CN103468664B - 一种促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进精氨酸脱亚氨基酶（ADI）高效水溶性表达的方法。是将来源于恶臭假单胞杆菌的ADI基因连接pET-30a-c(+)载体，构建重组表达质粒pET30a-ADI，并与pGro7质粒共转化入E.coliBL21(DE3)中，获得含双质粒的工程菌；将工程菌接种于含有1-10g/L D-葡萄糖的LB培养基中，并添加L-阿拉伯糖培养；当菌体培养至对数期时，再添加1-10g/L的L-精氨酸及0.1mM IPTG，在16℃，180rpm条件下诱导培养实现。本发明方法可显著提高重组ADI蛋白的水溶性产量，粗酶液活性也提高了15倍，并有效克服了重组ADI难以可溶性表达的缺陷，为工业化大规模生产瓜氨酸等应用提供了技术支持，也为其他重组蛋白的表达提供了一个新思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进异源蛋白在大肠杆菌中水溶性表达的方法，尤其涉及一种通过底物添加促进精氨酸脱亚氨基酶在大肠杆菌中高效水溶性表达的方法，属于生物技术领域。
背景技术
大肠杆菌作为异源表达宿主，因其培养条件简单，代时短，遗传操作体系成熟等特点已成为获取大量目的蛋白的主要方法。但在大肠杆菌系统中进行过量表达，常常导致蛋白发生错误折叠、聚集、降解、低活性及以包涵体形式存在等，限制了其相关的研究和应用。
精氨酸脱亚氨基酶（Arginine deiminase，EC3.5.3.6；ADI）催化L-精氨酸水解为L-瓜氨酸和氨，与鸟氨酸氨甲酰转移酶、氨甲酰磷酸激酶共同组成精氨酸脱亚氨基酶途径，广泛分布于一些以精氨酸为主要能量来源的细菌、古细菌及少数低等真核生物。精氨酸脱亚氨基酶除了可用于生产瓜氨酸外，还被证明其是一种潜在的抗癌药物，可抑制精氨酸缺陷型肿瘤细胞的生长，（如黑色素瘤、肝癌细胞）、抗白血病、潜在的抗病毒（HIV）作用等，在医疗领域具有广阔的应用价值。
目前，研究人员已经在大肠杆菌中克隆表达了来源于支原体(Mycoplasma arginini)、变形假单胞杆菌（Pseudomonas plecoglossicida）、链球菌（Streptococcus sanguis）、贾第鞭毛虫（Giardia Intestinalis）等微生物的ADI基因。但是，它们在表达过程中主要以包涵体形式存在，不利于大规模工业生产瓜氨酸及作为医药制剂。这也是目前ADI研究和应用的瓶颈。
在大肠杆菌中主要通过分子伴侣共表达、分泌表达、融合表达及培养条件优化等策略来提高重组蛋白的水溶性产量，但是，这些优化策略并不能有效地解决每一个蛋白在表达纯化中所遇到的问题，对于某些特殊的蛋白，还需要探寻一些新的更加有效的优化策略去帮助其进行活性表达。经检索，在分子伴侣共表达的基础上，在大肠杆菌的培养过程中通过添加底物L-精氨酸和D-葡萄糖促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法还未见报道。
发明内容
针对精氨酸脱亚氨基酶研究和应用的瓶颈，本发明要解决的问题是提供一种促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法。
本发明所述促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法，步骤是：
（1）将来源于恶臭假单胞杆菌（Pseudomonas putida）的精氨酸脱亚氨基酶（Argininedeiminase，ADI）基因连接至pET-30a-c(+)载体，构建重组表达质粒pET30a-ADI，并与pGro7质粒共转化入E.coliBL21(DE3)中，获得含双质粒的工程菌；
（2）将步骤（1）所述的含双质粒工程菌接种于LB培养基中，在37±1℃，200±10rpm条件下培养12-18h；
（3）在LB培养基中添加1-10g/L的D-葡萄糖制得LBG培养基，将步骤（2）培养后的菌液按体积比为1%的接种量接种于制得的LBG培养基中，再添加终浓度为0.2-0.8g/L的L-阿拉伯糖，在37±1℃，200±10rpm条件下培养；
