testu reaktivace redukované a denaturované RNázy A, který obsahuje následující kroky:

• Inkubace redukované a denaturované RNázy A v přítomnosti LmPDI v podmínkách, které umožňují její reaktivaci, • Inkubace redukované a denaturované RNázy A v podmínkách identických s podmínkami, které umožňují její reaktivaci pomocí LmPDI tak, že se přidá testovaná molekula, • Srovnání výsledků získaných v nepřítomnosti a v přítomnosti testované molekuly, defekt reaktivace RNázy A v přítomnosti testované molekuly odhalí, že uvedená molekula má LmPDI ínhibiční aktivitu.

Ve způsobech screeningu podle vynálezu může být použit kterýkoliv další test aktivity PDI, konkrétně každý test, který je odvozen z výchozího protokolu popsaného autory Lyles a Gilbert (1991).

Způsob screeningu podle vynálezu může také zahrnovat test na inhibici růstu Leishmania major v tekutém médiu, a pokud je to vhodné, test na inhibici růstu Leishmania major v experimentálním myším modelu leishmaniózy. Příklad takového způsobu je popsán v experimentální části, v příkladu 5.

Účinné molekuly, na kterých byl prováděn screening způsobem definovaným výše, jsou charakterizovány svou kapacitou inhibovat nebo modulovat růst Leishmania major.

Výsledky získané při použití bacitracinu ukázané v příkladu 4 ukazují, že PDI inhibitor může inhibovat růst Leishmanií. Použití jednoho nebo více inhibitorů proteinových disulfid izomeráz (PDI) pro přípravu farmaceutického přípravku určeného pro profylaxi, atenuaci nebo léčbu infekce parazitem • · ·· ·» · · ♦ • · ·· · ···· • · · · · ··· • · · ·· · · ···· ·· ·

Leishmanií tedy tvoří základní součást vynálezu. Sloučeniny s anti-PDI aktivitou, které mohou být použity podle vynálezu, které mohou být uvedeny, jsou anti-PDI protilátky nebo antiLmPDI protilátky, bacitracin, bacitracin zinečnatý, 5,5'-dithiobis(2-nitrolbenzoová) kyselina (DTNB), p-chlormerkuribenzensulfonová kyselina (pCMBS) nebo tocinoová kyselina.

Přípravky připravené v souladu s výše uvedeným použitím mohou být výhodně podávány humánnímu nebo zvířecímu hostiteli topicky, perorálně nebo parenterálně.

Podle konkrétního aspektu se vynález týká použití bacitracinu nebo bacitracinu zinečnatého jako inhibitoru růstu parazita odpovědného za leishmaniózu nebo jako účinné látky proti infekci Leishmanií.

Samozřejmě farmaceutický přípravek pro léčbu infekce parazitem Leishmanií, který obsahuje jeden nebo více inhibitorů proteinových disulfid izomeráz (PDI), tvoří základní součást vynálezu. Takový přípravek může konkrétně obsahovat bacitracin nebo bacitracin zinečnatý. Přípravek může být formulován pro topickou aplikaci, například ve formě krému, masti, masti nebo spreje, přičemž tento seznam je neomezující. Původci prokázali, že takový přípravek, použitý lokálně ve formě masti na místo injekce parazita u myší BALB/c, zmírňuje postup onemocnění (příklad 9 a obrázek 14).

Předkládaný vynález se také týká farmaceutického přípravku pro léčbu infekce parazitem Leishmanií, který obsahuje alespoň jednu specifickou protilátku proti LmPDI a/nebo kteroukoliv molekulu, která inhibuje PDI aktivitu. Výhodně je takový přípravek vhodný pro topické, perorální nebo parenterální podávání.

Způsoby léčení leishmanióz, které zahrnují podávání inhibitoru PDI nebo LmPDI humánnímu nebo zvířecímu pacientovi, ať už jako protilátka nebo kterýkoliv další typ molekuly, také • * · · ·· · · · • · · · · ···· ····· · · ·· ····· spadají do rozsahu vynálezu.

Příklady a obrázky uvedené níže popisují biologické pokusy, které byly prováděny v kontextu předkládaného vynálezu a které poskytují požadovanou experimentální oporu pro vynález, aniž by jakýmkoliv způsobem omezovaly jeho rozsah. Také ilustrují neomezujícím způsobem určité aspekty provedení a důležitosti předkládaného vynálezu.

Popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje analýzu technikou diferenciálního displeje (DD) exprese genů Leishmanía major u dvou izolátů s nejvyšší virulencí (94 a 67, V) a dvou izolátů s nejnižší virulencí (32 a 07, v).

Obrázek 1A ukazuje autoradiogram části sekvenačního gelu, který ukazuje produkty amplifikované pomocí PCR s použitím libovolného dekamerního a oligo dT primeru. Rozdílně exprimované cDNA jsou ukázány šipkami. pl4 cDNA je označena hvězdičkou.

Obrázek IB ukazuje analýzu technikou Northern blot (Northern hybridizace) exprese genu identifikovaného technikou DD mezi izoláty s nejvyšší virulencí (94 a 67, V) a izoláty s nejnižší virulencí (32 a 07, v). mRNA izolovaná z promastigotů z různých izolátů ve stacionární růstové fázi byla hybridizována s radioaktivně značenou sondou pl4. Po autoradiografii byly bloty zcela zbaveny hybridizované sondy a znovu hybridizovány se specifickou sondou pro identifikaci genu α-tubulinu z L. major (a-tub).

Obrázek 2 ukazuje nukleotidovou sekvenci cDNA (sekv. id.

č. 1) LmPDI a dedukovanou sekvenci aminokyselin (sekv. id. č. 3) . Nukleotidy uvedené malými písmeny představují netranslatované úseky. Vedoucí sekvence (SL) o velikosti 18 nt je podtržena a potenciální sekvence pro polyadenylační signál

je orámovaná. Potenciální sekvence pro signální peptid je uvedena tučným písmem. Potenciální aktivní místa pro LmPDI jsou dvojitě podtržena a pravděpodobná sekvence pro retenci v endoplazmatickém retikulu je uvedena jako přerušovaná čára.

Obrázek 3 ukazuje porovnání aminokyselinové sekvence pro LmPDI s proteinovou disulfid izomerázou z Trypanosoma brucei (T. brucei, GenBank přístupové č. P12865), Hypocrea jecorina (H. jecorina, 074568), Caenorhabditis elegans {C. elegans, 017908), Chlamydomonas reinhardtii (C. reinhard, 048949), Drosophila melanogaster (D. melano, P54399), Cryptosporidium parvum (C P072237).

Homo sapiens (H. sapiens, černě označují identické parvum, Q27553) a Písmena orámovaná aminokyseliny a písmena orámovaná šedě označují aminokyseliny podobné. Mezery byly do sekvence zavedeny proto, aby se dosáhlo maximální podobnosti mezi porovnávanými sekvencemi a jsou označeny přerušovanou čárou.

Pro provádění porovnání byly použity dva počítačové programy:

• CLUSTAL W verze 1.8, Thompson, J D, Higgins, D G a Gibson, T J, • BOXSHADE verze 3.2 t, Hoffman, K a Baron, M.

Obrázek 4 ukazuje analýzu úlohy rekombinantního LmPDI v reaktivaci redukované a denaturované RNázy. 8 μΜ redukované a denaturované RNázy A bylo inkubováno v pufru obsahujícím 4,5 mM cCMP, 1 mM glutathionu (GSH), 0,2 mM glutathiondisulfidu (GSSH), 2 mM EDTA a 100 mM Tris-HCl, pH 8, v přítomnosti 1,4 μΜ bovinního sérového albuminu (BSA) jako negativní kontroly, 1,4 μΜ bovinní proteinové disulfid izomerázy jako pozitivní kontroly nebo 1,4 μΜ rekombinantního LmPDI, po dobu 30 minut ve 25 °C. Reaktivace RNázy A byla určena měřením aktivity RNázy A ve 296 nm každých 5 minut po dobu 30 minut (Lyles a Gilbert,1991).

• · · ·

Obrázek 5A ukazuje analýzu Southern bloty na velkém počtu kopií genu LmPDI v genu Leishmania major. 8 pg izolátu 94 genomové DNA z L. major bylo štěpeno následujícími restrikčními enzymy: Aval, EcoRV, HindlII, Pstl, EcoRI, Xhol, Ncol, Sací, Sphl. Enzymy označené hvězdičkou štěpí cDNA LmPDI pouze jednou.

Obrázek 5B ukazuje analýzu Southern bloty (Southernova hybridizace) genu LmPDI u různých druhů Leishmanií. 8 μg genomové DNA (94) L. major, dermotropní L. infantům (L. infantům MC), viscerotropní L. infantům (L. infantům Vise), L. donovani bylo štěpeno enzymem Pstl. V těchto experimentech byla genomová DNA hybridizována se sondou reprezentující celou sekvenci cDNA z LmPDI.

Obrázek 6 ukazuje imunodetekci nativního LmPDI u L. major různými přípravky anti-LmPDI protilátek. S 20 pg celkových proteinů promastigota GLC 94 v Laemmliho pufru (dráha 1) nebo v přítomnosti 0,5 M DTT (dráha 2) a 0,05 pg LmPDI tvořeného v baktériích E. coli a purifikovaného (rLmPDI) (dráha 3) byla prováděna elektroforéza, a pak nitrocelulózovou membránu, a pak imunosérem (dráha 1) nebo anti-LmPDI protilátkami purifikovanými na afinitní koloně (dráhy 2 a 3).

Obrázek 7 ukazuje analýzu Western bloty exprese LmPDI ve dvou izolátech s nejvyšší virulenci (94, 67, V) a ve dvou izolátech s nejnižší virulenci (32, 7, v) z promastigotů.

S 20 pg celkových proteinů promastigota ve stacionární růstové fázi z různých izolátů byla prováděna elektroforéza, a byly pak přeneseny na nitrocelulózovou membránu, která byla inkubována v přítomnosti polyklonální anti-LmPDI protilátky. Šipky (>) označují 3 proteiny rozpoznávané anti-LmPDI imunosérem.

byly přeneseny na detekovány anti-LmPDI

Obrázek 8 ukazuje proliferaci mononukleárních buněk z • · · · · · ··· • · · · 9 · 9 9 9 9 • ····· · · · · ····· • 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 jedince žijícího v oblasti Tunisu, kde se vyskytuje zoonotická kožní leishmanióza, po inkubaci s 5 pg/ml LmPDI. Lymfomonocytární buňky byly získány, promyty 3 postupnými centrifugacemi s médiem RPMI-PS/GLU, nejdříve 30 ml, pak dvakrát 10 ml, a pak byly spočítány a inkubovány v koncentraci 10⁶ buněk/1 ml média v přítomnosti nebo nepřítomnosti LmPDI v koncentraci 5 pg/ml. Po 5 dnech kultivace byla stimulace lymfocytů stanovena inkorporací thymidinu značeného tritiem. Výsledek je vyjádřen v CPM.

Obrázek 9 ukazuje výsledky testu růstové inhibice parazita (i. major} v tekutém médiu s použitím bacitracinu. Jsou ukázány růstové křivky odebírané po 96 hodinách u promastigotů L. major v přítomnosti 0,1 mM, 1,5 mM nebo 2 mM bacitracinu.

Obrázek 10 ukazuje účinek bacitracinu (BAC), bacitracinu zinečnatého (BACZn), p-chlormerkuribenzoová kyselina (pCMBA) a tocinoová kyselina (TOC) na in vitro aktivitu rekombinantního LmPDI. Byly použity různé koncentrace inhibitorů (0 až 2 mM) pro sledování účinku inhibitorů PDI na kapacitu LmPDI reaktivovat redukovanou a denaturovanou RNázu A in vitro. LmPDI bez inhibitorů byl použit jako pozitivní kontrola (T).

Obrázek 11 ukazuje účinek bacitracinu (BAC) (obrázek 11A), bacitracinu zinečnatého (BACZn) (obrázek 11B), 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoové kyseliny) (DTNMB) (obrázek 11C) a p-chlormerkuribenzoové kyseliny (pCMBA) (obrázek 11D) ) na in vitro růst Leishmanií v tekutém médiu. Byly použity různé koncentrace inhibitorů (0 až 5 mM) pro sledování účinku inhibitorů PDI na rozmnožování parazitů in vitro. Jako kontrola pro tyto experimenty byly vybráni parazité, kteří nebyli ošetřeni inhibitory (T).

Obrázek 12 ukazuje inhibici aktivity rLmPDI bacitracinem a bacitracinem zinečnatým. Účinek bacitracinu (BAC) a bacitracinu zinečnatého (BACZn) na aktivitu rLmPDI byl měřen in vitro. Byly testovány různé koncentrace inhibitorů BAC a • · · * · ·· · φ · • » · · 9 9 9 9 9 9 9 • · » ·· · · · · » • ····· · · ·· 9 9 9 9 · • * · · · ··« • · · · ♦ ·« ·· · « · · · promastigotů zinečnatého

BACZn (0 až 2 mM), aby se analyzoval jejich účinek na kapacitu rLmPDI reaktivovat redukovanou a denaturovanou RNázu in vitro. Aktivita rLmPDI v nepřítomnosti inhibitorů fungovala jako pozitivní kontrola.

Obrázek 13 ukazuje inhibici rozmnožování GLC94 bacitracinem zinečnatým. Účinek bacitracinu (BACZn) na rozmnožování GLC94 promastigotů byl určován in vitro. Byly testovány různé koncentrace inhibitoru, aby se analyzoval jejich účinek na schopnost parazitů rozmnožovat se in vitro. Kontrola (C) byla představována parazity kultivovanými v kompletním médiu v nepřítomnosti inhibitorů.

Obrázek 14 ukazuje účinek bacitracinu zinečnatého na rozvoj onemocnění u senzitivních BALB/c myší infikovaných GLC94 izolátem promastigotů. Senzitivní BALB/c myši byly infikovány množstvím 10⁶ promastigotů z GLC94 izolátů do polštářku tlapky a léčeny nebo neléčeny bacitracinem. Léčba byla zastavena 9 týdnů po infekci (šipka ukazuje zastavení léčby). Každá křivka ukazuje změnu velikosti jedné myši.

Příklady provedení vynálezu

Experimentální výsledky ukázané v následujících příkladech byly získány s použitím následující materiálů a metod:

Parazité a podmínky kultivace

Izoláty L. major použité v této studii, které pocházejí z humánních ZCL lézí získaných během studie, jsou shrnuty v příkladu 1. Parazité byli kultivováni v NNN médiu (pevné médium připravené a založené na agaróze a králičí krvi) ve 26 °C a postupně přeneseni do RPMI (SIGMA, St Louis, MO), které obsahovalo 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicilinu, • *·· · · · · « · · ···· • ···· ·»· • · · · · · ř · · · · ·· ·

100 μς/πιΐ streptomycinu a 10% deaktivované fetální telecí sérum (kompletní médium). Koncentrace promastigotů v logaritmickém úseku růstové fáze byla upravena na 10⁶ parazitů/1 ml v konstantním objemu kompletního média a paraziti byli inkubováni ve 26 °C. Stacionární růstové fáze bylo dosaženo po 4 až 6 dnech s denzitou parazitů 3 x 10⁷ až 8 x 10⁷ parazitů. Promastigoty ve stacionární růstové fázi byly použity pro izolaci RNA a proteinů.

Izolace RNA a diferenciální displej

Celková RNA byla extrahována s použitím činidla TRIZOL (Gibco-BRL). PolyA⁺ RNA byla purifikována pasáží přes oligo dT/celulózovou kolonu s použitím soupravy pro izolaci polyA⁺ RNA (Amersham Pharmacia) podle instrukcí výrobce. 200 ng mRNA bylo použito v reakci reverzní transkripce o objemu 20 μΐ, která obsahovala 1 μΜ oligo(dT) uMN primeru, přičemž M = A nebo C nebo G a N = A nebo C nebo G nebo T (Genset) , lx pufr pro syntézu prvního vlákna (Gibco-BRL), 5 μΜ dNTP (Amersham Pharmacia), 10 U RNAsinu (Promega) a 200 U reverzní transkriptázy (Gibco-BRL).

