CN106085995B

CN106085995B - 一种基因定点改造的蛋白质二硫键异构酶及其应用

Info

Publication number: CN106085995B
Application number: CN201610429913.4A
Authority: CN
Inventors: 胡松青; 刘光; 侯轶; 李琳; 张亚萍; 王敬敬
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: Guangzhou yingzan Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2016-06-15
Filing date: 2016-06-15
Publication date: 2019-07-12
Anticipated expiration: 2036-06-15
Also published as: CN106085995A

Abstract

本发明公开一种基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶及其应用，属于基因工程领域。本发明通过对野生型小麦蛋白质二硫键异构酶进行基因定点改造，获得了仅含有伴侣活性的小麦蛋白质二硫键异构酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，是由氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的野生型小麦蛋白质二硫键异构酶定点改造而得，其43、46、387和390位氨基酸由半胱氨酸(Cys)突变成丝氨酸(Ser)。面包烘焙结果表明，基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶在改善面包品质效果上优于野生型小麦蛋白质二硫键异构酶。研究结果为深入揭示wPDI的伴侣活性对面筋蛋白的作用机制奠定了基础。

Description

一种基因定点改造的蛋白质二硫键异构酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶及其在改善面粉加工品质中的应用。

背景技术

蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)是一种位于真核生物细胞内质网中的巯基/二硫键氧化还原酶，对催化内质网中新生肽链氧化折叠、维持蛋白以及细胞功能具有重要作用。PDI主要由4个硫氧还蛋白结构域组成，以a，b，b′和a′的顺序排列。其中，a和a′含有独立的催化巯基/二硫键交换的CXXC活性位点(C为半胱氨酸cys，X为除cys以外的氨基酸)。PDI包含多种酶学活性，包括二硫键的氧化酶、还原酶和异构酶活性。

除酶学活性外，PDI还具有分子伴侣活性，即能够帮助新生肽链正确折叠并抑制因错误折叠引起的蛋白凝沉作用。PDI伴侣活性的大小受其活性位点cys氧化还原状态的调节。尽管如此，PDI的伴侣活性并不依赖于其活性位点cys。人PDI(hPDI)活性位点cys烷基化后丧失了酶学活性，但仍然保留了抑制变性蛋白凝沉的能力，即保留了分子伴侣活性。PDI的伴侣活性在促进重组蛋白可溶表达以及包涵体的复性等方面都表现出了积极的影响。

已有的研究认为小麦PDI(wPDI)的酶学活性在面筋蛋白的折叠和二硫键的形成中发挥了重要作用。张婷婷等在专利(ZL 201310373089.1)中指出，wPDI能够改善面粉加工品质。然而，Every等提出wPDI的添加水平与面包质量呈负相关关系，即wPDI添加量越大，面包品质越低，这可能是由于wPDI在面粉中发挥二硫键还原酶活性引起的。目前，尚未有将wPDI进行基因突变改造后应用于改善面粉加工品质的相关技术报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶。本发明通过对野生型小麦蛋白质二硫键异构酶进行基因定点改造，获得了仅含有伴侣活性的小麦蛋白质二硫键异构酶突变体。面包烘焙结果表明，基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶在改善面包品质效果上优于野生型小麦蛋白质二硫键异构酶。

本发明的另一目的在于提供所述的基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶在改善面粉加工品质中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

具体地说，上述基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶是由氨基酸序列为SEQID NO：3所示的野生型小麦蛋白质二硫键异构酶定点改造而得，其43、46、387和390位氨基酸由半胱氨酸(Cys)突变成丝氨酸(Ser)。

一种基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种含有上述核苷酸序列的重组表达载体。

根据本发明优选的，所述表达载体为pET-30b(+)。

一种重组表达菌，其包含了上述重组表达载体。

根据本发明优选的，所述表达菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述的基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶丧失了酶学活性，但保留了伴侣活性。