（4）当步骤（3）所述菌体培养至OD600=0.6-0.8时，向培养液中添加终浓度为1-10g/L的L-精氨酸，和终浓度为0.1mM的IPTG，在16±1℃，180±10rpm条件下诱导培养24-30h；
（5）将步骤（4）培养后的菌液在4℃，8000rpm条件下离心10-15min，弃上清，沉淀用体积比为10%的Tris-NaCl缓冲液重悬，常规超声破碎，之后在4℃，12000rpm条件下离心30-35min，分离出可溶性组分与不溶组分，可溶组分即为含有精氨酸脱亚氨基酶的粗酶液。
上述促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法中：步骤（3）所述的D-葡萄糖在LB培养基中添加的终浓度优选为5g/L。
上述促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法中：步骤（3）所述的L-阿拉伯糖添加的终浓度优选为0.4g/L。
上述促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法中：步骤（4）所述向培养液中添加L-精氨酸的终浓度优选为5g/L。
上述用于大肠杆菌（即含双质粒工程菌）培养的LB培养基组成为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L NaCl。
本发明在分子伴侣共表达的基础上，在大肠杆菌的培养过程中通过添加底物L-精氨酸和D-葡萄糖成功实现了促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达，克服了相关精氨酸脱亚氨基酶难可溶性表达的弊端，为ADI的功能研究、工业化大规模生产瓜氨酸及以ADI作为医药酶制剂等应用提供技术支持，也为其他重组蛋白的表达纯化也提供了一个新思路。
实验证明：本发明公开的方法中将来源于恶臭假单胞杆菌的精氨酸脱亚氨基酶，利用pET-30a-c(+)构建重组表达载体pET-30a-ADI，在E.coliBL21(DE3)中异源表达，重组rADI几乎完全以无活性的包涵体形式（图1），粗酶液活性为0.6357±0.0397U/ml菌液。分子伴侣GroEL/ES共表达可显著提高其水溶性产量（图1），粗酶活为3.1574±0.0150U/ml菌液，较现有方法提高了约5倍。
本发明方法在分子伴侣共表达的基础上，在LB培养基中添加5g/L L-精氨酸和5g/LD-葡萄糖诱导培养，可以显著并有效提高rADI的水溶性产量（图2），粗酶液活性高达9.7868±0.0368U/ml菌液，较现有方法提高了15倍左右。然而，在E.coliBL21(DE3)中，底物L-精氨酸需要在D-葡萄糖的协助下才能发挥显著的促进作用，单纯的添加L-精氨酸和D-葡萄糖均不能促进精氨酸脱亚氨基酶的水溶性表达。实验证实单独添加L-精氨酸或D-葡萄糖对rADI的水溶性产量则无促进作用，粗酶液活性依次分别为2.0775±0.0520U/ml菌液、2.7840±0.0232U/ml菌液，此也进一步验证了本发明方法所述的L-精氨酸和D-葡萄糖必须组合使用才能发挥促进作用的观点（图2）。进一步的，利用本发明方法125ml菌体（在分子伴侣共表达基础上添加5g/L L-精氨酸及5g/L D-葡萄糖诱导培养）培养物制备的粗酶液可完全催化100g L-精氨酸生成L-瓜氨酸，而在其本源菌中，催化100g L-精氨酸生成L-瓜氨酸则需要200ml菌体来源的粗酶液，且恶臭假单胞杆菌的培养条件复杂，生产成本较高。此外，经验证，本发明提供的新方法对另一种来源于威尔李斯特菌的LADI蛋白仍具有促进作用，可使其粗酶活由0.0165±0.0002U/ml菌液提高至0.1187±0.0023U/ml菌液，提高了7倍左右。利用Ni柱亲和层析的方法纯化获得的rADI（图3），其最适温度与pH分别为40℃和6.0。rADI在最适条件下的比酶活为76±0.03U/mg，处于文献中报道的中上游水平，且文献中的精氨酸脱亚氨基酶在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在，需通过包涵体体外复性进行纯化。
附图说明