Po inkubaci ve 37 °C po dobu jedné hodiny byla reakce zastavena inkubací po dobu 5 minut v 95 °C. cDNA byla amplifikována prostřednictvím PCR s použitím kombinace 12 oligo dT a 10 náhodných dekamerů. PCR byla prováděna v objemu 20 μΐ, které obsahovaly 2 μΐ reakce reverzní transkripce, 0,2 μΜ 5' primeru, 1 μΜ 3' primeru, 2 μΜ dNTP, 10 μCi [a³⁵S]

ATP, lx pufr pro reakci Taq DNA polymerázy a 1 U Taq polymerázy (Amersham Pharmacia). Reakční směsi byly inkubovány v Perkin-Elmer 9600 thermocykleru po 40 cyklů v 94 °C po dobu 30 s, 40 °C po dobu 60 s a 72 °C po dobu 30 s, pak následoval jeden cyklus v 72 °C po dobu 6 minut. PCR produkty byly analyzovány na 6% akrylamidovém sekvenačním gelu. Gel byl * · ·· ·« « · ·

Λ · · · · ♦ · ♦ · ····<· « > · · ···»« ··· ·· ·« · · ·> ·» >

usušen ve vakuu na papíru Whatmann 3MM a byla provedena autoradiografie. Rozdílně exprimovaná cDNA byla z gelu vyříznuta, eluována a opět amplifikována prostřednictvím PCR v přítomnosti stejných oligonukleotidů v podmínkách popsaných výše. Amplifikační produkty byly klonovány do vektoru pMOSblue s použitím soupravy pro klonování fragmentů PCR s tupými konci (Amersham Pharmacia), podle instrukcí výrobce. Klonované fragmenty byly sekvencovány s použitím soupravy „Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer) a analyzovány s použitím ABI 377 automatického sekvenátoru.

Analýza Northern bloty

200 ng mRNA z promastigotů izolované v průběhu stacionární růstové fáze ze 4 izolátů z L. major bylo denaturováno, separováno na gelu s 1,2% agarózou/2,2 M formaldehydem a přeneseno pomocí kapilárního vzlínání na membránu Hybond N⁺ (Amersham Pharmacia). Nukleové kyseliny pak byly fixovány zahříváním po dobu 2 hodin v 80 °C.

Rozdílně exprimované cDNA fragmenty a α-tubulin byly značeny s [a³²P]dCTP s použitím soupravy pro značení „Megaprime DNA labelling systém kit (Amersham Pharmacia). Hybridizace byly prováděny v roztoku lx Denhardtův roztok/6x SSC/0.1% SDS/0,1 mg.ml^-1 DNA spermatu lososa přes noc v 65 °C. Membrány byly promyty v 65 °C v roztoku obsahujícím 0,lx SSC/0,1 % SDS a byla provedena autoradiografie.

Konstrukce cDNA knihovny a charakterizace LmPDI cDNA

Knihovna cDNA byla konstruována z 5 pg mRNA z promastigotů z kmene s nejvyšší virulencí (GLC94) ve vektoru ZAPII, podle instrukcí výrobce (Stratagene). Na 6 x 10⁶ plácích, které byly lyžovány, byl prováděn screening s použitím pl4 sondy značené s [a³²P]dCTP s použitím • · ··« · · · ···· • ····« · · ·· ····· • ···· ··· ··· ·· «fl ···· ·· · soupravy pro značení „Megaprime DNA labelling systém kit (Amersham Pharmacia). Požadované lyžované plaky byly odstraněny a byl na nich znovu prováděn screening, aby se izolovaly pozitivní klony od kontaminujících klonů. Pozitivní klony pak byly sekvencovány.

Analýza Southern bloty gg genomové DNA izolované z promastigotů z kmene GLC94 s nejvyšší virulencí bylo štěpeno restrikčními enzymy uvedenými na obrázku 5 a analyzováno na 0,6% agarózovém gelu, a pak přeneseno na membránu Hybond N⁺ (Amersham Pharmacia). Membrána byla inkubována v přítomnosti sondy radioaktivně značené s [a³²P]dCTP a odpovídající klonu celé cDNA z LmPDI. Membrány pak byly promyty v roztoku obsahujícím 0,lx SSC/0,1% SDS a byla provedena autoradiografie.

Exprese a purifikace rekombinantního proteinu LmPDI v baktériích E. coli BL21

Sekvence odpovídající otevřenému čtecímu rámci cDNA LmPDI (1371 bp) derivované ze sekvence kódující signální peptid byla klonována do bakteriálního expresního vektoru pET-22b (Novagen). Baktérie E. coli BL21 obsahující rekombinantní plazmid (pET-22b-LmPDI) byly kultivovány v LB médiu, a pak byla indukována syntéza rekombinantního proteinu v přítomnosti 1 mM isopropyl-l-thio-D-galaktopyranosidu (IPTG) po dobu 4 hodin. Rekombinantní protein LmPDI-(His)6 (sekv. id. č. 4) byl purifikován afinitní chromatografíi na koloně s niklem (Ni²⁺) (Amersham Pharmacia). Čistota vytvořeného proteinu byla ověřena SDS-PAGE.

Produkce polyklonální anti-LmPDI protilátky a analýza exprese nativního proteinu imunoblotem

• φ · · ♦ * » « * · · 9 · • · · · • · ·· · · <Králík byl imunizován intramuskulární injekcí 500 pg emulgovaného purifikovaného rekombinantního LmPDI v nekompletním Freundově adjuvans (IFA, Sigma) (objem/objem). Králík dostal dvě další injekce 500 pg rekombinantního proteinu, první intramuskulárně 15 dnů po první injekci a druhou intradermálně 30 dnů později. Králíkovi byla odebrána krev 10 dnů po poslední injekci, sérum bylo shromážděno a drženo v -80 °C. Proteinový lyzát z promastigotů byl denaturován v lx Laemmliho pufru po dobu 10 minut ve 100 °C, vložen na 12 % SDS-akrylamidový gel a přenesen elektrotransferem na nitrocelulózovou membránu (Millipore). Membrány byly inkubovány v roztoku saturovaného PBS/0,1% Tween 20/3% odstředěné mléko při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny, pak ve stejném roztoku obsahujícím anti-LmPDI protilátku naředěnou na 1/1000 ve 4 °C přes noc. Po 3 promytích v PBS/0,1% Tween 20 byly membrány inkubovány v přítomnosti sekundární králičí anti-IgG protilátky kondenzované s peroxidázou (Amersham Pharmacia, naředěno na 1/1000) po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti a promyty 3 krát v PBS/0,1% Tween 20. Komplexy protein-protilátka byly odhaleny detekcí peroxidázové aktivity s použitím soupravy ECL systém podle instrukcí výrobce (Amersham Pharmacia).

Příprava redukované a denaturované RNázy A mg purifikované ribonukleázy (RNáza A) bylo redukováno a denaturováno při teplotě místnosti po dobu 18 hodin v pufru obsahujícím 0,15 M DTT, 6 M guanidin-HCl a 0,1 M Tris-HCl v pH 8,6 předtím, než bylo purifikováno na Sephadex G-25 koloně ekvilibrované 0,01 M HCI. Koncentrace frakcí redukované a denaturované RNázy A byla určena s použitím extinkčního koeficientu 9200 M^_1cm^_1 ve 275 nm. Frakce byly uloženy v -80 °C po dobu dvou týdnů.

♦ · ·· · · » · »

Reaktivace RNázy A v přítomnosti rekombinantního proteinu LmPDI μΜ redukované a denaturované RNázy A bylo inkubováno v pufru obsahujícím 4,5 mM cCMP, 1 mM glutathionu GSH, 0,2 mM glutathiondisulfidu (GSSH) , 2 mM EDTA a 100 mM Tris-HCl, pH 8, v přítomnosti 1,4 μΜ bovinního sérového albuminu (BSA) jako negativní kontroly, 1,4 μΜ bovinní proteinové disulfid izomerázy jako pozitivní kontroly nebo 1,4 μΜ rekombinantního LmPDI, po dobu 30 minut ve 25 °C. Reaktivace RNázy A byla určena měřením aktivity RNázy A ve 296 nm každých 5 minut, jak bylo popsáno v literatuře (Lyles a Gilbert, 1991).

Příklad 1

Selekce izolátů L. major, které mají různé stupně virulence

Izoláty L. major použité v této studii pocházející z humánních ZCL lézí byly získány během prospektivní studie prováděné v letech 1994 až 1995 v El Guettar, v jižním Tunisu (Louzir, Melby et al., 1998). Byly vybrány z 19 izolátů na základě jejich patogenní síly během experimentální infekce senzitivních BALB/c myší: 2 x 10⁶ amastigotů z různých izolátů bylo injikováno do polštářků zadních tlapek BALB/c myší a postup léze byl pozorován každý týden po dobu 9 týdnů. Pět týdnů po infekci byla měřena produkce IL-4 a IFN-γ mononukleární buňkami z lymfatických uzlin, které byly aktivovány ín vitro antigeny z parazita.

Tyto experimenty ukázaly za prvé velkou heterogenitu progrese onemocnění, které bylo indukováno různými izoláty

L. major a za druhé, že použití jednoho izolátů vede k reprodukovatelným výsledkům.

• · • · ♦ * · ·· - 4 4 <

• * · · 4 * 4 4 4 4 • ····♦ « « 44 4 4 · 4 · • · · · · 4 4 4 •44 4 · 4 · 4 4 4 4 44 >

Kmeny s nejvyšší virulencí indukovaly největší množství IL-4 a nejnižší hladiny IFN-γ in vitro 5 týdnů po infekci.

Z pozorování, že klinický obraz infekce způsobené L. major se mění v závislosti na kmenech a je reprodukovatelný u každého z nich v experimentálním modelu infekce BALB/c senzitivních myší, původci odvodili hypotézu, že geny zapojené do virulence by mohly být rozdílně exprimovány, když se srovnají izoláty s nejvyšší virulencí s nejméně virulentními izoláty. Předběžná analýza exprese skupiny genů již popsaných dalšími autory a spojovanými s virulencí parazita, včetně LPG1, LPG2, KMP-11, Cpe, Cpb, HsplOO, Gen B a gp63, byla prováděna technikou reverzní transkripce a kvantitativní amplifikace genů. Tato analýza neukázala žádný rozdíl mezi izoláty L. major projevujícími různou patogenicitu u BALB/c myší (Kebaier, Louzir et al., 2001).

Dva izoláty, MHOM/TN/94/GLC94 a MHOM/TN/94/GLC67 (GLC94 a GLC67, v daném pořadí), které indukovaly závažné léze, rychle se vyvíjely a reprezentovaly izoláty s nejvyšší virulencí a 2 izoláty MHOM/TN/94/GLC07 a MHOM/TN/94/GLC32 (GLC07 a GLC32, v daném pořadí), které indukovaly méně závažné experimentální onemocnění a reprezentovaly méně virulentní izoláty, byly vybrány pro pokračování ve vyhledávání genů virulence potenciálně exprimovaných v různém stupni v závislosti na kmenech.

Příklad 2

Identifikace nové proteinové disulfid izomerázy LmPDI z Leishmania major, zapojené do přirozené virulence parazita, pomocí metody diferenciálního displeje

1. Identifikace genů rozdílně exprimovaných ve virulentních • · · · · · » izolátech a izolátech s nízkou virulenci z L. major • · · » · · · • · · · · »··« mRNA byla nejdříve purifikována z promastigotů ze dvou vysoce virulentních izolátů (GLC94 a GLC67) a ze dvou izolátů s nízkou virulenci (GLC32 a 07), pak byla reverzně transkribována na cDNA s použitím oligo (dT) uMN primerů, kde M = A nebo C nebo G a N = A nebo C nebo G nebo T. Primer použitý během experimentů s technikou diferenciálního displeje byl:

Amplifikační reakce byly prováděny prostřednictvím PCR s použitím stejných oligo-dT primerů použitých během reakce reverzní transkripce a smíchaných s 10 náhodnými primery, jak bylo popsáno ve vědecké literatuře (Liang a Pardee, 1992, Liang, Bauer et al., 1995, Heard, Lewis et al., 1996).

Celkem bylo vytvořeno a analyzováno 60 kombinací primerů. Analýza amplifikačních produktů v polyakrylamidovém gelu s použitím různých kombinací primerů ukázala, že geny z L. major (vysoce virulentní nebo z různých izolátů s nízkou virulenci) exprimují v přibližně 95 případů stejnou mRNA a v ekvivalentních hladinách. Celkem vzato, 25 exprimovano mezi vysoce nízkou virulenci (obrázek byla nejdříve izolovaná mRNA vypadá, že je rozdílně virulentními izoláty a izoláty s IA) . Rozdílně exprimovaná cDNA z akrylamidového gelu, a pak opět amplifikována s použitím stejné kombinace primerů, jako byla použita během první PCR a nakonec klonována do pMOS vektoru. Sekvencování různých klonů ukázalo, že byl z nich identifikován určitý počet.

Analýza mRNA z různých izolátů z L. major prostřednictvím Northern blotů s použitím 14 fragmentů rozdílně exprimovaných jako sondou ukázala, že první 3 klony ze 14 izolátů projevují rozdílnou expresi mezi vysoce virulentními izoláty a izoláty s nízkou virulenci. Jeden z těchto klonů, pl4, byl charakterizován Northern bloty. Sonda odpovídající klonu pl4 specificky hybridizovala s transkriptem ••••· * · ·· ···· ♦ to · · to 9 · • · · · · · · · i « · s přibližnou velikostí 2,2 kb, který byl přednostně exprimován ve dvou izolátech s nejvyšší virulencí ve srovnání se dvěma izoláty s nejnižší virulencí (obrázek 1B). To potvrdilo výsledky získané technikou diferenciálního displeje. Klon pl4 byl kompletně sekvencován a velikost tohoto klonu je 339 bp. Srovnání nukleotidové sekvence tohoto fragmentu se sekvencí popsanou v databázích (GenBank a EMBL) neidentifikovalo významně homologní sekvenci. To mohlo být způsobeno faktem, že klon pl4 odpovídá netranslatovanému 3' koncovému úseku mRNA.

2. Klonování a analýza celé cDNA sekvence pl4

Aby se izolovala celá cDNA sekvence odpovídající klonu pl4, byl použit fragment o velikosti 339 bp ke screening cDNA banky promastigotů GLC94 izolátu. Z analyzovaných 6xl0⁵ rekombinantních klonů byly izolovány dva pozitivní klony. Obrázek 2 ukazuje nukleotidovou sekvenci nejdelšího klonu, což je 2094 bp (sekv. id. č. 1) . Tento klon má otevřený čtecí rámec kódující polypeptid o 477 aminokyselinách (aa) s teoretickou molekulovou hmotností 52,4 kD a izoelektrickým bodem 5,22. N-koncový úsek tohoto proteinu odpovídá potenciálnímu signálnímu peptidu pro export do endoplazmatického retikula, dlouhému 20 aa. Netranslatovaný 5' úsek obsahuje sestřihovou vedoucí sekvenci charakteristickou pro Leishmanie a netranslatovaný 3' úsek obsahuje póly A konec, kterému předchází potenciální místo polyadenylace (obrázek 2) .

Peptidová sekvence izolovaného klonu vykázala 27% až 36% identitu s proteiny rodiny proteinových disulfid izomeráz (PDI a Erp) z několika živočišných druhů (obrázek 3) . Navíc tento protein obsahuje dva úseky ve zbytcích 47 až 52 a 381 až 386, který jsou identické s potenciálními aktivními místy * · » · · « • # « (Cys-Gly-His-Cys nebo thioredoxinové rodiny, signál pro retenci v • · · · · · · fc · ····· · * ·· ····· • « · · · · « • •fc · · »·«· ·· ·

CGHC) PDI, Erp a proteinů z

C-koncová část vykazuje potenciální endoplazmatickém retikulu typu KDEL (EEDL) ve zbytcích 474 až 477, což svědčí pro to, že jako PDI a Erp byl tento protein zjištěn ve váčcích endoplazmatického retikula. pl4 je tedy protein z rodiny proteinových disulfid izomeráz L. major. Byl označen LmPDI (obrázek 2 a 3).