所述的基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶在改善面粉加工品质中的应用。

所述的基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶在改善面包品质中的应用，包括如下步骤：

将基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶按0.01％～0.5％(w/w，面粉基)比例添加至面包中，经面包质构分析发现，基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶在改善面包品质上具有优于野生型小麦蛋白质二硫键异构酶的效果。

优选地，按0.1％(w/w，面粉基)比例添加至面包中。

所述的基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶的制备方法，包括如下步骤：将核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的表达基因导入到pET-30b(+)表达载体上，然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，通过金属螯合层析纯化得到基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶。

本发明的机理是：wPDI同时含有酶学活性和分子伴侣活性，为了获得仅含有分子伴侣活性的wPDI突变体，探究wPDI的伴侣活性对面粉加工品质的影响，本发明利用基因工程技术，对wPDI的活性位点进行定向改造，获得了丧失酶学活性但保留了伴侣活性的wPDI突变体蛋白。本发明改造的小麦蛋白质二硫键异构酶在改善面包品质上发挥积极作用，且效果要优于野生型的wPDI。研究结果为深入揭示wPDI的伴侣活性对面筋蛋白的作用机制奠定了基础。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)本发明在野生型小麦蛋白质二硫键异构酶的基础上，通过定点突变生物技术改造了小麦蛋白质二硫键异构酶，得到仅含有伴侣活性的小麦蛋白质二硫键异构酶突变体。

(2)本发明得到的基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶在改善面包品质方面效果优于野生型小麦蛋白质二硫键异构酶。

附图说明

图1是mPDI诱导表达菌的SDS-PAGE分析；其中，泳道M：低分子量蛋白marker；泳道1：未诱导菌液；泳道2：诱导菌液。

图2是改造前后wPDI的SDS-PAGE图谱比较；其中，泳道M：低分子量蛋白marker；泳道1：亲和纯化的wPDI；泳道2：亲和纯化的mPDI。

图3是重组mPDI和wPDI对面包质构参数的影响比较；其中，不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。本发明的实施例中使用的面粉购于粮食市场；限制性内切酶BamHI和XhoI购于Thermo Fisher Scientific公司；pET-30b(+)质粒购于宝生物工程(大连)有限公司；大肠杆菌BL21(DE3)购于Novagen公司；重组质粒PET30b-wPDI由本实验室自行构建，构建的相关方法和信息见ZL 201310373089.1。

实施例1 小麦蛋白质二硫键异构酶的改造及其重组质粒构建

野生型小麦蛋白质二硫键异构酶的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，对小麦蛋白质二硫键异构酶基因的改造采用重叠延伸聚合酶链式反应，设计如下6条引物：

R1：5'-TTGGAGTGTCCACTCCATGGGGCGTAGAAC-3'；

F2：5'-ATGGAGTGGACACTCCAAGAGCCTGGCACC-3'；

R2：5'-TTTGAGTGTCCGCTCCAGGGTGCATAGAAC-3'；

F3：5'-TGGAGCGGACACTCAAAGAAGCTAGCACCC-3'；

T7：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；

T7ter：5'-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'；

以重组质粒PET30b-wPDI为模板，T7/R1，F2/R2，F3/T7ter为引物分别进行PCR扩增，PCR扩增条件如下：

PCR扩增后得到三个片段，琼脂糖凝胶电泳回收后，以T7/T7ter为引物，三个回收片段为模板再进行PCR扩增，得到全长片段。全长片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，经BamHI和XhoI双酶切，连接到经相同内切酶处理的pET-30b(+)质粒上，进一步转化至BL21(DE3)大肠杆菌中，并涂布于含有卡那霉素的LB平板培养基上37℃培养过夜。

结果：成功获得了基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶(mutant PDI，mPDI)重组质粒，碱基测序结果证实了该序列为基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。

实施例2 重组mPDI的诱导表达及纯化

1、重组mPDI的诱导表达

将构建好的重组mPDI质粒转化至BL21(DE3)中，挑取2～3颗单克隆菌落到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/m条件下培养至OD₆₀₀到0.6～0.8左右，加入0.5mMIPTG诱导表达8h，诱导温度为20℃。经SDS-PAGE分析，重组mPDI获得高效表达(图1)。