图1示分子伴侣GroEL/GroES共表达时，菌体各组分的SDS-PAGE电泳检测结果。
其中M：蛋白分子量Marker；1，2：含有pET-30a-c(+)空载体的菌体破碎上清和沉淀；3，4：含有pET30a-ADI重组质粒菌体的破碎和沉淀；5，6：含有pET30a-ADI重组质粒与pGro7质粒共表达菌体的破碎上清和沉淀。
图2示在分子伴侣GroEL/GroES共表达的基础上，添加5g/L L-精氨酸及5g/L D-葡萄糖时菌体各组分SDS-PAGE电泳检测结果。
其中M：蛋白分子量Marker；1，2：添加5g/L L-精氨酸时重组菌体破碎上清和沉淀；3，4：添加5g/L D-葡萄糖时重组菌体破碎上清和沉淀；5，6：添加5g/L L-精氨酸及5g/L D-葡萄糖的含有pET-30a-c(+)空载体的菌体的破碎上清和沉淀；7，8：添加5g/L L-精氨酸及5g/LD-葡萄糖的重组菌体的破碎上清和沉淀。
图3示纯化的rADI的SDS-PAGE电泳图。
图4示在分子伴侣GroEL/GroES共表达的基础上，添加5g/L L-精氨酸和5g/L D-葡萄糖时菌体制备的粗酶液的转化率曲线。
具体实施方式
实施例1将来源于恶臭假单胞杆菌的精氨酸脱亚氨基酶，构建重组表达载体，在大肠杆菌中进行异源表达。
（1）将来源于恶臭假单胞杆菌的精氨酸脱亚氨基酶(GenBank accession no.P41142)，根据表达宿主E.coliBL21(DE3)的密码子频率表，利用“密码子随机分布”的优化策略，对ADI基因进行全人工合成。然后，利用PCR的方法将限制性内切酶NcoⅠ、HindⅢ的相应酶切位点克隆到ADI基因上下游，连接至含有6His标签的pET-30a-c(+)载体，构建重组表达载体pET30a-ADI，并与编码分子伴侣GroEL/GroES的pGro7质粒共转化入E.coliBL21(DE3)中，获得获得含双质粒（pET30a-ADI与pGro7）的工程菌。
“密码子随机分布”策略指将此氨基酸序列中的每个氨基酸依据密码子频率表中每个密码子的频率进行加权，然后将编码这个氨基酸的多个密码子随机分配到此氨基酸序列中。例如：序列中有17个Ala，而编码Ala的密码子GCG，GCC，GCA，GCU在大肠中的频率分别为0.36，0.27，0.21，0.16。根据“密码子随机分布”的优化原则，此四个密码子在此序列中的出现次数为：0.36*17=6，0.27*17=5，0.21*17=4，0.16*17=2。
上述重组表达载体pET30a-ADI构建涉及的引物序列如下：
Forward：CATGCCATGGCTATGAGCGCCGAAAAACAGAATATG
Reverse：CCCAAGCTTGATAATCGATAGGGTCGCGAACAATG
（2）将含有双质粒的工程菌株的接种于新鲜的LB培养基（LB培养基配方：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L NaCl）中，在37℃，200rpm条件下培养16h；
（3）在LB培养基中添加5g/L的D-葡萄糖制得LBG培养基，将步骤（2）培养后的菌液按体积比为1%的接种量接种于制得的LBG培养基（同时添加40mg/L卡那霉素，20mg/L氯霉素）中，再添加终浓度为0.4g/L的L-阿拉伯糖诱导表达分子伴侣GroEL/GroES，在37℃，200rpm条件下培养；
（4）当步骤（3）所述菌体培养至OD600=0.6-0.8时，向培养液中添加终浓度为5g/L的L-精氨酸，和终浓度为0.1mM的IPTG，在16℃，180rpm条件下诱导培养24h；
（5）将步骤（4）培养后的菌液在4℃，8000rpm条件下离心10-15min，弃上清，沉淀用体积比为10%的Tris-NaCl缓冲液（50mM Tris,150mM NaCl，pH8.0）重悬，在冰水浴中进行常规超声破碎，之后在4℃，12000rpm（或15000g）条件下离心30min，分离出可溶性组分与不溶组分，可溶组分即为含有精氨酸脱亚氨基酶的粗酶液。用SDS-PAGE(12%)电泳检测重组蛋白表达情况，并对粗酶液进行活性检测。
（6）活性检测方法