Aby se určilo, zda je LmPDI obdařen thiodisulfid oxidoreduktázovou aktivitou, jak bylo prokázáno pro většinu popsaných proteinových disulfid izomeráz, byla studována kapacita rekombinantního proteinu LmPDI renaturovat denaturovanou RNáza A. Rekombinantní protein LmPDI byl syntetizován v E. coli, pak byl purifikován a použit v testu in vitro reaktivace RNázy. Získané výsledky ukazují, že LmPDI je schopný obnovit aktivitu RNázy A podobným způsobem jako bovinní PDI, použitá jako kontrola (obrázek 4).

Aby bylo možné identifikovat počet kopií genu kódujícího LmPDI, původci prováděli hybridizace typu Southern blotu s použitím cDNA fragmentu LmPDI značeného ³²P jakožto sondy.

Získané výsledky většinou vykázaly jeden pás, kromě enzymů s místem štěpení v cDNA LmPDI (obrázek 5A) . Gen kódující

LmPDI je tedy pravděpodobně přítomný v jedné kopii v genomu L. major. Kromě toho se ukazuje, že gen pro LmPDI je konzervativní u různých druhů testovaných Leishmanií (Leishmania infantům, dermotropní a viscerotropní, Leishmania donovani, obrázek 5B).

3. Analýza LmPDI exprese prostřednictvím imunoblotů syntetizovaným chromatografií,

Aby bylo možné charakterizovat expresi nativního proteinu, byl králík imunizován rekombinantním proteinem LmPDI v E. coli a purifikovaným afinitní

S použitím imunoblotů původci prokázali, že • · · · · ···· ····· · * ·· ····· • · · · · · · • · ·« ···· ·· « získaná anti-LmPDI polyklonální protilátka silně rozpoznávala protein očekávané velikosti (55 kD) v lyzátech z promastigotů ve stacionární růstové fázi GLC94 (obrázek 6) . Kromě toho byly detekovány dva další proteiny. První měl molekulovou hmotnost 105 kD, což odpovídá přibližně dvakrát molekulové hmotnosti LmPDI a druhý měl molekulovou hmotnost 35 kD. Tiby se ověřilo, zda protein o velikosti 105 kD odpovídal dimeru LmPDI, denaturované lyzáty GLC94 promastigotů byly analyzovány v přítomnosti vysokých koncentrací DTT (0,5 mM). V těchto podmínkách anti-LmPDI už nedetekovala žádné proteiny o velikosti 105 kD. Tyto výsledky svědčí pro to, že LmPDI je organizovaný v oligomerech. Protein o velikosti 35 kD vypadá jako kontaminující protein. Anti-LmPDI purifikovaná na afinitní koloně (Sepharose 4B-LmPDI) opravdu již dále nerozpoznává protein o velikosti 35 kD (obrázek 6).

Aby se srovnala hladina exprese LmPDI mezi nejvíce a nejméně virulentními izoláty, proteiny promastigotů byly extrahovány, a pak kvantifikovány ve stacionární růstové fázi. 5 pg proteinů bylo analyzováno na 12% polyakrylamidovém SDS gelu a přeneseno na nitrocelulózovou membránu. Analýza Western bloty s použitím anti-LmPDI protilátky ukázala, že LmPDI o velikosti 55 kD a jeho dimer o velikosti 105kD byly silněji exprimovány v izolátech s nejvyšší virulencí (obrázek 7) . Na rozdíl od toho, kontaminující protein o velikosti 35 kD byl exprimován rovnocenně bez ohledu na testovaný kmen. Tyto výsledky svědčí pro korelaci mezi stupněm exprese LmPDI a patogenní silou studovaných izolátů.

»· * · · · <« « • ····· · · · , ····• · · · · * · · •·· «· ·· ···· ·· «

Přiklad 3

Indukce in vitro proliferace mononukleárních buněk z jedinců, kteří mají aktivní léze nebo předchozí ZCL, pomocí LmPDI

LmPDI z L. major by mohl být díky své vysoké expresi během infekčního stádia parazita cílem pro buněčné imunitní reakce. Aby se ověřila pertinence této hypotézy, kapacita LmPDI indukovat buněčnou imunitní reakci byla hodnocena pomocí experimentů proliferace mononukleárních buněk získaných od jedinců, kteří mají aktivní léze nebo předchozí ZCL.

Tato studie byla prováděna u 37 jedinců, kteří žijí v El Guettar (jižní Tunis), u kterých byly k dispozici výsledky testu buněčné proliferace proti celkovým antigenům parazita (SLA, test indikující předchozí kontakt s parazitem). Tito jedinci byli rozděleni takto:

Skupina 1: složená z 8 jedinců s negativním SLA testem,

Skupina 2: složená z 29 jedinců s pozitivním SLA testem.

Mononukleární buňky zahrnující lymfocyty a monocyty byly separovány z periferní krve pomocí centrifugace na gradientu Ficoll/Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Švédsko).

Výsledky (obrázek 8) ukazují významnou proliferaci u imunních jedinců.

Cytokiny (IFN-β, IL-4) v supernatantech kultur PBMC byly indukovány inkubací mononukleárních buněk po dobu 48 hodin se stejnou koncentrací LmPDI a testovány pomocí testu ELISA s použitím humánních anti-IL-4 a anti-IFN-β monoklonálních protilátek (Pharmingen, San Diego, CA).

Výsledky pocházejí od malého vzorku jedinců. Jasně ukazují nepřítomnost IL-4 a přítomnost významného množství IFN-β v supernatantu z buněk stimulovaných LmPDI.

Tento výsledek ukazuje v podstatě na typ reakce Thl, což . :

indikuje, že LmPDI by mohl představovat proti Leishmaniím.

kandidátní vakcínu

Příklad 4

Inhibice růstu Leishmania major v tekutém médiu v přítomnosti inhibitoru PDI

Bacitracin je známý inhibitor PDI. Experimenty s použitím bacitracinu ukázaly, že v konečné koncentraci 2 mM bacitracin kompletně inhiboval růst parazitů L. major v tekutém médiu (obrázek 9).

Tyto experimenty byly prováděny v následujících experimentálních podmínkách:

a) Příprava redukované a denaturované RNázy A:

mg purifikované ribonukleázy (RNáza A) bylo redukováno a denaturováno při teplotě místnosti po dobu 18 hodin v pufru obsahujícím 0,15 M DTT, 6 M guanidin-HCl a 0,1 M Tris-HCl v pH

8,6 předtím, než bylo purifikováno na Sephadex G-25 koloně ekvilibrované 0,01 M HCl. Koncentrace frakcí redukované a denaturované RNázy A byla určena s použitím extinkčního koeficientu 9200 M¹cm'¹ ve 275 nm. Frakce byly uloženy v -80 °C po dobu dvou týdnů.

b) Reaktivace RNázy A v přítomnosti rekombinantního proteinu LmPDI μΜ redukované a denaturované RNázy A bylo inkubováno v pufru obsahujícím 4,5 mM cCMP, 1 mM glutathionu GSH, 0,2 mM glutathiondisulfidu GSSH, 2 mM EDTA a 100 mM Tris-HCl, pH 8, v přítomnosti 1,4 μΜ bovinního sérového albuminu (BSA) jako negativní kontroly, 1,4 μΜ bovinní proteinové disulfid izomerázy jako pozitivní kontroly nebo 1,4 μΜ rekombinantního • · ··· ·· · » · · · • ····· · · ·· ····· • ·«·· ··« • » * · 9 · · · · · · · · »

LmPDI, po dobu 30 minut ve 25 °C. Reaktivace RNázy A byla určena měřením aktivity RNázy A ve 296 nm každých 5 minut po dobu 30 minut, jak bylo popsáno v literatuře (Lyles a Gilbert, 1991).

c) in vitro testy inhibice thiodisulfid oxidoreduktázové aktivity rekombinantního LmPDI různými inhibitory PDI

Experimentální podmínky pro testy inhibice thiodisulfid oxidoreduktázové aktivity rekombinantního LmPDI byly striktně identické s podmínkami popsanými v odstavci Reaktivace RNázy A v přítomnosti rekombinantního proteinu LmPDI, kromě toho, že reakce byly prováděny v přítomnosti 0,01 mM, 0,1 mM, 0,5 mM a 2 mM následujících inhibitorů PDI:

• Bacitracin, • Bacitracin zinečnatý, • P-chlormerkuribenzoová kyselina (pCMBA), • Tocinoová kyselina.

d) Inhibice růstu parazita (i. major) v tekutém médiu

S cílem určit účinek bacitracinu (BAC), bacitracinu zinečnatého (BACZn), p-chlormerkuribenzoové kyseliny (pCMBA) a 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoové kyseliny) (DTNB) na in vitro růst Leishmanií v tekutém médiu, byly různé koncentrace inhibitorů uvedené výše, 0 mM, 0,05 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,5 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 2,5 mM a 5 mM, přidány k RPMI doplněnému 5% fetálním telecím sérem a obsahujícím 2 x 10⁶/ml parazitů v exponenciální růstové fázi. Parazité byli inkubováni ve 26 °C a počítáni každých 24 hodin po sobu 96 hodin. Parazité byli počítáni na Mallassezových buňkách.

• * • · · • · · · · ···· ····· · » · · ····· • · · ······ «· β

Příklad 5

Vyhodnocení molekul inhibujících LmPDI vzhledem k jejich kapacitě zastavit růst Leishmania major

Vyhodnocení úlohy LmPDI ve virulenci Leishmanií umožňuje, aby byly uvažovány nové strategie pro identifikaci molekul, které jsou aktivní v léčení onemocnění způsobených Leishmanií. Je pravděpodobné, že jiné molekuly než bacitracin, které jsou známé pro svou anti-PDI aktivitu, jsou schopné inhibovat růst parazita. Příklad protokolu pro hodnocení molekul potenciálně účinných proti infekci Leishmanií je uveden v tomto textu.

Hodnocení molekul, které jsou známé pro svou anti-PDI aktivitu nebo molekul, které budou nově identifikovány, může být prováděno ve třech krocích. Během prvního kroku, jsou molekuly testovány in vitro rekombinantním proteinem LmPDI produkovaným v Escherichia (E.) coli. Pak jsou prováděny testy inhibice růstu parazitů v tekutém médiu a konečně jsou molekuly testovány v experimentálním myším modelu leishmaniózy.

1. Vyhodnocení inhibice rekombinantního LmPDI.

Detailní technika pro analýzu PDI aktivity LmPDI byla popsána v příkladu 2 a v části Materiály a metody uvedené výše. Stejná technika může být použita pro vyhodnocení kapacity některých inhibitorů PDI, které jsou známy nebo ještě budou identifikovány (s použitím molekulárního modelu LmPDI), přidáním různých koncentrací potenciálních inhibitorů k obsahu reakce. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento inhibice ve srovnání s pufrem samotným. Jsou zachyceny pouze molekuly s významnou inhibiční aktivitou a s inhibiční aktivitou závislou na dávce LmPDI.

··· ·· · · · · · • ····· · · t · ····· • ···· ··· • ·· ·· · ··φ · ·· ·

S cílem určit, zda různé inhibitory PDI popsané v literatuře mohou inhibovat thiodisulfidovou oxidoreduktázovou aktivitu LmPDI, byla v různých koncentracích v in vitro testu studována kapacita těchto inhibitorů blokovat enzymatickou aktivitu LmPDI syntetizovaného v E. coli, a pak purifikovaného. Inhibitory byly:

• Bacitracin, • Bacitracin zinečnatý, • P-chlormerkuribenzoová kyselina (pCMBA), • Tocinoová kyselina

Získané výsledky jsou ukázány na obrázku 10 a ukazují, že LmPDI aktivita je kompletně inhibována v přítomnosti 0,01 mM pCMBA a 2 mM bacitracinu nebo bacitracinu zinečnatého. Na rozdíl od toho se neukazuje, že tocinoová kyselina má velmi velký účinek na aktivitu LmPDI v použitých koncentracích (koncentracích, které kompletně inhibují aktivitu humánního PDI) .

2. Inhibice růstu parazitů (L. major) v tekutém médiu.

Testovaná molekula byla rozpuštěna v rozpouštědle, jehož vhodnost závisela na jeho fyzikálně chemických vlastnostech (rozpustnost ve vodných roztocích nebo organických rozpouštědlech). Ve všech případech bylo rozpouštědlo samotné použito jako kontrola. Jako příklad, experimenty byly prováděny na izolátech GLC94 L. major. Složení kultivačního média bylo uvedeno výše (příklad 2 a Materiály a metody) . Tkáňové kultury byly inkubovány ve 26 °C a pravidelně pasážovány, aby se parazité udržovali ve stacionární růstové fázi. Pro některé experimenty byla použita forma amastigota parazita. V tomto případě, parazité (promastigoty) ve stacionární růstové fázi byli stočeni, médium bylo nahrazeno Schneiderovým médiem pro Drosophila, s upraveným pH 5,0 a • · · · · · ···· « ····· · · · · ····· • · · · · ··· ··· · · · · · · · · · · · doplněným fetálním telecím sérem (FCS). Kultury pak byly inkubovány v 5% C0₂ ve 35 °C.

Inhibice růstu promastigotů L. major byla prováděna na parazitech odebraných v exponenciální růstové fázi, s koncentrací upravenou na výchozí koncentraci 10⁶ parazitů/ml v kompletním médiu, a inkubovaných v množství 100 μΐ/jamka na 96 jamkových kultivačních destičkách v nepřítomnosti nebo přítomnosti různých koncentrací testované molekuly. Parazité byli inkubováni v 5% CO₂ ve 26 °C a počítáni každých 24 hodin po dobu 96 hodin. Počítání parazitů bylo prováděno na Mallassezových buňkách. Alternativně mohl být použit hemocytometr. Všechna měření byla prováděna v trojím provedení. Inhibiční kapacita molekuly byla určena jako inhibice koncentrace, která redukuje buněčné dělení o 50% ve srovnání s kontrolou (IC50).

Snížení životaschopnosti amastigotů bylo hodnoceno s použitím fluorimetrického testu používajícího Almarovu modř jako indikátor životaschopnosti/růstu.

Inhibitory PDI popsané v odstavci (1.) byly testovány s cílem vyhodnotit jejich kapacitu inhibovat in vitro růst parazitů. Pro tento účel byla různá množství inhibitorů přidána k RPMI obsahujícímu 2 x 10⁶/ml parazitů v exponenciální růstové fázi. Parazité byli inkubováni ve 26 °C a počítáni každých 24 hodin po dobu 96 hodin. Parazité byli počítáni na Mallassezových buňkách. Získané výsledky jsou ukázány na obrázku 11 a ukazují, že bacitracin, bacitracin zinečnatý nebo pCMBA kompletně inhibovaly růst Leishmanií v koncentracích 5mMa2mMaO,5 mM, v daném pořadí. Na rozdíl od toho se neukazuje, že 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoová kyselina) (DTNB) má velmi velký účinek na růst Leishmanií v použitých koncentracích (koncentrace, které kompletně inhibují aktivitu humánního PDI).

• · · ·· · · · · t . ····· · · ·· · ···· • ···· · * · • · · ·· · · · · ♦ · ·· a

3. Vyhodnocení účinnosti předem selektovaných inhibitorů v experimentálním modelu infekce senzitivních BALB/c myší L. major.

In vivo experiment závisí na toxicitě a fyzikálně chemických vlastnostech testovaných molekul. BALB/c myši jsou infikovány 10⁶ promastigotů L. major získaných během stacionární růstové fáze a injikovaných (v objemu 50 μΐ) do plantárních polštářků zadní pravé tlapky. Průměr léze byl měřen každý týden s použitím posuvného měřítka.