2、重组mPDI的亲和纯化

收集表达后的菌体，加入缓冲液重悬，利用探头式超声仪破碎菌体细胞，超声条件为功率300w，占空比0.4：0.6，超声时间15min。超声完全后，8000r/m离心20min后收集上清液。

上清液缓慢注入Ni-NTA亲和层析柱中，利用线性洗脱方式纯化目的蛋白，收集目的组分，并利用SDS-PAGE检测重组蛋白。

结果：重组mPDI获得高效表达，经一步亲和层析获得高纯度目的蛋白，且改造前后的蛋白在SDS-PAGE胶上的迁移率无显著差异(图2)。

实施例3 重组mPDI的酶学性质和伴侣活性测定

PDI的酶学活性包含二硫键氧化酶活性、还原酶活性以及异构酶活性。而PDI的伴侣活性指的是促进新生蛋白的折叠和抑制变性蛋白因稀释引起的凝沉作用。本文以胰岛素还原法表征二硫键的还原酶活性；以恢复二硫键断裂的核糖核酸酶活性表征二硫键氧化酶活性；以恢复二硫键错配的核糖核酸酶活性表征二硫键异构酶活性；以抑制胰岛素B链聚集表征伴侣活性。

结果：如表1所示，相比于wPDI，重组mPDI未表现出二硫键氧化酶、还原酶和异构酶活性，即丧失了酶学活性。对于伴侣活性，mPDI抑制胰岛素B链聚集程度比wPDI大，表明mPDI仍然保留了伴侣活性且高于wPDI。

表1 mPDI和wPDI的酶学活性和伴侣活性比较

酶	氧化酶活性(％)	还原酶活性(％)	异构酶活性(％)	伴侣活性(％)
					wPDI	100.0±0.0	100.0±10.0	100.0±8.0	100.0±4.4
mPDI	ND	ND	ND	159.4±12.3

注：以重组wPDI的活性作为参考，值以百分比表示。ND表示未检出。

实施例4 重组mPDI和wPDI对面包质构的影响比较

面包的制作方法：100g市售高筋粉中加入60g水、1.6g盐，6g糖，3g植物油(金龙鱼食用调和油，市售)，1g酵母粉(安琪高活性干酵母，市售)以及0.1％的重组mPDI或wPDI蛋白(溶于5mM Tris-HCl，pH 8.0中)，100r/m的速度搅拌20min后，将面团分成50g/个，揉成圆形，置于30℃下发酵50min。发酵好的面团放入180℃烘箱中烘烤10min，取出，冷却至室温，测定面包的质构参数，以无任何添加的为对照。

质构分析条件：p/25探头，测前和测试速度1mm/s，测后速度5mm/s，压缩比50％，下压间隔10s。

结果如图3所示：相比于对照组，添加wPDI提高了面包硬度和黏性，降低了面包弹性。该结果与ZL 201310373089.1中实施例3结果基本一致。然而，添加mPDI降低了面包硬度和黏性，提高了面包弹性，表现出了改善面包品质的作用。因此，面包质构结果表明，mPDI能够提高面包的品质。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶，其特征在于：所述的基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，是由氨基酸序列为SEQ IDNO：3所示的野生型小麦蛋白质二硫键异构酶定点改造而得，其43、46、387和390位氨基酸由半胱氨酸突变成丝氨酸。

2.一种编码权利要求1所述的基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种含有权利要求2所述的基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述的表达载体为pET-30b(+)。

5.一种重组表达菌，其特征在于：包含权利要求3或4所述的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达菌，其特征在于：所述的表达菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.根据权利要求1所述的基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶，其特征在于：该酶丧失了酶学活性，但保留了伴侣活性。

8.权利要求1所述的基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶在改善面粉加工品质中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶在改善面包品质中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于包括如下步骤：

将基因定点改造的小麦蛋白质二硫键异构酶按面粉基的0.01％～0.5％w/w比例添加至面包中。