采用改良的二乙酰一肟-氨基硫脲比色法检测酶反应液中的L-瓜氨酸含量。添加适量的ADI酶至含有20mM L-精氨酸的500mM的磷酸钠缓冲液（pH6.0）中，40℃，反应10min。添加混合酸-铁溶液（7%（V/V）浓磷酸，16%（V/V）浓硫酸，0.05g/L三氯化铁）终止反应，并添加二乙酰一肟-氨基硫脲溶液（10g/L二乙酰一肟，0.6g/L氨基硫脲）混合，100℃煮沸10min，在530nm处测量吸光值。粗酶液为菌体细胞经过超声破碎后的可溶性物质。粗酶液活性为每毫升菌液细胞经超声破碎后获得的可溶性物质的总活性，用U/ml菌液表示。
1Unit定义为每分钟将1μmol L-精氨酸转化为1μmol L-瓜氨酸的酶量。
（7）测定粗酶液转化率
将100ml菌体按步骤（5）所述方法制备的10ml粗酶液平均分成4份，分别在30℃、40℃条件下，采用底物添加与非添加的方式，并在0、2、3、5、6、8、10、22、28小时进行取样，检测相应的L-瓜氨酸产量，绘制转化曲线。每组实验均设置三组平行，取平均值。其中，非添加底物的方式指初始反应液为200ml含有100g/L L-精氨酸的磷酸钠缓冲液（500mM，pH6.0），而底物添加的方式指将150ml含有100g/L L-精氨酸的磷酸钠缓冲液分三次添加至50ml含有100g/L L-精氨酸的磷酸钠缓冲液的至总体积为200ml，与非添加组的总体积及总底物量相同，均为20g L-精氨酸。结果见图4。
实施例2
方法同实施例1，不同的是步骤（3）中的D-葡萄糖浓度为1g/L，步骤（3）中的L-阿拉伯糖终浓度为0.2g/L，步骤（4）中的L-精氨酸浓度为1g/L。
实施例3
方法同实施例1，不同的是步骤（3）中的D-葡萄糖浓度为10g/L，步骤（3）中的L-阿拉伯糖终浓度为0.8g/L，步骤（4）中的L-精氨酸浓度为10g/L。
Claims (4)
1.一种促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法，步骤是：
(1)将来源于恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)的精氨酸脱亚氨基酶(Argininedeiminase，ADI)基因连接至pET-30a-c(+)载体，构建重组表达质粒pET30a-ADI，并与pGro7质粒共转化入E.coliBL21(DE3)中，获得含双质粒的工程菌；
(2)将步骤(1)所述的含双质粒工程菌接种于LB培养基中，在37±1℃，200±10rpm条件下培养12-18h；
(3)在LB培养基中添加1-10g/L的D-葡萄糖制得LBG培养基，将步骤(2)培养后的菌液按体积比为1％的接种量接种于制得的LBG培养基中，再添加终浓度为0.2-0.8g/L的L-阿拉伯糖，在37±1℃，200±10rpm条件下培养；
(4)当步骤(3)所述菌体培养至OD600＝0.6-0.8时，向培养液中添加终浓度为1-10g/L的L-精氨酸，和终浓度为0.1mM的IPTG，在16±1℃，180±10rpm条件下诱导培养24-30h；
(5)将步骤(4)培养后的菌液在4℃，8000rpm条件下离心10-15min，弃上清，沉淀用体积比为10％的Tris-NaCl缓冲液重悬，常规超声破碎，之后在4℃，12000rpm条件下离心30-35min，分离出可溶性组分与不溶组分，可溶组分即为含有精氨酸脱亚氨基酶的粗酶液。
2.如权利要求1所述促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法，其特征在于：步骤(3)所述的D-葡萄糖在LB培养基中添加的终浓度为5g/L。
3.如权利要求1所述促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法，其特征在于：步骤(3)所述的L-阿拉伯糖添加的终浓度为0.4g/L。
4.如权利要求1所述促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法，其特征在于：步骤(4)所述向培养液中添加L-精氨酸的终浓度为5g/L。
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