V závislosti na případu budou použity celkem tři terapeutické protokoly:

• Pokud jde o hydrofobní molekuly, které dobře difundují a jsou mírně toxické nebo netoxické, bude produkt injikován intraperitoneálně v různých koncentracích a s použitím různých schémat. Frekvence injekcí bude záviset na biologické dostupnosti molekuly a na jejím poločase. Ve všech případech bude protokol zastaven na konci 9 týdnů po infekci, • Pokud jde o hydrosolubilní a relativně toxické molekuly, injekce bude prováděna do lézí (obecně může být účinná dávka dělena 10) prostřednictvím alespoň čtyř injekcí do indurované zóny, • Pokud jde o liposolubilní molekuly, mast bude testována týdenní aplikací na experimentální lézi.

Celkem a bez ohledu na způsob injekce testovaného produktu budou prováděny dva typy protokolů:

• Protokol, který začne ihned po injekci parazitů, • Protokol, který začne 4 až 5 týdnů po injekci parazitů, v době, kdy bude už vytvořena léze.

Ve všech případech budou na konci protokolu myší utraceny a bude prováděno určení míry infekce parazitem v místě injekce a v uzlině, která drénuje místo léze.

Příklad 6

In vitro infekce myších makrofágů Leishmanií

Makrofágy myší kostní dřeně (MBMM) byly získány z kostní dřeně vytlačené z femuru nebo tibie samic myší BALB/c. MBMM byly kultivovány na vícejamkových destičkách v množství 1,5 x 10³ buněk na jamku v 500 μΐ kompletního média. Aby se stimuloval růst a zrání MBMM, kultivační médium bylo doplněno 20% médiem kondicionovaným fibroblasty L-929 jako zdroje faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (MCSF). Po 6 dnech kultivace ve 37 °C a 5% CO2 bylo médium odstraněno, MBMM byly promyty a bylo přidáno čerstvé RPMI médium s 10% fetálním telecím sérem, ale neobsahující žádné médium kondicionované fibroblasty L-929. Amastigoty z léze byly purifikovány z neulcerovaných lézí diferenciální centrifugací a počítány s použitím virového barvení trypanovou modří. Tito parazité byli použiti k infekci MBMM v konečném poměru čtyři parazité na jeden makrofág. Dvě hodiny po přidání parazitů byly makrofágy pět krát promyty s PBS, aby se odstranily nefagocytující amastigoty. Kultury pak byly inkubovány ve 37 °C v 95% vzduchu a 5% CO₂. Experimenty byly prováděny v různých časových bodech: 30 minut a 2, 24 a 72 hodin. V uvedených časech byly jamky promyty PBS, víčka byla odstraněna a infikované makrofágy byly fixovány ethanolem po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Aby se sledovala infekce, byly destičky pak promyty a obarveny dle Giemsy.

Infikované makrofágy byly počítány v centru každé jamky, kde byly buňky dobře rozprostřeny a parazité mohli být snadno spočítáni. V této úrovni destičky mohl být poměr

parazit/makrofág vyšší než 4.

Příklad 7

Inhibice enzymatické aktivity rekombinantního LmPDI inhibitory proteinové disulfid izomerázy

Několik inhibitorů proteinových disulfid izomeráz (PDI) bylo popsáno v literatuře (Ryser et al., 1994, Orlandi 1997, Mou et al., 1998). Z nich bacitracin a bacitracin zinečnatý představují komplex polypeptidových antibiotik tvořených Bacillus subtilis a Bacillus lichenformis. Bacitracin A je hlavní sloučenina komerčního bacitracinu, který je směsí alespoň devíti bacitracinů. Toto antibiotikum je schopné inhibovat syntézu stěny mnoha Gram+ baktérií, ale také aktivitu mnoha proteáz, jako je například PDI, transglutamináza, papain a neuropeptidáza. Většina těchto proteáz má ve svém aktivním místu cysteinový zbytek.

V prvním kroku původci testovali účinek těchto inhibitorů při ověřování jejich eventuální schopnosti měnit enzymatickou aktivitu rekombinantního LmPDI (rLmPDI) in vitro.

Technika redukované a denaturované RNázy popsaná výše (Lyles a Gilbert, 1991) byla použita pro průkaz aktivity LmPDI. Dvacet miligramů RNázy A (Amersham Pharmacia) bylo denaturováno v pufru složeném z 0,15 M dithiothreitolu, 6M guanidin HCl a 0,1 M Tris HCl, pH 8,6, po dobu 18 hodin při teplotě místnosti. Redukovaná a denaturované RNáza pak byla purifikována na koloně Sephadex G25 ekvilibrované v 0,01 M HCl a spektrofotometricky kvantifikována ve 275 nm.

V redukčním pufru založeném na glutathionu PDI katalýzuje renaturaci redukované a denaturované RNázy (Gilbert, 1998). Obnova aktivity RNáza byla spektrofotometricky měřena v přítomnosti 2'-3'-cyklického cytidinmonofosfátu (cCMP) jako substrátu. 8 μΜ redukované a denaturované RNázy, samotné nebo v přítomnosti 1,4 μΜ bovinního sérového albuminu (BSA) nebo

1,4 μΜ rLmPDI, bylo smícháno v pufru obsahujícím 4,5 mM cCMP, mM redukovaného glutathionu (GSH), 200 μΜ oxidovaného glutathionu (GSSG) , 2 mM EDTA a 100 mM Tris-Cl, pH 8. Reakce byla prováděna při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Hydrolýza cCMP, která byla důsledkem renaturace RNázy, byla zaznamenávána měřením absorbance ve 296 nm každých 5 minut po dobu reakce půl hodiny.

Aktivita rekombinantního LmPDI (rLmPDI) byla měřena v přítomnosti různých koncentrací bacitracinu (BAC 0,01 mM až mM) a bacitracinu zinečnatého (BACZn, 0.01 nM až 2 mM) . Výsledky jsou ukázány na obrázku 12.

Tyto výsledky ukazují, že bacitracin a bacitracin zinečnatý měly podobné účinky. V přítomnosti těchto dvou produktů byla pozorována 50% inhibice v 0,1 mM, 70% inhibice v 0,5 mM a 100% inhibice ve 2 mM koncentraci. Koncentrace, které inhibují rLmPDI, jsou srovnatelné s koncentracemi popsanými v literatuře pro inhibitory PDI z jiných živočišných druhů.

Příklad 8

In vitro růstová kinetika promastigotů L. major v přítomnosti bacitracinu zinečnatého

Původci pak testovali účinek bacitracinu zinečnatého na in vitro růstovou kinetiku promastigotů L. major. Pro tuto studii byl testován pouze bacitracin zinečnatý, za prvé protože měl stejný profil inhibice enzymatické aktivity rLmPDI ··· ·« « «··« • ····· « · ·· *···· • ···· ··· ··· ·· ·· ···· ·· · jako bacitracin a za druhé protože bacitracin je více stabilní a méně toxický, když je kondenzován se zinkem.

Za tímto účelem byly promastigoty z izolátů GLC94 pěstovány na médiu založeném na sraženém králičím séru po dobu dvou dnů. Pak byli parazité v množství 2 x 10⁶ parazitů na 1 ml přeneseni do kompletního média obsahujícího bacitracin zinečnatý BACZn, v koncentracích 1, 1,5 a 2,5 mM. Promastigoty pěstované v kompletním médiu v nepřítomnosti inhibitorů byly použity jako kontroly. Monitorování bylo prováděno počítáním parazitů ve 49, 72 a 96 hodinách. Výsledky jsou ukázány na obrázku 13.

Tyto výsledky ukazují, že bacitracin zinečnatý částečně inhibuje růst parazitů v 1,5 mM koncentraci s kompletní inhibici v 2 mM a v 5 mM koncentraci, zatímco neměl žádný účinek v 1 mM koncentraci. Je tedy velmi důležité poznamenat, že tato molekula je schopná blokovat proliferaci parazitů L. major v tkáňové kultuře.

Příklad 9

Inhibice růstu promastigotů L. major v myších BALB/c v přítomnosti bacitracinu zinečnatého

Dostupnost bacitracinu zinečnatého, který již tvoří zbraň v terapeutickém arzenálu, umožnil to, že byl testován na evoluci infekce BALB/c myší s L. major. Myši byly infikovány promastigoty ve stacionární růstové fázi (10⁶ promastigotů na tlapku) izolátu GLC94 do plantárního polštářku zadní tlapky a léčeny mastí založené na 5 mM nebo 25 mM BACZn (připraven ve vazelíně). Léčba mastí započala 48 hodin po injekci parazitů prostřednictvím jedné aplikace denně po dobu 5 dnů v týdnu. Jako kontroly byly použity myši infikované stejným způsobem a • * · · · · · · · • · · · · · · · · · • · · · · · · · · · · fc · · «I • » · · · · · · ··· ·· ·· ···· fc· · léčeny vazelínou. Velikost lézí byla měřena každý týden. Výsledky jsou ukázány na obrázku 14.

I když jsou předběžné, ukazují tyto výsledky, že bacitracin zinečnatý zmírňuje progresi onemocnění, když je aplikován lokálně ve formě masti na místo injekce myším BALB/c. Mělo by být zdůrazněno, že ve skupině léčených myší bylo zmírnění lézí pozorováno u 2 ze 3 myší léčených 5 mM bacitracinem a u 2 ze 4 myší léčených 25 mM bacitracinem. Rekurence klinického onemocnění po zastavení léčby byla očekávána, protože BALB/c myši jsou neschopny kompletně eliminovat parazita a dokonce léčby používané u člověka (glukantim a paramomycin) mají malý účinek na onemocnění indukované u BALB/c myší, u kterých nikdy nebyl pozorován kompletní vymizeni parazitů.

LmPDI tak může být považován za potenciální cíl chemoterapie proti Leishmanii a ukazuje se, že bacitracin je potenciálně účinný proti L. major.

«♦ · · · · · · ·»· · · · · » · * • ··· « · · · · · ♦ ···· • ··«· · » · »·« ·· ·· ·»·· ·· <

Seznam literatury

Beveriey, S. ML and S. J. Turco (1998). Iúpophosphoglycar (LPG) and the identhicaliott of virulence genes in the protozoan parasite Leishmania. Trends Microbiolfl): 35-40.

Chakrabarty, K, S. Mukherjee, ct al. (1996). Kinetics of entry of virulent and avirulsnt strains of Leishmania donovani into macrophages: apossiblc role of vňufooce molecales (gpó3 and LPGU 7 Parasitol 82(4): 632-5.

Cotím, P. C., L. K. Gacrity, et al. (1999). Jsolation of genes mediating resistance to inhibitors of nncleoside and ergosíerol metabobsm in Leishmania by ovsrexprcssioiž/selectíon.ⁿ JBiol Chsm 274(53):37723-30.

De, T. and S. Roy (1999). Infectívity and attenuation of Leishmania donovani piomastigotes: association of galactosyl transferase wŤth loss of parasite virnlence. JParasitol 85(1): 54-9.

Descoteaux, A, Y. Luo, et al. (1995). A qjeaalizedpaťhway aflbctmg virulence gfycoconjugates of Láshmania Science 269(5232): 1869- 72.

Desjardins, M. and A. Descoteaux (1997). Inhibition ofphagolysosomaí biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan.'¹3 Exp Med 185(12): 2061-8.

Desjardins, M. and A Descoteaux (1998). Stavíval strategies of Leishmania donovani in mammalian host macrophages. Reslnnnunol 149(7-8): 689-92.

Dumas, C-, M. Ouellette, ct al. (1997). Disruption of the trypanothione reductas© gene of Leishmania deereases its ability to survive oxidalive stress in macrophages. EmboJ 16(10): 2590-8.

Ferrari, D. M. andH. D. SoHng (1999). Tle protein disnlphide-isomerasc lamily: unravelling a string of folds. Biochem J 339(Pt l): 1-10.

Frand, A R-, L W. Cuozzo, et al. (2000). Tathways for protein disulphide hond formafion. Trends Cell Biol 10(5): 203-10.

Garsaň, A. and T. Eg (2001). The role ofphosphomarmose isomerase in Leishmania mcxicana glycoconjugate synthesis and virulence.” JJBioiChem 276(9): 6566-75.

Gilbert, H. F. (1998). Protein disul&de isomerase. MetbodsEozymo) 290:26-50.

* ♦ ·» ·« 4*4 » · · · · » * · ·· · 4 · · » · 4 ····« • 444 · · 4 • · · · ·· ·· *4 4

Heard, P, L., C. S. Lewis, et al. (1996). “Leishmania mericana amazonsnsis: differential display analysis and cloning of mBNAs fiom attenuatcd and infective forms. J Eukaryot Microbiol 43(5):409-15.

Hubel, A., S. Krobitsch, et al. (1997). Leishmairia major HsplOO is requiredchiefly in the mammalian stage of tbe parasite. Mol Cell Biol 17(10): 5987-95.

Hultgrea, S. J., S- Abraham, et al. (1993). PEus and nonpilus bacterial adhesins: asscmbly and fjnction in cell recognítion.” Cell 73(5): 887- 901,

Eg, T. (2000). Proícophosphogiycans of Leishmania. Paraatol Today 16(11): 489-97.

flg, Τ., M. Demar, et al, (2001). Phosphoglycan Repeat-defíciait Leishmaniamexicana Parasitea Remam Ih&ctious to Macrophagcs and Míce. I Biol Chem 276(7k 4988-97.

KebaJer, C_o H. Loazir, et al. (2001). Heterogeneity of wild Leishmania major isolaíes m expedmeatal murine pathogenicity and specific imrmmc response. Tnfection and Inwnnrptv 69©.

Khaiil, E. A., A Μ. El ffassan, et al. (2000). Autoclaved Leishmsnia major vaccine for prevcntion of vjsceral lóshmaniasis: a randomised, double-blind, BCG-controllcd ttial in Sudan. Lancet_356(924t): 1565-9.

Liang, P., D. Bauer, et al. (1995). Analysis of alfered gene exprcssion by differential display.” Methods Bnzymol 254: 304-21.

Liang, P. and A. B. Paidec (1992). Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polyrnerase chain reaction.“ Science 257(50721:967-71.

Lira, R., S- Sundar, ct al. (1999). Evidence lhal the high incidence of trcafcnent Eailures in indián kala-azar is due to the emergence of antimony-rcsistant strains of Leishmania donovaní JInfect Dis 180(2): 564-7.

Louzir, Η., P. C. Melby, cl al. (1998). Immunologic determinanta of disease evohrtion in locaiized eutaneous leishmaniasis due to Leishmania major. JInfect Dis 177(61:1687-95.

·« « · « ·· ·» • · · · · flfl · • · · · · ·

I^ies, Μ. M. and H. F. Gilbert (1991). CatalysB of íbc oxidative folding of ribonuclease A by protein dasulfide isomerase; dependence of tbe rate on the composition of the redox bufíer. Biochenristrv, 30(3): 613- 9.

Lyles, Μ. M. and R F. Gilbert (1991). CaíaJysis of the oxidadve folding of ribonuclease A by protein disulfide isomerase: pre-steady-sfaíc Knetícs and theufíhzation of tbe oxidizřng eqnrvalents of the isomerase. Biocheanistrv 3QÍ3b 619-25.

Martin, J. L. (1995). Thioredoxin-a fold for all reafions. Stmctnre 3(3): 245-50.

McKerrow, J. H., J. C. Engel, et aL (1999). Cysteine protease inhibitors as chemotherapy for parasitic infecíions. Bioorg Med Chem 7(4): 639-44.

Moííratn, J. C., D. R. Brooks, et al. (199S). Roles of cysteine proteinases of tiypaoosomes and Leishmaaia in host- parasite interaetiops. Cmr Opin Miaobiol lf4): 455-60.

Mottram, J. C., A. E. Sanza, et al. (1996). Evidence fenu disruption of the Imcpb gene atray of Leisbmaniamexicauaťhat cysteine proteinases sre virulence factors. Proč Nati Acad Sci U S A 93(12):6008-13.

Mon, Y., H. Ni, et al. (1998). The selective inhibition of beta 1 and beta 7 integrin-mediated lymphocyte adheskm by bacitiacin. J lmmnnpL161(lI): 6323-9.

Mokhopadhyay, S., P. Sen, et al. (1998). Reduced expression of lipophosphoglycan (LPQ) and kínctoplastid membráně protein (KMP)-11 in Leishmania donovani promastigotes in axemc cultnre. J. Paraatol 84f3V. 644-7.

Noiva, R. (1999). Protein disulfidc isomerase: ťhc multifunctional redox chaperone of the endoplasmic reticulnm.¹’ Semiti Cell D&v Biol 10(5):

481-93.

Orlandi, P. A. (1997). Protein-disulfide isomeras^mediatedreduction of íhe A subunit of cholera toxin in a human inteslinal cell line. J. BioL Chem 272(7): 4591 -9.

Ostennricr, Μ., K. De Sutter, et al. (1996). Rukaryotic protein disulfide

999 9

99 »9 9999

9 9 9« secretsd protein with. di sulfide bonds. J Biol Chem 271(18): 10616-22.

Psramchuk, W. J-, S. O. ismail et aL (1997). Clonnig, characterizaliao and overexprcssion of two iron superoxide dismutase cDNAs from Leishmania cfaagasi: role in patbogenesis. Mol Biochem Parasitol 90(1): 203-21,

Peek, J. A. and R. K. Taylor (1992). Charactenzalion of a periplasmic thioldisulfíde interchange protein nsquircd for the fimctional matucadon of secreted virolence factors of Vihrio cholerae. Proč Nati Acad Sci USA89(13): 6210-4.

Perez-Victoria, J. M, F. J. Perez-Victoria, et al (2001). High-affinity binding of silybm deóvatives to lbe nucleotide-bmding dwnainof a Leishmania iropica P-glycoprotein-hke transportér and chcrnnsenatization of & multidmg-resistant paiasiie to daunomyetn. Antunicrefo Agenta Chemothcr 45(2): 439-46.

Ryser, H. J., E. M. Levý, ct aJ. (1994). ''hťhihition of human immnnodefícicncy virus infection by agents that interiére with thiol· disulfide iníerchangc upon vims-reccptor interaction. Proč Nati Acad Sci USA 91(1 QV. 4559-63.

Ryan, K. A., L. A Ganaway, et al (1993). Isolation of virolence genes direetmg surfecc glyw^ybphosphaúdyli nositel syn&esis by functicmal complementafion of Leishmania. P&c Nad Acad SdUSA90f 181.· 8609-13.

Sacks, D. 1., G. Módi, et al. (2000). The role of phosphoglycans in leishmania -sand fly interactions. Proč Nad Acad Sci USA 97(1): 406-11.

Sázet, P. ML, X. Chen, et aL (1997). Leishmania major molecular model íng of cysteine proteases and prodiction of newnon peptide inhib itors. Exp Px^itoI87(3)·' 212-21.

Sharifi, L, A. R. FeKri, et aL (1998). Randomised vaccine trial of single dose ofkilled Leishmania major plus BCG against anthroponotic eutaneous leišhnwniasis in Bam, Iron. Lancet 351(9115):1540-3.

Spaíh, G. F., L.Epstein, eí al. (2000). Lipopliosphoglycan is a virolence fector distínct &om rdaícd glycoconjugates in theprotezoan parasite Leishmania major. ProcNattAcad ScilJSA,

97(16): 9258-63.

Šírat, J. A., T. J. Recker, et al (2001). Protective inununity against the pratozoan Leishmania chagasi is induced by subdinieal cutaneous infectíon with viraleri but not avimlent organisms. /Immunol 66(3): 1921-9.

Tilus, JR. G, F. J. Gueiros-Filho, et aL (1995), Ďevclopment of a safe tíve lastunaflia vaccinc line by gene Teplacanent. ProcWaU AcadSáU S A 92(22): 10267-71.

Wang, Y., E. S. Bjes, ct al, (2000). Molecular aspects of complement- mediatod bacterial killrag. Penplasmic conversion of C9 ftom a protoxin to á toxin. J Biol Chem 275(7): 4687-92.

Wiesft Μ. (1995). A mitogen-activalcd protein (MAP) Jdnasc homoíoguc of Leishmania mexicana is cssential for parasite survival in the infected host. Embo 117(9): 2619-28.

Yu, J. (1998). Inactívation of DsbA, but not DsbC and DsbD, affects the intracellular survival and vimlence of Shigella flexneri. Tnfect hnmun 66(8): 3909-17.

Yu, 3., B, Edwanis-Jbnes, et al. (2000). Key role fot DsbA in cdl-to-cdl spread of Shigella flexneri, pemúttmg secretkm of Ipa proteins into inlerepithelial protrusions. Tnfect Irormig 68(11):6449-56.

Yu, J. and J. S. Kroll (1999). DsbA: aproteiu-ibldíng catalystconlributingto bacterial vinileooe.” Mkstobas Tnfect 1(14): 1221-8.

Yu, J„ H. Webb, et al. (1992). A homologae of flie Escherichia coli DsbA protein involved in disulphide bond fonnation is requiied for enterotoxin bfogene&is in Vibrio choksae.” Mol Microbiol 6(14): 1949- 58.

Zhang, H. Z. and M. S. Donnenberg (1996). DsbA is required for stability of the type IV pilin of cnteropathogcnic escherichia coli. Mol Microbiol 21(41:787-97.

Zhang, W. W. and & Matlashewski (1997> Loss of virulcncc in Leishmania donovani deficient in .an amastígote- specific protein, A2. Proč Nati Acad Sci US A_94(1.6): 8807-11.

• · · · · · · • · · · · · • · · · ····· • · · · · • · ···· ·· ·

Seznam sekvencí <210> 1 <211> 2094 <212> DNA <213> Leishmania major <220>

<221> CDS <222> (241).. (1674) <223> Kódující sekvence (orf) LmPDI <400> 1 ggcaccagcg gcaccagagt ttctgtactt tattgtcttt ctctattcta cccacacttg 60 cctctctgcg ctctctgtgc ctgtgcgggc gcgcaacgtg cotttctctc cgtattgccc 120 agctgtgagc tgctgcctac tggcaacgtg tacgccattc ccgtttcttg attctggtgc ISO agtgctcagc tctacoctat ttgtattgat accgttttcc ttttcgtttfe gcaaagaaaa 240

atg Met 1

cag cgc tea ttc ctt

gtt ttt

gtt ctg tgc gcc ctt

ctc ttc tgc Leu Phe Cys 15

288

Gin

Arg

Ser

Phe 5

Leu

Val

Phe

Val

Leu 10

Cys

Ala

Leu

gtc

gcg

tcc

gca

gag

gtg

cag

gtg

gcc

act

aag

gac

aac

ttt

gac

aag

336

Val

Ala

Sex

Ala

Glu

Val

Gin Val

Ala Thr

Lys

Asp

Asn

Phe

Asp

Lys

20

25

30

gtc

gta

atc

ggg

gat

ctc

acg

ttg

gtc

aag

ttt

tat

gct

ccg

tgg

tgc

384

Val

Val

lle

Gly Asp

Leu

Thr

Leu

val

Lys

Phe

Tyr

Ala

Pro

Trp

Cys

35

40

45

ggc

cac

tgc

aag

aca

ctc

gcc

ccg

gag

ttt

gta

aag

gcc

gct

gac

atg

432

Gly His

Cys

Lys

Thr

Leu

Ala

Pro

Glu

Phe

Val

Lys

Ala Ala

Asp

Met

•

50

55

60

ctg

gcc

ggc

atc

gcg

acc

ctt

gca

gag

gtc

gat

tgc

acc

aaa

gaa

gag

480

Leu

Ala

Gly

lle

Ala

Thr

Leu

Ala

Glu

Val

Asp

Cys

Thr Lys

Glu

Glu

65

70

75

80

• · · » · ·

	50	•	• • < • ·	• • · • >	B · B · B · • ·	• • • »· · ·	• · · · • · · · · · ·
• · • ·	« •
aqc ctt gct gag aag	tac gaa atc aag ggg	ttc	ccc	acg	ctg	tac	atc	528
Ser Leu Ala Glu Lys	Tyr Glu Ile Lys Gly	Phe	Pro	Thr	Leu	Tyr	Ile
85	90					95
ttc cgt aac ggt gag	aaa gtg aag atc tac	gat	ggt	ccc	cgc	act	gcc	576
Phe Arg Asn Gly Glu	Lys Val Lys Ile Tyr Asp	Gly	Pro	Arg	Thr	Ala
100	105				110
gcc ggc atc gcg tcg	tac atg aag gcg cat	gtc	ggt	cca	tcg	atg	aag	624
Ala Gly Ile Ala Ser	Tyr Met Lys Ala His	val	Gly	Pro	Ser	Met	Lys
115	120			125
gcc atc tca acg gct	gaa gag ctg gag gag	ctc	aag	aag	gag	act	ttc	672
Ala Ile Ser Thr Ala	Glu Glu Leu Glu Glu	Leu	Lys	Lys	Glu	Thr	Phe
130	135		140			-
ccg gtg tgc gtg gtg	aag aca gcg age acc	gac	tcg	gag	atg	gcg	tcg	720
Pro Val Cys Val Val	Lys Thr Ala Ser Thr	Asp	Ser	Glu	Met	Ala	Ser
145	150	155					160
atg ata acc aag gtg	gcg gac tet ctc cgc	tcg	cag	atg	aac	ttt	gtg	768
Met Ile Thr Lys Val	Ala Asp Ser Leu Arg	Ser	Gin	Met	Asn	Phe	Val
165	170					175
ctc gtg acg gat gcg	gcc atc tet ccg aat	gat	gcc	atg	gag	tcg	gtt	816
Leu -Val Thr Asp Ala	Ala Ile Ser Pro Asn	Asp	Ala	Met	Glu	Ser	Val
180	185				190
acg gtg tat cgc aag	aat gcg gag cgc gag	gcg	tac	acc	ggc	gct	aca	864
Thr Val Tyr Arg Lys	Asn Ala Glu Arg Glu	Ala	Tyr	Thr	Gly	Ala	Thr
195	200			205
cca atg acg gca gag	tcg gtg aag age ttt	ctc	acg	agt	gct	gtg	ttg	912
Pro Met Thr Ala Glu	Ser Val Lys Ser Phe	Leu	Thr	Ser	Ala	Val	Leu
210	215		220
gac tac ttt ggc gag	ctc ggc cag gag age	ttt	cag	aag	tac	atg	gaa	960
Asp Tyr Phe Gly Glu	Leu Gly Gin Glu Ser	Phe	Gin	Lys	Tyr	Met	Glu
225	230	235					240
gcg aac aag gat aaa	cct ctt ggg tgg gtg	ttc	atc	gac	aag	aac	acg	1008
Ala Asn Lys Asp Lys	Pro Leu Gly Trp Val	Phe	Ile	Asp	Lys	Asn	Thr
245	250					255
gat tet gcg ttg aag	ggg tca ctt gtg gcg	gtg	gcg	gag	aag	tac	cgc	1056
Asp Ser Ala Leu Lys	Gly Ser Leu Val Ala	Val	Ala	Glu	Lys	Tyr Arg
260	265				270
tcg cag gtg ttg cta	acc tac att gac ggc	gat	cag	tac	cgc	ccc	gtc	1104
Ser Gin Val Leu Leu	Thr Tyr Ile Asp Gly Asp	Gin	Tyr Arg	Pro	Val
275	280			285
tcg cgc cag ctg ggc	att cct gag gat gcg	aag	ttc	ccg	gcg	ttt	gtg	1152
Ser Arg Gin Leu Gly	Ile Pro Glu Asp Ala	Lys	Phe	Pro	Ala	Phe	Val
290	295		300
gtc gat ttc gag cgc	cgc cat cac gtg atg	939	acg	gac	acc	cca	gtc	1200
Val Asp .Phe Glu Arg Arg His His Val Met	Gly Thr Asp	Thr	Pro	Val
305	310	315					320

• ♦ · · · · ···· • ····· · · · · ····· • · · ·» · ··· ··· · · ·· ···· ·· ·

acc tcc gag tet	gtc get gcg ttt gtg gag aag tat gtc aag ggc gag	1248
Thr	Ser	Glu Ser	Val 325	Ala	Ala	Phe	Val Glu Lys Tyr Val Lys Gly Glu
330	335
acg	aag	cag acc	gtg	atg	tcc	gac	gcg att	ccc get aag gag acg gtg	1296
Thr	Lys	Gin Thr	Val	Met	Ser	Asp	Ala Ile	Pro Ala Lys Glu Thr Val
		340					345	350
aac	ggc	ctc aca	acg	gtg	gtg ggt	cag act	ttt gcg aag tac acg gac	1344
Asn	Gly	Leu Thr	Thr	Val	Val	Gly	Gin Thr	Phe Ala Lys Tyr Thr Asp
		355				360		365
ggc	aca	caa aac	gtg	atg	ctg	ctc	ttc tac	gcg ccg tgg tgc gga cac	1392
Gly	Thr	Gin Asn	Val	Met	Leu	Leu	Phe Tyr	Ala Pro Trp Cys Gly His
	370				375			380
tgc	aag	aag ctg	cac	ccc	gtc	tac	gat aaa	gta gcc aag age ttc gag	1440
Cyg	Lys	Lys Leu	His	Pro	Val	Tyr Asp Lys	Val Ala Lye Ser Phe Glu
385				390				395 400
tet	gag	aat gtg	atc	att	gcg	aag	atg gat	gcc acg acg aac gac ttt	1488
Ser	Glu	Asn Val	Ile	Ile	Ala	Lys	Met Asp	Ala Thr Thr Asn Asp Phe
			405				410	415
gac	ege	gag aag	ttt	gag	gtg	tet	gga ttt	cca acg att tac ttc atc	1536
Asp •‘Arg	Glu Lys	Phe	Glu	Val	Ser	Gly Phe	Pro Thr Ile Tyr Phe Ile
		420					425	430
cca	gcc	ggc aag	ccg	cca	atc	gtg	tac gag	ggt ggc ege acc gca gac	1584
Pro	Ala	Gly Lys	Pro	Pro	Ile	Val	Tyr Glu	Gly Gly Arg Thr Ala Asp
		435				440		445
gaa	atc	cag gtg	ttt	gtg	aag	tet	cac ctg	acc gcc tcc gcc get cca	1632
Glu	Ile	Gin Val	Phe	Val	Lys	Ser	His Leu	Thr Ala Ser Ala Ala Pro
	450				455			460
tet	ggc	ggc cct	tec	ggc	aac	age	gaa gag	gaa gat ttg tag	1674
Ser	Gly Gly Pro	Ser	Gly	Asn	Ser	Glu Glu	Glu Asp Leu
465				470				475

gactgcaagg gatgtggcgt ttataggctg ccctgocttc ccttgctgtt tctatgacgg 1734 attaggcttt tttttgttat atgtggggtg gtcaagagag tgccagggct ccttctttat 1794 atccttgcgc tttcttttat tttgcttcct tgtgttgacg tctatgcatg cgtgctgtcg 1854 acgactcttt gtcaacctgc gtcctatcta gtagcatcga tgtgaaaaga agagtagagg 1914 gaggtaacga tgcgtgcgct ggctgccgtt ttcatgggcg caatttcgag aaggaaaatc 1974 ggaaaatgga caggatagcg aaattagcgc aacgacaagg tcgtgcgtct ttctctatcg 2034 gtcattaaat ttctgggctt tgtaacaatg aaagaagtca cacaaaaaaa aaaaaaaaaa 2094 <210> 2 <211> 477 • · · · · · • ····· · · • · · · · ··· ·· ·· ···· <212> PRT <213> Leishmania major <400> 2

Met Gin Arg Ser Phe Leu	Val Phe	Val Leu Cys Ala Leu Leu Phe Cys
1	5	10	15
Val Ala Ser	Ala Glu Val 20	Gin Val	Ala Thr Lys Asp Asn Phe 25 30	Asp Lys
Val Val Ile 35	Gly Asp Leu	Thr Leu 40	Val Lys Phe Tyr Ala Pro 45	Trp Cys
Gly His Cys 50	Lys Thr Leu	Ala Pro 55	Glu Phe Val Lys Ala Ala 60	Asp Met
Leu Ala Gly 55	Ile Ala Thr 70	Leu Ala	Glu Val Asp Cys Thr Lys 75	Glu Glu 80
Ser Leu Ala	Glu Lys Tyr 85	Glu Ile	Lys Gly Phe Pro Thr Leu 90	Tyr Ile 95
Phe Arg Asn	Gly Glu Lys 100	Val Lys	Ile Tyr Asp Gly Pro Arg 105 110	Thr Ala
Ala Gly Ile 115	Ala Ser Tyr	Met Lys 120	Ala His Val Gly Pro Ser 125	Met Lys
Ala jíle Ser 130	Thr Ala Glu	Glu Leu 135	Glu Glu Leu Lys Lys Glu 140	Thr Phe
Pro Val Cys 145	val Val Lys 150	Thr Ala	Ser Thr Asp Ser Glu Met 155	Ala Ser 160
Met Ile Thr	Lys Val Ala 155	Asp Ser	Leu Arg Ser Gin Met Asn 170	Phe Val 175
Leu Val Thr	Asp Ala Ala 180	Ile Ser	Pro Asn Asp Ala Met Glu 185 190	Ser Val
Thr Val Tyr Arg Lys Asn 195	Ala Glu 200	Arg Glu Ala Tyr Thr Gly Ala Thr 205
Pro Met Thr 210	Ala Glu Ser	Val Lys 215	Ser Phe Leu Thr Ser Ala 220	Val Leu
Asp Tyr Phe 225	Gly Glu Leu 230	Gly Gin	Glu Ser Phe Gin Lys Tyr 235	Met Glu 240
Ala Asn Lys	Asp Lys Pro 245	Leu Gly Trp Val Phe Ile Asp Lys 250	Asn Thr 255
Asp Ser Ala	Leu Lys Gly 250	Ser Leu	Val Ala Val Ala Glu Lys 265 270	Tyr Arg
Ser Gin Val 275	Leu Leu Thr	Tyr Ile 280	Asp Gly Asp Gin Tyr Arg 285	Pro Val
Ser Arg Gin 290	Leu Gly Ile	Pro Glu 295	Asp Ala Lys Phe Pro Ala 300	Phe Val

• · v ·· · ···· • ····· » · * · ····· • · · · · · · · «·· · · ·· · ··· · · ·

Val 305	Asp Phe	Glu	Arg	Arg His His Val Met Gly Thr Asp Thr Pro Val
310	315	320
Thr	Ser Glu	Ser	Val	Ala	Ala Phe Val Glu Lys	Tyr Val Lys Gly Glu
			325		330	335
Thr	Lys Gin	Thr	Val	Met	Ser Asp Ala Ile Pro	Ala Lys Glu Thr Val
		340			345	350
Asn	Gly Leu	Thr	Thr	Val	Val Gly Gin Thr Phe	Ala Lys Tyr Thr Asp
	355				360	365
Sly	Thr Gin	Asn	Val	Met	Leu Leu Phe Tyr Ala	Pro Trp Cys Gly His
	370				375	380
Cys	Lys Lys	Leu	His	Pro	Val Tyr Asp Lys Val	Ala Lys Ser Phe Glu
385				390	395	400
Ser	Glu Asn	Val	Ile	Ile	Ala Lys Met Asp Ala	Thr Thr Asn Asp Phe
			405		410	415
Asp Arg Glu	Lys	Phe	Glu	Val Ser Gly Phe Pro	Thr Ile Tyr Phe Ile
		420			425	430
Pro	Ala Gly Lys	Pro	Pro	Ile Val Tyr Glu Gly Gly Arg Thr Ala Asp
	435				440	445
Glu	Ile Gin Val	Phe	Val	Lys Ser His Leu Thr Ala Ser Ala Ala Pro
	450				455	460
Ser	Gly Gly Pro	Ser	Gly	Asn Ser Glu Glu Glu Asp Leu

465 470 475 <210> 3 <211> 467 <212> PRT <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: rekombinantní protein <400> 3

Met 1

Ala

Glu

Val

Gin 5

Val

Ala

Thr

Lys

Asp 10

Asn

Phe

Asp

Lys

Val 15

Val

Ile

Gly Asp

Leu 20

Thr

Leu

Val

Lys

Phe 25

Tyr

Ala

Pro

Trp

Cys 30

Gly

His

Cys

Lys

Thr 35

Leu

Ala

Pro

Glu

Phe 40

Val

Lys

Ala

Ala

Asp 45

Met

Leu

Ala

Gly

Ile 50

Ala

Thr

Leu

Ala

Glu 55

Val

Asp

cys

Thr

Lys 60

Glu

Glu

Ser

Leu

Ala 65

Glu

Lys

Tyr

Glu

Ile 70

Lys

Gly

Phe

Pro

Thr 75

Leu

Tyr

Ile

Phe

Arg 80

• · • · • · ··· · ♦ * ···· • ····· · · ·· ····· • · · · · ··· «···» ·»···· ·· ·

Asn Gly Glu. Lys	Val 85	Lys	lle Tyr Asp Gly Pro Arg Thr Ala Ala Gly
90	95
lle Ala Ser Tyr 100	Met	Lys	Ala His Val Gly 105	Pro Ser Met Lys Ala lle 110
Ser Thr Ala Glu 115	Glu	Leu	Glu Glu Leu Lys 120	Lys Glu Thr Phe Pro Val 125
Cye Val Val Lys 130	Thr	Ala	Ser Thr Asp Ser 135	Glu Met Ala Ser Met lle 140
Thr Lys Val Ala 145	Asp	Ser 150	Leu Arg Ser Gin	Met Aen Phe Val Leu Val 155 160
Thr Asp Ala Ala	lle 165	Ser	Pro Asn Asp Ala 170	Met Glu Ser Val Thr Val 175
Tyr Arg Lys Asn 180	Ala	Glu	Arg Glu Ala Tyr 185	Thr Gly Ala Thr Pro Met 190
Thr Ala Glu Ser 195	Val	Lys	Ser Phe Leu Thr 200	Ser Ala Val Leu Asp Tyr 205
Phe Gly Glu Leu 210	Gly	Gin	Glu Ser Phe Gin 215	Lys Tyr Met Glu Ala Asn 220
Lys Asp Lys Pro 225	Leu	Gly Trp Val Phe lle 230	Asp Lys Asn Thr Asp Ser 235 . 240
Ala Leu Lys Gly	Ser 245	Leu	Val Ala Val Ala 250	Glu Lys Tyr Arg Ser Gin 255
Val Leu Leu Thr 260	Tyr	lle	Asp Gly Asp Gin 265	Tyr Arg Pro Val Ser Arg 270
Gin Leu Gly lle 275	Pro	Glu	Asp Ala Lys Phe 280	Pro Ala Phe Val Val Asp 285
Phe Glu Arg Arg 290	His	Hie	Val Met Gly Thr 295	Asp Thr Pro Val Thr Ser 300
Glu Ser Val Ala 305	Ala	Phe 310	Val Glu Lys Tyr	Val Lys Gly Glu Thr Lys 315 320
Gin Thr Val Met	Ser 325	Asp	Ala lle Pro Ala 330	Lys Glu Thr Val Asn Gly 335
Leu Thr Thr Val 340	Val	Gly	Gin Thr Phe Ala 345	Lys Tyr Thr Asp Gly Thr 350
Gin Asn Val Met 355	Leu	Leu	Phe Tyr Ala Pro 360	Trp Cys Gly His Cys Lys 365
Lys Leu His Pro 370	Val	Tyr Asp Lys Val Ala 375	Lys Ser Phe Glu Ser Glu 380
Asn val lle lle 385	Ala	Lys Met Asp Ala Thr 390	Thr Asn Asp Phe Asp Arg 395 400

• ···· ··· «·· · · ·» · · · > » » *

Glu Lys Phe Glu Val	Ser Gly Phe Pro Thr lle Tyr Phe lle Pro Ala
	405	410	415
Gly Lys	Pro Pro lle	Val Tyr Glu Gly Gly Arg Thr Ala	Asp Glu lle
	420	425	430
Gin Val	Phe Val Lys	Ser His Leu Thr Ala Ser Ala Ala	Pro Ser Gly
	435	440 445
Gly Pro	Ser Gly Asn	Ser Glu Glu Glu Asp Leu Leu Glu	His His His
450		455 460
His His	His
465
<210>	4
<211>	497
<212>	PRT
<213>	T. brucei

<400> 4

Met Arg 1	Ala lle Phe 5	Leu Val Ala Leu	Ala Leu Ala Thr Met Arg Glu
10	15
Ser Thr	Ala Glu Ser 20	Leu Lys Leu Thr 25	Lys Glu	Asn Phe Asn Glu Thr 30
lle Ala	Lys Ser Glu 35	lle Phe Leu Val 40	Lys Phe	Tyr Val Asp Thr Cys 45
Gly Tyr 50	Cys Gin Met	Leu Ala Pro Glu 55	Trp Glu	Lys Ala Ala Asn Glu 60
Thr lle 65	Asp Asn Ala	Leu Met Gly Glu 70	Val Asp 75	Cys His Ser Gin Pro 80
Glu Leu	Ala Ala Asn 85	Phe Ser lle Arg Gly Tyr 90	Pro Thr lle lle Leu 95
Phe Arg	Asn Gly Lys 100	Glu Ala Glu His 105	Tyr Gly Gly Ala Arg Thr Lys 110
Asp Asp	lle lle Lys 115	Tyr lle Lys Ala 120	Asn Val	Gly Pro Ala Val Thr 125
Pro Ala 130	Ser Asn Ala	Glu Glu Val Thr 135	Arg Ala	Lys Glu Glu His Asp 140
Val Val 145	Cys Val Gly	Leu Thr Ala Asn 150	Asn Ser 155	Thr Ser Leu Ser Thr 160
Thr Leu	Ala Glu Ala 165	Ala Gin Ser Phe	Arg Val 170	Ser Leu Lys Phe Phe 175
Glu Ala	Glu Pro Lys 180	Leu Phe Pro Asp 185	Glu Lys	Pro Glu Thr lle Val 190

·· · · ·· «·· « 9 · · » · · * · * • ····· · · » · ····· • ···« ··· • · · · · · · «··· ·· ·

Val Tyr Arg Lys	Gly Gly Glu Lys Glu Val Tyr Asp Gly Pro Met Glu
	195	200	205
Val Glu 210	Lys Leu	Thr Glu Phe Leu Gin 215	Ile Ser Arg Val Ala Phe Gly 220
Gly Glu 225	Ile Thr	Pro Glu Asn Tyr Gin 230	Tyr Tyr Ser Val Ile Lys Arg 235 240
Pro Val	Gly Trp	Ala Met Val Lys Pro 245	Asn Glu Thr Ala Ser Ile Glu 250 255
Leu Lys	Glu Ser 260	Leu Thr Glu Val Gly Lys Lys Met Arg Ser His Met 265 270
Val Val	Leu Trp 275	Val Asn Ile Ser Lys 280	His Pro Val Trp Arg Asp Phe 285
Gly Val 290	Pro Glu	Asp Ala Lys Tyr Pro 295	Ala Phe Leu Ala Ile His Trp 300
Gly Ala 305	Asn Tyr	Leu His Ser Thr Ala 310	Glu Val Val Thr Arg Glu Ser 315 320
Leu Glu	Lys Phe	Ile Leu Glu Phe Ala 325	Ala Gly Arg Val Glu Pro Thr 330 335
Ile Lys	Ser Leu 340	Pro Val Pro Glu Val 345	Glu Thr Val Asp Gly Lys Thr 350
Thr Ile	Val Ala 355	Lys Thr Met Gin Lys 360	His Leu Thr Ser Gly Lys Asp 365
Met Leu 370	Ile Leu	Phe Phe Ala Pro Trp 375	Cys Gly His Cys Lys Asn Phe 380
Ala Pro 385	Thr Phe	Asp Lys Ile Ala Lys 390	Glu Phe Asp Ala Thr Asp Leu 395 400
Ile Val	Ala Glu	Leu Asp Ala Thr Ala 405	Asn Tyr Val Asn Ser Ser Thr 410 415
Phe Thr	Val Thr 420	Ala Phe Pro Thr Val 425	Phe Phe Val Pro Asn Gly Gly 430
Lys Pro	Val Val 435	Phe Glu Gly Glu Arg 440	Ser Phe Glu Asn Val Tyr Glu 445
Phe Val 450	Arg Lys	His Val Thr Thr Phe 455	Lys Val Ser Glu Lys Pro Ala 460
Asn Val 465	Thr Glu	Glu Lys Lys Ser Glu 470	Glu Glu Asn Lys Ser Ser Lys 475 480
Ser Asn	Glu Ser	Asn Asp Ser Asn Glu 485	Ser Asn Val Asp Lys Gin Asp 490 495

Leu <210> 5 <211> 502 <212> PRT <213> H. jecorina

<400> S	Thr Ala Ala Leu Val Ala Ala Leu Ala Ala
Met 1	Gin Gin Lys	Arg 5	Leu
10	15
Val	Val Ser Ala 20	Glu	Ser	Asp Val Lys Ser Leu Thr 25	Lys Asp Thr Phe 30
Asn	Asp Phe Ile 35	Asn	Ser	Asn Asp Leu Val Leu Ala 40	Glu Ser Phe Ala 45
Pro	Trp Cys Gly 50	His	Cys	Lys Ala Leu Ala Pro Glu 55 60	Tyr Glu Glu Ala
Ala 65	Thr Thr Leu	Lys	Asp 70	Lys Ser Ile Lys Leu Ala 75	Lys Val Asp Cys 80
Val	Glu Glu Ala	Asp 85	Leu	Cys Lys Glu His Gly Val 90	Glu Gly Tyr Pro 95
Thr.	,Leu Lys Val 100	Phe	Arg	Gly Leu Aep Lys Val Ala 105	Pro Tyr Thr Gly 110
Pro	Arg Lys Ala 115	Asp	Gly	Ile Thr Ser Tyr Met Val 120	Lys Gin Ser Leu 125
Pro	Ala Val Ser 130	Ala	Leu	Thr Lys Asp Thr Leu Glu 135 140	Asp Phe Lys Thr
Ala 145	Asp Lys Val	Val	Leu 150	Val Ala Tyr Ile Ala Ala 155	Asp Asp Lys Ala 160
Ser	Asn Glu Thr	Phe 165	Thr·	Ala Leu Ala Asn Glu Leu 170	Arg Asp Thr Tyr 175
Leu	Phe Gly Gly 180	Val	Asn	Asp Ala Ala Val Ala Glu 185	Ala Glu Gly Val 190
Lys	Phe Pro Ser 195	Ile	Val	Leu Tyr Lys Ser Phe Asp 200	Glu Gly Lys Asn 205
Val	Phe Ser Glu 210	Lys	Phe	Asp Ala Glu Ala Ile Arg 215 220	Asn Phe Ala Gin
Val 225	Ala Ala Thr	Pro	Leu 230	Val Gly Glu Val Gly Pro 235	Glu Thr Tyr Ala 240
Gly Tyr Met Ser	Ala 245	Gly	Ile Pro Leu Ala Tyr Ile ' 250	Phe Ala Glu Thr 255
Ala	Glu Glu Arg 260	Glu	Asn	Leu Ala Lys Thr Leu Lys 265	Pro Val Ala Glu 270

··· ·» · ···· « ····· » · ·· ···· • ···· ··· ··· ·· ·· ···· ·· ·

Lys Tyr	Lys Gly 275	Lys Ile Asn Phe Ala Thr Ile Asp Ala Lys Asn Phe
280	285
Gly Ser	His Ala	Gly Asn Ile Asn	Leu Lys Thr Asp Lys Phe Pro Ala
290		295	300
Phe Ala	Ile His	Asp Ile Glu Lys	Asn Leu Lys Phe Pro Phe Asp Gin
305		310	315 320
Ser Lys	Glu Ile	Thr Glu Lys Asp	Ile Ala Ala Phe Val Asp Gly Phe
		325	330 335
Ser Ser	Gly Lys	Ile Glu Ala Ser	Ile Lys Ser Glu Pro Ile Pro Glu
	340.		345 350
Thr Gin	Glu Gly	Pro Val Thr Val	Val Val Ala His Ser Tyr Lys Asp
	355	350	355
Ile Val	Leu Asp	Asp Lys Lys Asp	Val Leu Ile Glu Phe Tyr Thr Pro
370		375	380
Trp Cys	Gly His	Cys Lys Ala Leu	Ala Pro Lys Tyr Asp Glu Leu Ala
385		390	395 400
Ser Leu	Tyr Ala	Lys Ser Asp Phe	Lys Asp Lys Val Val Ile Ala Lys
Λ		405	410 415
Val Asp	Ala Thr	Ala Asn Asp Val	Pro Asp Glu Ile Gin Gly Phe Pro
	420		425 430
Thr Ile	Lys Leu	Tyr Pro Ala Gly Asp Lys Lys Asn Pro Val Thr Tyr
	435	440	445
Ser Gly	Ala Arg	Thr Val Glu Asp	Phe Ile Glu Phe Ile Lys Glu Asn
450		455	460
Gly Lys	Tyr Lys	Ala Gly Val Glu	Ile Pro Ala Glu Pro Thr Glu Glu
455		470	475 480
Ala Glu	Ala Ser	Glu Ser Lys Ala	Ser Glu Glu Ala Lye Ala Ser Glu
		485	490 495
Glu Thr	His Asp	Glu Leu

500 <210> 6 <211> 488 <212> PRT <213> C. elegans <400> 6

Met Ile Trp Val Gin	Ala Ala	Leu Val Ala Ser Phe Leu Ala Phe Ala
1	5	10	15
Ser Ala Gly Gly	Ala	Val Leu	Glu	Tyr	Thr	Asp	Gly Asn	Phe	Asp Asp
20				25				30

« · · · · · · · w ····· · · ·· ·····

	59	• · · · ·	• · · · · ·
Leu Ile Gin Thr His Asp Ile Ala Leu 35 40	Val	Lys Phe Tyr 45	Ala Pro Trp
Cys Gly His Cys Lys Lys Ile Ala Pro 50 55	Glu	Tyr Glu Arg 60	Ala Ala Pro
Lys Leu Ala Ser Asn Asp Pro Pro Val 65 70	Ala	Leu Val Lys 75	Val Asp Cys 80
Thr Thr Glu Lys Thr Val Cys Asp Lys 85	Phe 90	Gly Val Lys	Gly Phe Pro 95
Thr Leu Lys Ile Phe Arg Asn Gly Val 100 105	Pro	Ala Gin Asp	Tyr Asp Gly 110
Pro Arg Asp Ala Asp Gly Ile Val Lys 115 120	Phe	Met Arg Gly 125	Gin Ser Gly
Pro Ser Ser Lys Glu Leu Lys Thr Val 130 135	Ala	Glu Phe Glu 140	Lys Phe Thr
Gly Gly Asp Glu Asn Val Val Ile Gly 145 150	Phe	Phe Glu Ser 155	Glu Ser Lys 160
Leu Lys Asp Ser Tyr Leu Lys Val Ala 165	Asp 170	Thr Glu Arg Asp Arg Phe 175
Ser Phe Ala His Thr Ser Asn Lys Asp 180 185	Ile	Ile Lys Lys	Ala Gly Tyr 190
Ser Asp Asp Val Val Val Phe Val Pro 155 200	Lys	Lys Leu His 205	Asn Lys Phe
Asp Thr Asn Glu Phe Lys Tyr Asp Gly 210 215	Asn	Tyr Asp Thr 220	Asp Lys Ile
Lys Asn Phe Leu Val His Glu Thr Val 225 230	Gly	Phe Ala Gly 235	Ile Arg Thr 240
Gin Gly Asn Leu Phe Gin Phe Glu Gin 245	Lys 250	Pro Ile Val	Ile Val Tyr 255
Tyr Asn Val Asp Tyr Val Lys Asp Pro 260 265	Lys	Gly Ser Asn	Tyr Trp Arg 270
Asn Arg Val Leu Lys Val Ala Gin Asn 275 2B0	Tyr	Lys Arg Lys 285	Val Gin Phe
Ala Val Ser Asn Lys Glu Glu Phe Ser 290 295	Ser	Glu Ile Glu 300	Thr Asn Gly
Leu Gly Glu Arg Lys Asp Ser Asp Lys 305 310	Pro	Ile Val Ala 315	Ile Leu Thr 320
Asn Glu Gly Lys Tyr Pro Met Asp Gin 325	Glu 330	Phe Ser Val	Asp Asn Leu 335
Gin Gin Phe Val Asp Glu Val Leu Ala 340 345	Gly	Asn Ala Glu	Pro Tyr Met 350

Lys Ser

Glu 355

Pro

Xle

Pro Asp Glu 360

Gin

Gly Asp

Val

Lys Val 365

Ala

Val

Gly Lye 370

Asn

Phe

Lys

Glu Leu Xle 375

Met

Asp

Ala

Asp 380

Lys Asp

Val

Leu

Ile Glu 385

Phe

Tyr

Ala

Pro Trp Cys 390

Gly

His

Cys 395

Lys

Ser

Leu

Ala

Pro 400

Lys Tyr

Glu

Glu

Leu 405

Ala Glu Lys

Leu

Asn 410

Lys

Glu

Asp

Val

Xle 415

Ile

Ala Lys

Met

Asp 420

Ala

Thr Ala Asn

Asp 425

Val

Pro

Pro

Met

Phe 430

Glu

Val

Arg Gly

Phe 435

Pro

Thr

Leu Phe Trp 440

Leu

Pro

Lys

Asn

Ala 445

Lys

Ser

Asn

Pro Xle 450

Pro

Tyr

Asn

Gly Gly Arg 455

Glu

Val

Lys

Asp 460

Phe

Val

Ser

Phe

Ile Ser 465

Lys

His

Ser

Thr Asp Gly 470

Leu

Lys Gly 475

Phe

Ser

Arg Asp

Gly 480

Lys Lys Lys Lys Lys Thr Glu Leu 485 <210> 7 <211> 532 <212> PRT <213> C. reinhard <400> 7

Met Asn Arg Trp Asn Leu Leu Ala Leu Thr Leu Gly Leu Leu Leu Val 1 5 10 15

Ala Ala Pro Phe Thr Lys' His Gin Phe Ala His Ala Ser Asp Glu Tyr 20 25 30

Glu Asp Asp Glu Glu Asp Asp Ala Pro Ala Ala Pro Lys Asp Asp Asp 35 40 45

Val Asp Val Thr Val Val Thr Val Lys Asn Trp Asp Glu Thr Val Lys 50 55 60

Lys Ser Lys Phe Ala Leu Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His 65 70 75 80

Cys Lys Thr Leu Lys Pro Glu Tyr Ala Lys Ala Ala Thr Ala Leu Lys 85 90 95

Ala Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ile Ala Lys Val Asp Ala Thr Gin Glu 100 105 110

Glu Ser Leu Ala Gin Lys Phe Gly Val Gin Gly Tyr Pro Thr Leu Lys 115 120 125 ··· ·· · ···· • ····· · · · · · ··· · • · · · · ··« • ·· · · ·* ···· ·· ·

Trp Phe	Val	Asp Gly Glu	Leu Ala Ser Asp Tyr Asn Gly Pro Arg Asp
	130	135	140
Ala	Asp	Gly	Ile Val Gly Trp Val Lys Lys	Lys Thr Gly Pro Pro Ala
145			150		155 160
Val	Thr	Val	Glu Asp Ala Asp Lys Leu Lys	Ser Leu Glu Ala Asp Ala
			165	170	175
Glu Val	Val	Val Val Gly Tyr Phe Lys Ala	Leu Glu Gly Glu Ile Tyr
			180	185	190
Asp	Thr	Phe	Lys Ser Tyr	Ala Ala Lys Thr	Glu Asp Val Val Phe Val
		195		200	205
Gin	Thr	Thr	Ser Ala Asp	Val Ala Lys Ala	Ala Gly Leu Asp Ala Val
	210			215	220
Asp	Thr	Val	Ser Val Val	Lys Asn Phe Ala	Gly Glu Asp Arg Ala Thr
225			230		235 240
Ala	Val	Leu	Ala Thr Asp	Ile Asp Thr Asp	Ser Leu Thr Ala Phe Val
			245	250	255
Lys	Ser	Glu	Lys Met Pro	Pro Thr Ile Glu	Phe Asn Gin Lys Asn Ser
	_·		260	265	270
Asp	Lys	Ile	Phe Asn Ser	Gly Ile Asn Lys	Gin Leu Ile Leu Trp Thr
		275		280	285
Thr Ala	Asp Asp Leu Lys	Ala Asp Ala Glu	Ile Met Thr Val Phe Arg
	290			295	300
Glu Ala	Ser Lys Lys Phe	Lys Gly Gin Leu	Val Phe Val Thr Val Asn
305			310		315 320
Asn Glu	Gly Asp Gly Ala Asp Pro Val Thr	Asn Phe Phe Gly Leu Lys
			325	330	335
Gly Ala	Thr	Ser Pro Val	Leu Leu Gly Phe	Phe Met Glu Lys Asn Lys
			340	345	350
Lys	Phe	Arg	Met Glu Gly	Glu Phe Thr Ala	Asp Asn Val Ala Lys Phe
		355		360	365
Ala	Glu	Ser	Val Val Asp	Gly Thr Ala Gin	Ala Val Leu Lys Ser Glu
	370			375	380
Ala	Ile	Pro	Glu Asp Pro	Tyr Glu Asp Gly Val Tyr Lys Ile Val Gly
385			390		395 400
Lys	Thr	Val	Glu Ser Val	Val Leu Asp Glu	Thr Lys Asp Val Leu Leu
			405	410	415
Glu	Val	Tyr	Ala Pro Trp	Cys Gly His Cys	Lys Lys Leu Glu Pro Ile
			420	425	430
Tyr Lys	Lys	Leu Ala Lys	Arg Phe Lys Lys	val Asp Ser Val Ile Ile
		435		440	445

<210>	8
<211>	496
<212>	PRT
<213>	D. melano
<40Q>	8

Het 1	Lys Phe	Leu lle 5	Cys Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Tyr Val Ala
10	15
Ala	Ser Ala	Glu Ala 20	Glu Val Lys Val Glu 25	Glu Gly Val Leu Val Ala 30
Thr	Val Asp 35	Asn Phe	Lys Gin Leu lle Ala 40	Asp Asn Glu Phe Val Leu 45
Val	Glu Phe 50	Tyr Ala	Pro Trp Cys Gly His 55	Cys Lys Ala Leu Ala Pro 60
Glu 65	Tyr Ala	Lys Ala	Ala Gin Gin Leu Ala 70	Glu Lys Glu Ser Pro lle 75 80
Lys	Leu Ala	Lys Val 85	Asp Ala Thr Val Glu 90	Gly Glu Leu Ala Glu Gin 95
Tyr	Ala Val	Arg Gly 100	Tyr Pro Thr Leu Lys 105	Phe Phe Arg Ser Gly Ser 110
Pro	Val Glu 115	Tyr Ser	Gly Gly Arg Gin Ala Ala Asp lle lle Ala Trp 120 125
Val	Thr Lys 130	Lys Thr	Gly Pro Pro Ala Lys Asp Leu Thr Ser Val Ala 135 140
Asp 145	Ala Glu	Gin Phe	Leu Lys Asp Asn Glu 150	lle Ala lle lle Gly Phe 155 160
Phe	Lys Asp	Leu Glu 165	Ser Glu Glu Ala Lys 170	Thr Phe Thr Lys Val Ala 175

Asn. Ala Leu Asp Ser Phe Val Phe Gly Val Ser Ser Asn Ala Asp Val
	180	185	190
Ile Ala Lys 195	Tyr Glu Ala	Lys Asp Asn 200	Gly Val Val Leu Phe Lys Pro 205
Phe Asp Asp 210	Lys Lys Ser	Val Phe Glu 215	Gly Glu Leu Asn Glu Glu Asn 220
Leu Lys Lys 225	Phe Ala Gin 230	Val Gin Ser	Leu Pro Leu Ile Val Asp Phe 235 240
Asn His Glu	Ser Ala Ser ‘ 245	Lys Ile Phe	Gly Gly Ser Ile Lys Ser His 250 255
Leu Leu Phe	Phe Val Ser 260	Arg Glu Gly Gly His Ile Glu Lys Tyr Val 265 270
Asp Pro Leu 275	Lys Glu Ile	Ala Lys Lys 280	Tyr Arg Asp Asp Ile Leu Phe 285
Val Thr Ile 290	Ser Ser Asp	Glu Glu Asp 295	His Thr Arg Ile Phe Glu Phe 300
Phe Gly Met 305	Asn Lys Glu 310	Glu Val Pro	Thr Ile Arg Leu Ile Lys Leu 315 320
.5 Glu Glu Asp	Met Ala Lys 325	Tyr Lys Pro	Glu Ser Asp Asp Leu Ser Ala 330 335
Glu Thr Ile	Glu Ala Phe 340	Leu Lys Lys 345	Phe Leu Asp Gly Lys Leu Lys 350
Gin Eis Leu 355	Leu Ser Gin	Glu Leu Pro 360	Glu Asp Trp Asp Lys Asn Pro 365
Val Lys Val 370	Leu Val Ser	Ser Asn Phe 375	Glu Ser Val Ala Leu Asp Lys 380
Ser Lys Ser 385	Val Leu Val 390	Glu Phe Tyr	Ala Pro Trp Cys Gly His Cys 395 400
Lys Gin Leu	Ala Pro Ile 405	Tyr Asp Gin	Leu Ala Glu Lys Tyr Lys Asp 410 415
Asn Glu Asp	Ile Val Ile 420	Ala Lys Met 425	Asp Ser Thr Ala Asn Glu Leu 430
Glu Ser Ile 435	Lys Ile Ser	Ser Phe Pro 440	Thr Ile Lys Tyr Phe Arg Lys 445
Glu Asp Asn 450	Lys Val Ile	Asp Phe Asn 455	Leu Asp Arg Thr Leu Asp Asp 460
Phe Val Lys 465	Phe Leu Asp 470	Ala Asn Glý	Glu Val Ala Asp Ser Glu Pro 475 480
Val Glu Glu	Thr Glu Glu 485	Glu Glu Glu Ala Pro Lys Lys Asp Glu Leu 490 495

• · ·« · » · · ·« • · · · · · •·· ·· ·· ···· ·· <210> 9 <211> 481 <212> PRT <213> C. parvum <400> 9

Met Ile Gly Xle Arg Ser Leu Val Ser Ala Ala Phe Leu Gly Phe Ser
1	5	10	15
cys	Leu Ser Lys Val Val 20	Leu Gly Gly Asp Glu Ala His Phe Ile Ser 25 30
Glu	His Ile Thr Ser Leu 35	Thr Ser Ser Asn Phe 40	Glu Asp Phe Ile Lye 45
Ser	Lys Glu His Val Ile 50	Val Thr Phe Phe Ala 55	Pro Trp Cys Gly His 60
Cys 65	Thr Ala Leu Glu Pro 70	Glu Phe Lys Ala Thr 75	Cys Ala Glu Ile Ser 80
Lys	Leu Ser Pro Pro Val 85	His Cys Gly Ser Val 90	Asp Ala Thr Glu Asn 95
Met	Glu Leu Ala Gin Gin 100	Tyr Gly Val Ser Gly Tyr Pro Thr Ile Lys 105 110
Phe	Phe Ser Gly Ile Asp 115	Ser Val Gin Asn Tyr 120	Ser Gly Ala Arg Ser 125
Lys	Asp Ala Phe Ile Lys 130	Tyr Ile Lys Lys Leu 135	Thr Gly Pro Ala Val 140
Gin Val Ala Glu Ser Glu 145 150	Glu Ala Ile Lys Thr 155	Ile Phe Ala Ser Ser 160
Ser	Ser Ala Phe Val Gly Arg Phe Thr Ser Lys 165 170	Asp Ser Ala Glu Tyr 175
Ala	Val Phe Glu Lys Val ISO	Ala Ser Gly His Arg 185	Glu His Asn Tyr Ala 190
Phe	Ile Ala Phe Phe Gin 195	Glu Gly Glu Gin Lys 200	Leu Glu Val Leu His 205
Lys	Asp Glu Glu Pro Val 210	Ser Leu Pro Met Pro 215	Lys Thr Val Glu Glu 220
Leu	Glu Ala Lys Ile Ser	Ile Met Asn Val Pro	Leu Phe Ser Ala Ile

225 230 235 240

Ser Ala Glu Asn Tyr Ser Leu Tyr Met Ser Arg Glu Gly Tyr Thr Pro 245 250 255 • * · · « ····· « · ·· ♦ « ♦ · ·

Gly Ser Val Val Leu Thr Arg Thr Ser Pro Ser Met Leu Gin Thr Leu
	260	265	270
Glu Arg	Leu Gin Leu 275	lle Thr Glu Lys Ser 280	Met Pro Leu Phe Ser Leu 285
Asp Thr 290	Glu Gin Phe	Gly Ser His Ala Thr 295	Gin His Leu Leu lle Glu 300
Lys Phe 305	Pro Gly Leu	Val lle Gin Ser Val 310	Asn Val Pro Ser Xle Arg 315 320
Tyr Met	Tyr Gly Pro 325	Ala Lys Phe Asp Ser 330	Val Glu Pro Leu Lys Glu 335
Phe Met	Lys Gin Val 340	Ser Glu Gly Lys His 345	Glu Leu Ser Xle Lys Ser 350
Glu Pro	Xle Pro Ala 355	Glu Gin Ser Gly Pro 360	Val Thr Val Val Val Gly 365
Lys Thr 370	Phe Glu Glu	lle Val Phe Arg Ser 375	Asp Lys Asp Val Leu Leu 380
Glu lle 385 Λ	Tyr Ala Gin	Txp Cys Gly His Cys 390	Lys Asn Leu Glu Pro Xle 395 400
Tyr Asn	Gin Leu Gly 405	Glu Glu Tyr Lys Asp 410	Asn Asp Lys Val Val Xle 415
Ala Lys	lle Asn Gly 420	Pro Gin Asn Asp lle 425	Pro Tyr Glu Gly Phe Ser 430
Pro Arg	Ala Phe Pro 435	Thr Xle Leu Phe Val 440	Lys Ala Gly Thr Arg Thr 445
Pro lle 450	Pro Tyr Asp	Gly Lys Arg Thr Val 455	Glu Ala Phe Lys Glu Phe 460
lle Ser	Glu His Ser	Ser Phe Pro Gin Glu	Lys Glu Ser Arg Asp Glu

465	470	475	480
Leu

<210> 10 <211> 508 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Met Leu Arg Arg Ala Leu Leu Cys Leu Ala Val Ala Ala Leu Val Arg 15 10 15

Val Leu Val Leu Arg Lys Ser 30

Ala Asp Ala Pro Glu Glu Glu Asp His 20 25 ·· *» *· ·· · • . ř 9 Λ ·· · · ·· ··· · · * · · · · • ·'.·· » * · · 9 99 99

9 9 9 9 9*9

99 9 9 99 9999 9 9 ·

Asn Phe Ala	Glu Ala	Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu Phe
	35	40	45
Tyr Ala 50	Pro	Trp Cys	Gly His Cys Lys 55	Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Ala 60
Lys Ala 65	Ala	Gly Lys	Leu Lys Ala Glu 70	Gly Sex Glu lle Arg Leu Ala 75 80
Lys Val	Asp	Ala Thr 85	Glu Glu Ser Asp	Leu Ala Gin Gin Tyr Gly Val 90 95
Arg Gly Tyr	Pro Thr 100	lle Lys Phe Phe 105	Arg Asn Gly Asp Thr Ala Ser 110
Pro Lys	Glu 115	Tyr Thr	Ala Gly Arg Glu 120	Ala Asp Asp lle Val Asn Tep 125
Leu Lys 130	Lys	Arg Thr	Gly Pro Ala Ala 135	Thr Thr Leu Pro Asp Gly Ala 140
Ala Ala 145	Glu	Ser Leu	Val Glu Ser Ser 150	Glu Val Ala Val lle Gly Phe 155 160
Phe Lys	Asp	Val Glu 165	Ser Asp Ser Ala	Lys Gin Phe Leu Gin Ala Ala 170 175
Glu Ala	lle	Asp Asp 180	lle Pro Phe Gly 185	lle Thr Ser Asn Ser Asp Val 190
Phe Ser	Lys 195	Tyr Gin	Leu Asp Lys Asp 200	Gly Val Val Leu Phe Lys Lys 205
Phe Asp 210	Glu	Gly Arg	Asn Asn Phe Glu 215	Gly Glu Val Thr Lys Glu Asn 220
Leu Leu 225	Asp	Phe lle	Lys His Asn Gin 230	Leu Pro Leu Val lle Glu Phe 235 240
Thr Glu	Gin	Thr Ala 245	Pro Lys lle Phe	Gly Gly Glu lle Lys Thr Híb 250 255
lle Leu	Leu	Phe Leu 260	Pro Lys Ser Val 265	Ser Asp Tyr Asp Gly Lys Leu 270
Sec Asn	Phe 275	Lys Thr	Ala Ala Glu Ser 280	Phe Lys Gly Lys lle Leu Phe 285
lle Phe 290	lle	Asp Ser	Asp His Thr Asp 295	Asn Gin Arg lle Leu Glu Phe 300
Phe Gly 305	Leu	Lys Lys	Glu Glu Cys Pro 310	Ala Val Arg Leu lle Thr Leu 315 320
Glu Glu	Glu	Met Thr 325	Lys Tyr Lys Pro	Glu Ser Glu Glu Leu Thr Ala 330 335
Glu Arg	lle	Thr Glu 340	Phe Cys His Arg 345	Phe Leu Glu .Gly Lys lle Lys 350

• ·· ·· ·· ·· * ···» · · · · · * · • · · · » · ··*· • ·«··· · · · · 9 99 99 • · 9 9 9 9 9 9

999 99 ·« 9999 ·· *

Pro His Leu Met	Ser	Gin	Glu	Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lye Gin Pro
	355	360	365
Val Lys	Val Leu	Val	Gly Lys	Asn Phe	Glu Asp Val Ala Phe Asp Glu
370				375		380
Lys Lys	Asn Val	Phe	Val	Glu	Phe Tyr	Ala Pro Trp Cys Gly His Cys
385			390			395 400
Lys Gin	Leu Ala	Pro	lle	Trp Asp Lys	Leu Gly Glu Thr Tyr Lys Asp
		405				410 415
His Glu	Asn lle	Val	Xle	Ala	Lys Met	Asp Ser Thr Ala Asn Glu Val
	420				425	430
Glu Ala	Val Lys	Val	His	Ser	Phe Pro	Thr Leu Lys Phe Phe Pro Ala
	435				440	445
Ser Ala	Asp Arg	Thr	Val	lle	Asp Tyr	Asn Gly Glu Arg Thr Leu Asp
450				455		460
Gly Phe	Lys Lys	Phe	Leu	Glu	Ser Gly Gly Gin Asp Gly Ala Gly Asp
465			470			475 480
Asp Asp	Asp Leu	Glu	Asp	Leu	Glu Glu	Ala Glu Glu Pro Asp Met Glu
		485				490 495
Glu Ásp	Asp Asp	Gin	Lys	Ala	Val Lys	Asp Glu Leu

500 505

Claims (35)

1. Protein zapojený do virulence Leishmanie, obsahující alespoň jedno místo (Cys-Gly-His-Cys) identické s potenciálním aktivním místem proteinu rodiny proteinových disulfid izomeráz (PDI).

2. Protein Leishmanie zapojený do virulence parazita, obsahující alespoň jedno místo (Cys-Gly-His-Cys) identické s potenciálním aktivním místem proteinu z rodiny proteinových disulfid izomeráz (PDL).

3. Protein podle nároku 1 nebo nároku 2, který je protein LmPDI z Leishmania major se sekvencí id. č. 3, nebo kterákoliv funkční variace LmPDI, která má alespoň 40% identitu, výhodně alespoň 80% identitu s LmPDI.

4. Rekombinantní polypeptid obsahující alespoň jeden fragment více než 10 aminokyselin z proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, přičemž rekombinantní polypeptid je schopen spustit imunitní reakci proti epitopu LmPDI, když je podán humánnímu nebo zvířecímu hostiteli.

5. Rekombinantní polypeptid podle nároku 4, který je LmPDI-(His)6 protein se sekvencí id. č. 3.

6. Fúzní protein obsahující rekombinantní polypeptid podle nároku 4, fúzovaný s další polypeptidovým fragmentem, přičemž fúzní protein je schopen spustit imunitní reakci proti epitopu LmPDI, když je podán humánnímu nebo zvířecímu hostiteli.

··· ·· · ···· • ····· · · ·· · · ··· • ···· ··· &· · ·· ·» ···· ·· ·

7. Sekvence rekombinantní nukleové kyseliny kódující protein nebo polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.

8. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 7, která obsahuje kódující sekvenci odpovídající nukleotidu 241 až 1674 ze sekvence id. č. 1, nebo fragment sekvence velikosti 100 nukleotidů nebo více.

9. Vektor nukleové kyseliny, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 7 nebo nároku 8.

10. Vektor podle nároku 9, který je plazmid, kozmid, fág nebo virus.

11. Kultivovaná buňka obsahující vektor podle nároku 9 nebo nároku 10.

12. Buňka podle nároku 11, která je buňka bakteriálního kmenu LmPDI-XL, který byl dne 31.1.2002 uložen ve sbírce mikroorganizmů CNCM pod přístupovým číslem 1-2621.

13. Použití sondy nukleové kyseliny specificky hybridizující za vysoce stringentních podmínek se sekvencí nukleové kyseliny id. č. 2 pro určení přítomnosti nebo nepřítomnosti genu virulence kódujícího LmPDI v biologickém vzorku.

14. Nukleotidový primer, který umožňuje specifickou amplifikaci alespoň část sekvence id. č. 1 z buňky infikované Leishmanií, čímž umožňuje určit přítomnost nebo nepřítomnost genu virulence kódujícího LmPDI v biologickém vzorku.

15. Purifikovaná protilátka, která specificky rozpoznává

LmPDI.

16. Imunogenní přípravek vyznačující se tím, že obsahuje protein podle nároku 1, 2, 3 nebo 6 a/nebo rekombinantní polypeptid podle nároku 4 nebo nároku 5 a/nebo sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 7 nebo nároku 8 a/nebo vektor podle nároku 9 nebo nároku 10 a/nebo buňku podle nároku 11, přičemž je imunogenní přípravek schopen stimulovat in vitro proliferaci mononukleárních buněk pocházejících z jedinců, kteří přišli do kontaktu s parazitem Leishmanií.

17. Imunogenní vyznačující se stimulovat proliferaci z jedinců, kteří přišli přípravek podle nároku 16 tím, že je schopen in vitro mononukleárních buněk pocházejících do kontaktu s Leishmania major.

18. Imunogenní přípravek podle nároku 16 nebo nároku 17, vyznačující se tím, že má farmaceuticky přijatelnou formu pro podávání humánnímu nebo živočišnému hostiteli.

19. Imunogenní přípravek podle nároků 16 až 18, vyznačující se tím, že je schopen indukovat imunitní reakci typu Thl, když je podán humánnímu nebo živočišnému hostiteli.

20. Očkovací přípravek vyznačující se tím, že obsahuje protein podle nároku 1, 2, 3 nebo 6 a/nebo rekombinantní polypeptid podle nároku 4 nebo nároku 5 a/nebo sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 7 nebo nároku 8 a/nebo vektor podle nároku 9 nebo nároku 10 a/nebo buňku podle nároku 11, přičemž očkovací přípravek je určen pro ochranu člověka nebo živočicha proti leishmanióze.

> · · · 9 · <··· • ····« · · ·· ····· • «··· ··· ····· ······ · · ·

21. Očkovací přípravek podle nároku 20 vyznačující se tím, že má farmaceuticky přijatelnou formu pro podávání humánnímu nebo živočišnému hostiteli.

22. Imunogenní a/nebo očkovací přípravek podle kteréhokoliv z nároků 16 až 21 vyznačující se tím, že dále obsahuje antigen cizorodý vzhledem k Leishmanii a/nebo sekvenci nukleové kyseliny kódující antigen cizorodý vzhledem k Leishmanii.

23. Způsob screeningu molekul, které jsou schopné inhibovat růst Leishmania major, vyznačující se tím, ž e obsahuje krok hodnocení schopnosti molekul inhibovat aktivitu LmPDI.

24. Způsob screeningu podle nároku 23 vyznačující se tím, že krok pro hodnocení schopnosti molekul inhibovat aktivitu LmPDI je prováděn v testu pro reaktivaci redukované a denaturované RNázy A obsahujícím následující kroky:

-inkubace redukované a denaturované RNázy A v přítomnosti LmPDI v podmínkách, které dovolují její reaktivaci,

-inkubace redukované a denaturované RNázy A v podmínkách totožné s těmi, které dovolují její reaktivaci LmPDI, s tím, že se přidá testovaná molekula,

-srovnání výsledků získaných v nepřítomnosti a v přítomnosti testované molekuly, kdy defektní reaktivace RNázy A v přítomnosti testované molekuly indikuje, že molekula má LmPDI inhibiční aktivitu.

25. Způsob screeningu podle nároku 23 nebo nároku 24, vyznačující se tím, že dále obsahuje test na inhibici růstu Leishmania major v tekutém médiu, a pokud je vhodné, ještě test na inhibici růstu Leishmania major «· · · ·· * • ·· · ···« ··· · · * · ····· • · · · · · · «· ···· ·· · v experimentálním myším modelu leishmaniózy.

26. Použití jednoho nebo více inhibitorů proteinové disulfid izomerázy (PDI) pro výrobu farmaceutického přípravku určeného k profylaxi, zeslabení nebo léčbě infekce Leishmanií.

27. Použití podle nároku 26, kdy inhibitor PDI je anti-PDI nebo anti-LmPDI protilátka, bacitracin, bacitracin zinečnatý, 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoová) kyselina (DTNB), p-chlormerkuribenzensulfonová kyselina (pCMBS) nebo tocinoová kyselina.

28. Použití podle nároku 26 nebo nároku 27 pro výrobu přípravku pro topické, perorální nebo parenterální podávání humánnímu nebo živočišnému hostiteli.

29. Použití bacitracinu nebo bacitracinu zinečnatého jako inhibitoru růstu parazita odpovědného za leishmaniózu nebo jako účinné látky proti infekci Leishmanií.

30. Farmaceutický přípravek určený k léčbě infekce Leishmanií vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároku 15.

31. Přípravek podle nároku 30 vyznačující se tím, že je vhodný pro topické, perorální nebo parenterální podávání.

32. Farmaceutický přípravek určený léčbě infekce Leishmanií vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více inhibitorů proteinové disulfid izomerázy (PDI).

«· · · · · · · · ····« * · · · ····· • · · · · · · •· ·· ···· ·· ·

33. Farmaceutický přípravek podle nároku 32 vyznačující se tím, že obsahující bacitracin nebo bacitracin zinečnatý.

34. In vitro způsob diagnózy infekce parazitem odpovědným za leishmaniózu vyznačující se tím, že obsahuje:

- přivedení alespoň jedné protilátky podle nároku 15 do kontaktu s biologickým vzorkem od pacienta částečně infikovaného parazitem odpovědným za leishmaniózu v podmínkách dovolujících vytvoření imunitního komplexu mezi protilátkou a antigenními proteiny obsaženými ve vzorku, a

- detekci komplexu.

35. Diagnostická souprava pro provádění způsobu podle nároku 34 vyznačující se tím, že obsahuje:

- alespoň jednu protilátku podle nároku 15, médium vhodné pro vytvoření imunitního komplexu s protilátkou,

-činidla dovolující detekci jakýchkoliv komplexů, které jsou vytvořeny,

-kontrolní vzorky, pokud je to vhodné.